JPH04108383A

JPH04108383A - 酸性ウレアーゼの遺伝子操作による製造法

Info

Publication number: JPH04108383A
Application number: JP2224674A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Suzuki; 康司鈴木; Kimiko Hattori; 服部　公子; Shigeyuki Imamura; 茂行今村; Masamichi Hara; 原　昌道; Takeaki Ishikawa; 雄章石川
Original assignee: TAX ADM AGENCY; National Tax Administration Agency; Toyo Jozo KK; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: TAX ADM AGENCY; National Tax Administration Agency; Toyo Jozo KK; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-08-27
Filing date: 1990-08-27
Publication date: 1992-04-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、酸性ウレアーゼの新規な製造法、当該製造法
に使用される形質転換微生物および酸性ウレアーゼの各
サブユニットのペプチドをコードする遺伝子に関する。

［従来の技術］ウレアーゼは、尿素と水をアンモニアと二酸化炭素に変
える酵素である。このウレアーゼは広く自然界に存在し
、中性ｐＨて働く中性ウレアーゼについては、いくつか
クローニングされ、アミノ酸配列も決定されている。

また、酸性で働く酸性ウレアーゼについては、ラクトバ
チルス・ファーメンタム（ｌｔｚｃｌｏｂｉｃｉ／ｌｕｓ　／ｅｒｚｅｎｌｔｔ
ｚ）由来のものが知られている［　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖ
ｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ。

３７（３）、　３７９−３８２（１９７９）コ。このう
ち１株のラクトバチルス・ファーメンタム株由来のもの
について、その部分アミノ酸配列が決定されている［　
Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ
ｎｏｌ。

井、　５３８−５４３　（１９９０）］。

ウレアーゼの工業的な利用法として、食品、特に酒類中
に含まれるウレアの分解があり、例えば、清酒中のウレ
アを分解することを目的として酸性ウレアーゼ、特に上
記のラクトバチルス・ファーメンタム由来の酸性ウレア
ーゼが広く利用されている。

［発明が解決しようとする課題］しかし、従来のラクトバチルス・ファーメンタムから酸
性ウレアーゼを得る方法においては、生産性が低いとい
う問題点があるばかりでなく、嫌気性発酵を行なわなけ
ればならないという問題があった。すなわち、嫌気培養
を行なう場合、その培養装置は窒素充填できるものでな
くてはならず、培養に先立って培地中の酸素を追い出す
必要もあり、また、培養中も生成するアンモニアを追い
出し続ける必要もあった。また、通常、好気培養によれ
ば、嫌気培養の場合に比較して菌の増殖速度が大きく、
したがって目的物の生産量の増大につながると考えられ
、より効率の良い酸性ウレアーゼ生産法の開発が望まれ
ていたが、酸性ウレアーゼについては、全く遺伝子解析
がなされていなかった。

［課題を解決するための手段］本発明者らは、遺伝子操作の手法により酸性ウレアーゼ
を有利に製造すべく鋭意研究を行なった結果、宿主微生
物および利用遺伝子として特定のものを選択すれば上記
目的が達成されることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の第一の目的は、第１図で示されるα
ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列、第２図
で示されるβペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基
配列および第３図で示されるγペプチドのアミノ酸配列
をコードする塩基配列を含む外来性のＤＮＡを有するベ
クターを導入することにより形質転換せしめた形質転換
微生物を培養して該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該
培養物から酸性ウレアーゼを採取することを特徴とする
酸性ウレアーゼの製造法を提供することである。

また、本発明の他の目的は上記した形質転換微生物およ
び外来性ＤＮＡを提供することである。

本酸性ウレアーゼは、α、βおよびγと呼ばれる各サブ
ユニットにて構成されて活性を発現する。

本発明の酸性ウレアーゼの製造法を実施するには、まず
、少なくとも第１図で示されるαペプチドのアミノ酸配
列をコードする塩基配列、第２図で示されるβペプチド
のアミノ酸配列をコードする塩基配列および第３図で示
されるγペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含む外来性のＤＮＡ　（以下、「外来ＤＮＡＪと略称
する）をベクターに組み込み、当該ベクターで宿主微生
物を形質転換する。

この場合に第１図で示されるαペプチドのアミノ酸配列
をコードする塩基配列、第２図で示されるβペプチドの
アミノ酸配列をコードする塩基配列および第３図で示さ
れるγペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列は
、それぞれ別のベクターに組み込んで良く、また同一ま
たは別の宿主微生物に導入して形質転換微生物を得ても
良いが、特に好ましくは、同一のベクターに組み込み、
同一の宿主微生物に導入して形質転換微生物を得る方法
が挙げられる。

本発明の、第１図で示されるαペプチドのアミノ酸配列
をコードする塩基配列において、その第１図にて表記さ
れるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端側にはアミノ酸
残基またはポリペプチド残基を含む場合であっても良く
、その塩基配列としては、それらの各アミノ酸に対応す
る一連のコドンのうちのいずれか１個のコドンであれば
良い。例えば、Ｎ末端側の上流につくアミノ酸残基また
はポリペプチド残基としては、水素原子、バリン（Ｖａ
ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ）またはシグナルペプチド等
が挙げられ、また、Ｃ末端側の下流には、さらに１個以
上のアミノ酸残基を有していても良い。また、第２図で
示されるβペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配
列および第３図で示されるγペプチドのアミノ酸配列を
コードする塩基配列においても上記と同様に定義される
。

上記の第１図で示されるαペプチドのアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列の代表例として、５°末端より第４図
で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができ
る。該ＤＮＡは、５′末端の上流側にアミノ酸をコード
するコードを１個以上有したものでも良く、ＴＡＡおよ
びＴＧＡ等の紡出コドン以外のコドンであれば良い。さ
らに好ましくは、ＡＴＧ、ＧＴＧ、それら以外の開始コ
ドンまたはシグナルペプチドに対応するコドンを有した
ものを挙げることができる。３″末端側の下流には、ア
ミノ酸をコードするコドンを１個以上有するか、または
終止コドンを有するかのいずれでも良く、更にその３゛
末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有する
場合には、このアミノ酸をコードするコドン３゛末端に
終止コドンを有することが好ましい。

また、第２図で示されるβペプチドのアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列の代表例として、５゛末端より第５図
で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができ
、第３図で示されるγペプチドのアミノ酸配列をコード
する塩基配列の代表例として、５゛末端より第６図で表
される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。

第５図および第６図の５゛末端側および３”末端側は、
上記第４図と同様に定義される。

本発明のＤＮＡは上記サブユニットそのものだけでなく
、当該サブユニットと同様に酸性ウレアーゼを構成し、
その活性を発現し得る一部分が相違するサブユニットを
コードする塩基配列を含むＤＮＡであってもよく、それ
ぞれのサブユニットにおいて、その塩基配列の相同性が
９０％以上であって該酵素活性を有するアミノ酸配列を
発現するＤＮＡを包含する。

また、本願の酸性ウレアーゼをコードするＤＮＡ、すな
わち外来ＤＮＡとしては、第８図に示す通り約２．４Ｋ
ｂｐの塩基配列であって、少なくともＨｈａ　Ｉの制限
酵素サイトを２つ、Ｋｐｎ　Ｉ、Ｎｃｏ　Ｉ、Ｘｂａ　
１の制限酵素サイトを各々１つ有し、制限酵素ＨｈａＩ
消化断片が約２．０Ｋｂｐの大きさとなる塩基配列であ
り一１更に具体的には、５°末端より少なくとも第７図
に示される塩基配列を有するものであっても良い。

上記の外来ＤＮＡは、例えば酸性ウレアーゼ産生微生物
の遺伝子ライブラリーをスクリーニングするか、α、β
およびγペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを化
学合成することにより得られる。

酸性ウレアーゼを産生ずる形質転換微生物を調製するに
は、以下の如く行なえば良い。

例えば、まず、酸性ウレアーゼ遺伝子供与微生物のＤＮ
Ａを分離精製した後、これを超音波、制限酵素などを用
いて切断し、このＤＮＡと、切断してリニヤ−にしたベ
クターとを、両ＤＮＡの平滑または接着末端部において
ＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、組み換えＤＮ
Ａベクターを得る。

ついて、得られた組み換えＤＮＡベクターを複製可能な
宿主微生物に導入して形質転換せしめる。

この形質転換せしめた微生物をベクターのマーカーと後
記の好ましい酸性ウレアーゼ遺伝子に対するプローブに
付した標ｉ１ｍ（例えば、３２ｐ等の放射能ラベル）と
を指標とすることにより選択し、選択された株が酸性ウ
レアーゼを生産することを確認することにより、本発明
の形質転換微生物を調製することができる。

ＤＮＡの供与体である供与微生物としてはラクトバチル
ス、好ましくはラクトバチルスファーメンタムＪＣＭ５
８６９　（ＦＥＲＭＢＰ−３０５０）が例示される。

遺伝子の供与体である微生物に由来するＤＮＡを採取す
るには以下の如く行なう。

例えば、上述の供与体である微生物を、液体培地で約１
−３日間培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し
、次いでこれを溶菌させることによって酸性ウレアーゼ
遺伝子を含有する溶菌物を調製する。溶菌法としては、
例えばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解
酵素による処理が施され、必要によりプロテアーゼなど
の他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤
が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融
解（特開昭６３−１８５３７１号公報参照）やフレンチ
プレス処理を上述の溶菌法との組合せで行なってもよい
。

この様にして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製する
には、例えばフェノール抽出による除蛋白処理、プロテ
アーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、
遠心分離などの公知の方法を適宜組合せる常法により行
なうことができる。

分離精製された微生物ＤＮＡを切断する方法は、例えば
、超音波処理、制限酵素処理などにより行なうことがで
きるが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合が容易
となる特定ヌクレオチド配列に作用する制限酵素、例え
ば、５ａｕ３ＡＩ、Ｓａｌ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ、Ｃ１ａ　
Ｉ、ＰｓｔＩなどが適している。

得られた外来ＤＮＡのベクターへの組み込みは、外来の
ＤＮＡ断片とベクターの両者を適宜の制限酵素で切断し
、公知の方法に従って両者を組み込むことにより行なわ
れる。

宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的
に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発現できるも
のであれば良いが、特に好気条件で成育する原核微生物
が好ましく、例えば、エシェリヒア・コリ（ｆｓｃｈｅｒｌｃｈ；ｉ　ｃｏｌｉ’）　　ＤＨ１、
エシェリヒア・コリ　ＨＢＩＯＩ、エシェリヒア・コリ
Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ　Ｃ６００等のエシェ
リヒア属や、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレ
プトマイセス（５ｔｒｅｐｔｏＢｔｃｅｓ　）属等に属
する微生物が利用される。

ベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しう
るファージ、コスミド又はプラスミドから遺伝子組み替
え用として横築されたものが適している。

例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物として遺伝子
ライブラリーを作成する場合には、ファージベクターと
して、λｇｔ、λＣ２λＢなどが使用できる。また、エ
シェリヒア・コリを宿主とするコスミドベクターとして
は、例えば、ｐＨＣ７９等が挙げられる。

また、エシェリヒア・コリを宿主微生物とするプラスミ
ドベクターとしては、例えば、プラスミドｐＢＲ３２２
、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵｃ１２、ｐＵ
Ｃ１３、ｐＵｃ１８、ＰＵＣ１９、ｐＵｃ１１８、ｐＵ
Ｃ１１９などが用いられ、同様にバチルス・スブチルス
には、プラスミドｐＴＵＢ、ｐＴＵＢ２８５などが使用
できる。

さらに、エシェリヒア・コリ及びストレプトマイセス・
リビダンス（５ｔｒｅｐｔｏｚｐｃｅｓｌｉＶＩ′ｄａ
〃ｓ）などの二種以上の宿主微生物体内で自律的に増殖
可能なシャトルベクター例えばｐｓＬＰｌｏｌ、ｐｓＬ
Ｐｌ　１１等を利用することもてきる。

微生？！ｌＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方
法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法てあればよく
、例えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片
の接着末端とのアニーリングの？麦、適当なりＮＡリガ
ーセ゛の作用により微生ＭＤＮＡ断片とベクター断片と
の組み換えＤＮＡを作成する。必要ならばアニーリング
の後、宿主微生物に導入して、生体内のＤＮＡリガーゼ
を利用して組み換えＤＮ、Ａを作成することもてきる。

上記の遺伝子操作に一般的に使用される量的関係を例示
すると、供与微生物からのＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡ
を０．１〜１１０Ａｔであるのに対し、制限酵素は約１
〜１０ｕ、リガーゼは約３００ｕ、その他の酵素は約１
−１００程度である。

酸性ウレアーゼのＤＮＡプローブとしては、酸性ウレア
ーゼのアミノ酸配列のどの部分に対してプロー７を構築
することにより、ハイブリダイゼーションが適切に行な
われるか否かが決まり、更に同一のアミノ酸をコードす
る塩基配列は、通常複数存在するため、ハイブリダイゼ
ーションのしやすい長いプローブを作成するためには、
極めて多くの種類のプローブが検討されなければならず
、好適なプローブを構築することは困難であったが、本
発明において用いた以下のプローブが好ましく使用でき
る。

宿主微生物に組み換えＤＮＡを導入する方法としては、
例えば、ファージ中に封入してファージの感染により移
入せしめるファージ法、カルシウムイオンの存在下で組
み換えＤＮＡの移入方法やコンピテントセル法またはリ
ポソーム組み換えＤＮＡのプロトプラスト宿主細胞への
電気的な融合移入法などを採用することができ、さらに
マイクロインジェクション法を用いても良い。

かくして得られた本発明の形質転換微生物を具体的に例
示すれば、エシェリヒア・コリＤＨＩ−ｐＵＲ１３（Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−３０５１）が挙げられ、本形質転換微生
物は、酸性ウレアーゼを安定的に生産することがてき好
気的に培養するのに適する。

この様にして一度選択された組み換えＤＮＡは、該組み
換えＤＮＡを保持する形質転換微生物から取り出し、他
の宿主微生物に導入することも容易に実施できる。

また、さらに、該組み換えＤＮＡから制限酵素などによ
り切断して酸性ウレアーゼ遺伝子を切出し、前記と同様
な方法により切断して得られる他の開環ベクター末端と
を結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮＡを作製
して、他の宿主微生物に移入することも容易に実施でき
る。

上記の様にして得られた形質転換微生物により酸性ウレ
アーゼを製造する：こ当っては、該形質転換微生物を栄
養培地で培養し、通常は培養液中または菌体中に酸性ウ
レアーゼを産生、蓄積せしめ、培養紡了佳、得られた培
養液または菌体中から分離、ｎ製すれば良い形質転換微
生物の培養形態はその栄養生理的性質を考慮して培養条
件を選択すれば良く通常多くの場合は、液体培養で行な
うが、工業的には深部通気撹拌培養を行なうのが有利で
ある。

培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用されうる。

炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、
例えば、グルコース、サッカロース、ラクトース、マル
トース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源
としては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物な
どが使用される。

その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カ
ルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩顛、
特定のアミノ酸、特定のビタミン類などが必要に応じて
使用される。

培養温度は微生物が発育し、酸性ウレアーゼを生産する
範囲で適宜変更し・得るが、通常は、２０〜４０°Ｃ程
度である。培養詩間は、条件によって多少異なるが、酸
性ウレアーゼが最高収量に達する時期を見計って適当な
時期に培養を終了すればよく、通常は１２〜２４時間程
度である。培地ｐＨは菌が発育し、酸性ウレアーゼを生
産する範囲で適宜変更し得るが、通常ｐＨ６〜８程度で
ある。

培養物中の酸性ウレアーゼは、菌体を含む培養液そのま
まを採取し、利用することもできるが、一般には常法に
従って、培養物中から分離、精製し、利用される。

すなわち、培養物を濾過又は遠心分離などの手段に付し
て、培養物と微生物菌体に分け、酸性ウレアーゼが培養
液中に存在する場合には、そのまま、酸性ウレアーゼが
菌体中に存在する場合は、菌体を機械的方法又はリゾチ
ームなどの酵素的方法で破壊した後、必要に応じてＥＤ
ＴＡ等のキレート剤及び／又は界面活性剤を添加して可
溶化し、水溶液として分離採取する。

この様にして得られた酸性ウレアーゼ含有溶液を、例え
ば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウムな
どの塩析処理１、あるいは親水性有機溶媒、例えば、メ
タノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法
により沈澱せしめればよい。

次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せし
めて、より低分子量の不純物を除去することができる。

また、吸着剤あるいはゲル漉過剤などによるゲル濾過、
アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により精製
し、これらの手段を用いて得られる酸性ウレアーゼ含有
溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により精製された
酸性ウレアーゼが得られる。

［発明の効果］斯くして得られた外来ＤＮＡを保持する形質転換微生物
は、栄養培地に培養されることにより多量の酸性ウレア
ーゼを安定して産生じ得る。

また、上記の形質転換体として好気性微生物を用いれば
、通常の培養装置により培養を行なうことが可能となり
、嫌気性培養に比べ、菌の増殖速度が大となるので、目
的物の生産増大につながる。

［実施例］以下、実施例で本発明の詳細な説明するが、本発明は何
らこれらによって限定されるものではない。

実施例１染色体ＤＮＡの分ｍ：ラクトバチルス・ファーメンタム　ＪＣＭ５８６９　（
ＦＥＲＭ　ＢＰ−３０５０）の染色体ＤＮＡを次の方法
で分離した。

同菌株をＭ、Ｒ，Ｓ、培地（５２ｇ／Ｉ　Ｍ、Ｒ。

Ｓ、　Ｂｒｏｔｈ　（０ＸＯＩＤ社製））５００ｍｌに
て３７℃で２日間振どう培養した。培養液を高速冷却遠
心機（トミーＣＸ−２５０型）を用い、６５００回転／
分（７６６０Ｇ）で１０分間遠心分離し、乳酸菌菌体を
集菌した。

乳酸菌体を２０ｍ１のＴＥＳ　（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　　ｐＨ８，０，５０ｍ　ＭＥＤＴＡ　　ｐＨ８，
ｏ、１５％　シュークロース）に懸濁し、最終濃度が２
　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌとなるようにリゾチーム（生化学
工業社製）を加え、３７゛Ｃで６０分間処理し、細胞壁
を破壊した。　次に、１ｍｌの１０％ＳＤＳ　（ラウリ
ル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製））を加え、更に２
１ｍ１のクロロホルム：フェノール＝１：１混合液を加
え攪拌した後１０．０００回転／分（１２０８０Ｇ）で１０分間遠心
し、分離した水層を回収した。

この水層に２倍量のエタノールを静かに加えてガラス棒
てゆっくり撹拌しながらＤＮＡをガラス棒に巻きつかせ
て分離し力。これを１０ｍ１の１０ｍＭｆ−リス塩酸（
ｐＨ８，０）、１ｍｌ　　ＥＤＴＡ溶液（以下ＴＥと略
す）で溶解した。これに等量のクロロホルム：フェノー
ル＝１＝１混合溌を加え、前記と同様の処理をした後、
水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて前記の方法
でもう１度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥに溶解した。

実施例２乳酸菌遺伝子ライブラリーの作成：実施例１で得られた乳酸菌ＤＮＡ　５μｇを５０ｍＭ　
　トリス−塩Ｍ（ｐＨ７，５＞、１００ｍＭ　ＮａＣ１
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１ｍＭ　ＤＴＴ、１０　μｇ　
／　ｍ　１の存在下、制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３
ＡＩ　（全酒造社製）３０ユニツト（Ｌｌｎｉｔｓ　）
を用い３７°Ｃ１２分間で部分切断処理した。

また、ベクターｐＵｃ１１９（全酒造社製）２μｇを制
限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（全酒造社製）１０ユ
ニツトで３７°Ｃ１２時間切断処理し、さらにアルカリ
性フォスファターゼ（以下、ＢＡＰと略す（全酒造社製
））１ユニツトを加え、６５℃、２時間で処理した。こ
れらの２種のＤＮＡ溶液を混合し、全体量と等量のクロ
ロホルム−フェノール混合液で処理し、遠心分離により
水層を分取した。

その水層に、その１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、つ
いでさらに２倍量のエタノールを加え、遠心でＤＮＡを
沈澱させた徨減圧乾燥した。このＤＮＡをＴＥにて溶解
後、６６ｍＭ　　トリス−塩Ｍ（ＰＨ７，６）、６．６
ｍＭ　ＨｇＣｌ２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、６６０μＭＡＴ
Ｐ（ペーリンガーマンハイム社製）の存在下、Ｔ４ＤＮ
Ａライゲース（全酒造社製）１００ユニツトを用い、１
６℃、１６時間ライゲーションした。

これをに、シゲサダの方法（細胞工学（１９８３）２．
　６１６−６２６）によってコンピテント細胞としたエ
シェリヒア・コリ（Ｅ、ｃ　ｏ　ｌ　ｉ　）　　ＤＨ１
（ＡＴＣＣ３３８４９；　Ｆ−。

ｒｅｃ　Ａ　１．ｅｎｄ　Ａ　Ｉ、ｇｙｒ　Ａ２Ｂ、ｔ
ｈｉ−１，ｈｓｄ　Ｒ１７（７＋ｔ−、ｍｋ＋）　、Ｓ
ｕｐ　Ｅ　４４．ｒｅｌ　Ａ　１．λ−；Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｅ
ｒ　（１９８２）　）に形質転換し、５０μｇ　／　ｍ
　１アンピシリン含有ＢＨＩ寒天培地にまき、３７℃で
一昼夜培養し、約５０００の形質転換微生物を得て乳酸
菌遺伝子ライブラリーとした。

実施例３放射性オリゴヌクレオチドプローブの作成：酸性ウレアーゼ精製標品をα、β、γサブユニットに分
けＮ末端アミノ酸配列を決定した。

（以下余白） αサブユニット！−イｅｔ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｘ
−Ｘ−Ｘ−ＰｈｅＡｌａ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ　−Ｘ　−Ａｓｐ−３ｅ
ｒ−Ｖａｔ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ βサブユニット。

Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｐｒ。

ＡＳＰ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｖ
ａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ　−ＸＡｓｐ−１１ｅ　−Ｘ　−
Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ　−γサブユニット：Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ　−Ｍｅｔ−工
１ｅ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ　−１
１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓ
ｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ
−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ　−Ｘ　−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−
Ｌｅｕ　−（式中、Ｘのアミノ酸は不明であることを示
す）この情報をもとに遺伝子の５”末端側から塩基配列
を予想した。この塩基配列には様々な可能性が存在する
。

まず、我々はγサブユニットの中の可能性の高そうなオ
リゴヌクレオチド配列を設計して実験を行った。

オリゴヌクレオチドはアール・エル・レッシンシャー等
の方法（Ｒ，Ｌ、　ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、　Ｗ、Ｂ。

Ｌｕｒｓｆｏｒｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ
　５ｏｃｉｅｔｙ　９８３６５５）に基づきＤＮＡシン
セサイザー（サイクロン（バイオサーチ社製））を用い
て作成した。

γサブユニットアミノ酸配列６残基目Ｇｌｕから１２残基目１１ｅまでに対応する１６ミツク
ス２ｏマー：Ａ　　Ａ　　Ａ　　ＡＡＴＧＡＴＧＡＴ合成りＮＡ　Ｇ
ＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧ対応アミノ酸　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ
　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　　Ｉｌｅ歿基数
　６　７　８　９　１０１１１２完成したオリゴヌクレ
オチド５０ｎｇをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　、１
０ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２．１０ｍＭ２−メルカプト
エタノール）、３７０キロベクレルの３２ｐ−ＡＴＰ　
（アマジャムジャパン社製）およびＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ８．５ユニツトで３７℃、３０分間反応せし
め、アイソトープ３２ｐを取り込ませ、放射性オリゴヌ
クレオチドプローブとした。

実施例４酸性ウレアーゼ遺伝子含有クローンのスクリーニング：前述の如くにより得た遺伝子ライブラリー即ち平板寒天
培地上のアンピシリン耐性コロニー上にナイロンメンブ
レンフィルター（マグナグラフナイロン（ミクロンセパ
レーション社製））を重ね、フィルター上に該コロニー
菌体の一部を移行させた。このフィルターをアルカリ変
性溶液（０，５Ｎ　ＮａＯＨ１１，５ＭＮａＣ１）に５
分間浸し、さらに中和液（０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　　ｐＨ７，０，３Ｍ　ＮａＣ１）に５分間浸した後乾
燥させた。このフィルターを８０″Ｃで２時間加熱し、
菌体中にあったプラスミドＤＮＡをフィルターに固定し
た。さらにこのフィルターをハイブリダイゼーション溶
液（ＮａＣ１４３，８ｇ／ｌ、クエン酸３−ナトリウム
２２．１　ｇ／ｌ、５０ｍＭリン酸３ナトリウム（ｐＨ
６，５）、ラウリル硫酸ナトリウム１ｇ／ｌ、フィコー
ル（ファルマシア社製）１ｇ／ｌ、ポリビニルピロリド
ン　Ｉｇ／ｌ、ＢＳＡ　１ｇ／ｌ、サケ精子ＤＮＡ　（
ファルマシア社製）２５０ｍｇ／ｌ、ホルムアミド０．
１１／１　’）に浸し、４２℃で１時間プレハイ７リダ
イゼーシヨンを行った。その後、フィルターを新しいハ
イブリダイゼーション溶液に浸し、先に用怠した放射性
オリゴヌクレオチドプローブを加え、４２°Ｃで一昼夜
ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーシ
ョン後、洗浄液（ＮａＣ１４，３８ｇ／ｌ、クエン酸３ナトリウム２．２１ｇ／ｌ
、ラウリル硫酸ナトリウムＩｇ／ｌ）でフィルターを３
回洗浄し、次いて、このフィルターを４５°Ｃの洗浄液
に１０分間浸し、余分なブローンを洗い落とした。

フィルターは風乾？＆Ｘ線フィルム（富士写真フィルム
社製Ｎｅｗ　ＲＸ○−Ｈ）に重ね、遮光下、−８０°Ｃ
で２４時間オートラジオグラフィー復、フィルムを現像
し、ポシテイフシグナル確認し、そのボシテイフシグナ
ルに対応するコロニーを前記平板寒天培地上の遺伝子ラ
イブラリーより採取した。

このコロニーを酸性ウレアーゼをコードするＤＮＡを含
む形質転換微生物、エシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ
）　ＤＨＩ−ｐＵＲ１３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３０５１）
と命名した。

実施例５組換えプラスミドの抽出：エシェリヒア・コリ　ＤＨ１−ｐＵＲ１３を培養し、そ
の培養菌体から、ティー・マニアティス等の方法（Ｔ、
　Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　ａｌ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｃｏｌｄ　
　ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ（１９８２）、　８６
−９４）によって酸性ウレアーゼをコードするＤＮＡを
含む１且換えプラスミドｐＵＲ１ｊを抽出した。

このプラスミド中の乳酸菌染色体歯末の部位をジデオキ
シｌ去（５ｃｉｅｎｃｅ　２１４　１２０５−１２１０
（１９８１））により塩基配列を決定し、酸性ウレアー
ゼγサブユニットをコードする全Ｄ　Ｎ　Ａが含まれて
いることを確認した。このｐＵＲ１３の制限酵素地図を
第９図に、ｐＵＲ１３から切り出された外来ＤＮＡの制
限酵素地図を第８図に示す。

おどろくべきことに、この外来ＤＮＡではγサブユニッ
トの後にβサブユニット、αす７ユニツトの順に遺伝子
がクラスタとして存在していた。

我々はα、β、γのすべての酸性ウレアーゼをコードす
る全ＤＮＡが含まれていることを確認すると共にその全
塩基配列を決定した。

この結果を第７図に示す。すでに判明している酸性ウレ
アーゼのα、β、γサブユニットのＮ末端アミノ酸配列
と本外来ＤＮＡの塩基配列により考えられるアミノ酸配
列とは完全に一致した。

これらの遺伝子情報をまとめると以下の配列表の通りで
ある。

（以下余白）Ｗ　尉副　嘔　−Ｌ　扇　瑠Ｌ）＜豐４：黒　くり（コ　　切　　　　　（り ΩΦ　ト一＜い　ロロ望じく　Ｑ実施例６ｐＵＲ１３保有大腸菌の培養と活性検出：ｐＵＲ１３保有大腸菌を５０　ｕ　ｇ　／　ｍ　１のア
ンピシリン、３．７％　ＢＨＩ、０．０５％Ｎ　ｉＳ　
Ｏａ、０．０５％ＭｎＳＯ４の培地で３７°Ｃ１−昼夜
好気的に培養した。この培養液を１５０００回転／分で
２分間遠心し、沈澱を回収した。この沈澱に培養液と同
量ｔＤ　０．０５％　Ｎ１５Ｏ，，０，０５％Ｍ　ｎ　
Ｓ　Ｏａを含む２０ｍλ（酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）を
加え、超音波破砕を行い、粗酵素液とした。　得られた
ウレアーゼの測定は以下の手順で行った。

基質溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）　、４００ｍＭウレア）１３０μｍに粗酵素液
２０μｌを加え、３７°Ｃで１時間反応させた。次にＩ
Ｎ硫酸４０μｍで反応を止め、この反応液１００μｌと
発色試薬Ａ（１％フェノール、０．００５％ニトロプル
ジェット）０．５ｍｌと発色試薬Ｂ　（０，５％ＮａＯ
Ｈ１１％アンチホルミン、５．３６％リン酸２ナトリウ
ム・１２水塩）０．５ｍｌを加え、６５℃で２０分発色
させ、室温になるまで水で冷やしてから６３０ｎｍの吸
光度を測定した。酸性ウレアーゼ遺伝を含まないｐＵｃ
１１９のみをトランスフォーメーションさせた大腿菌の
破砕液について上記と同じ操作を行い対照とした。

表に示した結果から明らかなようにｐＵＲ１３の導入に
より酸性ウレアーゼ活性の発現が確認された。

（以下余白）ウレアーゼ活性（ＯＤ　６３０βｍ　）形質転換体０．０　４　２ＵＲ１３非転換体　　　　　　ｏ、ｏ　ｏ　ｓＵｃ１１９このようにして調製された粗酵素液から以下の物性を示
す酸性ウレアーゼが得られた。

■分子量：２１０，０００±２０，０００（ＴＳＫ３０
００ＳＷを用いたゲル濾過法による）本酸性ウレアーゼのα、β、γサブユニットを５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認したところ、ａ　　：　　６２．ＯＯＯ＋６，０００β　：１４，０
００　±　１，０００ γ　：１１，０００　±　１，０００の各サブユニットの存在を確認した。

■至適ｐＨ：　約４付近（フェノール・インドフェノール法による）

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図および第３図は、それぞれ酸性ウレアー
ゼのα、βおよびγサブユニットのアミノ酸配列を示す
図面である。第４図、第５図および第６図は、それぞれ酸性ウレアー
セ゛のα、βおよびγサブユニットをコードする塩基配
列を示す図面である。第７図は、酸性ウレアーゼをコードする遺伝子の塩基配
列の一例を示す図面である。第８図は、酸性ウレアーゼをコードする遺伝子の制限酵
素地図の一例を示す図面である。第９因は、酸性ウレアーゼをコードする遺伝子を含むベ
クターの制限酵素地図を示す図面である。図図ｈｒｓｐ第図にρｎＩＣＯ１手続補正書（方式）６、補正の対象平成２年１２月２０日図面及び吏任状

Claims

【特許請求の範囲】

（１）第１図で示されるαペプチドのアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列、第２図で示されるβペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列および第３図で示されるγペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む外来性のＤＮＡを有するベクターを導入することにより形質転換せしめた形質転換微生物を培養して該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培養物から酸性ウレアーゼを採取することを特徴とする酸性ウレアーゼの製造法。
（２）第１図で示されるαペプチドのアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列、第２図で示されるβペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列および第３図で示されるγペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、それぞれ第４図で示される塩基配列、第５図で示
される塩基配列および第６図で示される塩基配列である請求項第１項記載の製造法。
（３）酸性ウレアーゼをコードするＤＮＡを含む約２．
４ｋｂｐの塩基配列であつて、少なくともＨｈａｌの制限酵素サイトを２つ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトを各々１つ有し、制限酵素ＨｈａＩ消化断片が約２．０Ｋｂｐの大きさとなる塩基配列を含む外来性のＤＮＡを有するベクターを導入することにより形質転換せしめた形質転換微生物を培養して該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培養物から酸性ウレアーゼを採取することを特徴とする酸性ウレアーゼの製造法。
（４）酸性ウレアーゼをコードするＤＮＡを含む約２．４ｋｂｐの塩基配列であって、少なくとも
ＨｈａＩの制限酵素サイトを２つ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトを各々１つ有し、制限酵素ＨｈａＩ消化断片が約２．０Ｋｂｐの大きさとなる塩基配列を含む外来性のＤＮＡが、第７図で示
される塩基配列である請求項第３項記載の製造法。
（５）形質転換微生物が、好気性微生物である請求項第
１項又は第３項記載の製造法。
（６）形質転換微生物が、エシェリヒア属に属する微生
物である請求項第１項、第３項又は第５項記載の製造法。
（７）形質転換微生物が、エシェリヒア・コリＤＨ１−
ｐＵＲ１３［微工研条寄第３０５１（ＦＥＲＭＢＰ−３０５１）］である請求項第１項、第３項、第５項または第６項記載の製造法。
（８）少なくともＮ末端側より第１図で表わされる酸性
ウレアーゼのαペプチドのアミノ酸配列をコードする実質的に純粋化されたαペプチドのＤＮＡ。
（９）ＤＮＡが５′末端側より第４図で表される請求項
第８項記載のαペプチドのＤＮＡ。
（１０）少なくともＮ末端側より第２図で表される酸性
ウレアーゼのβペプチドのアミノ酸配列をコードする実質的に純粋化されたβペプチドのＤＮＡ。
（１１）ＤＮＡが５′末端側より第５図で表される請求
項第１０項記載のβペプチドのＤＮＡ。
（１２）少なくともＮ末端側より第３図で表される酸性
ウレアーゼのγペプチドのアミノ酸配列をコードする実質的に純粋化されたγペプチドのＤＮＡ。
（１３）ＤＮＡが５′末端側より第６図で表される請求
項第１２項記載のγペプチドのＤＮＡ。
（１４）酸性ウレアーゼをコードするＤＮＡを含む約２
．４ｋｂｐの塩基配列であって、少なくともＨｈａＩの
制限酵素サイトを２つ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトを各々１つ有し、制限酵素ＨｈａＩ消化断片が約２．０Ｋｂｐの大きさとなる塩基配列を含む実質的に純粋化された酸性ウレアーゼのＤＮＡ。
（１５）ＤＮＡが第７図で表される請求項第１１項記載
のγペプチドのＤＮＡ。
（１６）第１図で示されるαペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列、第２図で示されるβペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列および第３図で示される γペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む外来性のＤＮＡを有するベクターを導入することにより形質転換せしめた実質的に純粋化された形質転換微生物。
（１７）第１図で示されるαペプチドのアミノ酸配列を
コードする塩基配列、第２図で示されるβペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列および第３図で示されるγ ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、それぞれ第４図で示される塩基配列、第５図で示される塩基配列および第６図で示される塩基配列である請求項第１６項記載の形質転換微生物。
（１８）酸性ウレアーゼをコードするＤＮＡを含む約２
．４ｋｂｐの塩基配列であって、少なくともＨｈａＩの
制限酵素サイトを２つ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトを各々１つ有し、制限酵素ＨｈａＩ消化断片が約２．０Ｋｂｐの大きさとなる塩基配列を含む外来性のＤＮＡを有するベクターを導入することにより形質転換せしめた実質的に純粋化された形質転換微生物。
（１９）酸性ウレアーゼをコードするＤＮＡを含む約２
．４ｋｂｐの塩基配列であって、少なくともＨｈａＩの
制限酵素サイトを２つ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトを各々１つ有し、制限酵素ＨｈａＩ消化断片が約２．０Ｋｂｐの大きさとなる塩基配列を含む外来性のＤＮＡが、第７図で示
される塩基配列である請求項第１８項記載の形質転換微生物。
（２０）形質転換微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である請求項第１６項または第１８項記載の形質転換微生物。
（２１）形質転換微生物が、エシェリヒアコリＤＨ１−ｐＵＲ１３［微工研条寄第３０５１（ＦＥＲＭＢＰ−３０５１）］である請求項第１６項または第１８項記載の形質転換微生物。