JPH04128238A - フィブロネクチン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は高度に精製されたフィブロネクチンを含有する
組成物に関し、その組成物においてはフィブロネクチン
の水に対する溶解性が改良され、水溶液からのフィブロ
ネクチンの析出が抑制され、かつ保存中のフィブロネク
チンの活性低下が抑制される。

〔従来の技術〕

フィブロネクチンは体内に広く分布する糖蛋白質で、多
様な生物活性を有する細胞外マトリックスの一つとして
知られている。フィブロネクチンの生物活性ｌこは、細
胞接着、細胞間相互作用、細胞形態維持、細胞移動、細
胞走化性、細胞分化、食作用、血液凝固、組織損傷修復
作用などが明らかになっており、フィブロネクチンの臨
床応用にかける期待は非常に大きいものがある。フィブ
ロネクチンには細胞表面や細胞間隙に不溶性の形で存在
する細胞性フィブロネクチンと血漿中に溶存する血漿性
フィブロネクチンの２種あるが、医薬として応用するた
めには血漿性フィブロネクチンが利用しやすい。血漿性
フィブロネクチンは動物の血液から得ることもできるが
、抗原性に問題があり医薬としてはヒトの血液由来のフ
ィブロネクチンが好ましい。ヒト血漿性フィブロネクチ
ンは約５％の糖鎖を含む分子量およそ４６にの２本鎖構
造の可溶性糖蛋白質で、血中濃度は約３００μｆ／ｍｌ
である。これまで内科領域では外傷後敗血症患者（Ａｒ
ｃｈ、　８ｕｒｇ、　１１８　；　３３８−３４２　。

１９８３　）や白血病患者（Ｂｒ、　Ｊ、　Ｈｅｍａｔ
ｏｌ、　５１　；４８７−４９１．１９８２　）に血漿
性フィブロネクチンを投与して、夫々臨床症状の一時的
改善が報告されている。更に眼科領域においては角膜ヘ
ルペス後あるいは眼内手術後の遷延性角膜上皮欠損や三
叉神経の障害による麻痺性角膜潰瘍、角膜熱傷、化学熱
傷後の角膜上皮欠損などの治療に対し、血漿性フィブロ
ネクチンの著しい有効性が認、められている（自限４２
：５５−５７．１９８８　）。

しかしながら、これまで使用されたフィブロネクチンは
工業的に製剤化されたものではなく、患者自身の血液あ
るいは保存血から用時調製されたものであった。フィブ
ロネクチンは元来水溶液中で互いに凝集し不溶性になり
やすい性質や容器に吸着しやすい性質があり、凍結乾燥
しても良好な溶解性が得られない。

フィブロネクチンの水溶液からの析出を防ぎ、また水に
対する溶解性を改善するためにフィブロネクチン含有製
剤に対してアルブミンの存在下に中性アミノ酸、単糖類
、二輪類、または糖アルコールの一種以上を添加するこ
とが提案されている（特開昭５９−６７２２８）。また
その後二糖類、アルブミンまたは非イオン界面活性剤の
一種以上を添加することも提案されている（特開昭６ｌ
−１０３８３６）。

これらの方法の実験例に用いられているフィブロネクチ
ンは、特開昭５７−１４０７２４および特開昭６８−１
２１２２０の方法により加熱と遠心分離による方法によ
って製造されたもので、その純度はアフィニティークロ
マトグラフィーによって精製されたもの（Ｆｉｂｒｏｎ
ｅｃｔｉｎ１Ａｃａｄｅｍｉｃ１’ｒｅｓｓ、　４４１
−４５６．　１９８９　）と比較すれば明らかに劣って
おり、フィブロネクチン以外の血漿蛋白の混入が類推さ
れる。したがってこれらの方法におけるアルブミンおよ
び他の添加物は、むしろ他の血漿蛋白を包含した状態に
おいて効果があると考えられることから、これらはフィ
ブロネクチン自体の溶解性および安定性の改善を直接開
示するものではない。本発明者らはかかる点を考慮し、
高度に精製されたフィブロネクチンを、点眼剤をはじめ
皮膚、直腸および腟内、口腔内、皮下および静脈内いず
れにも投与可能な剤形において供用できるフィブロネク
チン製剤として安定なフィブロネクチン組成物を完成す
るに至った。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は高純度フィブロネクチンの水溶液中分子間凝集
を抑制し、容器吸着を阻害し、安定で澄明なフィブロネ
クチノ溶液を提供すること、および長期保存可能な凍結
乾燥製剤においても、用時溶解後溶解性に変化をもたら
′さず軟膏基剤や坐薬基剤、口腔内適用基剤とも混和可
能なフィブロネクチン組成物を提供することを意図する
。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記の課題について鋭意検討を重ねた結果
、単糖類あるいはアミノ酸を高度に精製されたフィブロ
ネクチンに適当量添加することによって、水溶液の状態
においてもまたそれを凍結乾燥後溶解しても不溶物を認
めずフィブロネクチン活性に何ら影響を与えないことを
見いだし本発明を完成した。

本発明は、高度に精製されたフィブロネクチンにその安
定化に有効な量の単糖類またはアミノ酸を少くとも１種
添加してなるフィブロネクチン組成物である。

本発明においては、フィブロネクチンを、本発明におけ
るフィブロネクチンの安定化の作用を阻害しない程度に
、高度に精製された状態で用いる。

その精製は、たとえば、ゼラチンセファローズを用いる
アフィニティークロマトグラフィーによって行うことが
できる（　Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　、　Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ１’ｒｅｓｓ、４４１−４５５（１９８９））。

フィブロネクチンは動物またはヒトの血漿から抽出され
て用いられ、好ましいのはヒト血漿性フィブロネクチン
であるが、それはヒト血漿を原料に用いるので、肝炎ウ
ィルスやエイズウィルスのようなウィルスで汚染されて
いるかも知れない。

それでウィルスの不活性処理が行われているのが望まし
い。血液製剤におけるこのようなウィルスの不活性化法
としては従来６０°Ｃで１０時間加熱する方法がとられ
て来たが、精製フィブロネクチンが加熱により失活し易
いので、トリ−ｎ−ブチルホスフェートによる脂質含有
ウィルスの不活性化処理（特開昭６０−５１１１６号公
報）を行うのが好ましい。

本発明に用いる単糖類は、たとえば、グルコース、ガラ
クトース、マンノース、フラクトース、アラビノース、
キシロースなどを包含する。これらの単糖類は単独にも
しくは２種以上を用いることができ、通常好ましいのは
グルコースである。

単糖類は重量比でフィブロネクチン１に対して３〜２０
の範囲で添加するのが好ましい。

本発明で用いるアミノ酸は好ましくはａ−アミノ酸で、
たとえば、グリシン、アラニン、トリプトファン、シス
チン、グルタミン酸、セリン、リジン、バリン、イソロ
イシン、ロイシンなどを包含する。これらのうちより好
ましいのはグリシンおよびアラニン、イソロイシン、ロ
イシン、バリンである。これらのアミノ酸は単独にもし
くは２種以上を用いることができる。好ましいアミノ酸
の添加率は重量比でフィブロネクチン１に対して３〜２
０の範囲である。

単糖類またはアミノ酸はフィブロネクチンを水に溶は易
くし、水溶液からのフィブロネクチンの析出を抑制する
と共にフィブロネクチンの経時的な失活を抑制して活性
を保持させる作用を示す。

単糖類とアミノ酸は両者を併用してもよく、両者の合計
量が重量でフィブロネクチン１に対して３〜２０の範囲
であればフィブロネクチンに対する上記の有利な詩作用
に変りはない。

精製フィブロネクチンは通常等張で中性の緩衝液に対し
て透析したのち、除菌濾過して使用されるが、濾過前に
単糖類または／およびアミノ酸（以下、安定化剤と略称
することもある）を加えることが好ましく、溶液状態の
ままで使用してもよく、またこれを凍結乾燥して再溶解
して用いてもよい。凍結乾燥する場合、溶液中のフィブ
ロネクチンの濃度は０．２５ｍ９／ｍｅ以上３０　ｍｙ
／ｍｌ！以下であることが望ましい。

本発明による安定他剤添加のヒトフィブロネクチンは調
製後溶液或いは乾燥後再溶解して、そのまま点眼或いは
注射することもできるしまた通常用いられる水溶性の皮
膚外用基剤、坐薬基剤、口腔内適用基剤などと混合して
夫々の臨床適用に供することができる。尚また各剤形に
通常用いられる防腐剤が含まれてもフィブロネクチンの
活性は失われない。

以下に実験例および実施例を挙げて本発明を更に詳しく
説明する。尚これらの実験例および実施例に用いたヒト
フィブロネクチンはヒトブールプラズマからゼラチンセ
ファ０−スを担体とするアフィニティークロマトグラフ
ィーによる方法（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、　Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　４４１−４５６．１９８９）に
より精製したものである。

フィブロネクチン活性はＢＨＫ細胞（ベイビーハムスタ
ー腎株化細胞）を用い、ＢＨＫ細胞接着能試験法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　８２　；８
０５．１９８２）に準じて測定した。

実験例１ 精製ヒトフィブロネクチンを最終濃度１　ｍｇ／ｍｅ含
み、リン酸１ナトリウム・２水塩１．５６ｍｇ／ｍｌを
含む溶液に第１表の如く種々の濃度のグリシンを添加す
るとともに、等張化のために夫々加える食塩濃度を調整
したのち、０．　Ｉ　Ｎ　−ＮａＯＨで各試料溶液のｐ
Ｈを７．２に調整し、各バイアルに３ｍｆｆずつ分注し
て４°Ｃおよび３７°Ｃにおける１ケ月間保存安定性を
試験した。第１表に示した残存活性の結果から、明らか
にグリシンはヒトフィブロネクチン活性の安定化に効果
があり、またグリシノ不合試料に保存期間中不溶性凝集
物を認めたのに反し、グリシンを含む試料では溶状に変
化なく、したがってグリシンはフィブロネクチンの溶解
性に対しても安定化効果を有することが判明した。

第１表 （ＦＮ　　： フィブロネクチン） 実験例２ 実験例１と同様にグルコースについて、ヒトフィブロネ
クチンの安定化効果を試験した結果、第２表に示す如く
グルコースはフィブロネクチンの活性の安定化効果を有
し、またグリシン同様フィブロネクチンの溶解性に対し
ても安定化効果を有することが判明した。

第２表 （ＦＮ：フィブロネクチン） 実験例３ グリシン以外のアミノ酸およびグルコース以外の単糖類
について、実験例１と同様にヒトフィブロネクチンの安
定化効果を試験した結果、第３表および第４表に示す如
くアミノ酸ではグリシンと特にすぐれた活性の安定化効
果ま有していることが判明した。

第 表 第 表 実験例４ 次に示す第５表の組成のヒトフィブロネクチン溶液を調
製し、ｐＨおよび浸透圧を調整後、バイアルに分注し凍
結乾燥した。これら乾燥品を４°Ｃ１ケ月保存し蒸留水
でフィブロネクチンの濃度がＩｍｇ／ｍｌになるように
再溶解して、乾燥フィブロネクチンの水溶液への復元性
と活性の安定性を試験した。第５表の結果からグリシン
およびグルコースは、フィブロネクチンの乾燥における
活性の安定性と再溶解性に効果を有することが判明しｔ
こ。

第 表 実施例１ 次に示す処方により、ヒトフィブロネクチン凍結乾燥製
剤を常法に従って調製した。

ヒトフィブロネクチン　　　　　　５．０９グリシン　
　　　　　　　　　　４０．０９グルコース　　　　　
　　　　　　２０．０ｇリン酸１ナトリウム・２水塩　
　　１．６　ｆ／ＮａＣ１６，６ｆ／ 上記の組成物を蒸留水３，０００ｍｊ’に溶解後、０、
　Ｉ　Ｎ　−ＮａＯＨでｐＨを１．２に調整した。乾燥
後蒸留水で復元した結果、活性は１００％回収され、溶
解性も同等問題なかった。

本乾燥製剤は注射剤にも点眼剤にもなり、点眼剤の場合
通常用いられるパラベン混合液の如き防腐剤含有溶解液
で溶解しても安定な医薬として供せられる。

実施例２ 次に示す処方により、常法に従って皮膚外用および坐薬
のゲル剤を調製した。

ヒトフィブロネクチン　　　　　　１０ｇグリシン　　
　　　　　　　　　　４０１グルコース　　　　　　　
　　　　　６０ｇマクロゴール４．０００　　　　　６
０　Ｏｆマクロゴール４００　　　　　　５００ｆ本ゲ
ル剤に含まれるフィブロネクチンの活性は調製前と何ら
変化なかったし、またゲル化により全く濁りを生じなか
った。

実施例３ 次に示す処方により、常法瘉こ従って口腔内適用の剤形
であるトローチ剤を調製した。

ヒトフィブロネクチン　　　　　　１０ダグリシン　　
　　　　　　　　　　４０ｇグルコース　　　　　　　
　　　　　６０ｆアラビアゴム末　　　　　　　　１５
０ｆ白　　糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
６００　　ｇ本トローチ剤を可溶化してフィブロネクチ
ン活性を測定し、１００％活性が保持されていることを
確認した。

〔発明の効果〕

本発明によれば、単糖類または／およびアミノ酸を添加
することにより、高度に精製したフィブロネクチンの水
に対する溶解性を改良して、水に澄明に溶解し、水溶液
からのフィブロネクチンの析出を抑制すると共に水溶液
中におけるフィブロネクチンの活性低下を抑制できる組
成物が提供される。

特許出願人　　日本ケミカルリサーチ株式会社（自発）
手続補正書 平成２年特許願第３１０４０２号 ２゜ 発明の名称 フィブロネクチン組成物 ３゜ 補正をする者 ４゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　高度に精製されたフィブロネクチンにその安定化に
   有効な量の単糖類またはアミノ酸を少くとも１種添加し
   てなるフィブロネクチン組成物。 ２　フィブロネクチンがアフィニティクロマトグラフィ
   ーによって精製されたものである請求項１記載の組成物
   。 ３　該単糖類がグルコース、ガラクトース、マンノース
   、フラクトース、アラビノースおよびキシロースからな
   る群から選ばれる少くとも１種である請求項１記載の組
   成物。 ４　該単糖類が重量比でフィブロネクチン１に対して３
   〜２０の範囲で添加される請求項１記載の組成物。 ５　該アミノ酸がグリシンまたは／およびアラニン、ロ
   イシン、イソロイシン、バリンである請求項１記載の組
   成物。 ６　該アミノ酸が重量比でフィブロネクチン１に対して
   ３〜２０の範囲で添加される請求項１記載の組成物。 ７　フィブロネクチンがヒト血漿から得られたものであ
   る請求項１、２、３、４、５または６記載の組成物。 ８　フィブロネクチンが、トリ−ｎ−ブチルホスフェー
   トによる脂質含有ウィルスの不活性化工程を経由して準
   備されたものである請求項１、２、３、４、５、６また
   は７記載の組成物。 ９　３０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度でフィブロネクチンを含
   有する水溶液を凍結乾燥してなる請求項１、２、３、４
   、５、６、７または８記載の組成物。 １０　点眼用の剤形である請求項１、２、３、４、５、
   ６、７、８または９記載の組成物。 １１　皮膚外用に適する剤形である請求項１、２、３、
   ４、５、６、７、８または９記載の組成物。 １２　坐薬の剤形である請求項１、２、３、４、５、６
   、７、８または９記載の組成物。 １３　口腔内に適用するのに適する剤形である請求項１
   、２、３、４、５、６、７、８または９記載の組成物。 １４　注射用凍結乾燥製剤の剤形である請求項１、２、
   ３、４、５、６、７、８または９記載の組成物。