JPH0399098A

JPH0399098A - エイズを検出するために使用するペプチド

Info

Publication number: JPH0399098A
Application number: JP23800589A
Authority: JP
Inventors: Koji Ushijima; 廣治牛島; Kenji Okuda; 研爾奥田; Naoyuki Taniguchi; 直之谷口
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1989-09-13
Filing date: 1989-09-13
Publication date: 1991-04-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、エイズを検出するために使用するベブチド、
更に詳しくは新規ペプチド、該ベプチドを含むエイズ検
出試薬及び該ベブチドを使用するエイズ検出方法に関す
るものである．（従来の技術）近年、後天性免疫不全候群（エイズ：　ＡＩＤＳ）思者
が多〈の国で確認されている．そして，エイズの撲滅の
ために、その治療手段とともに早期発明のための検出手
段の確立が望まれている．エイズの検出手段としてエイズ患者の体液例えば血液中
のエイズ特有させ、次いで被検液を検出する方法が提案
されている．例えば特開昭６２−１２７９９号公報、同
６２−６１９９６号公報，同６２−２７７４００号公報
、特表昭６２−５００５９２号公報には、各々特定の構
造のペプチドを使用して血液中のエイズ特有させ、次い
で被検液を分離し、定量する方法が開示されている．（
発明が解決しようとする課題）上記に例示した如く、従来種々エイズの検出方法が提案
されているが，未だ決定的な方法はない．それ故、多数
の検出方法を併用して検出精度を向Ｌさせ、総合的にエ
イズ感染の有無を判断しているのが実状である．したが
って、新規なエイズ検出方法に対する大きな要望がある
．本発明は上記要望に答えるべく威されたものであり、そ
の目的とするところは簡便迅速且つ高精度なエイズ検出
手段を提供することにある．（課題を解決するための手段）本発明者らは、鋭意研究の結果、新規なベブチドがエイ
ズ特有させ、次いで被検液と選択的に結合することを見
出し，本発明を完或するに至った．本発明のペプチドは
次式（Ｉ）ないし（［Ｉ）Ｔｙｒ−＾『κ一人『【−＾
ｓｎ一人ｒｌ−ｋｒｇ−ｋｒｇ−ｋｒｇ−Ｔｒｐ一人ｔ
４−Ｇｌｕ−＾ｒｌ〔上記式（１）ないし（ＩＩＩ）中
，　Ａｌａはアラニンを表わし、Ａｒｇはアルギニンを
表わし、Ａｇｎはアスパラギンを表わし、Ａｓｐはアル
ギニンを表わし、Ｃｙｓはシスチンを表わし、Ａｓｐは
アスパラギン酸を表わし、Ｃｙｓはシスチンを表わし、
Ｇ１ｙはグリシンを表゛わし．　ｒｌｅはグルタミン酸
を表わし、Ｇｌｙはグリシンを表わし，Ｉｌｅはイソロ
イシンを表わし、　Ｌｅｕはセリンを表わし、Ｔｈｒは
トレ才ニンを表わし、Ｔｒｐはトリブトファンを表わし
、Ｔｙｒはチロシンを表わし，Ｖａｌ　はバリンを表わ
し、Ｔｙｒはチロシンを特徴とする．本発明のペプチドは合或によって天然の蛋白質の一部を
取り出すことにより得てもよい．更に上記二つの方法を
組合せて用いることにより得てもよい．合或法によって
本発明のべブチドを得る場合には、例えば市販のべブチ
ド合成装置を使用することができる．式（Ｉ）ないし（ＩＩＩ）で表わされるベプチド（通常
はいずれか一種）と適する助剤，例えば緩衝剤、安定剤
、稀釈剤、賦形剤等とを適する比率で混合して未発明の
エイズ検出試薬を｛りることかできる．本発明のエイズ
検出試薬の形態は特に限定されず，例えば液体又は固体
（例えば粉末、顆粒、ペレット，カプセル等）であって
よい．エイズを検出するためには、本発明のべブチドを表面に
担持させた固体支持体と被検液とを接触させて，被検液
中のエイズウイルスに起因する抗体をペプチドと結合さ
せ、次いで被検液を除去した後固体支持体を洗浄して未
結合させ、次いで被検液を除去し，更に固体支持体をエ
イズウイルスに起因する抗体を選択的に検出できる試薬
で処理する．本発明のべブチドを固体支持体の表面に担持させるには
、本発明のエイズ検出試薬を使用して固体支持体の表面
を処理すると都合がよい．固体支持体はポリスチレン、
ボリプロビレン等の慣用のものを使用できる．又、未結
合させ、次いで被検液を除去するための固体支持体の洗
浄にも、慣用の洗浄液を使用してよい．被検液はエイズ
患者の体液例えば血液や血清を用い得る．エイズウイルスに起因する抗体を選択的に検出できる試
薬としては，例えば抗ヒ｝　ＩｇＧが挙げられる．例え
ば抗ヒ｝ＩｇＧと所定条件下で反応させた後は、比色法
などの慣用の方法を用いて測定する．（作　用）被検液中のエイズウイルスに起因する抗体は、木発明の
べブチドと選択的に反応するので、その一部を固体支持
体上に単離することができ、これを測定することにより
、エイズ感染の有無を確認することができる．（実施例）以下の実施例において本発明を更に詳細に説明する．な
お，本発明は下記実施例に限定されるものではない．％
は重量％を示す． ■．ベプチド合戒各ペプチドの合威には、アプライド、バイオシステム社
製ベプチドシンセサイザー４３０Ａを使用した．合戊方
法は，ｔ−Ｂｏｃ法を用いた．又、反応に必要な試薬は
、同社の専用品として市販されているベプチド・シンセ
サイザー専用カートリッジに充填されているものを使用
した．このｔ−Ｂｏｃ法は、中程度のペプチド鎖を合戊
する方法としては、ごく一般的な方法で、数多〈の文献
が発表されている．その概要は、以下の通りである．目的とするペブチド鎖のＣ末端側のアミノ酸のカルボキ
シル基を架橋剤を介してボリスチレン樹脂（レンジ）に
結合させて固相化し、ベブチドの１次構造に従って順次
Ｎ未満へアミノ酸を結合させ、ペプチド鎖を延長する．
その際、各アミノ酸の７ミノ基は、第三一ブトキシー力
ルボニル基（ｔ−Ｂｏｃ）で保護しておき、ペブチド結
合を行ラアミノ基のみに各段階ごとにトリフルオロ酢酸
で脱保護基反応を行う．この保護基を取り除いたアミノ
基への反応は、予めジシクロへキシル力ルポジイミドに
よる無水物法やｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾールによ
る活性エステル法により活性化しておいたカルポキシル
基と反応させ、ペプチド結合を生或させることにより行
う．各段階での反応収率は、反応の終わったベプチドを一部
取り出し、ニンヒドリン呈色反応による遊敲アミノ酸は
、側鎖の変或を避けるため，ベブチド合成化学の分野の
文献ならびに参考書に記載されている一般的方法、例え
ば，ベンジル基、ベンジルオキシ基、Ｐ−メトキシベン
ジル基、ｐ−メトキシベンゾスルホニル基、による側鎖
の保護を行ったものを使用した．合戊の終わったエブチ
ドは、フッ化水．素で処理することでレジンから切り離
す．この際、側鎖の保護に用いられた保護基の大半は、
脱Ｌする．生戊物は，イオン交換クロマトグラフィー逆相クロマト
グラフィー等で精製する．合戊したべブチドを高速液体
クロマトグラフィーで分離し、その溶出パターン（クロ
マトグラム）よりペプチドが単品であることを確認した
後、電気泳動法により分子量を測定し、目的物の確認と
した．上記方法で合威したペプチドを以下に示す．■　ベプチ
ド（１）Ｏｆｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉ１ｃ−Ｃｙｓ■　ペプチド
（ＴＩ）Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｈｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ＝”
ｙｒｇ−Ａｒ　ｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−｛ｉ１ｕ−ｌ〜ｒ
ｇ ■ ■　ペプチド（ｍ）Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−（ｊｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−　　（１）Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｕ−Ａｒｇフッ化水素
によるレジンからの切り出し前の時点での収率は， ■　５３．３％　　（各段階平均　９７．３％）■　７
ｆｔ．５％　　（各段階平均　９７．５＄）■　８１７
％　　（各段階平均９７．目）であった．ベブチドの樹脂からの脱離と脱保護基反応は，以下の操
作で行った．【ベプチド（工）１合戊ノ終わったレジンをシンセサイザーの合或容器から
取り出し，アスビレーターで減圧乾燥する．充分に乾燥
したレジン１．２ｇをテフロン製反応容器へ入れる．更
に、反応容器ヘア二ノー／Ｌ／　１．９２ｍ　ｌ　（　
Ｌ．Ｓ　ｍ　ｌ　／　ＩＨｚジン），チオクレゾール０
．８６　ｍ文（０．８　ｍ　ｌ　／　Ｉｇｔｚジン）を
加える．反応容器をドライアイス／メタノールで冷却し
、液体フッ化水素１２ｍ　ｌ　（　１０ｍ　ｌ　／Ｉｇ
レジン）を加える．８合物をマグネチックスターラーで
攪拌しながら，θ℃で１時間反応させる。反応後、反応
容器を室温に戻し５減ｆＥ下で、フッ化水素を完全に除
去し乾燥させる．レジンをフィルター上に移し、エーテ
ル５０ｍＪｌとジクロロメタン５０ｍ文で交互に３回洗
浄する。

洗浄の終わったレジンを乾燥させた後，５ｏｚ酢酸１０
ｍ文で３回抽出する．抽出液を凍結乾燥し，粗ペプチドを５０ｍｇ得た．［ペブチド（ＴＩ）１合戊の終わったレジンをシンセサイザーの合或容器から
取り出し、アスビレーターで減圧乾燥する．充分に乾燥
したレジン１．５ｇをテフロン製反応容器へ入れる．更
に、反応容器へアニソール２．４　ｍｌ　（１．６　ｍ
！２．／Ｉｇレジン）、チオクレゾール１．２ｍ文（０
．８　ｍ文／Ｉｇレジン）を加える．反応容器をドライ
アイス／メタノールで冷却し、液体フー，化水素Ｌ５ｍ
文（１０ｍ文／Ｉｇレジン）を加える．混合物をマグネ
チックスターラーで攪拌しながら、０℃で１時間反応さ
せる．反応後、反応容器を室温に戻し、減圧下で、フッ
化水素を完全に除去し乾燥させる．レジンをフィルター
上に移し、エーテル５０ｍ文とジグロロメタン５０ｍｉ
で交互に３回洗浄する．洗浄の終わったレジンを乾燥させた後、５０ｍ酢酸！Ｏ
ｍＪＬで３回抽出する．抽出液を凍結乾燥し，粗ベブチドを　１２０　ｍｇ得た
．［ペブチド（ＩＩＩ）］合或の終わったレジンをシンセサイザーの合或容器から
取り出し、アスビレーターで減圧乾燥する．充分に乾燥
したレジン１，４ｇをテフロン製反応容器へ入れる．更
に、反応容器ヘアニンール２．２４ｍ文（１．６　ｍ文
／Ｉｇレジン）、チオクレゾールｉ．　＋２ａｘＱ　（
０．８　ｍｕ／Ｉｇレジン）を加える．反応容器をドラ
イアイス／メタノールで冷却１，、液体フッ化水素１４
ｍ文（１０ｍ交／′１ｇレジン）を加える．混合物をマ
グネチックスターラーで纜拌しながら，０℃で１時間反
応させる．反応後、反応容器を室温に戻し、減圧下で，
フッ化水素を完全に除去し乾燥させる．レジンをフィル
ター上に移し、エーテル５０ｍ文とジクロロメタン５０
ｍ文で交亙に３回洗浄する．洗浄の終わったレジンを乾燥させた後、５０１酢酸Ｉｏ
ｍ見で３回抽出する．抽出液を凍結乾燥し、粗ペプチドを　１０５　ｒａｇ得
た．ＩＩ　．評価試験健常者１９例，関節リュウマチ患者１０例、ＰＡ法及び
ＷＢ法でのＨ　Ｉ　Ｖ　（ヒト免疫不全症ウイルス）抗
体陽性者２９例の血清を試料とした．抗体価測定には、
ドットプロット法を使用した．ドー，トプロット法（Ｄ
Ｂ法）は合成ベブチドをニトロセルロース膜に５ｇｇｌ
ｒｎ見吸着させた後、被検体血清（１００倍穐釈）を加
え４℃にて一晩反応させた後、抗ヒ｝　ＩｇＧビオチン
ーアヒジンーアルカリフォスフγターゼ試薬を用いて行
った。

ＥＬＩＳＡ法は以下の如く行った．まず９６六マイクロ
タイタープレート（ボリスチレン製）に、　０．０５Ｍ
重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）でＴＡ製した２　ｇ　ｇ　
／　ｍ文の濃度のそれぞれの合成ペプチド溶液１００県
文を加え，４℃で一晩吸着させたプレートを３回洗浄し
た＠０．５％マリーム加０．１％　Ｔｖｅｅｎ２０　−
　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（　ｐ　Ｈ　７．４　）２００川文を加
え、室温で１時間、ボストコートシた．次いでプレート
を洗浄液２００ｋｌにて３回洗浄し、抗原固相化プレー
トを作戊した．次いで、抗原固相化マイクロプレートの
各ウエルに、０．１％カゼイン、０．１％ゼラチンＰＢ
Ｓ（稀釈液）で１００倍に稀釈した血清サンプル　１０
０　ｐ文を加え，３７℃で１．５時間反応させた後、洗
沙液で３回洗浄した．稀釈液にて１０００倍に稀釈した
市販の抗ヒトｌｇＧ−ＨＲＰコンジュゲー｝　　１００
ｐ文を加え、３７℃で１時間反応させた．洗浄液にて３
回洗浄したのち，　　０．０５Ｍクエン酸緩衝液（　Ｐ
　Ｈ５．０　）　テ０．３ｍ　ｇ／　ｍ　１の濃度に調
製したＡＢＴＳ基質液１５０ル交を加え、室温で２０分
間反応させたのち、反応停止液　５０川文を加え、　４
１０ｎｍで各ウエルの吸光度を測定した．カット才フ値は、正常ヒト血清を稀釈液で１００倍に稀
釈し、そのｔｏｏｇ文を使用して同様に測定した平均吸
光度値の２倍とした．又、血清の稀釈曲線を作製し、カ
ットオフ値に達したときの血清積釈率の逆数をもって抗
体価とした．以ドに評価試験の結果を示す． ■　健常者、関節リュウマチ患者，ＨＩＶ抗体陽性者に
ついて，ドットプロット法で測定した結果を第１表に示
す．健常者はＤＢ法で陰性を示し，関節リュウマチ患者
はＤＢ法及びＷＢ法で陰性を示した．ＦＡ法及びＷＢ法
でのＨＩＶ抗体陽性者血清２９例のうちベプチド（Ｉ）
を使用したＤＢ法では全例陽性、ペブチド（ｍ）を使用
したＤＢ法では２６例が陽性であった．方　　法ＤＢ法ベプチド（１）ベブチドＯＷＩＪ法Ｉ’Ａ法第ｌ表　抗ＨＩＶ抗体の測定健常者　　関節リュウ　　ＨＴＶ抗体マチ患者　　　陽性者（　ｎ　＝　ｔｏ）　　　（　ｎ　＝　１０）　　　（
　ｎ　＝　２９）０（ＯＸ）　　　　Ｏ（０：）　　　
２１３（１００％０（ＯＸ）　　　　Ｏ（ＯＸ）　　　
２８（８９．ｅ測定せず　　０（ＯＸ）　　２９（１０
０２０（０％）　測定せず　　２９（１００％■　ベブ
チド（１）に対する抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定した結
果を第１図に示す．ＨＩＶ抗体陽性者で一例では抗体価
４００倍と低いが、その他は１６００−　　２５１３０
０倍に抗体価の分布を認めた．しかし、健常者や関節リ
ュウマチ患者では　１００倍以下であった・ ■　ペブチド（　ＩＩ　）に対する抗体価をＥＬＩＳＡ
法で測定した結果を第２図に示す。抗体価３２００倍を
中心に４００　−　２５８００倍に分布が認められたが
、健常者や関節リュウマチ恵名には認められなかった。

■　ベブチド（ｍ）に対する抗体価をＥＬ　ＩＳＡ法で
測定した結果を第３図に示す．抗体価は１２８００倍を
中心に１６００　−１０２４００倍に分布が認められた
が、健常者や関節リュウマチ患者には認められなかった
．ヌ，ペブチド（　ＩＩ　）に対する抗体価に比較して
ベプチド（ＩＩＩ）に対する抗体価が高い傾向がみられ
た．（発明の効果）上述の如く、本発明のベプチド（Ｉ）なｌ／１シＣＩＩ
Ｉ）は合戒が容易であり、又、血清などの被検液中のエ
イズウイルスに起因する抗体と選択的に反応するので、
ベプチド（Ｉ）ないし（ｍ）を使用してエイズ感染の有
無を簡便迅速に確認することができる．又、本発明のエイズ検出試薬は形態が特に限定されない
ので使用の態様に応じて種々の変形が可能であり、適用
範囲が広い．四に、本発明のエイズ検出方法は従来の設備や操作手法
を利用し得るものであり、容易に実施例することができ
、従来の種々のエイズ検出フｊ法と併用することにより
、エイズ感染の有無の判断情度をより高めることができ
る．

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第３図はペブチド（Ｉ）ないし（ｍ）を使
用してＥＬＩＳＡ法によって測定した抗体価を示す図で
ある．

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次式（ I ）ないし（III）：【遺伝子配列があります】（ I ）【遺伝子配列があります】（II）【遺伝子配列があります】（III）〔上記式（ I ）ないし（III）中、Ａｌａはアラニンを
表わし、Ａｒｇはアルギニンを表わし、Ａｓｎはアスパ
ラギンを表わし、Ａｓｐはアスパラギン酸を表わし、Ｃ
ｙｓはシスチンを表わし、Ｇｌｎはグルタミンを表わし
、Ｇｌｕはグルタミン酸を表わし、Ｇｌｙはグリシンを
表わし、Ｉｌｅはイソロイシンを表わし、Ｌｅｕはロイ
シンを表わし、Ｌｙｓはリジンを表わし、Ｓｅｒはセリ
ンを表わし、Ｔｈｒはトレオニンを表わし、Ｔｒｐはト
リプトファンを表わし、Ｔｙｒはチロシンを表わし、Ｖ
ａｌはバリンを表わす〕で表わされることを特徴とする
ペプチド。
（２）請求項１記載のペプチドを含むことを特徴とする
エイズ検出試薬。
（３）請求項１記載のペプチドを表面に担持させた固体
支持体と被検液とを接触させて、被検液中のエイズウィ
ルスに起因する抗体をペプチドと結合させ、次いで被検
液を除去した後固体支持体を洗浄して未結合の抗体を除
去し、更に固体支持体をエイズウィルスに起因する抗体
を選択的に検出できる試薬で処理することを特徴とする
エイズ検出方法。