JPH0375530B2

JPH0375530B2 -

Info

Publication number: JPH0375530B2
Application number: JP57129560A
Authority: JP
Inventors: Hajime Sakamoto; Takao Kyota; Hiroshi Hayashi
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1982-07-27
Filing date: 1982-07-27
Publication date: 1991-12-02
Also published as: JPS5920225A; SU1605914A3

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ガン壊死因子（以下、TNFと略記
する）の安定化方法、詳しくは保存時、分離精
製、凍結乾燥などの操作を行なう際のTNFの安
定化方法に関するものである。本発明におけるTNFとは、「網内系賦活化作用
を有する物質の１種または２種以上を哺乳動物に
投与し、次いでグラム陰性菌由来のエンドトキシ
ンを注射することによつて、または哺乳動物由来
の活性化マクロフアージを含む組織培養系にグラ
ム陰性菌由来のエンドトキシンを加えることによ
つて誘発される生理活性物質で、担ガン動物に接
種することにより、ある種のガンを壊死せしめる
因子」と定義される物質である。TNFの特徴と
しては、ある種のガンを壊死せしめることの他
に、その作用が種特異的でないことが知られてい
る。たとえば、ウサギより得られたTNFがマウ
スのガンを壊死せしめることができる。さらに、
TNFはin vitroで正常細胞にはほとんど有害な
作用を及ぼさず、ある種のガン細胞（たとえば、
マウスのガンに由来するＬ−Ｍ細胞）を殺す能力
をもつことが知られている。このようにTNFは
制ガン作用を有し、種非特異的で、正常細胞に作
用しないことから制ガン剤として期待される。従来から、動物あるいは組織培養系中に誘発さ
れるTNFの量は、非常に微量であることが知ら
れている。TNFを制ガン剤として広く安全に使
用するためには、分離精製することが重要であ
り、また溶液あるいは凍結状態で長期保存した
り、凍結乾燥を行なうことは、TNFを大量に工
業的に製造する際に必須の操作である。ところが
本発明者らは、高純度のTNF溶液を保存したり、
凍結あるいは凍結乾燥を行なうと、活性が著しく
低下することを見いだした。また、高純度の
TNFの安定性について検討した報告もない。こ
のような現状では、その制ガン効果にもかかわら
ず、高純度のTNFを効率よく安定的に工業的規
模で提供することは不可能である。本発明者らは、TNFの安定化のために鋭意研
究を重ねた結果、グロブリンまたはプロタミンも
しくはその塩を添加すると長期保存しても、ま
た、分離精製、凍結乾燥などの操作を行つても、
TNFの活性が保持されることを見いだした。本
発明は、この知見に基づくものである。本発明は、TNFにクロブリンまたはプロタミ
ンもしくはその塩を添加することを特徴とする
TNFの安定化法に関するものである。本発明に用いられるTNF原料は、公知の方法
で生産される。そのようなものとしては、たとえ
ば、Matthewsら，Br.J.Cancer，42（1980）416
や、Greenら，J.Natl.Cancer Inst.，59（1977）
1519の方法が挙げられる。以下、その方法を説明
する。すなわち、哺乳動物（たとえば、マウス、ウサ
ギ、モルモツトなど）に網内系賦活化作用を有す
る物質の１種または２種以上を静脈内または腹腔
内に注射する。網内系賦活化作用を有する物質と
しては、通常グラム陽性菌、原生動物または酵母
が用いられ、生菌状態、死菌状態（たとえば、熱
処理やホルマリン処理後）または菌体抽出成分と
して投与される。ここでグラム陽性菌としては、たとえば、
Propionibacterium acnes（Corynebacterium
parvum）、Propionibacterium granulosum
（Corynebacterium granulosum）のような
Propionibacteria、Bacillus Calmette−Gue´rin
（BCG）、Mycobacterium smegmatisのような
Mycobacterria、Nocardia erythropolis、
Nocardia gardneriのようなNocardiasが挙げら
れる。原生動物としては、たとえばマラリア原
虫、トキソプラズマが挙げられる。酵母の場合、
通常Saccharomyces cerevisiaeなどから抽出し
たZymosanが用いられる。また、ピランコーポ
リマーのような合成高分子化合物を用いることも
できる。網内系賦活化作用を有する物質の投与後７〜14
日後にグラム陰性菌より得られたエンドトキシ
ン、たとえば、大腸菌、緑膿菌、チフス菌由来の
リポポリサツカライドを該哺乳動物の静脈内に注
射する。注射後1.5〜２時間後に該哺乳動物の体
液（たとえば、腹水、リンパ液など）および／ま
たは血清もしくは血漿を得るか、または該動物の
肝臓、脾臓等の臓器を均一に破砕し、生理食塩水
で抽出してTNF原料を得る。本発明に用いられるTNF原料の生産方法は、
上記に限られるものではない。すなわち、細胞培
養法のようなTNF原料生産法も採用できる。このようにして生産されたTNF原料は、通常
の生化学的分離精製方法を組み合わせて分離精製
される。そのようなものとして、たとえば、硫酸
アンモニウムによる塩析法、陰イオン交換樹脂に
よるイオン交換クロマトグラフイー、ゲル過
法、電気泳動法などが挙げられる。これらの方法
を組み合わせて、分離精製工程を進めて精製度を
上げていくと、TNFは次第に不安定となる。た
とえば比活性（１mgの総蛋白質中に含まれる
TNFの活性、活性の単位は後述）50万単位／mg
まで精製したTNF試料は、実施例に示すように
非常に不安定である。比活性がこれより低い
TNF試料も程度の差はあるが、保存したり、凍
結、凍結乾燥などの操作により、その活性が低下
する。本発明の対象となるものは、このように精
製度が上がり不安定となつたTNFであり、溶液
および粉末のいずれでもよいが、特にTNFを含
有する溶液である。本発明で用いられるTNFを含有する溶液のPH
は５〜10に保たれていることが好ましく、適当な
緩衝液で調整されていることがより好ましい。そ
のような緩衝液としては、たとえば、リン酸緩衝
液、トリス〔tris（hydroxymethyl）
aminomethane〕−塩酸緩衝液などが挙げられる。
目的によつては塩を加える場合もある。用いられ
る塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムな
どがあり、その濃度は目的によつて決定される。
たとえば、注射用として用いる場合には、塩化ナ
トリウムを0.15Mになるように加え等張液とす
る。本発明で用いられるグルブリンとしては、動物
由来の血清グロビリンが挙げられ、由来動物とし
ては、たとえば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒ
トなどが挙げられ、いずれも安定化効果に大差は
ない。注射用製剤の安定化剤として用いる場合に
は、公知の方法にしたがつて精製されたヒトガン
マーグロルリンが最も好ましい。本発明で用いられるプロタミンとしては、たと
えば、サケ、ニシン、サバなどのプロタミンまた
はその塩（たとえば、硫酸塩）が挙げられ、いず
れも安定化効果に大差はない。注射用製剤として
用いる場合には、公知の方法によつて医療用に精
製されたプロタミンまたはその塩が好ましい。グロブリンおよびプロタミンまたはその塩の添
加濃度は、TNFを含有する溶液１mlあたり1μg以
上、より好ましくは10μg以上、さらに好ましく
は100μg以上である。添加濃度の上限は常識的、
経済的観点から決められ、同溶液１mlあたり50mg
である。なお、TNFを含有する粉末に添加する
場合の、グロブリンおよびプロタミンまたはその
塩の添加量は、該粉末に溶解した際に、上記の溶
液濃度になるように選ばれる。添加方法は特に限定されないが、たとえば、グ
ロブリンおよびプロタミンまたはその塩の粉末を
直接TNF含有溶液に添加する方法、あらかじめ
同粉末を水あるいは適当な緩衝液に溶解して添加
する方法、または同粉末をTNF含有粉末と混合
せしめて添加する方法が挙げられる。添加時期
は、分離精製過程であつても、製剤化工程であつ
てもよい。グロブリンおよびプロタミンまたはその塩を共
に添加する方法もまた本発明の方法に含まれる。
その場合、両物質の合計量が、先に述べた添加濃
度および量になるように調整すればよい。このようにグロブリンまたは／およびプリタミ
ンもしくはその塩を添加したTNFを含有する溶
液は、溶液状態のままでは０〜30℃、より好まし
くは０〜10℃で保存あるいは分離精製、製剤化操
作をすることが好ましい。また、同溶液を凍結状
態で保存する場合は０℃以下、より好ましくは−
20℃以下とすることが望ましい。本発明における
グロブリンまたは／およびプロタミンもしくはそ
の塩を添加したTNFを含有する溶液では、溶液
状態または凍結状態での保存中あるいは分離精
製、製剤化操作中にもTNFの活性は保持される。また、本発明の方法は、凍結乾燥操作に対して
も有効である。すなわち、TNFを含有する溶液
を常法により凍結乾燥を行なうと（特に高純度の
場合）、その活性は低下するが、同溶液にグロブ
リンまたは／およびプロタミンもしくはその塩を
添加することによつてTNFの活性は低下しない。
また、凍結乾燥後にグロブリンまたは／およびプ
ロタミンもしくはその塩を添加してもよい。粉末
状態での保存は、室温あるいは室温以下が好まし
い。 TNFの活性測定は、in vivoで腫瘍壊死効果を
測定する方法と、in vitroでガン細胞を殺す効果
を測定する方法がある。 in vivo法としては、たとえば、Carswellらの
方法，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，72（1975）
3666が挙げられる。この方法は、移植したMeth
Ａ sarcomaによる腫瘍をTNFが壊死させる効
果を測定するものである。すなわち、（BALB／
ｃ×C57BL／６）F₁マウスの腋下部皮内に２×
10⁵コのMeth Ａ sarcoma細胞を移植する。７
日後、移植した腫瘍の大きさが直径７〜８mmとな
り、出血性壊死などがなく良好な血行状態にある
マウスを選び、尾静脈より生理食塩水で希釈した
0.5mlのTNF試料を注射し、24時間後に次の判定
基準により判定を行なう。（−）：変化なし（＋）：かすかな出血性壊死（）：中程度の出血性壊死（移植ガン表面の
真中から50％以上にわたつて壊死）（）：顕著な出血性壊死（移植ガンの中央部
が重度に壊死し、周囲のガン組織がわずか
に残つた状態） in vitro法によるTNF活性測定は、たとえば、
Ruffら〔Lymphokine Reports Vol.，ed.by
E.Pick，Academic Press，N.Y.（1980）235〕、
あるいはKullら〔J.Immunol.，126（1981）
1279〕の方法が挙げられる。本発明者らが用いている方法は、これらを各良
したものであり、TNFがＬ−Ｍ細胞（アメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン，
CCL1.2）を殺す効果を測定するものである。す
なわち、順次培地で希釈したTNF試料0.1mlと
10⁵コ／mlの濃度のＬ−Ｍ細胞の培地懸濁液0.1ml
を96穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・
ラボラトリー社）に加える。培地は10v／ｖ％の
ウシ胎児血清を含むイーグルのミニマム・エツセ
ンシヤル培地（その組成は、たとえば、「組織培
養」中井準之助他編集、朝倉書店、1967年に記載
されている）を用いる。マイクロプレートを５％
の炭酸ガスを含む空気中、37℃で48時間培養す
る。培養終了後、グルタルアルデヒド20μを加
え細胞を固定する。固定後、マイクロプレートを
洗浄、乾燥して、0.05％メチレンブル−溶液を
0.1ml加え、生き残つた細胞を染色する。余分な
メチレンブルーを洗い流し乾燥した後、残つたメ
チレンブルーを３％塩酸溶液で抽出し、その
665nmにおける吸光度をタイターテツク・マルチ
スキヤン（フロー・ラボラトリー社）で測定す
る。この吸光度は、生き残つた細胞数に比例す
る。TNF試料を加えない対照の吸光度の50％の
値に相当するTNF試料の希釈率を、グラフある
いは計算によつて求め、その希釈率を単位
（Ｕ）／mlと定義する。以下、本発明における
TNFのin vitro活性は、すべてこの単位で表示
される。本発明の方法によれば、制ガン剤として期待さ
れているTNFを溶液、凍結、凍結乾燥状態での
保存や、分離精製、製剤化操作の際にもその活性
は保持されるので、高純度のTNFを効率よく安
定的に工業的規模で提供することが可能となる。
また、安定化剤としてヒトグロブミンまたはプロ
タミンもしくはその塩を用いる場合には、人体に
投与しても安全で、TNFを制ガン剤として用い
る際にきわめて有利である。次に、実施例によつて本発明をさらに詳細に説
明する。実施例１比活性500000U／mgであるウサギ由来のTNF
を用いて、1200U／mlの活性を有するTNF溶液
（0.15M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液
PH7.0）を調製した。該TNF溶液に各種濃度のヒ
トガンマーグロブリンを添加し、４℃で保存し、
経時的（２日，７日，30日目）に、本明細書中に
記載したin vitroおよびin vivo評価法で残存活
性を測定した。in vitro法の場合は、得られた測
定値より残存活性率（％）を算出した。結果は他
の実施例の結果と共に表１に示す。また図面にヒ
トガンマーグロブリンの各種添加濃度に対する７
日間保存後のTNF残存活性率を示す。なお、in
vivo評価、該処理溶液を限外過濃縮装置，ミニ
モジユールNM−３（旭化成工業製，フナコシ薬
品販売）にて20倍濃縮し、１匹当り0.5mlを尾静
脈に投与し、投与後24時間目の壊死の程度を５匹
１群で観察した。実施例２実施例１と同様の活性濃度を有するTNF溶液
を調製し、該TNF溶液に各種濃度のヒトガンマ
ーグロブリンを添加し、凍結（−70℃）と融解を
繰り返し（１回，３回）、その残存活性をin
vitro評価法で測定した。また、該溶液を−70℃
に凍結後、凍結乾燥機で凍結乾燥を行ない、次い
で、該凍結乾燥品を１週間室温で放置後、滅菌蒸
留水を加えて溶解し、残存活性率をin vitro評価
法で求めた。なお、該凍結乾燥品は、実施例１と
同様にin vivo評価を行ない、制ガン効果につい
ても確認をした。結果を表１に示す。実施例３実施例１と同様の方法で、ヒトガンマーグロブ
リンの代わりにサケ硫酸プロタミンを用いてその
安定化効果を調べた。結果を表１に示す。実施例４実施例２と同様の操作で、ヒトガンマーグロブ
リンの代わりにサケ硫酸プロタミンを用いてその
安定化効果を調べた。結果を表１に示す。比較例実施例１と同様の活性濃度を有するTNF溶液
に、通常の生理活性物質の溶液安定化剤としてよ
く知られている各種アミノ酸、金属塩類およびキ
レート剤を添加し、４℃で保存し、７日間保存後
のTNF残存活性率をin vitro評価により求めた。
結果を表２に示す。

【表】

【表】以上の実施例、比較例から明らかなように、本
発明の安定化法によれば、溶液状態での保存、凍
結、融解、凍結乾燥などの操作時において、
TNFの活性を安定的に保持することが可能であ
り、TNF製造時の精製工程、製剤化工程などへ
の応用はもちろんのこと、製品化した際の製品安
定性をも保証するものである。

【図面の簡単な説明】

図面はヒトガンマーグロブリンの添加濃度に対
する４℃７日間保存後のTNF in vitro残存活性
率との関係を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１ガン壊死因子にグロブリンまたはプロタミン
もしくはその塩を添加することを特徴とするガン
壊死因子の安定化法。