JPH03505210A

JPH03505210A - エラスターゼ阻害ポリマーおよび方法

Info

Publication number: JPH03505210A
Application number: JP1510119A
Authority: JP
Inventors: ディゲニス，ジョージ，エイ．; バンクス，ウイリアム，アール．; リィパセック，フランティセック; アグハ，ブシュラ
Original assignee: Czech Academy of Sciences CAS; University of Kentucky Research Foundation
Current assignee: Czech Academy of Sciences CAS; University of Kentucky Research Foundation
Priority date: 1988-09-09
Filing date: 1989-09-08
Publication date: 1991-11-14
Also published as: EP0403605A1; EP0368449A2; WO1990002558A1; EP0403605A4; EP0368449A3; AU4229689A; AU625292B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】エラスターゼ阻害ポリマーおよび方法剤、ならびに動物およびヒトにおけるその酵素活性を阻害するためのそれらの利用に関する。本発明はまた、親水性で可撓性で生体内で実質的に分解を受けないポリマーに多くの単位のペプチドエラスターゼ阻害剤を結合させることによって、この阻害剤の生物学的半減期および／またはエラスターゼ酵素阻害活性を増大させる方法に関する。

背景技術多形核白血球およびマクロファージからのプロテアーゼ、とぐにエラスターゼ（ヒト白血球エラスターゼおよびカテプシンＧ）は、炎症、関節炎および気腫に伴う慢性組織破壊の原因と考えられている。感染または炎症時には、正常な肺は、グロテアーゼ阻害剤αニーアンチトリプシンによって蛋白分解的消化から保護される。その保護機構は、遺伝的なまたは他の原因にょるα、−アンチトリプシン欠損患者では作動しない。

Ｃ１−アンチトリプシンに代用できる合成エラスターゼ阻害剤はしたがって、肺気腫や関連疾患の治療に有用でおる。

数種のエラスターゼ阻害剤がこれ萱で文献に報告されている。この中には、Ｐ、Ｍ、Ｔｕｈｙ　２よびＪ、Ｃ，Ｐｏｗｅｒｓ：’　　　Ｉｎｈｉｂｉｔｊｏｎ　　ｏｆ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　　ＥｌａｓＬａｓｅ　　ｂｙＰｅｐｔｉｄｅ　　Ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ　　Ｋｅｂｏｎｅｓ　　　’　　、ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔ、　　　５　　Ｑ　　：３５９〜６６１Ｃ１９７５）、Ｊ、Ｃ，Ｐｏｗｅｒｓ、　Ｂ、Ｆ。

Ｇｕｐ？ｏｎ、　　Ａ、Ｄ、Ｈａｒｌｅｙ、　　Ｎ、Ｎ１５ｈｉｕｏ　　２　　よ　び　Ｒ，Ｊ　、Ｗｈｊ　ｔｌｅｙ：’　　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　　ｏｆ　　Ｐｏｒｃｉｎｅ　　Ｐａｕｃｒｅａｔｊｃ　　Ｅｌａｓｔａｓｅ。

Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ＫｌａｓＬａｓｅ　ａｎｄ　Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　Ｇ。

Ｉｎｈｊｂｉｂｉｏｎ　　ｗｊｔｈ　　Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ　　Ｋｅｔｏｎｅｓ　　　’　　、Ｂｉｏｃｂｅｒｎ、　　　Ｂｊｏｐｈｙｓ、　　Ａｃｅａ、　　　４　８　５　　　：　　　１　　５　６　〜１　６６（１９７７）に記載されているペプチドクロロメチルケト７　；　Ｃ，Ｐ、Ｄｏｒｎ、　Ｍ、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、　Ｓ、Ｓ、Ｙａｎｇ、　Ｅ、Ｃ。

Ｙｕｒｅｗｉｃｚ、　Ｂ、Ｍ、Ａｓｈｅ、　Ｒ，Ｆｒａｎｋｓｈｕｎ　２よびＨ，Ｊｏｎｅｓ　：”　　ＰｒｏＬｅｉｎａｓｅ　　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、　　１　　、　　工ｎｈｉｂｉ　しｏｒｓ　　ｏｆＥｌａｓｔａｓｅ　’、Ｊ、Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　２０　＋　１４６４〜１４６８（１９７７）、Ｊ　、Ｃ，ＰｏｗｅｒｓおよびＢ、Ｆ、　Ｇｕｐｔｏｎ　：’　　Ｒｅａｃｔｊｏｎ　　ｏｆ　　５ｅｒｊｎｅ　　Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　　ｗｊ　しｈ　　Ａｚａａｍｉｕ。

Ａｃ１ｄ　　ａｎｄ　　Ａｚａ−ｐｅｐｔｊｄｅ　　Ｄｅｒｉｖａｔｊｖｅｓ　　　’　　、Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　４°６　：２０８〜２１６（１９７７）に記載でれているアゾペプチド；　Ｔ、Ｙｏｓｈｊｍｕｒａ、　Ｌ、Ｎ、Ｂａｒｋｅｒ２　よ　び　Ｊ、Ｃ，Ｐｏｗｅｒｓ　　：　　’　　５ｐｅｃｊｆｉｃｊ　ｂｙ　　ａｎｄ　　Ｒｅａｃｔｊｖｊ　ｂｙｏｆ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　　Ｅｌａｓｔａｓｅ、　　Ｐｏｒｃｊｎｅ　　ＰａｎｃｒｅａｔユＣＥｌａｓｔａｓｅ、　　Ｈｕｍａｎ　　０ｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　　Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　　Ｇ、　　　ａｎｄＢｏｖｊｎｅ　Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ＥｌａｓＬａｓｅ、　Ｈｕｍａｎ　Ｃ）ｒａｎｕｌｏｃｙｌＣａＬｈｅｐｓｊｎ　　Ｇ、　　　ａｎｄ　　Ｂｏｖｉｕｅ　　Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　　Ｃｈｙｍｏしｒｙｓｉｎｗ４ｔｈ　　Ａ、ｒｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　　Ｆｌｕｏｒｉａｅｓ、　　　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　　ｏｆ　　ａ　　ｎｅｗｓｅｒｉｅｓ　　ｏｆ　　ｐｏｔｅｎｔ　　ａｎｄ　　５ｐｅｃｊｆｊｃ　　ｊｒｒｅｖｅｒｓｊｂｉｅＥｌａｓＬａｓｅ　　工ｎｈｉｂｊｂｏｒｓ　　　’　　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　　Ｃｈｅｍ、、　　　２　５　７　　：５０７７〜５０８４（１９８２）に記載さｎているスルホニルフルオリド；　Ｍ、　Ｚｊｍｍｅｒｍａｎ、　Ｈ，Ｍｏｒｍａｎ、　Ｄ。

Ｍ＋、Ｌｖｅｙ、　Ｈ，Ｊｏｎｅｓ、　Ｒ，ＦｒａｕｋｓｈｕｍおよびＢ、Ｍ、Ａｓｈｅ　：’　　工ｎｈｉｂｊｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｅｌａｓｔａｓｅ　　ａｎｄ　　０Ｌｈｅｒ　　５ｅｒｊｕｅＰｒｏｔｅａｓｅｓ　　ｂｙ　　Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　　Ａｃｙｌａｔｊｎｇ　　Ａｇｅｎｔｓ　　’　　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　　２５　　：　　９８　４８　〜９８５　１　　　（１９８０バＢ、Ｍ、Ａｓｈｅ、　Ｒ，Ｌ、Ｃ１ａｒｋ、　Ｈ，ＪｏｎｅｓおよびＭ、　Ｚｊｍｍｅｒｍａｎ　：’　　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　　Ｉｎｈｉｂｊｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｈｕｍａｎ　　ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＥｌａｓｂａｓｅ　　ａｎｄ　　Ｂｏｖｊｎｅ　　　ａｌ−ＣｈｙｍＯＬｕｙｐ１９ｉｎ　　ｂ７　　ＮｏｖｅｌＨｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ　　’　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５６　　：　　１　１６０５〜１１６０６（１９８１）に記載されている異項環アシル化剤；　Ｗ、Ｃ，Ｇｒｏｕｔａｓ、　Ｒ＋Ｃ，Ｂａｄｇｅｒ、　Ｔ、Ｄ、　０ｃａｊｎ。

Ｄ、Ｆｅ１ｄｅｒ、　Ｊ、ＦｒａｎｋｓｏｎおよびＭ、Ｔｈｅｏｄｏｒａｋｉｓ　：　Ｂｊｏｃｈｅｍ。

Ｂｊｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍｍｕｎ、、　　　　９５　　：１８９０　　（１９８０）に記載されているイミダゾールＮ−刀ルポキシアミド；Ｒ，Ｅ、５ｃｏｆｊｅ１４．　Ｒ，Ｐ、Ｗｅｒｕｅｒ　ｓｒよびＦ、Ｗｏｌｄ　：　　’　Ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　　Ｃａｒｂａｍａｔｅｓ　　ａｓ　　ＡｃＬｉｖｅ−８ｊ　　しｅ−８ｐｅｃｉｆｉｃＲｅａｇｅｎＬｓ　　　ｆｏｒ　　５ｅｒｉｎｅ　　Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　　　”　　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ　しｒｙ。

１６：２４９２（１９７７）に記載されているｐ−二トロフ二二ルカルバメートがアル。

ある種のペプチドクロロメチルケトンは、動物モデルに２いてエラヌターゼ誘発気腫の防止に有効なことが示さｎている（　Ａ、ＪａｏｆｆおよびＲ，Ｄｅａｒｉｎｇ　：”　　Ｐｒｅｖｅｎｂｊｏｎ　　　ｏｆ　　Ｅｌａ６ｔａｓｅ　　　Ｉｎｄｕｃｅｄ　　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＥ＋ｒ＋ｐｈ’ｙｓｅｍａ　　ｂｙ　　０ｒａｌ　　Ａｄｍｊｎｉｓｃｒａｔｉｏｕ　　ｏｆ　　５ｙｎｔｈｅし１ｃＥ１ａｓＬａｓｅ　　ｒｎｈｉｂｉ　しｏｒ　　　１　、Ａｍ、Ｊ、Ｒｅ５ｐｔｒ、　　Ｄｉｓ、、　　　１　２　１　　：１０２５〜１０５０．１９８０）。しかしながら、このような反応剤がヒトの気腫の治療に使用できるかどうかはかなり疑問である。連続的に使用された場合、これらの阻害剤中のアルキル化残基が毒性を示す可能性があるので、これは驚くべきことではない。ヒトへの使用に適当であるためには、酵素阻害剤は高度の選択性を有し、しかも有害な副作用は最小限でなければならない。その結果として、大部分の薬剤は特定の酵素または受容体部位に可逆的に結合する分子である。

たとえば、アセチルコリンニステラーゼの阻害剤として臨床的に用いられてきたカルバメートエステル、フィゾスチグミンおよびネオスチグミンがその例である（　Ａ、Ｇ、　Ｇｉ１ｍａｎ＋　Ｌ、Ｓ、Ｇｏｏｄｍａｎ　ＷよびＡ、Ｇｊ　１ｍａｎ　：　”　ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｂａ５ｉｓ　　ｏｆ　　Ｔｈ＋ｅｒａｐｅｕｔｊｃｓ　　’　　ｔ　　１　０　１　　頁、Ｍａｃ　　Ｍｊｌｌａｎ　　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　　Ｃｏ、、　　　１　９　８　０　　）　　。

米国特許第４，６４５．９９１号、Ｔｓｕｊｉ　Ｋ、ら二Ｂ、Ｂ。

Ｒ，Ｃ，，１２２（２）＋５７１（１９８４）およびＤｓ　ｇｅｎｉ　ｓ　。

Ｃ）、Ａ、ら：　Ｊ、Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、、　２９　＋　１４６８　（１９８６）には特異的な、活性部位に向けられた阻害剤で、この目的での他の従来化合物に伴う欠点をもたないペプチドエラスターゼ阻害剤が記載されている。

しかしながら、特異的で活性部位に向けられたエラスター七９酵素明讐剤にはなお、生物学的半減期の延長、エラスターゼ酵累阻害活注の増強が求められている。

不発明は、式％式％）〔式中、Ｐは少なくとも１単位の式、（ＡｍＢｎ）　（式中、（ＡｍＢＢ）　は生体内で実質的に分解されず、平均分子量約１，０００〜５００．０００ダルトンで、ｍｈよびｎは互いに同一であるかまたは異なり約５〜３，０００であシ、ＡおよびＢは互いに同一であるかまたは異なシ、Ａ２よびＢの少なくとも一方はＬおよび只の一方と共有結合できる）からなるポリマーであり、（式中、Ｘは酸素または硫黄であシ　Ｂｌは直鎖状および二級分岐鎖（Ｃ１−ｃａ　）アルキル、（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ，）アルキニル、（Ｃｓ＜６）シクロアルキルおよびベンジルからなる詳よシ選ばれ　Ｒ２は置換および非置換フェニル（この場合、ｆ！１換基はニトロ２よびペンタフルオロからなる詳よシ選ばれる〕、ベンシル、ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３．１−低級アルキルテトラゾリル、１−２エニルテトラゾリル、２−チオキソ−６−チアシリシェル、ピリジルならびにベンゾチアゾリルからなる群より選ばれる。ただし、Ｒ２がｐ−ニトロフェニルの場合にはＲ′は三級ブチル、ベンシルまたはシクロヘキシル以外で６り、Ｘが硫黄の場合にはＲ２はベンジル以外である）で示される化合物Ｃ１以下の一般式（式中、Ｘは０またはＳであＣ１Ｒ２はフェニル、二）　ｏ　７　ｘ　＝　ル、７Ａ、オａ　７　ｘ　二／ｌ／、−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２．１−低級アルキルテトラゾリル、１−７エニルテトラゾリル、ベンジル、２−チオキソ−３−チアゾリジニル、ピリジルおよびベンゾチアゾリルからなる群よシ選ばれ、Ｒ′は直鎖状および二級分岐鎖（Ｃｌ＜、）アルキル、（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２Ｓ−ｃ、）アル午二Ａ、、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルおよびベンジルからなる群よシ選ばれる。ただし　Ｂ２がｐ−ニトロフェニルの場合にはＲ′は三級°ブチル、ベンジルｔたはシクロヘキシル以外であジ、Ｘが慨黄の場合にはＲ２はベンジル以外である）で示される化合物り、および式（式中、ＺはＯ−５ｕｅ−Ａｌａ−Ａｌａである〕で示される化合ｖＡＥからなる群より選ばれる化合物であって、それぞｎＬまたはＡおよびＢの一方に共有結合し、Ｌは共有結合ならびに、ＲとＡおよびＢの一方に共有結合するリンカ−基からなる群より選ばれ、ｑは約１からｍ＋Ｄまでである〕で示されるポリマーに関する。

本発明はまた、上述のポリマーのエラスターゼ阻害倉、および担体からなるエラスターゼ酵素阻害組成物に関する。

また本発明の一部として、本発明のポリマーのエラスターゼ阻害ｆを、このような治療を必要とする動物またはヒトに投与することからなる動物またはヒトの酵素エラスターゼの阻害方法が包含される。

本発明はまた、上述の本発明のエラスターゼ酵素阻害組成物を、このような治療を必要とする動物またはヒトに投与することからなる動物またはヒトの酵素エステラーゼの阻害方法に関する。

本発明はまｔその一部として、式（式中、又は酸素または硫黄でろり、Ｒ′は直鎖状２よび二級分岐鎖（Ｃ１−Ｃ，）アルキル、（Ｃ２り３）アルケニル、ベンジルからなる群よｐ選ばｉ、Ｒ２は置換２よび非ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２．１−低級アルキルテトラゾリル、１ −フェニルテトラゾリル、２−チオキソ−６−チアゾリゾニル、ピリゾルならびにベンゾチアゾリルからなる群より選ばれる。ただし　Ｂ２がｐ−ニトロフェニルの場合にはＲ′は三級ブチル、ベンジルま次はシクロヘキシル以外でらシ、Ｘが硫黄の場合にはＲ２はベンジル以外である）で示される化合物Ｃ１以下の一般式％式％（式中、Ｘは０またはＳであり　Ｒ２はフェニル、ニトロフェニル、フルオロフェニル、−ＣＨ２ＣＦ　２　ＣＦ　２　ＣＦ　２．１−低級アルキルテトラゾリル、１−７ニニルテトラゾリル、ベンシル、２−チオキソ−３−チアゾリジニル、ピリゾルおよびベンゾチアゾリルからなる群よシ選ばれ、Ｒ′は１傾状ま之は二級分′ｔＩｃ鎖（Ｃｌ−Ｃ、）アルキル、（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２ −ｃ、）アルキニル、（Ｃ３−く。）シクロアルキルおよびべ／ゾルからなる群よシ選ばれる。ただし　Ｂ２がｐ−ニトロフェニルノ場合にはＲ′は三級ブチル、ベンジルまたはンクロヘ斤シル以外でらシ、Ｘが硫黄の場合にはＲ２はベンシル以外である）で示される化合物り、２よび（式中、Ｚ　ｒｉＯ−８ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａである）で示さｎる化合物Ｅからなる群より選ばれる化合物の生物学的半減期全延長させる方法を包含する。

ＲはそれぞれＬまたはＡおよびＢの一方に共有結合し、Ｌは共有結合ならびに、ＲとＡおよびＢの一方に共有結合するリンカ−基からなる群よｐ選択され、ｑは約１からｍ＋ｎまでである。

さらに、本発明はまた、式［％式％（式中、Ｘは酸素または硫黄であシ、Ｆ２はフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ヘンタフルオロフェニル、−Ｏ−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ二ＣＦ２　％　１−メチルテトラゾリル、１−フェニルテトラゾリル、２−チオキソ−３−チアゾリゾニル、ピリジル、ベンジルおよびベンゾチアゾリルからなる群よシ選ばれ、Ｒ′は低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルおよびベンジルから選ばれる。

ただし、Ｒがｐ−ニトロフェニルの場合はＲ′は三級ブチル以外であシ、Ｘが硫黄の、場合はＲはベンシル以外である）で示される化合物Ｃ１以下の一般式（式中、ＸはＯま九はＳであシ　Ｂ２はフェニル、ニトロフェニル、フルオロフェニル、−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２．１−低級アルキルテトラゾリル、１−フェニルテトラゾリル、ベンシル、２−チオキン−３−チアゾリジニル、ピリゾル２よびベンゾチアゾリルから選ばれ　Ｒ１は直鎖ま九は二級分岐鎖（Ｃ１Ｋ４）アルキル、（０２貨３）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ，）アルキニル、（Ｃ３−０６）　シ／　ｃ＋　フルキルおよびベンジルから選ばれる。ただし、Ｒ２がｐ−二トロ２エニルの場合はＲ′は三級ブチル、ベンジルまたはシクロヘキシル以外であシ、Ｘが硫黄の場合にはＲ２はベンジル以外である）で示される化合物Ｄ、および式（式中、ＺはＭｅＯ−５ｕｅ−Ａｌａ−Ａｌａである）で示される化合物Ｅからなる群よシ選ばれる化合物のエラスターゼ酵素阻害活性を増強する方法に関する。

ＲはそｎぞれＬまたはＡお↓びＢの一方に共有結合し、Ｌは共有結合ならびに、Ｒ（：Ａ＄−よびＢの一方に共有結合するリンカ−基からなる群よシ選択され、ｑは約１からｍ＋ｎまでである。

添付の図面を考慮しながら以下の詳細な説明を参照することによって本発明がよシよく理解されると同時に、本発明とその利点のさらに完全な評価が容易にな第１図は、基質としてＭｅＯ−８ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡを用いた各種ペゾチジルカルバメート誘導体およびα１−プロテアーゼ阻害剤（Ｃ１−ＰＩ）によるヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）の阻害を示し、基質濃度は１．６２Ｘ１［）−’Ｍ、酵素濃度は３．４　Ｘ　１０−８Ｍである。

第２図は、例２に記載のポリマー結合化合物（ポリマー■）の累積分子量分布を示す。

第３図は、例２のポリマー結合化合物（ポリマー■）の吸収スペクトルを示す。

第４図は、化合物と例２のポリマー（化合初夏〕の反応混合物の様々な反応時間におけるデル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析を示す。

第５図は、エラスターゼ阻害ペプチドの例２のポリマー（化合物置）への結合を示す。

本発明の他の目的、利点および特徴は、本技術分野の熟練者には以下の説明から明らかでろろう。

本発明は、米国特許第４．６４５．９９１号に同じ発明者らによって提供されたエラスターゼ酵素のペプチド阻讐剤の生物学的半減期２よび／または効力を改醤することの要望から生じたものである。不発明者らは、公知のベプデド阻讐剤の多ぐの単位を可撓性の一状ボリマーに共有結合させると、驚くべきことに生成物ポリマーがエラスターゼ酵素の阻害に関して高い生物学的半減期および／または効力を有することを発見した。

これは全く予期し得ないものでらつ之。

本発明によって提供されるポリマーは、式％式％）〔式中、Ｐは少なくとも１単位の式（ＡｍＢｎ）　Ｃ式中、（ＡｍＢｎ）は生体内で実質的に分解されず、平均分子量約１．ＯＤ　Ｏ〜５００．０００ダルトンで、ｍｓ”よびｎは互いに同一であるかまたは異なり約５〜３．ＯＤ　Ｏであシ、ＡおよびＢは互いに同一であるかまたは異な力、ＡおよびＢの少なくとも一方はＬおよび只の一方と共有結合できる）からなるポリマーであジ、Ｒは式（式中、Ｘは鍍累または砿貢であシ、Ｒ′は直鎖状および二級分岐鎖（Ｃ１”４）アルキル、（Ｃ２＜３）アルケニル、（Ｃ２％Ｃ，）アルキニル、（Ｃ３−０６）シクロアルキルおよびベンジルからなる群より選ばれ　Ｒ２は置換または非置換フェニル（この場合、置換基はニトロ、ペンタフルオロからなる群よシ選ばれる）、ベンシル、ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３．１−低級アルキルテトラゾリル、１−フェニルテトラゾリル、２−チオキソ−３−チアシリンジニル、ビリゾル訃よびベンゾチアゾリルからなる群より選ばれる。ただし、Ｒ２カｆｐ−ニド０フエニルの場合にはＲ′は三級ブチル、ペンシルまたはシクロヘキシル以外であシ、Ｘが硫黄の場合にはＲ２はベンジル以外である）で示される化合物Ｃ１以下の一般式％式％（式中、Ｘは０またはＳであり、Ｒ２はフェニル、ニトロフェニル、フルオロフェニル、−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３．１−低級アルキルテトラゾリル、１−フェニルテトラゾリル、ペンシル、２−チオキソ−６−チアゾリジニル、ピリジルおよびベンゾチアゾリルからなる群よシ選ばれ　Ｒ１は直鎖状または二級分岐鎖ＣＣｘ〜Ｃυアルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキニル、（０３〜Ｃ６）シクロアルキルおよびベンシルからなる群よシ選ばれる。ただし　Ｂ２がｐ−ニトロフェニルノ場合にはＲ′は三級ブチル、ベンジルまたはシクロヘキシル以外で６Ｌ　Ｘが硫黄の場合にはＲ２はベンジル以外でめる）で示される化合物Ｄ、および式（式中、ＺはＭｅＯ−５ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａである）で示される化合物Ｅからなる群より選ばれる化合物であって、それぞれＬまたはＡおよびＢの一方に共有結合し、Ｌは共有結合ならびに、ＲとＡおよびＢの一方に共有結合するリンカ− 基からなる群よシ選ばれ、ｑは約１からｍ＋ｎまでである〕で示される。

これらのポリマーは、１ｎｖｊｔｒｏおよび１ｎｖｉｖｏの両者で、エラスターゼ酵素の活性全阻害するのに適している。これらをｊｎｖｊｖｏでのエラスターゼ酵素の阻害に利用する場合には、もっばら医薬的に許容されるポリマーが使用できる。これらは本技術分野において公知であって、本明細書にとぐに言及するまでもない。

本発明のポリマーを酵素のｉＴ：ｌ　Ｖｉ　ｔｒｏ阻害に利用する場合は、これらは医薬的に許容されるものでおる必要はない。したがって、多数のポリ！−がｊｕ　Ｖｊ　ｔｒ□で用いられる本発明の阻害ポリマーの設計に最終的に適している。

一般に、本発明に使用するのに適当なポリマーは水溶性ポリマーであＢ１好ましぐは容易には生体内で分解さｎない可撓性バックボーン講造を有し、シフｔがって長い生物学的半減Ｍを有するポリマーでおる。さらに好ましいポリマーは、水溶性で実質的に生体内で分解されず、しかも可撓性のポリマーバックボーンを有するものである。ポリマーが示す高い可撓性は、ポリマーに結合された阻害性分子の酵素への接近を増大させるのに有効である。

本発明に使用するのに適当なポリマーは、主鎖にアミド結合全含有するポリマーである。とぐに有用なものは、合成ポリアミノ酸の誘導体で、その例にはα−ヒドロキシアルキル−Ｄ、Ｌ−アスパラギン酸アミドのランダム共重合体、たとえばボタα−ＣＮ−Ｃ２−ヒドロキシエチル）−Ｄ、Ｌ−アスパラギン酸アミド〕が包含され、この場合２−ヒドロキシエチル側鎖の分画が上述の付加反応性残基によって置換される。

適当なポリマーの他の例には、多糖誘導体、とぐにデキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸およびヒアルロン酸の誘導体もしくはそれらの配合物、または他のポリマーとの配合物がある。さらに他の、主ポリマー鎖に酸素原子を有する適当なポリマーの例には、ポリエーテルポリマー几とえばポリエチレングリ；−ル（ポリオキシラン）、ジビニルエーテルマレイン酸共重合体（ピラン共重合体、ＤｒＶ鳳）等がある。

本発明に使用するのに過西なα−Ｃ−Ｃバックざ−ンｔもつポリマーのｖすにに、異なる種類のモノマーの混合物から製造てれる共重合体がある。このようなポリマ一群のひとつとして、反応注付加残基金もつ１糧の七ツマ−とこのような残基’を欠＜＝檀の七ノマートを混合して形成させ次ポリマーがある。とくに適当なものは、製水性ビニルおよび／またはアクリル型モノマー、たとえばＮ　−２ −ビニルピロリドン、２−　ヒドロキシプロピルメタクリル酸アミド、メタクリル酸２−ヒドロキシエチルエステルならびに他の本技術分野でよく知られているアクリル酸およびメタクリル酸の現水性エステルおよびアミドから誘導される共重合体である。本発明に用いられる共重合体を製造するための付加反応性残基金倉む適当なモノマーには、たとえばマレイン酸無水物ならびにアクリル酸およびメタクリル酸の反応性エステルが包含される。とくに適当なものは、たとえばアクリル酸グリシジルエステル、メタクリル酸グリシジルエステル、ｐ−ニトロフェニル、Ｎ−とドロヤシ；ハク酸イミド、メタクリル酸２よびアクリル酸の′ペンタクロロフェニルまたは７′およびペンタフルオロフェニルエステルであジ、この場合反応性エステルのアルコそシ残基はメタクリル酸ま７ｔはアクリル酸のカルボニルに直接冶金するがまたはスペーサーリンカ−を介して結合することができる。こ１゛ムらの種類のポリマーに使用するのに適洛なスペーサーリンカ− は一般に本技術分野において公知である。とくに適当なポリマーにはポリ（Ｎ− ビニルピロリドン）、：ｆｆ＠リ−（Ｎ−に’ニルピロリドンーコー無水マレイン酸）、コポリ−（Ｎ−ビニルビロリドンーコーメタクリロイルーＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、コポリ（Ｎ−（２−１５−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミトーコーメタクリロイルｐ−ニトロンエニルエステル）および上述のモノマーによって形成される他の共重合体が包含される。

本発明のポリマー結合阻害剤内に任意に導入されるリンカ−またはスペーサーは少なくとも２個の反応基をもたなければならない。反応基の一方は、ポリマー中に含有されるモノマ一単位の少なくとも一部に存在するけ加残基に共有結合できるものでなければならない。他の反応基は酵素の活性部位への結合に関与しない、遊離阻害剤分子中に存在する反応基に共有結合できるものでなければならない。適当なリンカ−は本技術分野において公知であり、本明細書にとくに記述する必要はない。本発明に使用するのに逼轟であることが明らかにされた１群のリンカ−は、少なくとも２１１ｉｆｆｉの反応基を含有する可撓性バックボーン炭化水素を含むものでるる。反応器としてはヒドロキシル、スルフヒドリル、アミノ、カルボ干シル、ヒドラジノおよびヒドラシトのような基がとくに適当である。

しかしながら他の基も使用できる。リンカ−またはスペーサーの長さは特定の適当の要求によ・つて変動するものである。通常は（Ｃ２〜Ｃ２０）炭化水素リンカ−１好ましくは機状の炭化Ｘ素が使用される。しかしながら、他の種類の分子もこの場所に導入できる。

とぐに適当な種類のリンカ−は、最初と最後の炭素原子に共有結合され処置侯基を有する（Ｃ１〜Ｃ２０〕炭化水素、たとえばとドロキシアミン類からなるものであることが明らかにされた。本発明に使用するのに適し几他の例には、α、ω −ジアミン類、α、ω−ジアミノアルコールおよびα、ω−ジアミノ酸である。

新規な置換カルバメート化合物ポリマー、それらを含有する医薬組成物、およびこれらのポリマーを使用する方法では、たとえばブタ膵臓エラスターゼ２よびヒト白血球エラスターゼが特異的に阻害され、類似のセリン依存性プロテアーゼ、ウシ膵臓トリプシンおよびキモトリプシンには影響しない。

本技術分野ＶＣ２いては、多形核白血球およびマクロ７アーゾからのグロテアーゼ、とくにエラスターゼ（ヒト白血球ＨＬエラスターゼおよびカテプンンＧ）が炎症、関節炎および気禮に伴う慢性組織破壊の原因となることが昶られている。

ｇ染または炎症時には、正常な肺は、グロテアーゼ阻害剤、αｌ−ｌ−アンチトリジシンって蛋白分解的消化から保護される。この保護機構は、遺伝的なｌ之は他の原因によってＣ１−アンチトリプシンが欠損した患者では作動しないようでおる。したがって、Ｃ１−アンチトリプシンに置換できる合成エラスターゼ阻害剤が、肺気腫や関連疾患の治療に有用である。

本発明によれば、動物２よびヒトエラスターゼの活性部位に向けられた阻害剤であるカルバメート官能基２よびオリゴペプチドを含有する一部の公知化合物は、その複数単位を実質的に生体内で分解されないポリマーに結合させると、生物学的半減期の延長および／ま几は効力の増強を示すことが明らかにされた。すなわち、ペゾチジル刀ルバメート鎖が多数結合したポリマーは単一の単位中に多数の阻害性残基全導入する機会を提供し、したがって酵素の活性部位へのアクリル化残基の移送効率が増大する。これにより、低分子量阻害性ペプチド自体に比べて、酵素に対するポリマー阻害剤の親和性は至適化される。

アシル化残基の性質は、所望に応じて、酵素の不活性化の持続を至適にするように変動できる。

本発明の機構は、カルバメートエステルがそのカルボニル炭素において、そのアルコキシ部分を失いカルバミル化残基金酵素の活性部位に移送することによシ、グロテアーゼおよびエステラーゼと反応するという事実を利用するものと理論づけることができる。ついで脱アシル化で酵素活性の回復が起こる。

上述の提案においてエステラーゼ阻害剤として活性ｔＶする適当なカルバメート化合物には多種の化合物がある。これらの化合物は、オリゴペプチドで置換されたカルバメートで、一般的には以下の一般式ＣＯＺ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＣＨ２−Ｎ−Ｃ−Ｘ−Ｒ２Ｒ′ ０式中、ＺはＲ”０−３ｕＣ（式中Ｒ”は（Ｃ１−Ｃ３）アルキルである）、ＣＦ３ＣＯ −および／またはポリマーへのり７カーからなる群より選ばれ、Ｘは酸素または硫黄であジ、Ｒ′は直鎖状および二級分岐鎖（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルおよびベンジルからなる群よシ選ばれ、Ｒ２は、置換または非置換フェニル（この場合、置換基ハニトロ、ペンタフルオロである）、ペンシル、ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３．１−低級アルキルテトラデリル、１−フェニルテトラゾリル、２−チオキン−３ −チアゾリゾニル　ｇ　ＩＪゾルおよびベンゾチアゾリルである。

ただし　Ｒ２がｐ−ニトロフェニルの場合にはＲ′は三級ブチル、ベンジルまたはシクロヘキシル以外であシ、Ｘが硫黄の場合にはＲ２はベンシル以外である〕で表すことができる。

さらに好ましい態様においては、阻害ペプチドは、以下の一般式りまたはＥＲ′は（Ｃ１−Ｃ３）アルキルまたはポリマーへの適当なリンカ−であシ、Ｘは敏素または硫黄であシ、Ｒ２はフェニル、フルオロフェニル、ニトロフェニル、１−フェニルテトラゾリル、１−低級アルキルテトラゾリル、ベンジル、３−チアゾリジニル、ビリゾルおよびベンゾチアゾリルからなる群よシ選ばれ、Ｒ′は直鎖状ま友は二級分岐鎖（０２〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃａ）アルケニル２よび（Ｃ２〜Ｃ４）アルキニルである。

ただし　Ｒ２がｐ−ニトロフェニルの場合にはＲ′は三級ブチル以外であり、Ｘが硫黄の場合にはＲ２はペンシル以外である〕およびＺ′はＭｅＯ−３ｕＣ−Ａｌａ−Ａｌａ　、　ＣＦ３Ｃ０−Ａｈａ−Ａｌａおよびこの化合物ｔ−ポリマーと連結する適当なリンカ−からなる群よシ遺ばれ、Ｒ′は先に定義したとおりであるが、好ましくはイソプロピルである）で表すことができる。

適当なリンカ−は、存在する特定の原子配置の種類に応じて、本技術分野でよく知られている。

不発明に便用するのに適当な阻害ペプチドは、アミン部分がオリビペプチドを含有し、ペプチド部分はエラスターゼに対するそのカルバメートエステルの特異性全増大させるように選択されたベプチゾル力ルバメートである。

個々の阻害化合物に対するペプチドは、最終的にペプチドにカップリングさせる環窒素が保護されたＬ−プロυンに始まる連続的な一連の反応によって製造できる。最初の工程においては、Ｎ−保護プロリン、たとえばＮ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ− プロリンをジアゾメタンと反応させてジアゾケトンを得、ついでＨＣＩで処理してクロロメチルケトン保護Ｌ−プロリンを得る。このようにして得られたクロロメチルケトンを適当なアミンＨ２ＮＲ’と反応させて、保護アミン誘導体を形成させる。

次にこのアミンを適当なりロロホルメートまたはチオクロロホルメートと反応させ、酸たとえばＨｅ７と反応させて脱保護するとＨｅ１塩を与える。この化合物を次に、混合無水カルざン酸法で：１Ａｌａ−Ａｌａとカップリングさせると、本発明の化合物が得られる。　Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ化合物は、Ａｌａ−Ａｌａ　ｆ、ＺがＲ′０−９ｕＣたとえばＭｅＯ６ｕＣの場合には、メチルコハク酸Ｎ− とドロ中シコノ・り酸イミドと反応させることによつそ得られる。これらのＺ− Ａｌａ−Ａｌａ中間体は、以下の反応式に従って製造できる。

ＩＩ　　　　ＩＩＭｅＯ−ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ−Ａｌａ−Ａｌａこれらの反応を実施するに際しては、最初の工程でＬ−プロリンは、本技術分野で公知の任意の適当な保護剤と反応させて環窒素を保護する。したがって、反応は分子のカルボン酸部分にも起こることになる。好ましくは、環内窒素原子は公知の保護剤たとえばＬ−ＢＯＣで保護される。次とえばｔ−ＢＯＣ−Ｐｒｏは、ＳｊｇｍａＣｈｅｍ３ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　ＳＬ、　Ｌｏｕｊｓ、　Ｍｊｓｓｏｕｒｊから市販されている。

保護プロリンは、Ｐｅｎｋｅらの方法（Ｂ。

Ｐｅｎｋｅ、　　　Ｊ、　　　Ｃｚｏｍｂｏｓ、　　　Ｌ、Ｂａ１ａＳｐｊｒｊ、、　　Ｊ、ｐｅ　しｅｒｓ　　お・　よ　びに、　　　ＫｏｖａｃＳ　　：　　　Ｈｅ１ｖ、　　　Ｃｈｊｍ、ＡｃＬａ、　　　５　５　　　：　　　１　　０　５　７　　ｈ１９７０）によってジアゾメタンと反応させる。得られたクロロメチルケトンを次に適当なアミンと反応させる。

反応は、浴媒溶液たとえば低級アルキルアルコール中、好ましくはヨウ化アルカリ金属の存在下に行うのが好ましい。反応原料を冷却下に混合し、ついで５０〜７５℃で反応させて、反応を完結させる。虫取したＨＣＩ　ｆたとえば炭酸ナトリウム溶液で中和し、抽出する。この中間体を次に適轟なりロロホルメートまタハチオクロＣ２ｒ（＋ルメートと反応させ、ついで理化水素で脱保護すると、分子のカルバメート部分が形成される。

この分子を次に、分子のベゾチド部分とカンプリングゴせると、最終生成物が形成する。

この反応操作は次のように例示することができる。

ＩＩ　　　　　　　　ＲＸＣＯＣＩＩＩ　　　　　　ＩＩ　　　　　　ＭＣＩＩＩ　　　　　ＩＩ　　　　ＭｅＯ３ｕｃ−Ａｌａ−ＡｌａＭｅＯ３ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＣＨ２−Ｎ−Ｃ −ＸＲＲ′ 上に指摘したように、本発明のポリマーは酵素エラスターゼの特異的な、活性部位に対する阻害剤として使用できる。この目的では、ポリマーは、注射または経口用剤形による］ｎ　ｖｊｖｏ投与用に、医薬的に許容される担体と配合することが好ましい。

慣用の補助剤２よび担体が、約１〜９０重量饅の活性ポリマーと配合して用いられる。このポリマーは、動物またはヒトに、約０．１■／ｋｆｌ〜６００■／ゆ、好ましくは約１　ｍ９７に９〜３０　ｍ９／に９、さらに好ましくは平均約１２：ｎ９／Ｘ？の用量で投与できる。

以下の実施例には、本発明の好ましい態様を例示するが、これらは本発明を限定するものではない。実施例２よび本明細書を通じて、部はとくに指示のない限シ重蓋部である。

本発明の化合物の合成に際しては、融点をＴｈｏｍａｓ−Ｈｏｏｖｅｒ　Ｔａｎコｂｅｌｔ装置で測定し、補正していない。１ＨＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｊａｎ　ＥＭ−５６０（６０ＭＨｚ）またはＥＭ−３９０（９０ＭＨｚ　）スペクトロメーターを用いて測定した。赤外（ＩＲ）スペクトルはＰｅｒｋｊｎ−Ｅ１ｍｅｒ５６７スペクトロフオスペクトロメータ−ターた。微量分析は　Ａｔ１ａｎｔｊｃ　　Ｍｊｃｒｏｌａｂ、　　Ｉｎｃ、、Ａｔ１ａｎｔａ、　　Ｇｅｏｒｇｊａｏま　たは　Ｍｉｃｒｏ　　Ａｎａｌｙｓｊｓ、　　　Ｉｎｃ、、　　ＷｊｌｍｊｇｎＬｏｎ、　　　Ｄｅｌａｗａｒｅによって実流した。

反応は定常的に、ＷｈａＬｍａｎ　’Ｂ原６Ｆシリカゾルプレートを用い、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって追跡した。スポットは紫外分光光測法（２５４ｎｍ　）、ヨウ素またはＨＢｒ−二ンヒドリン噴霧によって検出した。カラムクロマトグラクイ−はＳユ１ｉｃａ　（）ｅｌ　６０（Ｍｅｒｃｋ、　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、　Ｇｅｒｍａｎｙ　）を用いて実施した。

化合物はすべて、スペクトルデータ２よび元素分析によって同定した。

ポリマーへの阻害剤の負荷は、直接またはリンカ−スペーサーを用いて、本技術分野において公知の化学反応によジ実施する。その詳細は本明細書に記載するまでもない。負荷の程度、すなわち、ポリマー鎖に沿ったＰＣ単位の密度は、所望の負荷に応じて量適になるように変動させることができる。これは実験条件、たとえばポリマー鋼上の付加反応性残基の数、スペーサー基の数、２よび／または反応混合物中のＰＣとポリマーの比を変動させることによって達成できる。以下の実施例では、特定の反応方式について述べるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものではない。

以上、本発明について一般的に説明したが、以下の特定の実施例を参照すれば、本発明はより完全に理解できるものと考える。しかしながら、本明細書に述べる特定の実施例は単に例示の目的のものであって、とくに指示のない限シ、本発明またはその実施態様の限定を意図するものではない。

例例　　１重合体に固定した阻害剤の製造に適したペプチジルカルバメート阻害剤（化合物５）を下記スキーム１によシ本発明方法に従って調製する。

（１〕この方法の個々の工程上下にもつと詳しく述べる。

例　　２ｊ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン（化合物１）の合成ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（４：　１　）中ｔ、−Ｂｏｃ　−Ｌ−アラニン（５，９ｇ、３１．２ミリモル）およびＬ−アラニンエチルエステル塩酸塩（４，１，３１，２ミリモル）の溶液へ、かきまぜながら室温でトリエチルアミン（４，３１ｎ！、３１．２ミリモル）を加える。

この反応混合物へ、１−エトキシカルボニル−２−エトキン−１，２−クヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）（８，Ｃ１ｇ、３２．３　ミＩＪモル）を加え、かきまぜｔ−晩続ける。

次ニ混合物ｋ　ＣＨ２Ｃｌ２　（１００ｍｌ　）で抽出し、１０チクエン酸（５０ｍｌ　ｘ　５　）　ｓ−よび５％Ｎ１１ＨＣＯ３（５０ｍｌ　）で戊浄する。

肩磯層を乾燥しくＮａ２５Ｏ１）、真空で濃縮する。

ｉらｉ、ｉ油状物ｆ：ＥＬｏｈ　（１００ｍｌ　）に溶かし、１．ＯＮ　ＫＯＨ５Ｑ　ｍｌ　ｆ加え、混合物’ｔ３５−４０”Ｃで一晩かき筐ぜる。Ｅ　ｔＯＨの蒸発後クエン酸（Ｈ２Ｏ５０反中１４ｇ）ｔ−加えて過筆」のＫＯＨｉ中和する。

次に反応混合物ｆ　ＥｔＯＡｃ　／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）　（１：　１混合物１５０ｍ／Ｘ２）中に抽出し、乾燥する（Ｎａ２ＳＯ４）。次に溶媒を蒸発させて生成物（１）ヲ得、これｔシリ刀デル刀ラムクロマトグラフィー（ｃＨ２ｃｉ２／Ｅｂｏｐ−ｃ　１０　：　１　）により精製するＣ　Ｉ　２．１ｇ１７４％）。融点８９〜９１℃。

（Ｄｏｙｌｅ、　Ｂ、Ｂ、；　Ｔｒａｕｂ、　Ｗ、；　Ｌｏｒｅｎｚ、Ｇ、Ｐ、；　Ｂｒｏｗｎ。

Ｆ、Ｒ，；　　ＢｌｏｕＪ　　Ｅ、Ｒ，、Ｊ、ＭＯｌ、　　Ｂｉｏｌ、、　　５　１　　　：　　４　７（１９７０）による〕（、１，０ｇ、３．９　ミＩＪモル）の溶液へＮ−メチルモルホリフ　（０−４６ｍｌ、　　４．２ミリモル）ヲ加え、混合物を５分間かきまぜる。ＴＨＦ　（２ｍ／　）中イングチルクｏｏホルメート（０，５５ｍ１．４．２ミリモル）を加え、かきまぜを−１５℃で１０分続ける。

この反応混合物へ、アセトニトリル（４０１ｉ／）空化合物２　（Ｃ３ｇ、３．５ミリモル）およびＮ−メチルモルポリ”ＣＤ−４６ｒｎｔ、４．２ミリモル〕の懸濁液ヲ−４０℃で加え、かきまぜ全室温で１時間続ける。

次に反応混合物を濾過し、濾ｇ、′ｔ−ＣＨＣｘ３で抽出し、１０％クエン酸（３×１０ｍ／）で況浄し、乾燥しくＮａ２５Ｏ，）　、溶媒を蒸発させて油−ｙ、物を得る。

酢酸エチル（Ｅ　ｔＯＡｃ　）で飽和して固体を得、これをシリカゲルカラムクロ７トグラ２イー（６％　ＣＨ３０Ｈ／ＣＨ２１ｊ２）によりｎＩ製して化合物３（９０％）を得る。

化合物３の緒特性は次の通りである：融点：　１７０−１７２℃ 工Ｒ（ＫＢｒ）Ｖ、、ｘｌ　７５０．１６５０，１５２０．１３４５゜１１９０、　１１５５ｃＩｎ−１；Ｎ’ｌＡＲ（ＣＤＣ７，３）デルタ８−２０　（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．２０　（２Ｈ，ｄ、　　Ｊ　＝９Ｈｚ）、４−１−４．５　（ｔＨ，ｍ）、３．５−３．７　（３Ｈ，ｍ　）、２−０　（４Ｈ，ｍ　）、１．５　（９Ｈ。

Ｓ）、１−７−１−６（２１Ｈ，ｍ）。

ＥｔＯＡｃ　（７ｍｌ　）中化合書３　（０，７ｉ１．０２ミリモル）のかきまぜた溶液ヘギ峨（１，２５１／　）　ｔ−加える。

次にこの反応混合物中に無水Ｈ（Ｊを通気し、反応を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によシ追跡する。溶媒を蒸発させ、Ｄ−へブタンの技部によシイばｔ＃榔混合物に質える。得らｎた油吠物金それ歩、上梢製することなく次の工程で用いる。

例　　５ｐ−ニトロフェニルＮ−（スクシニル−Ｌ　−７ラ二ＤＭＦ　（２０Ｍ〕中化合物４（１，５ｇ、２．９ミリモル）の溶液へＥＣ３Ｎ　（０，５ゴ、６．６ミリモル）２よび無水コハク酸（０，３５Ｆ、３．６　ミＩＪモル）を加え、混合物音８０℃で１．５時間かきｌぜる。次にジエチルエーテルＣ６０ｍ１）ｔこの冷却した混合物へ加え、沈殿したＥ　シ３Ｎ−ａｃｚ、　ｔ　’ｄｉ過し、濾液を蒸発させて淡黄色固体を得る。次に生成物を２％ＨＣＩとすシまぜ、濾過し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）　／エーテルから再結晶して化合物５　ＣＰｃｔ、）　１．６１ｉ’　（９４チ）を得る。

化合物５の緒特性は次のようである：融点：１８５−１８６℃ ＩＲ（ＫＢｒ）Ｖｍａｘ３５００．２７００．１７８０゜１７５０．１６５１．１５６０．１２００ロ一１ＮＭＲ（ＤＭＳＯａ６）デルタ８−５　（２Ｈ，ｄ、　　Ｊ　＝９Ｈｚ）、１．０６−１−６　（２６Ｈ，ｍ）。

分析’　Ｃ２６Ｈ３５Ｎ９０１０１／２　Ｈ２Ｏに対する計算値：ｃ。

５５．４３；Ｈ，６，１７；Ｎ、１１．９４゜実測値：Ｃ，５３，３４；Ｉ（，８，４１；Ｎ、１１．９３゜例　　６９’ｌＪＩ＆Ｃ従い＝１４ｇし几ペプチジルカルバメートヘミスクシネート（スキーム１の化合物５）を重合体担体に固定する。全体の手順を次のスキーム２で説明する。

スキーム２：別２の重合体固定ＰＣ阻害剤の合成Ｖｌａｓａｋ、　　Ｊ、、Ｒｙｐａｃｅｋ、　　Ｆ、、Ｄｒｏｂｎｊｋ、　　Ｊ、、５ａｕｄｅｋ＋　　Ｖｔ１Ｊ、Ｐｏｌｙｍｅｒ　　Ｓｃｊ、、Ｐｏｌｙｍｅｒ　　Ｓｙｍｐ、、　　６　６　　：　　５　９　−　６　４シンイミド（１）′ｔ一つクシ、分別する。

ポリスクシンイミド（Ｉ）（分子！５２，０００ｔもっ画分）１０ｇをＮ　、　Ｎ’−ジメチルホルムアミド（Ｄ＆Ｆ）５Ｑｍｌに溶かし、七ノーＮ　−ＢＯＣ −１、２−ジアミン二ｐンベンゾエート２．８０ｇ（０，０１％ル）およヒドリエチルアミン０．８　ｍｌ　（０，０１モル）ｔ″加える。

反応混合物を室温に４日間放置し、次に２−アミノエタ／−ル１１．Ｏｍ／（０，１８モル）ｅ加え、反応を更に２４時間続ける。

次に混合物を酢酸で中和し、水に対して透析し、凍結乾燥によシ重合体を単離する。

収量：　ＰＨＥＡ（厄−ＢＯＣ）（スキーム２の化合物ｆｌ　）９．２０ｇ。

ＰＨＥＡ（ＡＥ−ＢＯＣ）　（化合物１１）８．５０．９をトリフルオロ酢酸５Ｑｍｌに溶かす。溶液を室温に１時間放置し、次に蒸留水に対して透析する（’ Ｖｉｓｋｊｎｇ　ＤｊａｌｙｓｉｓＴｕｂｉｎｇ、　５ｅｒｖａ）。

透析した溶液を次にＡｍｊｃｏｎ　ＹＭ　ｉ　Ｑ　＠上での限外濾過によシ体積６０！ｎｌまで濃縮し、再び水で２００ｍ７まで希釈する。限外濾過を同じ方法で５回縁シ返す。リテンテートヤ為ら凍結乾燥によシ重合体を単離する。

収量：　ＰＨＥＡ（ＡＥ）　（スキーム２の化合物置）６．５Ｅｉペプチジル・ −力ルバメート−ヘミスクシネート（スキーム１の化合物５）（０，５８６ｇ、０．００１モル）およびＮ−エチル−Ｎ’−Ｃ５−ジメチルアミンプロピル）カルボジイミド塩酸塩（、０，２３ｇ、０．００１２モル）をＤＭＦ　４．Ｑ　ｍｌ中で４５分間水浴の中で反応させる。

次にＤＭＦ　１２　ＩＩＩ／中に重合体１２．２０９　（−ＮＨ２０−００１２モル）とトリエチルアミ７０．１６７ｍ／（ｏ、ｏ　ｏ　１２モル）を含む水冷塔液を加え、反応混合物ｋＯ〜４℃で２４時間かきまぜる。

次に重合体生成物ｆ　Ｈａ（Ｊ　０．１５　Ｍ　を含む＄　７．００のリン酸緩衝液に対して透析する。透析した重合体を、同じｉｗｘ中５ｅｐｂ、ａｄｅｘ　Ｇ２５Ｆカラム（５０×３００１１上でのゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によシ更に樗製し、集めた重合体ンラクションをＡｍｊｃｏｎ　ＹＭ　１Ｑ遍による限外濾過と希釈によって脱塩する。この重合体阻害剤ｔ−凍結乾燥によシ水から単離する。

収量二Ｐ三Ａ（ＡＥ−ＰＣ）（スキーム２の化合物ｆｆ）１．３５５’すべての重合体の分子量分布分析を混合床カラム（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂ：５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　２Ｑ　Ｑ　Ｓ　Ｆ　：　５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５ＳＦ、１６：５：３；１５Ｘ３５０ｆｆｆｉ）上でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥｃ）によシ行なう。

溶離剤としてｗａｃｚ　Ｏ，１５Ｍを含有する−７．５ｏの０．０５　Ｍ　’Ｊン酸緩衝液を用いる。

カラムをＰＨＥＡ　ｃＤ５Ｗ準試料全用すて校正する。

（Ｒｙｐａｃｓｋ、Ｆ、、５ａｕｄｅｋ、Ｖ、、Ｐｙｔｅｌａ、　Ｊ、、５ｋａｒｄａ、　Ｖ、。

Ｄｒｏｂｎｉｋ、Ｊ、、　Ｍａｋｒｏｍｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　５ｕｐｐ１．９　：　１２９−１３５（１９８５））。

溶離の概略を５　工ＳＣＯモデル１８４０分光光度検印器によシモニターする。

分子量の平均値（Ｍｗｙよび）ｘｎ　）および累積分子量分布をＳＥＣデータから計算する。これらデータを第２図に示す。

重合体Ｉおよび■に２けるアミノエチル側鎖含量を、Ｂｒｏｗｎ、　Ｈ，Ｈ，、Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅ？＋１．、１４　：　９６７　、　（１９６８）に従いアミノエテル基と２．３．５−１リニトロベンゼンスルホン酸との反応後に分光光度計で決定する。

データを下記表１に示す。

表　に重合体固定阻害剤の分子特性１　　９１．２　８．８　０　　３１，６００　２１．０００ＩＶ　　　９１．２　４．２　４．６　３８．ＤＣＩＯ２４，０００１個のＰＣＣ単位クシ分子量当量：　４０４２、即ち重合体固定Ｐ　ＣＯ−２４７μ％ルＰｃ／ｒｎ９重合体固定阻害剤におけるペプチジルカルバメート単位の含量を、上記ＰＣ［ｉｌ害剤の２７６　ｎｍにおけるモル吸光係数に対し９７００モル−１１，（ｍの値を仮定して重合体−阻害剤（重合体■）の吸収スペクトルから決定する（データを第６図に示す）。

遊離ＰＣと重合体璽との間の結合反応の時間的進行をＧＰＣで追跡する。典型的には反応混合物の試料１０μｌを適当な時間間隔で抜き取り、リン酸緩衝ＨＣ例えば、ＰＢＳ　）で希釈し、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５６Ｆ　１１　Ｘ４０　ｍＭ　）カラムに適用する。重合体固定ＰＣ阻害剤と未固定低分子量ｐｃ阻害剤との比を、２７６　ｎｍ　（遊離ＰＣに対する吸収極大）における光学密度としてモニターした溶出曲縁のそれぞルのピーク下の面積から決定する。結果を第４図と第５図に示す。

例１０６−アミンへキシルスペーサー鎖をもつポリ−α。

β−（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ、Ｌ−アスパラギン酸アミド）共重合体金側２で述べた全体の手順に従ってつくるが、ただしモノ−Ｎ−ｔ−ＢＯＣ− １゜２−シアミノエタンの代シにモノ−Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−１。

６−ジアミノヘキサン塩酸塩を用いた。ＰＨＥＡ（ＡＨ）　１７２■（−鷹２基０．１ミ！Ｊモル）を、例１で調製したペプチジルカルバメートヘミスクシネート（スキーム１の化合物５　）　５８．６ｍ９（０，１ミリモル）とＮ　−ｘ　チ／ｌ／　−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルざシイミド（Ｆ、ＤＣ）塩酸塩２５．０ｍ９（、０，１２ミリモル）ト、シｉ’ｙ−ルホルムアミド（２ｍり中トリエチルアミン０．１２ミリモルの存在下０〜４℃の温度で２００時間反応せる。

この重合体生成物を水に対して透析し、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５Ｆカラム（Ｐｈａｒｍａｃｊａ）上でＧＰＣによう更に精製し、重合体阻害剤を凍結乾燥によシ水から単離する。

収量：　ＰＨＥＡ　（ＡＨ−ＰＣ）　１１８　′ｍ９゜最初に反応に加えたＰＣの６８％が重合体に結合するので、６．２モル俤のＰＣ側鎖金含む重合体固定ＰＣを生ずる。

例１１メタクリルオキシ−Ｎ−オキンースクンンイミドコモノマー８モル％を含む０メタクリロイル−Ｎ−オキシ−スクシンイミドとＮ−２−ビニルピロリドンの共重合体（ｐ　（ＶＰ−Ｃｏ−ＭＡＮＳｕ））を、開始剤としてアゾ−ビス−イソ− ブチロニトリルを用いて前記コモノマーをジオキサン中で共重合させることによｐつくる。

１．４６　ｇのｐ　（ＶＰ−Ｃｏ−ＭＡＮＳｕ　）共重合体（Ｎ−オキシ−スクシンイミドエステル基１ミリモル）を、ＤＭＦ（１０！Ａり中トリエチルアミン２ミリモルの存在下にモノ−ｔ　−ＢＯＣ−１、６−ジアミノヘキサン塩酸塩０．５１　ｇ（２，０モル）と５０℃の温度で４８時間反応させる。次にこの重合体生成物を蒸留水に対して透析し、次に溶液を約５ｍ／の体積まで濃縮し、トリフルオロ酢酸５ｍ／を加える。反応混合物を室温に４時間放置してから蒸留水に対して透析し、重合体を５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５−Ｆカラム上でＧＰＣによシ更に精製する。

（５ｅｐｈａｄｅｘ　：　Ｐｈａｒｍａｃｊａ　Ｔ７ｐｐｓａｌａ、スウェーデンの商標）。重合体ポリ（ＶＰ−Ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ）　、即ちＮ−２−ビニルピロリドンとＮ−（６−アミノヘキシル）メタクリルアミドとの共重合体を連結乾燥によシ水溶液から単離する。アミンへキシルスペーサー鎖のモル含量ハ、共重合体の全単量体単位から８．９モル俤であると測定される。

ボＩＪ　（ＶＰ−Ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ）　１４９　Ｉ＋＋９　（−ＮＨ２基０．１　　ミリモル）を、カンプリング剤としてＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）塩酸塩を使用して、例１で得たペプチジルカルバメートヘミスクシネート（スキーム１の化合物５　）　５８．６ｍ？ｃ　Ｏ，１ミ１，１モル）と反応させる。例２で述べた方法と同様の手順を用いることによシ、ｐｖｐ型共型合重合体定されたＰＣＩ　１５■を得る。得られた重合体阻害剤におけるＰＣ阻害部位の含量は、共重合体の全単量体単位から４．８モル俤であると決定された。

例１２デキストラン（分子量７０＋０００　；　ＰｈａｒｍａｃｉａτＪｐｐＳａｌａ、　スウエーデ７　）　１．＋５２　ｇｔ−ｐ）１８．００の０．１モルト２ホウ酸緩爾液４０Ｗ／に溶かし、１，２−エポキシ−３−ゾロモプロパンｉ、ｏｓｇを加え、混合物を３０℃で４時間激しくかきまぜる。次に反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水層を分離し、これに濃水酸化アンモニウム２０ｍ１ｔ−加え、溶液を室温で２４時間かきまぜる。次に溶液を中和し、蒸留水に対して透析し、得られたデキストラン誘導体（ＤｅｘＬｒａｎ−ＮＨ２）を５ｅｐｈａｄｅｘＧ −２５カラム上でのＧＰＣによって最終的に精製する。

ｆｔＯ，８４ｇ。分析したところアンヒドログルコース単位１モルにつきＮＨ２基１５個（６，２モル％）を示した。

例１に従い調製したベプチゾルー力ルバメートヘミスクシネート阻害剤（スキーム１の化合物５　）　５８．６”！ｌｏ、ｉミリモル）　ｆ　ＤＭＦ　１．０　ｍｌ　ｃｐＯ℃でＥＤＣ２１１９（０゜１１ミリモル）と反応させる。６０分後、−９，００の０．１　モ／’　１−１ホウ酸緩衝液２　ｍ／中上記Ｄｅｘｔｒａｎ−ＮＨ２２６０ｒｎ９の溶液を加え、混合物ｔ　氷浴中で更に１６時間かきまぜる。次に反応混合物を５　ｍｌの０．６モｋ　１−１ＮａＣｌで希釈し、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム上に適用する。デキストラン固定ＰＣ阻害剤を、集めた高分子量クラクションから凍結乾燥により単離する。

収ｆｊｋ：　２１０ｍ９．アンヒドログルコース単位１モル当シＰＣ阻害単位３．２モル％。本発明に従い調製した重合体固定阻害剤によるエラスターゼ活性の阻害を、下に詳細に述べた手順により評価する。

すべての酵素検定ばＣＡＲＹ　２１９または２２００Ｖａｒｊａｎ分光計を使用して２５℃で分光光度法によシ行なった。ＰＰＥの活性は基質として５−　Ｂｏｃ　−Ｌ−アラニンデーニトロフェニルエステル（Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＮＰ）を使用し、３４７．５　ｎｍ　（ｐ−ニトロフェノール）に２ける吸光度をモニターすることにより測定する。ＨＬＥの活性は、基質としてメトキシスクシニル− Ｌ　−７ラニルーＬ−アラニルーＬ−７’ロリルーＬ−バリンｐ−二トロアニリド（ＭｅＯ−３ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａ／−ＮＡ　）を使用し、４１０ｎｍ（ｐ−ニトロアニリン）における吸光度を追跡することにより測定する。活性阻害剤は、他のセリン依存性タンパク質分解酵累、例えばトリプシンおよびキモトリプシンに対して、これらのそれぞれの基質、即ちＮ−ベンゾイル−Ｌ −アルギニンエチルエステル、Ｎ−ペンソイル−Ｌ−チロシンエチルエステル全使用し、それぞれ２５３　ｎｍ　９よび２５６　ｎｍにおける吸光度をモニターすることによシ試験する。

スクリーニング試験（時間経過）　ＰＰＥおよびＨＬＥの検定緩衝液：　　ＰＰＥに対して０．０５ＭＩＪン酸二水素ナトリウム緩衝剤、ｐ）１６．５ＨＬＥに対して０．１　Ｍ　Ｉ（ＥＰＥＳ　（Ｎ　−２ヒドロキシエチルピペラジンＮ−２エタンスルホン酸）緩衝剤ｐ）Ｉ　７．４．０．５　Ｍ塩化ナトリウムと１０チジメチルスルホキシドを含有基質：　　ＰＰＥに対して、Ｌ−Ｂｏａ−Ａｌａ−ＯＮＦ　（メタノール中１．ＯＸ　１０−２Ｍ）、ＨＬＥに対して、ＭｅＯ−８ｕｃ−Ａｌａ−Ａｊａ−Ｐｒｏ−Ｖａ／−Ｎａ（ジメチルスルホキシド中１．０　Ｘ　１０−２Ｍ）阻害剤：ジメチルスルホキシド中２．ＯＸ　１０−３Ｍ酵素　：　ＰＰＥに対して、０．０５Ｍ’Ｊン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）］　６．５　）　５ｍｌ中１．５ｍ９ＨＬＥに対して、０．０５Ｍ酢歌す）　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ５，５）　２．４１ｌＩｌ中１　ｍ？。

操作：　阻害剤Ｑ、１ｍｌと基質０．１１ｎｌ＆、２個の石英セル中リン酸ナトリウム緩衝液２．７ｒｎｌへ加え゛る。セルを分光光度計中で２分間熱平衡させ、３４７．５　ｎｍで吸光度を釣合わせる。

試料セルへＰＰＥ　（緩衝液中０．１ｍ／）を加え、また対照セルへは緩衝液０．１１ｎ／を加える。混合換金２０秒間振シ、吸光度増加を６０分モニターする。

対照実験阻害剤溶液の代シに０．１コのジメチルスルホキシドを両方のセルに加える。

重合体固定ｐｃ阻害剤および遊離ＰＣ阻害剤のＫｉを決定する定常状態反応速度試薬：緩衝液：０．１　Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（Ｎ　−２ヒドロキシエチルビペラゾンーＮ−２−エタンスルホン酸）緩衝剤（ｐ）］　７．５　）、Ｑ、Ｑ　５　Ｍ　ＮａＣｔおよび１０％ジメチルスルホキシドを含有。

基質二ＭｅＯ−３ｕｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡ　、　（１−２７＋　８−４７＋４．２３）　Ｘ　ｉ　Ｃｌ’″３Ｍ（ジメチルスルホキシド中）酵素：　ＨＬＥに対して＋　０．０５　Ｍ酢酸す）　ｌ）ラム緩衝液（ｐ）１５ −５　）　４．２　ｒｎｌ中０．２７”ｆ　　’阻害剤：０．０５Ｍ！Ｊン酸二水素カリウム緩衝液（−６，５）中型合体固定阻害剤（２，０９，１，０５，０，４２，０，２１）Ｘ１０−５Ｍ遊離阻害剤：ジメチルスルホキシド中（６，９Ｂ、　３．４９．１．７４．０．７０）ｘｌ　０−３ｙ操作：２個の石英セルの各々に入れたＨＥＰＥＳ緩衝液１．９ｍ／へ、基質６３μ１１阻害剤３６μｇ、およびジメチルスルホ中シト３３μｔ（または、遊離ＰＣ阻害剤実験に対してはＨＥＰＥＳ緩衝液３３μｌ）’？：加える。セルを分光光度計中２５°Ｃで２分間熱平衡させ、４１０ｎｍにおける吸光度を釣合わせる。

試料セルへ酵素（３３μｅ）を加え、標準側のセルへは０．０５　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（３３μｅ）を加える。

混合物を１５秒間振った後、４１０　ｎｍにおける吸光度の増加ｔ−３分間モニターする。

対照対照実験は、重合体固定ＰＣ阻害剤の代シに０．０５Ｍリン酸二水素カリウム緩衝液（ｐ）（６，５）３３μｔ（または、遊離ＰＣ阻害剤の代シにジメチルスルホキシド３３μｔ）を加えることにより行なう。

Ｄｊ、ｘｏｎ　７’　ｏ’　７トおよびＬｊｎｅＷｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅ　７ ’ロツトの勾配リプロットからに１愼を決定する。重合体固定遊離ＰＣ阻害剤に対するＫｉは８．ＯＸ　１０−７Ｍまた遊離ｐｃ阻害剤に対するにコは０．４〜１．０　Ｘ　１０−５Ｍで（残留酵素活性パーセント）（Ｋｉ測測定ため）試薬ニルスルホキシドを含有する０、　１Ｍ　Ｈｅｐｅｓｆｉ衝液（Ｆ）］７．５）基質：ジメチルスルホキシド中ＭｅＯ−３ｕｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡ　＋　１．２６　Ｘ　１０−２Ｍ阻害剤：　０．０５　Ｍ　ＮａＣｔおよび１０％ジメチルスルホキシドを含有するＱ、　ｉ　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐ）Ｉ　７．５　）中、重合体固定遊離ＰＣ阻害剤（４，５６，１，８２，０，９１゜０．４５　）　Ｘ　１０ −’Ｍ酵素：　０．０５　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液Ｃｐ）］　５．５　）中２．１　× １０”−６Ｍ操作二石英セル中のＱ、１Ｍ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液１．９ｍｌへ阻害剤６３μｔおよび酵素３３μｌを加え、混合する。標準側セルは、阻害剤３５μＪ　０．０５　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液３５μｌ、およびＯｉ　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液１．ｑｏｍｔｔ含む。

セルを分光光度計中で２分間熱平衡させ％４１０ｎｍで吸光度を釣合わせる。予定のインキュベーション時間（２，５〜２０分）の終シに、標準セルおよび試料セルの両方に３６μｌの基質を加え、混合物を１５秒間振る。次に反応を３分間モニターＬ、ｐ−ニトロアニリンの遊Ｈを４１０　ｎｍで記録する。

対照実験を上記のように行なうが、ただし阻害剤の代シにＱ、１Ｍ　Ｈｅｐｅｓ緩衝！３３μｇを使用し、１００チ活性とみなす。

Ｋｌ値は阻害剤濃度に対するＫｏｂｓ　（阻害に対する擬−次速度定数）の逆数プロットから得られる。

例１６重合体に固定した遊離ＰＣ１０阻害剤に対する堅固な結合の有無の決定試薬：緩衝剤：　［］、Ｑ　５　Ｍ　ＮａＣ１および２０％ジメチルスルホキシドを含有する０、１　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐ）１７．５　）基質ニジメチルスルホキシド中ＭｅＯ−８ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡ　ｌ　４．２３Ｘ　１０−３Ｍ阻害剤＋　０．０５　）ｔ　ＮａＣ７および１０％ジメチルスルホキシドを含有するＱｉ　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐ）１７．５　）中（５，５８，２，７９，２０２，１５，１，８６，１，４０゜０．９３３．０．６９Ｂ、０．３４９．０．２０９，０．１０５）操作＝２個の石英セルの各々に入れたＱ、　１Ｍ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液１．９ｍｌへ基質３３μぎおよび阻害剤３３μｌを加え、２５℃で２分間熱平衡させ、４１０　ｎｍで吸光度を釣合わせる。試料セルへ酵素（３３μｔ）を加え、混合物を１５秒間振る。ｐ−ニトロアニリンの解放を４１０ｎｍで３分間追跡する。標準側のセルへは酵素の代シに０．０５　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（６３μｌ）を加える。

上記と同様に行なうが、しかし阻害、ＩＪＯ代シに０．１Ｍ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液３６μｌを加える。

速度対阻害剤濃度プロットを用めて重合体固定ＰＣ７と酵素との間の堅固な結合の存在を実証する。

上記手順によって得られたデータは、遊離ペプチジルカルバメート阻害剤のエラスターゼ阻害能力（ＥＩＣ）が保持されるだけでなく、水溶性重合体に結合したとき向上することを示している。

酵素−阻害剤複合体の解離定数（Ｋｉ）は阻害力の係数として使用できる。これを行なうときは、重合体にＰＣ阻害剤を結合すると、Ｋｉ値が少なくとも７００倍減少するのが観察され、阻害力の向上の示すことが分かる。第１図は遊離ｐｃ阻害剤（ｐｃ−’＋Ｌ重合体固定ＰＣ阻害剤（ＰＨＥＡ−（ＡＥ）−ＰＣＸＰ− ＰＣｌ　１　）およびエラスターゼ、即ちアルファー１プロテナーゼ阻害剤（アルファー１−ＰＩ）の阻害活性の比較を示している。重合体固定ＰＣ阻害剤が、この場合１．６モルチといった低含量のＰＣ羊位を含んでも、アルファー１−ＰＩと少なくとも同程度に活性である。

重合体ＰＨＥＡは毒性を欠くことが示された（　Ｎｅｒｉ、Ｐ、５Ａｎｔｏｎｉ　、　Ｇ、　；　ＢｅｎｖｅｎｕＬｅ　、　Ｆ、　；　Ｃｏｃｏｌａ　、　Ｆ、ａｎｄ　Ｇａｚｚｅｉ。

Ｇ、、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、、１　６　　：　　８９３−　８９７　　（１９７３）。

事実、４０日間にわたる極端な耐薬性のためマウスやラットでＬＤｓｏを測定できない。ＰＨＥＡをヒトに用いる量よ９１０倍大きい用量で毎日静脈内注射ｔしても全体重取得または器官重量に有意な変化を起こさない。

更にまた、血清タンパク質おるいは血球の生合成機構におよぼすＰＨＥＡの悪影響は観察されたことがない（Ｎｅｒｉ等、前記）。

更にまた、ＰＨＥＡは抗原性を欠くことが示された。

ＰＨＥＡ　ｉ多数の免疫化パターンに従い家兎およびモルモットに注射したとき、免疫反応の徴候は見られない（Ｎｅｒｉ等、上記）。

本発明を詳しく記述したが、本発明の主旨あるいは範囲から離れることなく多くの変化および修飾をなしうろことは当業者にとって明白であろう。

吸光度（４１０ｎｍ）Ｆ工Ｇ、　　３ −　　　　　　　　　　　　　　〇手続補正書（自発）平成　２年　１月イ日

Claims

【特許請求の範囲】

１．式：Ｐ−（Ｌ−Ｒ）ｑ〔式中、Ｐは式（ＡｍＢｎ）（式中、（ＡｍＢｎ）は実質的に非生物分解性で約１，０００から５００，０００ドルトンの平均分子量をもち、ｍとｎは同じことも異なることもありそして約５から３，０００であり、ＡおよびＢは同一のことも異なることもあり、そしてＡとＢの少なくとも一つはＬおよびＲの一つに共有結合することができる）をもつ少な（とも一つの単位からなる重合体であり、Ｒは式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘは酸素または硫黄であり、Ｒ′は直鎖および２級分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、およびベンジルからなる群から選ばれ、Ｒ２は置換および非置換フェニル（この置換基はニトロおよびペンタフルオロからなる群から選ばれる）、ベンジル、ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、１−低級アルキルテトラゾリル、１−フェニルテトラゾリル、２− チオキソ−３−チアゾリジニル−、ピリジルおよびベンゾチアゾリルからなる群から選はれるが、ただしＲ２がｐ−ニトロフェニルである場合には、Ｒ′はｔｅｒｔ−ブチル、ベンジルまたはシクロヘキシル以外の基であり、またＸが硫黄である場合には、Ｒ２はべンジル以外の基であることを条件とする）を有する化合物Ｃ、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＸはＯまたはＳであり、Ｒ２はフェニル、ニトロフェニル、フルオロフェニル、−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、１−低級アルキルテトラゾリル、１−フェニルテトラゾリル、ベンジル、２−チオキソ−３−チアゾリジニル、ピリジル、およびベンゾチアゾリルからなる群から選ばれ、Ｒ′は直鎖または２級分校鎖（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルおよびベンジルからなる群から選ばれるが、ただしＲ２がｐ−ニトロフェニルである場合には、Ｒ′はｔｅｒｔ−ブチル、ベンジルまたはシクロヘキシル以外の基であり、またＸが硫黄である場合には、Ｒ２はベンジル以外の基であることを条件とする）を有する化合物Ｄ、および式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｚは−Ｏ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａである）を有する化合物Ｅからなる群から選ばれる化合物で、前記の各Ｒはしへ、あるいはＡおよびＢの一つへ共有結合しており、Ｌは１本の共有結合および１個のリンカー基（これはＡおよびＢの一方およびＲへ共有結合している）からなる群から選ばれ、ｑは約１からｍ＋ｎまでである〕で表わされる重合体。
２．Ａは式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｍは０か１、ｎは１か０であり、ＲはＯＨ、２−ヒドロキシエチルアミン、２−ヒドロキシプロピルアミン、３−ヒドロキシプロピルアミン、２，３− ジヒドロキシプロピルアミン、２−ヒドロキシブチルアミンおよび４−ヒドロキシブチルアミンからなる群から選ばれる）を有する化合物であり、またＢは前記式（１）〔式中、ＲはＮＨ２、ＮＨ−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｒ′−ＮＨ２（Ｒ′は（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルまたは（Ｃ６〜Ｃ８）アリールである）、およびＮＨ− Ｒ′′−ＯＨ（Ｒ′′は（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルまたは（Ｃ６〜Ｃ８）アリールである）からなる群から選ばれる〕を有する化合物である、請求項第１項記載の重合体。
３．重合体Ｐはポリ−アルフア−１ベータ−（Ｎ（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ，Ｌ−アスパラギンである、請求項第１項記載の重合体。
４．ＡはＮ−２−ビニルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、およびアクリルアミドからなる群から選ばれ、Ｂはアミノ（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルメタクリルアミド、アミノ（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルアクリルアミド、アミノ（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルマレイン酸モノアミド、Ｏ−アルキルアタリレートおよびメタクリレート〔この場合アルキルは一般式ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ′−ＮＨ２（式中、Ｒ′はＣ２〜Ｃ６炭化水素である）で表わされる〕からなる群から選ばれる、請求項第１項記載の重合体。
５．重合体Ｐはポリ（Ｎ−２−ビニルピロリドン）から誘導される共重合体である、請求項第１項記載の重合体。
６．重合体Ｐはデキストラン、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸およびヒアルロン酸からなる群から選ばれる多糖類である、請求項第１項記載の重合体。
７．ＡとＢは同一である、請求項第１項記載の重合体。
８．Ｌは式−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−〔式中、Ｒは１本の共有結合、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）ヒドロキシアルキル、および（Ｃ６〜Ｃ８）アリールからなる群から選ばれ、あるいはこれらアルキル基のうちの２から４個はＮ，ＯおよびＳからなる群から選ばれるヘテロ原子によりまたは−ＮＨ−ＣＯ−により互に結合される〕を有するリンカー残基である、請求項第１項記載の重合体。
９．Ｌは共有結合である、請求項第１項記載の重合体。
１０．ＲはＣ、Ｒ′は−ＯＨ（ＣＨ３）２Ｒ２は１−メチルテトラゾールである、請求項第１項記載の重合体。
１１．ＲはＣ、そしてＲ′は−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ３、−Ｃ（ＣＨ３）３、シクロプロピル、シクロヘキシル、およびベンジルからなる群から選ばれる、請求項第１項記載の重合体。
１２．ＲはＣ、そしてＲ２はｐ−ニトロフェニル、フェニル、ペルフルオロフェニル、−ＯＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、１−低級アルキルテトラゾール、１−フエニルテトラゾリル、ピリジル、２−チオキソ−３−チアゾリジニルおよびベンゾチアゾリルからなる群から選ばれる、請求項第１項記載の重合体。
１３．ＲはＤ、Ｒ２はｐ−ニトロフェニル、そしてＲ′はイソプロピルである、請求項第１項記載の重合体。
１４．ＲはＤ、Ｒ２は１−メチルテトラゾリル、そしてＲ′はイノプロピルである、請求項第１項記載の重合体。
１５．ＲはＤであり、そして下記化合物：ｐ−ニトロフェニルＮ−（メチルスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリルメチル）−Ｎ−イソプロピルカルバメート、フェニルＮ−（メチルメクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリルメチル）−Ｎ−イソプロピルカルバメート、ペンタフルオロフェニルＮ−（メチルスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル −Ｌ−プロリルメチル）−Ｎ−イソプロピル−カルバメート、ヘプタフルオロブチルＮ−（メチルスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル− Ｌ−プロリルメチル）−Ｎ−インプロピルカルバメート、１−メチル−５−テトラゾリルＮ−（メチルスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリルメチル）−Ｎ−イソプロピルチオールカルバメート、ｐ− ニトロフェニルＮ−（メチルスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ３０アラニル−Ｌ− プロリルメチル）Ｎ−プロピルカルバメート、ｐ−ニトロフェニルＮ−（メチルスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ −プロリルメチル）−Ｎ−シクロプロピルカルバメート、ｐ−ニトロフェニルＮ−（メチルユクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ −プロリルメチル）−Ｎ−メチルカルバメート、ペンタフルオロフェニルＮ−（トリフルオロアセチル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリルメチル）−Ｎ−イソプロピルカルバメート、１−メチル−５ −テトラゾリルＮ−（メチルスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリルメチル）−Ｎ−シクロプロピルチオカルバメート、１−メチル−５−テトラゾリルＮ−（メチルスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリルメチル）−Ｎ−プロピルチオカルバメート、１−メチル−５−テトラゾリルＮ− （メチルスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロピルメチル）−Ｎ −ブチルチオカルバメート、１−フェニル−５−テトラヅリルＮ−（メチルスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリルメチル）−Ｎ−イソプロピルチオイルカルバメート、および１−メチル−５−テトラゾリルＮ−（メチルスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリルメチル）−Ｎ−アリルチオールカルバメートからなる群から選ばれる、請求項第１項記載の重合体。
１６．動物あるいはヒトにおける酵素エラスターゼを阻害する方法において、前記動物あるいはヒトへエラスターゼ阻害量の請求項第１項記載の重合体を投与することからなる上記方法。
１７．１日当り約０．１ｍｇ／ｋｇから３００ｍｇ／ｋｇの量で重合体を投与する、請求項第１６項記載の方法。
１８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＺはＲ′′ＯＳｕｃ−（ただし、Ｒ′′は（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルである）およびＣＦ３ＣＯ−からなる群から選ばれ、ｘは酸素または硫黄であり、Ｒ′は直鎖および２級分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、およびベンジルからなる群から選ばれ、Ｒ２は置換および非置換フェニル（これら置換基はニトロおよびペンタフルオロからなる群から選ばれる）、ベンジル、ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、１−低級アルキルテトラゾリル、１−フェニルテトラゾリル、２ −チオキソ−３−チアゾリジニル−、ピリジルおよびベンゾチアゾリルからなる群から選ばれるが、ただしＲ２がｐ−ニトロフェニルである場合には、Ｒ′はｔｅｒｔ−ブチル、ベンジルまたはシクロヘキシル以外の基であり、またＸが硫黄である場合には、Ｒ２はベンジル以外の基であることを条件とする〕を有する化合物Ｃ、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＸはＯまたはＢであり、Ｒ２はフェニル、ニトロフェニル、フルオロフェニル、−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、１−低級アルキルテトラゾリル、１−フェニルテトラゾリル、べンジル、２−チオキソ−３−チアゾリジニル、ピリジルおよびベンゾチアゾリルからなる群から選ばれ、Ｒ′は直鎖または２級分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、およびベンジルからなる群から選ばれるが、ただしＲ２がｐ−ニトロフェニルである場合には、Ｒ′はｔｅｒｔ−ブチル、ベンジルまたはシクロヘキシル以外の基であり、またＸが硫黄である場合には、Ｒ２はベンジル以外の基であることを条件とする〕を有する化合物Ｄ、および式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＺはＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＡｌａおよよびＣＦ３ＣＯ−Ａｌａ−Ａｌａからなる群から選ばれる）を有する化合物Ｅからなる群から選ばれる化合物の生物学的半減期を増加させる方法において、前記化合物約１から３，０００単位を平均分子量約１，０００から５００，００００ドルトアの実質的に非生物分解性の重合体に結合することにより遊離化合物の約１０倍以上の生物学的半減期をもつの重合体を得ることからなる上記方法。
１９．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＺはＲ′′Ｏ−Ｓｕｃ−（Ｒ′′は（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルである）およびＣＦ３ＣＯ−からなる群から選はれ、Ｘは酸素または硫黄であり、Ｒ′は直鎖および２級分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２〜¢Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、およびベンジルからなる群から選ばれ、Ｒ２は置換および非置換フェニル（これら置換基はニトロ、ペンタフルオロからなる群から選ばれる）、ベンジル、ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、１−低級アルキルテトラゾリル、１−フェニルテトラゾリル、２− チオキソ−３−チアゾリジニル−、ピリジルおよびべンゾチアゾリルからなる群から選ばれるが、ただしＲ２がｐ−ニトロフェニルである場合には、Ｒ′はｔｅｒｔ−ブチル、ベンジルまたはシクロヘキシル以外の基であり、またＸが硫黄である場合には、Ｒ２はベンジル以外の基であることを条件とする〕を有する化合物Ｃ、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＸはＯまたはＳであり、Ｒ２はフェニル、ニトロフェニル、フルオロフェニル、−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、１−低級アルキルテトラゾリル、１−フェニルテトラゾリル、ベンジル、２−チオキソ−３−チアゾリジニル、ピリジル、およびベンゾチアゾリルからなる群から選ばれ、Ｒ′は直鎖または２級分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、およびベンジルからなる群から選はれるが、ただしＲ２がｐ−ニトロフェニルである場合には、Ｒ′はｔｅｒｔ−ブチル、ベンジルまたはシクロヘキシル以外の基であり、またＸが硫黄である場合には、Ｒ２はベンジル以外の基であることを条件とする〕を有する化合物Ｄ、および式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＺはＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＡｌａおよよびＣＦ３ＣＯ−Ａｌａ−Ａｌａからなる群から選ばれる）を有する化合物Ｅからなる群から選ばれる化合物のエラスターゼ酵素阻害活性を増加させる方法において、前記化合物約１から３，０００単位を平均分子量約１，０００から５００，０００ドルトンの実質的に非生物分解性の重合体に結合して遊離化合物の活性より約１０倍以上大きいエラスターゼ酵素阻害活性を有する請求項第１項記載の重合体を得ることからなる上記方法。
２０．動物あるいはヒトにおける酵素エラスターゼを阻害する方法において、前記動物あるいはヒトへエラスターゼ阻害量の式：Ｐ−（Ｌ−Ｒ）ｑ〔式中、Ｐは式（ＡｍＢｎ）（式（ＡｍＢｎ）は実質的に非生物分解性で、約１，０００から５００，０００ドルトンの平均分子量をもち、ｍとｎは同じことも異なることもあり、そして約５から３，０００であり、ＡとＢは同じことも異なることもあり、そしてＡおよびＢの少なくとも一つはＬおよびＲの一つに共有結合できる）で表わされる少なくとも一つの単位からなる重合体であり、Ｒは式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘは酸素または硫黄であり、Ｒ′は直鎖および２級分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、およびベンジルからなる群から選ばれ、Ｒ２は置換および非置換フェニル（この互換基はニトロおよびペンタフルオロからなる群から選ばれる）、ベンジル、ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、１−低級アルキルテトラゾリル、１−フェニルテトラゾリル、２− チオキソ−３−チアゾリジニル−、ピリジルおよびベンゾチアゾリルからなる群から選ばれるが、ただしＲ２がｐ−ニトロフェニルである場合には、Ｒ′はｔｅｒｔ−ブル、ベンジルまたはシクロヘキシル以外の基であり、またＸが硫黄である場合には、Ｒ２はベンジル以外の基であることを条件とする）を有する化合物Ｃ、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＸはＯまたはＳであり、Ｒ２はフェニル、ニトロフェニル、フルオロフェニル、−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、１−低級アルキルテトラゾリル、１−フェニルテトラゾリル、ベンジル、２−チオキソ−３−チアゾリジニル、ピリジル、およびべンゾチアゾリルからなる群から選ばれ、Ｒ′は直鎖または２級分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ３）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、およびベンジルからなる群から選ばれるが、ただしＲ２がｐ−ニトロフェニルである場合には、Ｒ′はｔｅｒｔ−ブチル、ベンジルまたはシクロヘキシル以外の基であり、またＸが硫黄である場合には、Ｒ２はベンジル以外の基であることを条件とする）を有する化合物Ｄ、および式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｚは−Ｏ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａである）を有する化合物Ｅからなる群から選ばれる化合物で、前記各ＲはしへあるいはＡおよびＢの一方へ共有結合し、Ｌは１本の共有結合および１個のリンカー基（これはＡおよびＢの一方およびＲへ共有結合している）からなる群から選ばれ、ｑは約１からｍ＋ｎまでである〕で表わされる重合体を投与することからなる上記方法。
２１．重合体を１日当り約０．１ｍｇ／ｋｇから３００ｍｇ／ｋｇの量で投与する、請求項第２０項記載の方法。