JPH0379991B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はマンノ糖を含有する糖質の新規製造法
に関し、更に詳しくいえば新規β−マンナナーゼ
および/またはβ−マンノシダーゼを、β−1,
4−D−マンノピラノシド結合を有する糖類基質
に作用させることを特徴とするマンノ糖含有糖質
の製造法に関するものである。
従来の技術
β−マンナナーゼは分子内にβ−1,4−D−
マンノピラノシド結合を持つホモおよびヘテロの
β−D−マンナンであるマンナン、グルコマンナ
ン、ガラクトマンナン、ガラクトグルコマンナン
などの主要骨格であるβ−1,4−D−マンノピ
ラノシド結合を任意に加水分解し、粘性を低下せ
しめると同時に一連のマンノオリゴ糖を生成する
酵素であり、非常に多くの微生物や植物がこの酵
素を生産することが知られている〔アドバンスズ
イン カルボハイドレート ケミストリー&バイ
オケミストリー(Advances in Carbohydrate
Chemistry and Biochemistry)、1976、32、299
−316〕。
また、β−マンノシダーゼは、分子内にβ−マ
ンノシド結合を有する低分子のβ−D−マンナン
(マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、
ガラクトグルコマンナン)に作用し、非還元末端
部位から順次マンノシド結合を加水分解し、マン
ノースを生成する酵素であり、上記のβ−マンナ
ナーゼと同様に、広範囲の植物並びに微生物がこ
の酵素の産生能を有していることが知られている
〔バイオシミカ エ バイオフイジカ アクタ
(Biochim.Biophys.Acta)、1978、522、521−
530;特開昭51−38486号〕。
これらβ−マンナナーゼおよび/またはβ−マ
ンノシダーゼによつて加水分解され、有用な糖類
を与える天然物は、セルロースと共に天然界に多
量に存在するものとして知られるβ−マンナン、
例えばグルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラ
クトグルコマンナンなどである。
まず、β−1,4−D−マンナンを含むものと
して、アイボリーナツツ(学名:フイテレフア
ス・マクロカルパ)やコロゾがよく知られてい
る。その他β−1,4−マンナン含有植物として
はヤシ科のフオエニクス・カナリエンシス、オー
キス・マキユラタなどが知られている。
ガラクトマンナンはイナゴマメ及びグアーの種
子に含まれる各々の粘質物、ローカスビーンガム
及びグアーガムが代表的なものであり、この二種
のガラクトマンナンは、そのままあるいは化学的
な改質をほどこした後、工業的に広く使用されて
いる。また、ガラクトマンナンは大豆、コーヒー
豆、ムラサキウマゴヤシ、アカツメクサ、コロハ
などマメ科の植物にも多く含まれている。その他
のガラクトマンナン含有植物としてはゲニスタ・
スコパリア、グレデイツシヤ・フエロクス、レウ
カエナ・グラウカなどが知られている。
グルコマンナン含有物としてはコンニヤク(学
名:アモルフオフアラス・コンニヤク)が最も有
名であるが、サトイモ科のアルム根、マツ属のジ
ヤツクパイン、ラン科の球根、エゾマツやハリモ
ミなどのトウヒ属の植物などが知られている。そ
の他のグルコマンナン含有植物としては、アスパ
ラガス・オフイシナリス、エレムラス・フスカ
ス、エレムラス・レゲリー、エレムラス・スペク
タビリス、フアセオラス・アウレウスなどが知ら
れている。これらは、一般にアルカリ抽出法など
により得られている。また、これらβ−D−マン
ナンは糊料あるいは増粘剤として、食品工業や繊
維産業で工業的に大量に消費されているものであ
る。これら糖質の中で、特にマンノースはモリブ
デンなどの金属触媒を用い、高温で反応させるこ
とによりグルコースから20%前後の収率で得られ
ていた(特公昭56−40700)。しかしながら、この
方法では上記の如くマンノースの精製操作など多
数の工程を必要とし、経済的には不利なものであ
つたため、マンノースの価格も必然的に高いもの
となつていた。
一方、これらβ−D−マンナンを任意に加水分
解する酵素として知られているβ−マンナナーゼ
は、従来から多数の研究者の研究対象とされてお
り、非常に多くの微生物由来のものが検討されて
きた。特に、糸状菌〔アクタ ケミカ スカンジ
ナビカ(Acta.Chem.Scand.)、1968、22、1924;
農化、1969、43、317;バイオケミカル ジヤー
ナル(Biochem.J.)、1984、219、857〕、放線菌
〔アグリカルチユラル アンド バイオロジカル
ケミストリー(Agric.Biol.Chem.)、1984、48、
2189〕、細菌〔ジヤーナル オブ バイオケミス
トリー(J.Biochem.)、1982、91、1181;特開昭
57−65182号〕などの酵素が良く研究されている。
しかしながら、これらの酵素はいずれも温度安
定性に劣る場合や、培養に長時間必要なものが多
く、該酵素を工業的に安価に使用する場合に難点
を残していた。
更に、従来、これらβ−D−マンナンの非還元
末端からマンノース単位で加水分解する酵素とし
て知られているβ−マンノシダーゼは、動物〔バ
イオケミストリー(Biochemistry)、1972、11、
1493〜1501:バイオシミカ エ バイオフイジカ
アクタ(Biochim.Biophys.Acta)、1973、315、
123〜127〕、植物〔ジヤーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー(J.Biol.Chem.)、1964、
239、990〜992〕、微生物〔バイオシミカ エ バ
イオフイジカ アクタ(Biochim.Biophyys.
Acta)、1978、522、521〜530:特開昭51−38486
号)〕などの酵素が良く研究されている。
しかしながら、同様にこれらの酵素はいずれも
生産性が低く、培養法・精製法が煩雑なものが多
く、該酵素を工業的に安価に使用する場合に問題
を残していた。
発明が解決しようとする問題点
天然界に再生可能な資源として大量に存在する
β−D−マンナンの有効利用、特に該物質の酵素
的加水分解によるマンノオリゴ糖やマンノース、
グルコース、ガラクトースなどの糖類を効率良く
回収利用するためには耐熱性に優れ、かつβ−マ
ンナンの各種植物からの抽出操作が主にアルカリ
性で行われていることから、中和操作を簡略化
し、かつ分解工程を単純化するためにも、アルカ
リ側に酵素反応の至適PHを有することが好まし
い。
さらに、高温度下で酵素反応を行うことにより
腐敗を防止したり、酵素反応速度を増大し、生成
物の量産性を高めるなどが期待できることから、
至適温度も高温であることが望ましい。
しかしながら、既に述べたように、従来のβ−
マンナナーゼ並びにβ−マンノシダーゼはいずれ
も温度安定性の点で不十分であつたり、該酵素の
生成のためには長い培養時間が必要である等の欠
点を有しており、従つてこれら酵素を工業的規模
で、β−D−マンナンの加水分解生成物を得るた
めに利用することは困難であるか、コストの点で
不満であつた。
そこで、本発明の目的は上記のような酵素反
応、特にマンノ糖含有糖質の生成反応における各
種要件を満足し、β−D−マンナンの加水分解
を、経済的かつ工業的規模で実施することを可能
とする新規なβ−マンナナーゼおよびβ−マンノ
ダーゼを使用したマンノ糖含有糖質の製造法を提
供することにある。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、工業的に使用するためのβ−マ
ンナナーゼが具備すべきこれらの諸性質を有する
酵素を生産する能力を持つ微生物を得るべく広く
天然界を検索した結果、アルカリ性に生育の至適
PHを有し、バチルス属に属するいくつかの細菌が
上記要件を備えた酵素を産生し、またこれを量産
性良く産生することを見出し、本発明を完成した
ものである。
即ち、本発明は、新規なβ−マンナナーゼおよ
び/またはβ−マンノシダーゼを、β−1、4−
マンノピラノシド結合を主骨格とする糖類基質に
作用させることを特徴とするマンノ糖含有糖質の
製法を提供するものであり、これ等の酵素は各々
以下のような理化学的諸特性を有している。
() β−マンナナーゼ:
(イ) 作用:
マンナン、グルコマンナン、ガラクトマン
ナン、ガラクトグルコマンナンのβ−1,4
−D−マンノピラノシド結合を非特異的に加
水分解し、マンノオリゴ糖を生成する。
(ロ) 基質特異性:
β−マンナンに特異的に作用し、α−マン
ナンに作用しない。β−1,4−D−マンノ
テトラオース以上の分子量をもつマンノオリ
ゴ糖に作用し、これを加水分解する。
(ハ) 至適PHおよび安定PH範囲:
至適PHは8〜10であり、60℃、30分間の加
熱条件下ではPH6〜10の範囲内で安定であ
る。
(ニ) 温度に対する安定性:
PH8.0、30分間の加熱条件下では65℃まで
安定である。
(ホ) 作用適温の範囲:
65℃近傍に至適作用温度を有する。
(ヘ) 失活条件:
60℃、30分間の処理条件ではPH5.0および
12.5で完全に失活する。また、PH8.0、30分
間の処理では、80℃に完全に失活する。
(ト) 阻害および活性化:
塩化第二水銀、硝酸銀、エチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム(EDTANa2)、尿素、
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシル
ベンゼンスルフオン酸ナトリウム(DBS)
により阻害を受ける。
(チ) クロマトフオーカシング法による等電点:
5.0〜5.4
(リ) ゲルろ過法による分子量:
37000〜57000
() β−マンノシダーゼ
(イ) 作用:
非還元末端から順次β−マンノシド結合を
加水分解し、マンノースを生成する。
(ロ) 基質特異性:
β−メチル(エチル)−D−マンノシドを
完全に分解し、またβ−結合のマンノースを
含むオリゴ糖に作用し、マンノースを遊離す
る。p−ニトロフエニル−グリコシドのβ−
D−マンノシドを基質となし得るが、α−D
−マンノシド、α−D−グルコシド、β−D
−グルコシド、α−D−ガルクトシド、β−
D−ガラクトシド、β−D−キシロシド、α
−L−フコシド、β−D−グルクロニドを基
質となし得ない。
(ハ) 至適PHおよび安定PH範囲:
至適PHは6〜7であり、40℃、30分間の加
熱条件下ではPH6〜9の範囲内で安定であ
る。
(ニ) 温度に対する安定性:
PH6.5、30分間の加熱条件下では45℃まで
安定である。
(ホ) 作用適温の範囲:
50℃近傍に至適作用温度を有する。
(ヘ) 失活条件:
40℃、30分間の処理条件下ではPH5.0およ
び10で完全に失活する。また、PH6.5、30分
の処理では、55℃で完全に失活する。
(ト) ゲル濾過法による分子量:
63000〜68000
本発明の方法において使用する新規β−マンナ
ナーゼ産生菌株および新規β−マンノシダーゼ産
生菌株は本発明者等により新たに天然界から検
索・単離されたものである。これらの菌株をバー
ジエーズ マニユアル オブ デターミナテイブ
バクテリオロジー(Bergey′s Mannual of
Determinative Bacteriology)、第8版および
ザ・ジーナス・バチルス〔The Genus Bacillus、
米国、デパートメント オブ アグリカルチヤー
(Dept.of Agricalture)版〕に従つて同定とする
と、いずれも好気性有胞子桿菌であり、運動性が
あり、周ベン毛を有し、グラム染色陽性もしくは
バリアブル、カタラーゼテスト陽性であることか
ら、バチルス(Bacillus)属に属することは明ら
かであつたが、PH7.5〜11.5のアルカリ性で良く
生育することから、既知のバチルス属菌とは分類
学上異なる新菌株と考えた。
以下の第1表〜第3表に各々単離した二種の菌
体外β−マンナナーゼ生産菌株、二種の菌体内β
−マンノシダーゼ生産菌株並びに一種のβ−マン
ノシダーゼおよびβ−マンナナーゼ生産菌株の菌
学的諸性質を示す。
【表】
【表】
+:生育する又は陽性
−:生育しない又は陰性
【表】
【表】
+:生育する又は陽性
−:生育しない又は陰性
【表】
【表】
+:生育する又は陽性
−:生育しない又は陰性
尚、上記菌は工業技術院微生物工業技術研究所
に、夫々FERM P−8857(AM−024)、FERM
P−8858(AM−044)、FERM P−8859(AS−
420)、FERM P−8860(AS−440)および
FERM P−8856(AM−001)として寄託してい
る。
本発明の方法において有用な新規菌体外β−マ
ンナナーゼ等の製造法につき更に詳しく説明す
る。上記のような例えば菌体外β−マンナナーゼ
生産菌を適当な培地に接種し、菌体の生育温度の
観点から30〜45℃にて、48〜72時間、好気的に培
養するが、培地は炭素源、窒素源の他、必要に応
じて無機塩、微量栄養素等を含むものである。
まず、炭素源としては従来公知の各種材料を使
用することができ、例えばやし油抽出残渣、コン
ニヤク粉、ローカストビーンガム、キヤロブガ
ム、グアーガム、赤松ヘミセルロース、あるいは
いなご豆粉末などβ−マンナンを含有する植物な
どがいずれも使用できる。
また、窒素源としても特に制限はなく、酵母エ
キス、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリ
カー、アミノ酸液、大豆粕などの有機態窒素、あ
るいは硫安、尿素、硝酸アンモニウム、塩化アン
モニウムなどの無機態窒素などが安価かつ入手容
易なものとして例示できる。
尚、有機態窒素源は炭素源ともなることはいう
までもない。更に、このような炭素源、窒素源の
他、一般に使用されている各種の塩、例えばマグ
ネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無
機塩、ビタミンなどを添加することも可能であ
る。
本発明の方法において使用するのに適した微生
物の培地は、例えば1%のコンニヤクマンナン、
2%のポリペプトン、0.2%の酵母エキス、0.1%
のK2HPO4および0.02%のMgSO4・7H2Oおよび
NaHCO3またはNa2CO30.5%を含有する液体培
地であり得る。
また、本発明の方法で使用する微生物の生育PH
は塩基性の範囲内であるので、適当なアルカリを
用いて上記培地のPH値を調整する必要がある。そ
のために0.5%炭酸水素ナトリウムを典型例とし
て挙げることができるが、これに限定されず水酸
化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウ
ム、リン酸ナトリウム、水酸化カルシウムなどの
アルカリ試薬も使用できる。
本発明の方法において有用な酵素産生微生物
AM−024およびAM−044はいずれもβ−マンナ
ナーゼを菌体外生産するので、生産されるβ−マ
ンナナーゼは培養液中に放出され、そこに蓄積さ
れる。これらの菌の培養はバツチ式、連続式のい
ずれによつて行うこともでき、生成される酵素の
分離精製は例えば以下のようにして実施すること
ができる。
即ち、まず培養液中の菌体を遠心分離、濾過な
どで除去した後、得られる上澄液(粗酵素液)を
そのままβ−マンナンの加水分解反応に適用する
ことも可能であり、これは経済的に有利である。
また、これを更に精製して使用することもでき
る。そのためには、例えば硫安等による塩析、エ
タノール、アセトン、イソプロパノール等による
溶媒沈澱法、限外濾過法、ゲル濾過法、イオン交
換樹脂等による一般的な酵素精製法により精製す
ることができる。
以下に、本発明で使用するβ−マンナナーゼの
好ましい精製法の1例につき説明する。
好アルカリ性バチルス属に属する例えばAM−
024菌株を、例えば上記のような培地に植菌し、
37℃にて72時間好気的に培養して得られる培養液
に、0.8%(w/v)のセタブロン(セチルトリ
メチルアンモニウムブロマイド)を添加し、30分
間放置後、7000rpm、0℃にて20分間遠心分離し
て菌体を除き、3の上澄液を得る。次いで、該
上澄液に硫酸アンモニウムを加えて75%飽和と
し、4℃で一夜放置する。生じた沈澱をろ別し、
10mM燐酸緩衝液(PH7.0)に溶解させ、一夜4
℃で同緩衝液に対して透析する。
生じた沈殿を遠心分離して除いた上清液を同上
緩衝液で平衡化したDEAE−トヨパール650Mに
吸着させ、0.1〜0.5MのNaClを含む同上緩衝液の
濃度勾配法によつて酵素を溶出する。溶出した活
性画分を集め、同上緩衝液に対して一夜4℃で透
析した後、同上緩衝液で平衡化したハイドロオキ
シアパタイトに吸着させる。ついで、0.4Mリン
酸緩衝液(PH8.0)で酵素を溶出させ、活性画分
を集めて、平均分画分子量10000の限外濾過膜を
用いて濃縮する。濃縮酵素は、高速液体クロマト
グラフ用蛋白質分取精製用カラム、シヨデツク
ス、プロテイン(SHODEX protein)WS−
2003、に充填し、10mMリン酸緩衝液(PH7.0)
を用いて溶出する。かくして得られた活性画分は
濃縮した後再度同上カラムを用いて同一条件で再
度クロマトグラフイーにかけ、得られ活性画分を
濃縮し、ポリアクリルアミドゲルデイスク電気泳
動法〔アナルズ オブ ザ ニユーヨーク アカ
デミー オブ サイエンス(ANN.N.Y.Acad.
Sci.)、1964、121、404〕において均一な酵素標
品18mgが得られ、活性収率は23%であつた。
なお、本発明の方法において有用なAM−044
菌についても上記方法と同様にして精製すること
ができる。
なお、β−マンナナーゼ活性の測定法並びいに
活性表示法は以下の通りである。即ち、0.1Mの
グリシン−NaOH−NaCl緩衝液(PH9.0)0.4ml
と1%(w/v)のコンニヤクマンナン水溶液
0.5mlに酵素液0.1mlを混合し、50℃で10分間反応
させた後、ソモギー〔Somogyi;ジヤーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー(J.Biol.
Chem.)、1952、195、19〕液1.0mlを添加して酵
素を失活させた後、沸騰水浴中で加熱する。10分
後、氷浴中で急冷し、ネルソン〔Nelson、ジヤ
ーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
(J.Biol.Chem.)、1944、153、、375〕液1.0mlを加
えよく撹拌した後、水を加えて10mlにする。着色
度を紫外光(波長:660nm)で100μg/mlのマ
ンノースを標準として測定する。酵素活性の単位
は前述の条件下で1分間に1μmolのマンノースに
相当する還元糖を生成するのに要する酵素量を1
単位として表示する。
本発明の方法によつて得られるμ−マンナナー
ゼの理化学的、酵素化学的性質は上記の他、各菌
株AM−024およびAM−044から得られる酵素の
分子量は夫々45000±3000および37000±3000であ
る。尚、これらの分子量はゲル濾過法で求めたも
のである。本発明のβ−マンナナーゼおよび従来
公知の微生物由来のβ−マンナナーゼの理化学的
性質および酵素化学的性質を比較して第4−表
に示す。
また、AS−420およびAS−440はいずれもβ−
マンノシダーゼを菌体内に生産し、そこに蓄積す
る。この培養はβ−マンナナーゼ生産菌株と同様
に行うことができ、生成する酵素の分離・精製は
例えば以下のように実施することができる。
即ち、まず培養液中の菌体の遠心分離、濾過な
どの公知の手段で集菌した後、得られた菌体をそ
のままマンノオリゴ糖の加水分解反応に使用する
ことも可能であり、これは経済的に有利である。
また、勿論これを更に精製して使用することも
できる。そのために、菌体を適当な手段で破砕処
理した後、β−マンナナーゼの場合と同様な一般
的な酵素精製法により精製することができる。
以下に、本発明のβマンノシダーゼの好ましい
精製法の1例につき説明する。好アルカリ性バチ
ルス属に属する例えばAS−440菌株を、例えば上
記のような培地に植菌し、37℃にて48時間好気的
に培養して得られる培養液を、12000r.p.m、0℃
にて30分間遠心分離して菌体を集め、湿重量10g
の菌体を得る。次いで該菌体を氷水中で冷却しな
がら10mM燐酸緩衝液(PH7.0)に懸濁して超音
波破砕を数回に分け、計3分間程度行う。次い
で、12000r.p.m、0℃にて30分間遠心分離して残
渣を除き、上澄液50mlを得る。次いで該上澄液に
硫酸アンモニウムを加えて75%飽和とし、4℃で
一夜放置する。生じた沈澱を濾別し、10mM燐酸
緩衝液(PH7.0)に溶解させ、一夜4℃で同緩衝
液に対して透析する。以下、上記と同様に処理し
て、ポリアクリルアミドゲルデイスク電気泳動法
〔アナルズ ニユーヨーク アカデミツク サイ
エンス(ANN.N.Y.Acad.Sci.)、121、404
(1964)〕において均一な酵素標品15mgが得られ、
活性収率は18%であつた。
なお、本発明の方法において有用なAS−420菌
株についても上記方法と同様にして精製すること
ができる。また、β−マンノシダーゼ活性の測定
法並びに活性表示法は以下の通りである。
即ち、0.2Mの燐酸緩衝液(PH7.0)0.2mlと8m
Mのp−ニトロフエニル−β−D−マンノピラノ
シド水溶液0.2mlに酵素液0.1mlを混合し、40℃で
10分間反応させた後、0.5Mの炭酸ナトリウム水
溶液1.0mlを添加して酵素を失活させた後、水を
加えて3mlにする。着色度を紫外光(波長420n
m)で1μmol/mlのp−ニトロフエノールを標準
として測定する。
酵素活性の単位は前述の条件下で1分間に
1μmolのp−ニトロフエノールを遊離させる酵素
量を1単位として表示する。
本発明の方法によつて得られるβ−マンノシダ
ーゼの理化学的、酵素化学的性質は上記の他、各
菌株AS−420およびAS−440から得られる酵素の
分子量は夫々68000±3000、および63000±3000で
ある。尚、これらの分子量はゲル濾過法で求めた
ものである。
本発明のβ−マンノシダーゼおよび従来公知の
微生物由来のβ−マンノシダーゼの理化学的性質
および酵素化学的性質を比較して第4−表に示
す。
更に、AM−001菌株は菌体外にβ−マンナナ
ーゼをまた同時に菌体内にβ−マンノダーゼを産
生するので、この場合には上記各菌株と同様に培
養した後、菌体と培養液とを遠心分離、濾過など
を公知の手段で分離した後、上記と同様な操作に
従つて各々β−マンナナーゼおよびβ−マンノシ
ダーゼを回収できる。まず、β−マンノシダーゼ
は上記方法に従つて精製できる。また、β−マン
ナナーゼについては上記方法に従つてハイドロキ
シアパタイトに吸着させるまで同様に操作した後
以下のように操作する。即ち、0.01〜0.4Mリン
酸緩衝液(PH7.0)の濃度勾配法によつて酵素を
溶出させると、β−マンナナーゼ活性を持つた2
つの画分(F−A、F−B)が得られ、2つの画
分を合わせた活性収率は29%であつた。
ついで、各フラクシヨンを各々平均画分子量
10000の限外濾過膜を用いて濃縮し、該濃縮酵素
を高速液体クロマトグラフ用蛋白質分取精製用カ
ラムシヨデツクス プロテイン(SHODEX
protein)WS−2003に充填し、10mMリン酸緩衝
液(PH7.0)を用いて溶出する。かくして得られ
た活性画分は濃縮した後、同上カラムを用いて同
一条件で再度クロマトグラフイーにかけ、得られ
る活性画分を濃縮し、精製酵素を得る。ついで、
これらの精製酵素をSDS−ポリアクリルアミドデ
イスク電気泳動法〔バイオケミカル&バイオフイ
ジカル リサーチ コミユニケーシヨンズ
(Biochem.Biophys.Res.Commun.)、1967、28、
815〕およびポリアクリルアミドデイスク電気泳
動法〔アナルズ ニユーヨーク アカデミツク
サイエンス(ANN.N.Y.Acad.Sci.)、121、404
1964)〕において、それらの均一性を検討した結
果、SDS−ポリアクリルアミドデイスク電気泳動
法ではF−AおよびF−B画分でのいずれにおい
ても各々、分子量57000±3000および43000±3000
の均一のバンドが検出されたが、ポリアクリルア
ミドデイスク電気泳動法では、F−A画分につい
ては、β−マンナナーゼ活性を有する2本のバン
ドが検出され、一方、F−B画分については、該
電気泳動法によつても均一のバンドが検出され
た。
尚、これらの3種のβ−マンナナーゼは、分子
量を異にする以外は、それらの酵素化学的諸性質
はほぼ同一であつた。
なお、AM−001菌株より得られるβ−マンノ
シダーゼおよびβ−マンナナーゼの活性測定法並
びに活性表示法は上記と同様である。同様に、以
下の第4−表および第4−表に各生成酵素の
特性を従来のものと比較して示した。
【表】
【表】
【表】
【表】
かくして、本発明の方法においては上記の如き
新規菌株の産生する新規β−マンナナーゼおよ
び/またはβ−マンノシダーゼをβ−1、4−D
−マンノピラノシド結合を主骨格に有する糖類基
質に作用させてマンノ糖含有糖質を得ることにあ
り、この方法において有用な糖類基質としては既
に述べた各種植物を起源として有するマンナン、
グルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラクトグ
ルコマンナンおよびこれらのオリゴマーなどが典
型例として例示できる。これら糖類基質の酵素分
解反応は上記新規なβ−マンナナーゼおよび/ま
たはβ−マンノシダーゼの至適PH(あるいは安定
PH)にて、至適温度(もしくは安定温度範囲)で
行う。
天然物からの上記糖類基質の抽出操作は一般的
にアルカリ領域で実施されるので至適PHあるいは
安定PHをアルカリ性に有する酵素の組合せを利用
することが好ましいが、場合によつてはPH調節剤
を使用して中性〜弱酸性とした後酵素反応を実施
することができる。
また、糖類基質に対する酵素量は特に制限はな
いが、反応時間、収率等経済性を考慮すれば、β
−マンナナーゼおよびβ−マンノシダーゼともに
夫々少なくとも10単位/g糖質とすることが有利
である。
作 用
天然界に多量に存在するβ−D−マンナンはデ
ンプンと共に食品、繊維、薬品、化粧品等の各種
分野で広範囲に利用されている。また、このβ−
D−マンナンあるいはこれらを酸あるいは適当な
酵素で加水分解して得られたマンノオリゴ糖類に
特定の酵素を作用させて、加水分解することによ
り、分子内にマンノースあるいはその他の糖を含
有する一連のマンノオリゴ糖およびマンノースが
得られ、これらマンノオリゴ糖、マンノースある
いはそれらの還元生成物であるマンノ糖アルコー
ルなどは甘味源として利用できるばかりでなく臨
床検査の分野における微生物同定用培地成分ある
いは医薬品などとして有用なものである。更に、
これらの糖質は有用な腸内細菌であるビフイズス
菌の増殖促進物質としても知られており、工業的
観点から極めて有用な物質と考えられている。
従来、これら糖質の中で、特にマンノースはモ
リブデンなどの金属触媒を用い、高温で反応させ
ることによりグルコースから20%前後の収率で得
られていた(特公昭56−40700)。しかしながら、
この方法では上記の如くマンノースの精製操作な
ど多数の工程を必要とし、経済的には不利なもの
であつたため、マンノースの価格も必然的に高い
ものとなつていた。
更に、従来提案されていたβ−D−マンナンの
分解酵素にあつても、これらの生成生産力価の
点、あるいは酵素自体の安定性、至適PHなどの観
点から工業的に利用することは難しかつた。
この点、本発明で使用するβ−マンナナーゼお
よびβ−マンノシダーゼは上記分解反応の各種条
件をいずれも満足し、これらの産生微生物の生産
力価も高いために、工業的規模での利用が可能と
なり、マンノース等分解生成物(糖質)のコスト
を大巾に低下することが可能となる。これらはい
ずれも本発明で使用するβ−マンナナーゼおよび
β−マンノシダーゼがアルカリ〜弱酸性に至適PH
を有し、高温安定性を有するものであることによ
るものであり、また本発明者等の検索の結果見出
された好アルカリ生バチルス属に属する菌株の高
い酵素産生力価に基くものである。
本発明の方法において、β−D−マンナンの加
水分解反応においては、各酵素を従来公知の方法
に従つて固定化し、バイオリアクター内で使用す
ることも勿論可能であり、回収・再利用すること
ができる。この場合にも高温安定性等の諸性質は
酵素活性の維持という観点から望ましい性質であ
り、固定化後も十分な活性の維持が期待できる。
実施例
以下、実施例に基き本発明を更に具体的に説明
するが、本発明の範囲はこれら実施例により何等
制限されない。
実施例 1
好アルカリ性細菌バチルスNo.AM−001株
(FERMP−8856)を1容の三角フラスコ中の
こんにやく粉1%、ボリペプトン2%、酵母エキ
ス0.2%K2HPO40.1%、MgSO4・7H2O0.02%、
Na2CO30.5%(別殺菌)を含むアルカリ性の培地
100ml(PH9,0)に植菌し、37℃で40時間
200rpmで振とう培養し、培養液を遠心分離して
94mlの上澄を得た。本上澄中には50単位/mlのβ
−マンナナーゼが含まれていた。
このようにしてえられたβ−マンナナーゼ溶液
に硫酸アンモニウムを加えて80%飽和とし、一夜
4℃で保存した。生じた沈澱を濾別し、10mlの10
mMグリシン−NaOH−NaCl緩衝液(PH9.0)に
溶解させ370単位/mlの酵素液を得た。
さらに遠心分離で得られた菌体を10mlの10mM
燐酸緩衝液(PH7.0)に懸濁させ氷水中で冷却し
ながら超音波破砕を数回に分け、計3分間程度行
う。次いで、12000r.p.m.0℃で30分間遠心分離し
て残渣を除き、上澄液10mlを得る。これを、平均
分画分子量10000の限外濾過膜を用い3mlに濃縮
した。この濃縮液中には9単位/mlのβ−マンノ
シダーゼが含まれていた。
上記のようにして得られたβ−マンナナーゼ
を、予め水酸化ナトリウム溶液に溶解させた後、
PH9に調整した1%(w/v)ぞうげやしマンナ
ン溶液100ml(マンナン:1g)中に、マンナン
1g当り150単位添加し、65℃で50時間反応させ
て得られた糖質の加水分解率を測定した結果21%
であり、該糖質を高速液体クロマトグラフイーに
より分析した結果、マンノース、マンノビオー
ス、マンノトリオースなどの一連のマンノオリゴ
糖が検出された。
さらに該糖質に上記方法で得られたβ−マンノ
シダーゼを20単位/g(固型物)添加し、PH7.0、
55℃で50時間反応させた結果、加水分解率29%で
マンノースを主体とし、マンノオリゴ糖を含む、
糖質が得られた。
実施例 2
好アルカリ性細菌バチルスNo.AM−024株
(FERMP−8857)を実施例1の培地組成中のこ
んにやく粉の代りにやし油抽出残渣を用いて同様
に培養し、95mlの培養上澄中に28単位/mlのβ−
マンナナーゼが含まれていた。次いで、該粗酵素
液を平均分画分子量10000の限外濾過膜を用いて
約10倍に濃縮し、210単位/mlの濃縮酵素液を得
た。
このようにして得られたβ−マンナナーゼを5
%(w/v)コンニヤクマンナン溶液100ml(マ
ンナン5g)中にマンナン1g当り100単位添加
し、65℃で50時間反応させて得られた糖質の加水
分解率を測定した結果20%であり、該糖質を高速
液体クロマトグラフイーにより分析した結果、マ
ンノースおよび分子内にマンノースおよびグルコ
ースを含む一連のオリゴ糖が検出された。
実施例 3
好アルカリ性細菌バチルスNo.AM−044株
(FERMP−8858)を実施例1の培地組成中のこ
んにやく粉の代りにグアーガムを、そしてポリペ
プトンの代りにコーンステイープリカー5%を用
いて同様に培養し、培養上澄中に21単位/mlのβ
−マンナナーゼ活性を有する94mlの粗酵素液を得
た。ついで、該酵素に対して4倍量の冷イソプロ
パノール(−40℃)を添加し、冷室中で一夜放置
した。生じた沈澱を濾別し、10mlの10mMグリシ
ン−NaOH−NaCl緩衝液(PH9.0)溶解させ168
単位/mlのβ−マンナナーゼ溶液を得た。
このようにして得られたβ−マンナナーゼを、
予め水酸化ナトリウム溶液に溶解させた後、PH9
に調整した1%やし油抽出残渣マンナン溶液100
ml(マンナン 1g)中にマンナン1g当り110
単位添加し、70℃で50時間反応させて得られた糖
質の加水分解を測定した結果21%であつた。
また、本糖質を高速液体クロマトグラフイーに
より分析した結果、マンノースおよび分子内にマ
ンノースおよびガラクトースを含む一連のオリゴ
糖が検出された。
実施例 4
好アルカリ性細菌バチルスNo.AS−420株
(FERMP−8859)を実施例1で用いたものと同
一の培地300ml(PH9.0)に植菌し、37℃で24時
間、200rpmで振とう培養した。ついで遠心分離
して菌体を集め、5mlの10mMリン酸緩衝液(PH
7.0)に懸濁させ、0.5mlの10mg/ml塩化リゾチー
ム溶液を添加して37℃で一夜放置した。次いでポ
リエチレンイミンを0.1%になるように添加し、
30分間放置して溶出した核酸を凝集させた後、遠
心分離して9.5mlの上澄を得た。本上澄中には8.5
単位/mlのβ−マンノシダーゼが含まれていた。
このようにして得られたβ−マンノシダーゼ溶
液を、実施例1で得られたぞうげやしマンナンβ
−マンナナーゼ水解物に該水解物1g当り20単位
添加し、40℃にてPH7.0で50時間作用させて得ら
れた糖質の加水分解率を測定した結果28%であ
り、該糖質を高速液体クロマトグラフ法により分
析した結果、マンノースおよび少量のマンノオリ
ゴ糖が検出された。
実施例 5
好アルカリ性細菌バチルスNo.AS−440株
(FERMP−8860)を実施例2で用いたものと同
一の培地300ml(PH9.0)に植菌し、実施例4と同
一の培養方法およびβ−マンノシダーゼの取得方
法により、9.6mlの18単位/mlのβ−マンノダー
ゼ溶液を得た。
このようにして得られたβ−マンノシダーゼ溶
液を予め実施例1で得られたβ−マンナナーゼを
作用させて液化させた10%(w/v)コンニヤク
マンナン溶液100ml(マンナン10g)中にマンナ
ン1g当り20単位および実施例1で得られたβ−
マンナナーゼ120単位を添加し、50℃、PH8.0で50
時間反応させて得られた糖質の加水分解率を測定
した結果、29%であり、該糖質を高速液体クロマ
トグラフイーにより分析した結果、マンノースお
よび少量のマンノオリゴ糖が検出された。
実施例 6
好アルカリ性細菌バチルスNo.AS−440(FERM
P−8860)を実施例1の培地組成中のこんにやく
粉の代りにコーヒー抽出カスを用いて実施例4と
同一の培養方法および酵素取得方法により9.5ml
の12単位/mlのβ−マンノシダーゼ溶液を得た。
このようにして得られたβ−マンノシダーゼ溶
液を予め実施例3で得られたβ−マンナナーゼを
作用させて液化した5%(w/v)グアーガム溶
液100ml(マンナン5g)中にマンナン1g当り
25単位および実施例3で得られたβ−マンナナー
ゼ150単位を添加し、50℃、PH8.0で50時間反応さ
せて得られた糖質の加水分解率を測定した結果30
%であつた。
また本糖質を高速液体クロマトグラフイーによ
り分析した結果、マンノースおよび分子内に少量
のマンノース、グルコース、ガラクトースを含む
マンノオリゴ糖が検出された。
発明の効果
以上詳しく説明したように、本発明のマンノ糖
含有糖質の製造方法によれば、β−D−マンナン
の酵素分解反応に要求される諸要件をいずれも満
足する新規なβ−マンナナーゼおよびβ−マンノ
シダーゼを使用したことにより、従来問題となつ
ていた諸難点がすべて解決され、高い生産率で各
種工業分野で有用なβ−マンナンの加水分解生成
物を工業的規模で提供することが可能となつた。
この事実は、また上記β−マンナナーゼ並びに
β−マンノシダーゼが、本発明者等の新たに検
索・分離した新規微生物により簡単な操作、工程
により量産し得るようになり、しかもコスト的に
有利になつたことによるものである。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of Industrial Application The present invention relates to a novel method for producing carbohydrates containing mannosaccharides, and more specifically, the present invention relates to a novel method for producing carbohydrates containing mannosaccharides, and more specifically, a method for producing a novel β-mannanase and/or β-mannosidase.
The present invention relates to a method for producing a mannosaccharide-containing carbohydrate, which is characterized by acting on a saccharide substrate having a 4-D-mannopyranoside bond. Conventional technology β-mannanase contains β-1,4-D-
The β-1,4-D-mannopyranoside bond, which is the main skeleton of mannan, glucomannan, galactomannan, galactoglucomannan, etc., which are homo and hetero β-D-mannans with a mannopyranosidic bond, is optionally hydrolyzed to increase the viscosity. It is an enzyme that simultaneously produces a series of mannooligosaccharides, and a large number of microorganisms and plants are known to produce this enzyme [Advances in Carbohydrate Chemistry & Biochemistry]
Chemistry and Biochemistry), 1976, 32 , 299
−316]. In addition, β-mannosidase is a low-molecular β-D-mannan (mannan, glucomannan, galactomannan,
It is an enzyme that acts on galactoglucomannan) and hydrolyzes mannoside bonds sequentially from the non-reducing terminal site to produce mannose. Similar to the β-mannanase mentioned above, a wide range of plants and microorganisms have the ability to produce this enzyme. [Biochim. Biophys. Acta, 1978, 522 , 521-
530; Japanese Patent Publication No. 51-38486]. Natural products that are hydrolyzed by β-mannanase and/or β-mannosidase to give useful saccharides include β-mannan, which is known to exist in large quantities in nature along with cellulose;
Examples include glucomannan, galactomannan, and galactoglucomannan. First, ivory nuts (scientific name: Phytelehus macrocarpa) and corozo are well known as those containing β-1,4-D-mannan. Other known β-1,4-mannan-containing plants include Phoenicus canariensis and Orchis maquillata, which belong to the palm family. Typical examples of galactomannan are the mucilage contained in carob and guar seeds, locus bean gum, and guar gum. widely used. Galactomannan is also found in large amounts in leguminous plants such as soybeans, coffee beans, alfalfa, red clover, and fenugreek. Other galactomannan-containing plants include Genista
Known examples include Scoparia, Gleeditssia fuerox, and Leucaena glauca. The most famous glucomannan-containing substance is konjac (scientific name: Amorphopharas konjac), but other sources include arum roots of the Araceae family, jack pine of the Pinus genus, bulbs of the Orchidaceae family, and plants of the spruce genus, such as Picea abies and Pinus genus. Are known. Other known glucomannan-containing plants include Asparagus oficinalis, Eremulus fuscus, Eremulus legeri, Eremulus spectabilis, and Phaceolus aureus. These are generally obtained by an alkali extraction method or the like. Further, these β-D-mannans are consumed in large quantities industrially in the food industry and the textile industry as thickeners or thickeners. Among these carbohydrates, mannose in particular has been obtained from glucose at a yield of around 20% by reacting at high temperatures using metal catalysts such as molybdenum (Japanese Patent Publication No. 1987-40700). However, as described above, this method requires a large number of steps such as purification of mannose, and is economically disadvantageous, so that the price of mannose is inevitably high. On the other hand, β-mannanase, which is known as an enzyme that arbitrarily hydrolyzes β-D-mannan, has been the subject of research by many researchers, and a large number of microbial-derived enzymes have been investigated. It's here. In particular, filamentous fungi [Acta.Chem.Scand., 1968, 22 , 1924;
Noka, 1969, 43 , 317; Biochem.J., 1984, 219 , 857], actinomycetes [Agricultural and Biological Chem., 1984, 48 ,
2189], Bacteria [J.Biochem., 1982, 91 , 1181;
No. 57-65182] and other enzymes have been well studied. However, many of these enzymes have poor temperature stability or require a long period of time for culturing, which poses difficulties in using the enzymes industrially at low cost. Furthermore, β-mannosidase, which is conventionally known as an enzyme that hydrolyzes β-D-mannan into mannose units from the non-reducing end, can be used in animals [Biochemistry, 1972, 11 ;
1493-1501: Biochim.Biophys.Acta, 1973, 315 ,
123-127], Plants [J.Biol.Chem., 1964,
239, 990-992], Microorganisms [Biochim.Biophyys.
Acta), 1978, 522 , 521-530: Japanese Patent Publication No. 51-38486
Enzymes such as [No.]] have been well studied. However, all of these enzymes similarly have low productivity, and many of them require complicated culture and purification methods, leaving problems in using the enzymes industrially at low cost. Problems to be Solved by the Invention Effective use of β-D-mannan, which exists in large amounts as a renewable resource in nature, particularly mannooligosaccharides and mannose produced by enzymatic hydrolysis of the substance.
In order to efficiently recover and utilize sugars such as glucose and galactose, we have developed a method that simplifies the neutralization process because it has excellent heat resistance and extraction operations for β-mannan from various plants are mainly carried out under alkaline conditions. Also, in order to simplify the decomposition process, it is preferable to have the optimum pH for the enzymatic reaction on the alkaline side. Furthermore, by carrying out enzymatic reactions at high temperatures, it is expected that spoilage will be prevented, the enzyme reaction rate will be increased, and the mass production of products will be improved.
It is desirable that the optimum temperature is also high. However, as already mentioned, the conventional β-
Both mannanase and β-mannosidase have drawbacks such as insufficient temperature stability and the need for long culture times to produce the enzymes, so these enzymes cannot be used industrially. It has been difficult or unsatisfactory in terms of cost to utilize it to obtain hydrolysis products of β-D-mannan on a commercial scale. Therefore, the purpose of the present invention is to satisfy various requirements in the above-mentioned enzymatic reactions, especially reactions for producing mannosaccharide-containing carbohydrates, and to carry out the hydrolysis of β-D-mannan economically and on an industrial scale. The object of the present invention is to provide a method for producing mannosaccharide-containing carbohydrates using novel β-mannanase and β-mannodase. Means for Solving the Problems The present inventors have extensively searched the natural world in order to obtain microorganisms capable of producing enzymes having these properties that β-mannanase for industrial use should possess. As a result, growth is optimal in alkaline conditions.
The present invention was completed by discovering that some bacteria that have PH and belonging to the genus Bacillus produce enzymes that meet the above requirements, and that they can be produced in large quantities with good productivity. That is, the present invention provides novel β-mannanase and/or β-mannosidase, β-1,4-
The present invention provides a method for producing mannosaccharide-containing carbohydrates, which is characterized by acting on a saccharide substrate having a mannopyranoside bond as the main skeleton, and each of these enzymes has the following physical and chemical properties. . () β-mannanase: (a) Action: β-1,4 of mannan, glucomannan, galactomannan, galactoglucomannan
-D-mannopyranoside bonds are non-specifically hydrolyzed to produce mannooligosaccharides. (b) Substrate specificity: Acts specifically on β-mannan and does not act on α-mannan. It acts on mannooligosaccharides with a molecular weight greater than β-1,4-D-mannotetraose and hydrolyzes them. (c) Optimal PH and stable PH range: The optimal PH is 8 to 10, and is stable within the PH range of 6 to 10 under heating conditions at 60° C. for 30 minutes. (d) Stability against temperature: Stable up to 65℃ under heating conditions of PH8.0 and 30 minutes. (e) Range of optimum temperature for action: The optimum temperature for action is around 65°C. (f) Inactivation conditions: PH5.0 and
It becomes completely inactive at 12.5. Furthermore, when treated at pH 8.0 for 30 minutes, it is completely inactivated at 80°C. (g) Inhibition and activation: mercuric chloride, silver nitrate, disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTANa 2 ), urea,
Sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium dodecylbenzenesulfonate (DBS)
is inhibited by (h) Isoelectric point by chromatofocusing method: 5.0-5.4 (li) Molecular weight by gel filtration method: 37,000-57,000 () β-mannosidase (b) Action: Hydrolyzes β-mannosidic bonds sequentially from the non-reducing end and produces mannose. (b) Substrate specificity: Completely decomposes β-methyl (ethyl)-D-mannoside, and also acts on β-linked mannose-containing oligosaccharides to liberate mannose. β- of p-nitrophenyl-glycoside
D-mannoside can be used as a substrate, but α-D
-Mannoside, α-D-glucoside, β-D
-glucoside, α-D-galctoside, β-
D-galactoside, β-D-xyloside, α
-L-fucoside and β-D-glucuronide cannot be used as substrates. (c) Optimal PH and stable PH range: The optimal PH is 6 to 7, and is stable within the PH range of 6 to 9 under heating conditions at 40° C. for 30 minutes. (d) Stability against temperature: Stable up to 45°C under heating conditions of PH6.5 and 30 minutes. (e) Range of optimum temperature for action: The optimum temperature for action is around 50°C. (f) Inactivation conditions: Under the treatment conditions of 40°C and 30 minutes, it is completely inactivated at pH 5.0 and 10. Furthermore, when treated at pH 6.5 for 30 minutes, it is completely inactivated at 55°C. (G) Molecular weight by gel filtration method: 63,000 to 68,000 The novel β-mannanase-producing strain and novel β-mannosidase-producing strain used in the method of the present invention were newly searched and isolated from the natural world by the present inventors. It is. These strains were collected in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
Determinative Bacteriology), 8th edition and The Genus Bacillus,
According to the U.S. Department of Agriculture version], all of them are aerobic spore-forming bacilli, motile, have pericytial hairs, and are Gram-stain positive or variable. , it was clear that it belonged to the genus Bacillus because of its positive catalase test, but since it grows well in alkaline conditions of pH 7.5 to 11.5, it is a new species that is taxonomically different from the known genus Bacillus. I thought it was a bacterial strain. Tables 1 to 3 below show two types of extracellular β-mannanase producing strains and two types of intracellular β-mannanase producing strains isolated respectively.
- The mycological properties of a mannosidase-producing strain and a type of β-mannosidase and β-mannanase-producing strain are shown. [Table] [Table] +: Growing or positive -: Not growing or negative [Table] [Table] +: Growing or positive -: Not growing or negative [Table] [Table] +: Growing or positive -: No growth or negative The above bacteria were submitted to the Institute of Microbiology, Agency of Industrial Science and Technology under the FERM P-8857 (AM-024) and FERM respectively.
P-8858 (AM-044), FERM P-8859 (AS-
420), FERM P-8860 (AS-440) and
It has been deposited as FERM P-8856 (AM-001). The method for producing the novel extracellular β-mannanase etc. useful in the method of the present invention will be explained in more detail. For example, extracellular β-mannanase producing bacteria as described above are inoculated into a suitable medium and cultured aerobically at 30 to 45°C for 48 to 72 hours from the viewpoint of bacterial growth temperature. In addition to carbon sources and nitrogen sources, it contains inorganic salts, micronutrients, etc. as necessary. First, various conventionally known materials can be used as the carbon source, such as coconut oil extraction residue, konjac flour, locust bean gum, canalbum gum, guar gum, red pine hemicellulose, or locust bean powder containing β-mannan. Any plant can be used. There are also no particular restrictions on nitrogen sources, including organic nitrogen such as yeast extract, peptone, meat extract, cornstarch liquor, amino acid solution, and soybean meal, or inorganic nitrogen such as ammonium sulfate, urea, ammonium nitrate, and ammonium chloride. can be exemplified as being inexpensive and easily available. It goes without saying that the organic nitrogen source also serves as a carbon source. Furthermore, in addition to such carbon sources and nitrogen sources, it is also possible to add various commonly used salts, such as inorganic salts such as magnesium salts, potassium salts, phosphates, and iron salts, and vitamins. . Microbial media suitable for use in the method of the invention include, for example, 1% konjac mannan,
2% polypeptone, 0.2% yeast extract, 0.1%
of K2HPO4 and 0.02 % MgSO4.7H2O and
It can be a liquid medium containing 0.5% NaHCO3 or Na2CO3 . In addition, the growth pH of the microorganism used in the method of the present invention
Since it is within the basic range, it is necessary to adjust the PH value of the medium using an appropriate alkali. For this purpose, 0.5% sodium hydrogen carbonate can be cited as a typical example, but alkaline reagents such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium phosphate, and calcium hydroxide can also be used without being limited thereto. Enzyme-producing microorganisms useful in the methods of the invention
Since both AM-024 and AM-044 produce β-mannanase extracellularly, the produced β-mannanase is released into the culture medium and accumulated there. These bacteria can be cultured either batchwise or continuously, and the enzymes produced can be separated and purified, for example, as follows. That is, it is possible to first remove the bacterial cells in the culture solution by centrifugation, filtration, etc., and then apply the resulting supernatant (crude enzyme solution) as it is to the hydrolysis reaction of β-mannan. Economically advantageous.
It can also be used after further purification. For this purpose, purification can be carried out by, for example, salting out using ammonium sulfate, solvent precipitation using ethanol, acetone, isopropanol, etc., ultrafiltration, gel filtration, or general enzyme purification using ion exchange resins. Below, one example of a preferred purification method for β-mannanase used in the present invention will be explained. For example, AM- belonging to the alkalophilic Bacillus genus
024 strain, for example, inoculated into a medium as described above,
0.8% (w/v) cetabron (cetyltrimethylammonium bromide) was added to the culture solution obtained by culturing aerobically at 37°C for 72 hours, and after standing for 30 minutes, the culture was incubated at 7000 rpm for 20 hours at 0°C. Centrifuge for a minute to remove the bacterial cells and obtain the supernatant liquid in step 3. Then, ammonium sulfate was added to the supernatant to make it 75% saturated, and the mixture was left overnight at 4°C. Filter out the resulting precipitate,
Dissolve in 10mM phosphate buffer (PH7.0) and incubate overnight.
Dialyze against the same buffer at °C. The resulting precipitate was removed by centrifugation, and the supernatant was adsorbed onto DEAE-Toyopearl 650M equilibrated with the above buffer, and the enzyme was eluted using the concentration gradient method of the above buffer containing 0.1 to 0.5 M NaCl. do. The eluted active fractions are collected and dialyzed against the above buffer solution overnight at 4°C, and then adsorbed onto hydroxyapatite equilibrated with the above buffer solution. Then, the enzyme is eluted with 0.4M phosphate buffer (PH8.0), active fractions are collected, and concentrated using an ultrafiltration membrane with an average molecular weight cutoff of 10,000. Concentrated enzymes include columns for protein separation and purification for high-performance liquid chromatography, SHODEX, and protein (SHODEX protein) WS-
2003, filled with 10mM phosphate buffer (PH7.0)
Elute using The active fraction thus obtained was concentrated and subjected to chromatography again under the same conditions using the same column as above, and the obtained active fraction was concentrated and subjected to polyacrylamide gel disc electrophoresis [Annals of the New York Academy of Science] (ANN.NYAcad.
Sci., 1964, 121 , 404], 18 mg of a homogeneous enzyme preparation was obtained, and the activity yield was 23%. Furthermore, AM-044 useful in the method of the present invention
Bacteria can also be purified in the same manner as the above method. The method for measuring β-mannanase activity and the method for displaying the activity are as follows. That is, 0.4 ml of 0.1M glycine-NaOH-NaCl buffer (PH9.0)
and 1% (w/v) konjac mannan aqueous solution
Mix 0.1 ml of enzyme solution with 0.5 ml and react at 50℃ for 10 minutes.
of Biological Chemistry (J.Biol.
Chem.), 1952, 195 , 19] to inactivate the enzyme, and then heat in a boiling water bath. After 10 minutes, quench in an ice bath, add 1.0 ml of Nelson's solution, stir well , and add water. Make it 10ml. The degree of coloration is measured using ultraviolet light (wavelength: 660 nm) using 100 μg/ml mannose as a standard. The unit of enzyme activity is the amount of enzyme required to produce reducing sugar equivalent to 1 μmol of mannose per minute under the above conditions.
Display as a unit. In addition to the physicochemical and enzymatic properties of μ-mannanase obtained by the method of the present invention, the molecular weight of the enzyme obtained from each strain AM-024 and AM-044 is 45,000 ± 3,000 and 37,000 ± 3,000, respectively. be. Incidentally, these molecular weights were determined by gel filtration method. Table 4 shows a comparison of the physicochemical properties and enzymatic chemical properties of the β-mannanase of the present invention and conventionally known β-mannanase derived from microorganisms. In addition, both AS-420 and AS-440 are β-
Mannosidase is produced within the bacterial body and accumulated there. This culture can be carried out in the same manner as for the β-mannanase producing strain, and the produced enzyme can be isolated and purified, for example, as follows. That is, it is possible to first collect bacteria in a culture solution by known means such as centrifugation or filtration, and then use the obtained bacteria as is for the hydrolysis reaction of mannooligosaccharides, which is economical. It is advantageous. Of course, it can also be further purified and used. For this purpose, the bacterial cells can be disrupted by appropriate means and then purified by a general enzyme purification method similar to that used for β-mannanase. Below, one example of a preferred purification method for β-mannosidase of the present invention will be explained. For example, the AS-440 strain belonging to the alkaliphilic Bacillus genus is inoculated into a medium such as the one described above, and the culture solution obtained by culturing it aerobically at 37°C for 48 hours is incubated at 12000 rpm and 0°C.
Centrifuge for 30 minutes to collect bacterial cells and weigh 10 g wet.
Obtain bacterial cells. Next, the bacterial cells are suspended in 10 mM phosphate buffer (PH7.0) while being cooled in ice water, and subjected to ultrasonic disruption several times for a total of about 3 minutes. Next, the mixture is centrifuged at 12,000 rpm and 0° C. for 30 minutes to remove the residue and obtain 50 ml of supernatant. Ammonium sulfate was then added to the supernatant to make it 75% saturated, and the mixture was allowed to stand overnight at 4°C. The resulting precipitate is filtered off, dissolved in 10 mM phosphate buffer (PH7.0), and dialyzed against the same buffer overnight at 4°C. The following steps were performed in the same manner as above to perform polyacrylamide gel disk electrophoresis [ANN.NYAcad.Sci., 121 , 404]
(1964)], 15 mg of homogeneous enzyme preparation was obtained.
The activity yield was 18%. Note that the AS-420 strain useful in the method of the present invention can also be purified in the same manner as the above method. Furthermore, the method for measuring β-mannosidase activity and the method for displaying the activity are as follows. That is, 0.2 ml of 0.2 M phosphate buffer (PH7.0) and 8 m
Mix 0.1 ml of enzyme solution with 0.2 ml of p-nitrophenyl-β-D-mannopyranoside aqueous solution of M, and incubate at 40℃.
After reacting for 10 minutes, add 1.0 ml of 0.5 M sodium carbonate aqueous solution to inactivate the enzyme, and then add water to make up to 3 ml. Coloring degree with ultraviolet light (wavelength 420n)
m) using 1 μmol/ml p-nitrophenol as a standard. The unit of enzyme activity is per minute under the above conditions.
The amount of enzyme that liberates 1 μmol of p-nitrophenol is expressed as 1 unit. In addition to the physicochemical and enzymatic properties of β-mannosidase obtained by the method of the present invention, the molecular weight of the enzyme obtained from each strain AS-420 and AS-440 is 68000±3000 and 63000±3000, respectively. It is. Incidentally, these molecular weights were determined by gel filtration method. Table 4 shows a comparison of the physicochemical and enzymatic properties of the β-mannosidase of the present invention and the conventionally known β-mannosidase derived from microorganisms. Furthermore, the AM-001 strain produces β-mannanase outside the bacterial cells and β-mannodase inside the bacterial cells, so in this case, after culturing in the same manner as the above-mentioned strains, the bacterial cells and culture solution are centrifuged. After separation by known means such as separation and filtration, β-mannanase and β-mannosidase can be recovered respectively according to operations similar to those described above. First, β-mannosidase can be purified according to the above method. Further, for β-mannanase, the same procedure is performed according to the above method until it is adsorbed to hydroxyapatite, and then the following procedure is performed. That is, when the enzyme is eluted by the concentration gradient method of 0.01 to 0.4M phosphate buffer (PH7.0), it is found that 2
Two fractions (FA, FB) were obtained, and the combined activity yield of the two fractions was 29%. Next, each fraction was determined to have an average fractional molecular weight.
Concentrate the enzyme using a 10,000 ultrafiltration membrane, and convert the concentrated enzyme into a column system for protein preparative purification for high performance liquid chromatography (SHODEX).
Protein) WS-2003 and elute using 10mM phosphate buffer (PH7.0). After the active fraction thus obtained is concentrated, it is subjected to chromatography again under the same conditions using the same column as above, and the obtained active fraction is concentrated to obtain a purified enzyme. Then,
These purified enzymes were subjected to SDS-polyacrylamide disk electrophoresis [Biochem.Biophys.Res.Commun., 1967, 28 ,
815] and polyacrylamide disc electrophoresis [Annals New York Academy]
Science (ANN.NYAcad.Sci.), 121 , 404
1964)], as a result of examining their homogeneity, the molecular weights of both the FA and FB fractions were 57,000 ± 3,000 and 43,000 ± 3,000, respectively, using SDS-polyacrylamide disk electrophoresis.
However, in polyacrylamide disc electrophoresis, two bands with β-mannanase activity were detected in the F-A fraction, while in the F-B fraction, a uniform band was detected. Uniform bands were also detected by this electrophoresis method. These three types of β-mannanases had almost the same enzymatic chemical properties except for their different molecular weights. The methods for measuring and displaying the activities of β-mannosidase and β-mannanase obtained from the AM-001 strain are the same as described above. Similarly, Tables 4 and 4 below show the characteristics of each produced enzyme in comparison with conventional ones. [Table] [Table] [Table] [Table] Thus, in the method of the present invention, the novel β-mannanase and/or β-mannosidase produced by the above-mentioned novel strain is converted into β-1,4-D
- Mannosugar-containing carbohydrates are obtained by acting on a saccharide substrate having a mannopyranosidic bond in its main skeleton, and useful saccharide substrates in this method include mannans originating from the various plants mentioned above;
Typical examples include glucomannan, galactomannan, galactoglucomannan, and oligomers thereof. The enzymatic decomposition reaction of these saccharide substrates is carried out at the optimal pH (or stable
PH) at the optimum temperature (or stable temperature range). Since the extraction operation of the above-mentioned saccharide substrates from natural products is generally carried out in an alkaline region, it is preferable to use a combination of enzymes that have an alkaline optimum pH or stable pH, but in some cases, a pH regulator may be used. The enzymatic reaction can be carried out after making the solution neutral to weakly acidic. There is no particular restriction on the amount of enzyme for the sugar substrate, but considering economics such as reaction time and yield, β
Advantageously, both mannanase and β-mannosidase are each at least 10 units/g carbohydrate. Function β-D-mannan, which exists in large amounts in nature, is widely used along with starch in various fields such as foods, textiles, medicines, and cosmetics. Also, this β−
A series of mannooligosaccharides containing mannose or other sugars in the molecule can be produced by hydrolyzing D-mannan or mannooligosaccharides obtained by hydrolyzing these with acids or appropriate enzymes using a specific enzyme. Sugar and mannose are obtained, and these mannooligosaccharides, mannose, and their reduction products, such as manno sugar alcohols, can not only be used as sweetness sources, but also useful as medium components for microorganism identification in the field of clinical testing, or as pharmaceuticals. It is. Furthermore,
These carbohydrates are also known as substances that promote the growth of Bifidobacterium, which is a useful intestinal bacterium, and are considered to be extremely useful substances from an industrial standpoint. Conventionally, among these carbohydrates, mannose in particular has been obtained from glucose at a yield of around 20% by reacting at high temperatures using a metal catalyst such as molybdenum (Japanese Patent Publication No. 1983-40700). however,
This method requires a large number of steps such as the purification of mannose as described above, and is economically disadvantageous, so the price of mannose is inevitably high. Furthermore, even with the previously proposed β-D-mannan degrading enzymes, it has not been possible to use them industrially due to the production potency, the stability of the enzyme itself, the optimal pH, etc. It was difficult. In this regard, the β-mannanase and β-mannosidase used in the present invention satisfy all of the various conditions for the decomposition reaction described above, and the production titers of the microorganisms that produce them are also high, so they can be used on an industrial scale. , it becomes possible to significantly reduce the cost of decomposition products (carbohydrates) such as mannose. Both β-mannanase and β-mannosidase used in the present invention are suitable for alkaline to slightly acidic pH.
This is because it has high temperature stability and is also based on the high enzyme production titer of a strain belonging to the genus Alkaliphilic Bacillus, which was discovered as a result of a search by the present inventors. . In the method of the present invention, in the hydrolysis reaction of β-D-mannan, it is of course possible to immobilize each enzyme according to a conventionally known method and use it in a bioreactor, and it is possible to recover and reuse it. I can do it. In this case as well, properties such as high temperature stability are desirable from the perspective of maintaining enzyme activity, and sufficient activity can be expected to be maintained even after immobilization. EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be explained in more detail based on Examples, but the scope of the present invention is not limited in any way by these Examples. Example 1 Alkaliphilic bacterium Bacillus No. AM-001 strain (FERMP-8856) was mixed with 1% konjac powder, 2% boripeptone, 0.2% yeast extract, 0.1% K 2 HPO 4 , MgSO 4 in a 1-volume Erlenmeyer flask.・7H2O0.02 %,
Alkaline medium containing 0.5% Na 2 CO 3 (separately sterilized)
Inoculate 100ml (PH9,0) and incubate at 37℃ for 40 hours.
Culture with shaking at 200 rpm, and centrifuge the culture solution.
94 ml of supernatant was obtained. This supernatant contained 50 units/ml of β.
- Contains mannanase. Ammonium sulfate was added to the β-mannanase solution thus obtained to make it 80% saturated, and the solution was stored overnight at 4°C. The resulting precipitate was filtered and 10 ml of 10
It was dissolved in mM glycine-NaOH-NaCl buffer (PH9.0) to obtain an enzyme solution containing 370 units/ml. Furthermore, the bacterial cells obtained by centrifugation were added to 10ml of 10mM.
Suspend in phosphate buffer (PH7.0), cool in ice water, and perform ultrasonic disruption several times for a total of about 3 minutes. Then, centrifuge at 12,000 r.pm for 30 minutes at 0°C to remove the residue and obtain 10 ml of supernatant. This was concentrated to 3 ml using an ultrafiltration membrane with an average molecular weight cut off of 10,000. This concentrate contained 9 units/ml of β-mannosidase. After previously dissolving the β-mannanase obtained as above in a sodium hydroxide solution,
Hydrolysis of carbohydrates obtained by adding 150 units per 1 g of mannan to 100 ml of 1% (w/v) elephant palm mannan solution (mannan: 1 g) adjusted to pH 9 and reacting at 65°C for 50 hours. As a result of measuring the rate 21%
As a result of analyzing this carbohydrate by high performance liquid chromatography, a series of mannooligosaccharides such as mannose, mannobiose, and mannotriose were detected. Furthermore, 20 units/g (solid matter) of β-mannosidase obtained by the above method was added to the carbohydrate, and the pH was 7.0.
As a result of reacting at 55℃ for 50 hours, the hydrolysis rate was 29%, and the result was a product mainly composed of mannose and containing mannooligosaccharides.
Carbohydrates were obtained. Example 2 Alkaliphilic bacterium Bacillus No. AM-024 strain (FERMP-8857) was cultured in the same manner as in Example 1, using coconut oil extraction residue instead of konjac powder in the medium composition, and cultured in 95 ml. 28 units/ml of β-
Contains mannanase. Next, the crude enzyme solution was concentrated about 10 times using an ultrafiltration membrane with an average molecular weight cutoff of 10,000 to obtain a concentrated enzyme solution with a concentration of 210 units/ml. The β-mannanase obtained in this way was
% (w/v) konjac mannan solution (100 ml per 1 g of mannan) was added to 100 units per 1 g of mannan and reacted at 65°C for 50 hours. The resulting carbohydrate hydrolysis rate was 20%. As a result of analyzing the carbohydrate by high performance liquid chromatography, mannose and a series of oligosaccharides containing mannose and glucose in the molecule were detected. Example 3 The alkaliphilic bacterium Bacillus AM-044 strain (FERMP-8858) was grown using guar gum instead of konjac flour and 5% cornstarch liquor instead of polypeptone in the culture medium composition of Example 1. 21 units/ml of β was added to the culture supernatant.
- 94 ml of crude enzyme solution with mannanase activity was obtained. Then, 4 times the amount of cold isopropanol (-40°C) was added to the enzyme, and the mixture was left in a cold room overnight. The resulting precipitate was filtered and dissolved in 10 ml of 10 mM glycine-NaOH-NaCl buffer (PH9.0).
A β-mannanase solution of units/ml was obtained. The β-mannanase obtained in this way was
After pre-dissolving in sodium hydroxide solution, pH9
1% coconut oil extraction residue mannan solution adjusted to 100%
110 per 1g of mannan in ml (1g of mannan)
The hydrolysis of carbohydrates obtained by adding a unit of sugar and reacting at 70°C for 50 hours was 21%. Furthermore, as a result of analyzing this carbohydrate by high-performance liquid chromatography, mannose and a series of oligosaccharides containing mannose and galactose in the molecule were detected. Example 4 Alkaliphilic bacterium Bacillus No. AS-420 strain (FERMP-8859) was inoculated into 300 ml of the same medium (PH9.0) used in Example 1, and shaken at 200 rpm for 24 hours at 37°C. It was cultivated for a long time. The cells were then collected by centrifugation and added to 5 ml of 10mM phosphate buffer (PH).
7.0), 0.5 ml of a 10 mg/ml lysozyme chloride solution was added, and the mixture was left at 37°C overnight. Next, add polyethyleneimine to 0.1%,
The eluted nucleic acids were allowed to stand for 30 minutes to aggregate, and then centrifuged to obtain 9.5 ml of supernatant. 8.5 in Honjosumi
unit/ml of β-mannosidase. The β-mannosidase solution thus obtained was added to the elephant palm mannan β obtained in Example 1.
- Adding 20 units per gram of mannanase to a hydrolyzate and allowing it to react at 40°C and pH 7.0 for 50 hours, the resulting carbohydrate hydrolysis rate was 28%. As a result of analysis by high performance liquid chromatography, mannose and a small amount of mannooligosaccharides were detected. Example 5 The alkaliphilic bacterium Bacillus No. AS-440 strain (FERMP-8860) was inoculated into 300 ml of the same medium (PH9.0) used in Example 2, and the same culture method and method as in Example 4 were carried out. By the method for obtaining β-mannosidase, 9.6 ml of 18 units/ml β-mannosidase solution was obtained. 1 g of mannan is added to 100 ml of a 10% (w/v) konjac mannan solution (10 g of mannan) in which the β-mannosidase solution thus obtained is liquefied by the action of the β-mannanase obtained in Example 1. 20 units per and β- obtained in Example 1
Add 120 units of mannanase and incubate at 50℃ and pH 8.0.
As a result of measuring the hydrolysis rate of the carbohydrate obtained by the time reaction, it was 29%, and as a result of analyzing the carbohydrate by high performance liquid chromatography, mannose and a small amount of mannooligosaccharide were detected. Example 6 Alkaliphilic bacterium Bacillus No.AS-440 (FERM
P-8860) was grown in 9.5 ml using the same culture method and enzyme obtaining method as in Example 4, using coffee extract grounds instead of konjac powder in the medium composition of Example 1.
A β-mannosidase solution of 12 units/ml was obtained. The thus obtained β-mannosidase solution was added to 100 ml of 5% (w/v) guar gum solution (5 g of mannan) which had been liquefied by the action of the β-mannanase obtained in Example 3 per 1 g of mannan.
The results of measuring the hydrolysis rate of carbohydrates obtained by adding 25 units and 150 units of β-mannanase obtained in Example 3 and reacting at 50°C and pH 8.0 for 50 hours.
It was %. Furthermore, as a result of analyzing this carbohydrate by high-performance liquid chromatography, mannose and mannooligosaccharides containing small amounts of mannose, glucose, and galactose were detected in the molecule. Effects of the Invention As explained in detail above, according to the method for producing a mannosaccharide-containing carbohydrate of the present invention, a novel β-mannanase that satisfies all the requirements for the enzymatic decomposition reaction of β-D-mannan is produced. By using β-mannosidase and β-mannosidase, all the conventional problems have been solved, and it has become possible to provide β-mannan hydrolysis products useful in various industrial fields at a high production rate on an industrial scale. It became possible. This fact also means that the above-mentioned β-mannanase and β-mannosidase can now be mass-produced using the novel microorganisms newly searched and isolated by the present inventors using simple operations and processes, and moreover, it has become cost-effective. This is due to a number of things.
Claims (1)
ゼおよび/またはβ−マンノシダーゼを、β−
1,4−マンノピラノシド結合を主骨格として有
する糖類基質に作用させることを特徴とするマン
ノ糖含有糖質の製造法。 β−マンナナーゼ: (イ) 作用: マンナン、グルコマンナン、ガラクトマン
ナン、ガラクトグルコマンナンのβ−1,4
−D−マンノピラノシド結合を非特異的に加
水分解し、マンノオリゴ糖を生成する。 (ロ) 基質特異性: β−マンナンに特異的に作用し、α−マン
ナンに作用しない。β−1,4−D−マンノ
テトラオース以上の分子量をもつマンノオリ
ゴ糖に作用し、これを加水分解する。 (ハ) 至適PHおよび安定PH範囲: 至適PHは8〜10であり、60℃、30分間の加
熱条件下ではPH6〜10の範囲内で安定であ
る。 (ニ) 温度に対する安定性: PH8.0、30分間の加熱条件下では65℃まで
安定である。 (ホ) 作用適温の範囲: 65℃近傍に至適作用温度を有する。 (ヘ) 失活条件: 60℃、30分間の処理条件ではPH5.0および
12.5で完全に失活する。また、PH8.0、30分
間の処理では、80℃で完全に失活する。 (ト) 阻害および活性化: 塩化第二水銀、硝酸銀、エチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム(EDTANa2)、尿素、
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシル
ベンゼンスルフオン酸ナトリウム(DBS)
により阻害を受ける。 (チ) クロマトフオーカシング法による等電点: 5.0〜5.4 (リ) ゲルろ過法による分子量: 37000〜57000 β−マンノシダーゼ (イ) 作用: 非還元末端から順次β−マンノシド結合を
加水分解し、マンノースを生成する。 (ロ) 基質特異性: β−メチル(エチル)−D−マンノシドを
完全に分解し、またβ−結合のマンノースを
含むオリゴ糖に作用し、マンノースを遊離す
る。p−ニトロフエニル−グリコシドのβ−
D−マンノシドを基質となし得るが、α−D
−マンノシド、α−D−グルコシド、β−D
−グルコシド、α−D−ガラクトシド、β−
D−ガラクトシド、β−D−キシロシド、α
−L−フコシド、β−D−グルクロニドを基
質となし得ない。 (ハ) 至適PHおよび安定PH範囲: 至適PHは6〜7であり、40℃、30分間の加
熱条件下ではPH6〜9の範囲内で安定であ
る。 (ニ) 温度に対する安定性: PH6.5、30分間の加熱条件下では45℃まで
安定である。 (ホ) 作用適温の範囲: 50℃近傍に至適作用温度を有する。 (ヘ) 失活条件: 40℃、30分間の処理条件下ではPH5.0およ
び10で完全に失活する。また、PH6.5、30分
の処理では、55℃で完全に失活する。 (ト) ゲル濾過法による分子量: 63000〜68000 2 上記糖類基質がマンナン、グルコマンナン、
ガラクトマンナン、ガラクトグルコマンナン、こ
れらのオリゴマーからなる群から選ばれる少なく
とも1種であることを特徴とする特許請求の範囲
第1項記載の糖質の製造法。 3 上記β−マンナナーゼがバチルス属に属し、
アルカリ性に生育の至適PHを有する好アルカリ性
微生物、微工研菌寄第8857号または第8858号を30
〜45℃の温度にて、PH7.5〜11.5の下で培養し、
上記酵素を培養液中に生成・蓄積させて得られた
ものであることを特徴とする特許請求の範囲第1
項または第2項記載の糖質の製造法。 4 上記マンノシダーゼが、バチルス属に属し、
アルカリ性に生育の至適PHを有する好アルカリ性
微生物、微工研菌寄第8859号または同第8860号を
30〜45℃にて、PH7.5〜11.5の下で培養し、上記
酵素を菌体内に生成・蓄積させて得られたもので
ある特許請求の範囲第1項〜第3項のいずれか1
項に記載の糖質の製造法。 5 上記β−アンナナーゼおよびβ−マンノシダ
ーゼが、バチルス属に属し、アルカリ性に生育の
至適PHを有する微生物、微工研菌寄第8856号を、
30〜45℃にて、PH7.5〜11.5の下で培養し、β−
マンナナーゼを菌体外にかつβ−マンノシダーゼ
を菌体内に生成・蓄積させて得られたものである
ことを特徴とする特許請求の範囲第1項〜4項の
いずれか1項に記載の糖質の製造法。[Scope of Claims] 1 β-mannanase and/or β-mannosidase having the following physicochemical properties,
1. A method for producing a mannosugar-containing saccharide, which comprises acting on a saccharide substrate having a 1,4-mannopyranoside bond as a main skeleton. β-mannanase: (a) Action: β-1,4 of mannan, glucomannan, galactomannan, galactoglucomannan
-D-mannopyranoside bonds are non-specifically hydrolyzed to produce mannooligosaccharides. (b) Substrate specificity: Acts specifically on β-mannan and does not act on α-mannan. It acts on mannooligosaccharides with a molecular weight greater than β-1,4-D-mannotetraose and hydrolyzes them. (c) Optimal PH and stable PH range: The optimal PH is 8 to 10, and is stable within the PH range of 6 to 10 under heating conditions at 60° C. for 30 minutes. (d) Stability against temperature: Stable up to 65°C under heating conditions of PH8.0 and 30 minutes. (e) Range of optimum temperature for action: The optimum temperature for action is around 65°C. (f) Inactivation conditions: PH5.0 and
It becomes completely inactive at 12.5. Furthermore, when treated at pH 8.0 for 30 minutes, it is completely inactivated at 80°C. (g) Inhibition and activation: mercuric chloride, silver nitrate, disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTANa 2 ), urea,
Sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium dodecylbenzenesulfonate (DBS)
is inhibited by (h) Isoelectric point by chromatofocusing method: 5.0-5.4 (li) Molecular weight by gel filtration method: 37000-57000 β-mannosidase (b) Action: Hydrolyzes β-mannosidic bonds sequentially from the non-reducing end, Produces mannose. (b) Substrate specificity: Completely decomposes β-methyl (ethyl)-D-mannoside, and also acts on β-linked mannose-containing oligosaccharides to liberate mannose. β- of p-nitrophenyl-glycoside
D-mannoside can be used as a substrate, but α-D
-Mannoside, α-D-glucoside, β-D
-Glucoside, α-D-galactoside, β-
D-galactoside, β-D-xyloside, α
-L-fucoside and β-D-glucuronide cannot be used as substrates. (c) Optimal PH and stable PH range: The optimal PH is 6 to 7, and is stable within the PH range of 6 to 9 under heating conditions at 40° C. for 30 minutes. (d) Stability against temperature: Stable up to 45°C under heating conditions of PH6.5 and 30 minutes. (e) Range of optimum temperature for action: The optimum temperature for action is around 50°C. (f) Inactivation conditions: Under the treatment conditions of 40°C and 30 minutes, it is completely inactivated at pH 5.0 and 10. Furthermore, when treated at pH 6.5 for 30 minutes, it is completely inactivated at 55°C. (g) Molecular weight by gel filtration method: 63,000 to 68,000 2. If the saccharide substrate is mannan, glucomannan,
2. The method for producing a carbohydrate according to claim 1, wherein the carbohydrate is at least one selected from the group consisting of galactomannan, galactoglucomannan, and oligomers thereof. 3. The β-mannanase belongs to the genus Bacillus,
Alkaliphilic microorganisms with an optimal pH for growth in alkaline conditions, 30
Cultured at a temperature of ~45℃ and under pH7.5~11.5,
Claim 1, characterized in that the enzyme is obtained by producing and accumulating the enzyme in a culture solution.
The method for producing carbohydrates according to item 1 or 2. 4 The above-mentioned mannosidase belongs to the genus Bacillus,
Alkaliphilic microorganisms with optimal pH for growth in alkaline conditions, Fiber Microorganisms No. 8859 or No. 8860.
Any one of claims 1 to 3, which is obtained by culturing at 30 to 45°C and PH7.5 to 11.5 to produce and accumulate the enzyme in the bacterial body.
The method for producing carbohydrates described in section. 5. The above β-annanase and β-mannosidase belong to the genus Bacillus, and are microorganisms that have an optimal pH for growth in alkaline conditions.
Cultivate at 30-45℃ under pH7.5-11.5,
The carbohydrate according to any one of claims 1 to 4, which is obtained by producing and accumulating mannanase outside the bacterial cell and β-mannosidase inside the bacterial cell. manufacturing method.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP61192607A JPS6349093A (en) | 1986-08-18 | 1986-08-18 | Production of mannosaccharide-containing glucide |
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JPS6349093A JPS6349093A (en) | 1988-03-01 |
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US20090311411A1 (en) | 2006-11-21 | 2009-12-17 | Hiroyuki Kanatani | Mannooligosaccharide-containing food compositions |
-
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- 1986-08-18 JP JP61192607A patent/JPS6349093A/en active Granted
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