JPH03504236A - 哺乳動物における妊娠の認知のための新規タンパク質、妊娠の早期検出への応用とそのタンパク質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物における妊娠の認知のための新規タンパク質、妊娠の早期検出への応用 とそのタンパク質の製造法本発明は反すう動物の妊娠を認知するための新規タン パク質に関するもので特に妊娠の早期検出のための用途とそのタンパク質の製造 法に関するしのである。

雌牛においでは妊娠ｊ７て２０８目までは胚子の着床は起こらない。しかしなが ら、生き長らえるためには受胎産物は黄体の後退を防ぐように１７日目までＩご 母体の器官にメツセージを送らねばならない。それ故に受胎産物によって産生さ れるかまたは刺激された胚子の物質の存在を示すあらゆる徴候が存在するが、そ の物質は妊娠認知の機構に関連する。Ｂｕｔｌｅｒ、　ＩＩａｎ＋１ｌｔｏｎ。

５ａｓｓｅｒ、　Ｒｕｄｅｒ；　ｌ１ａｓｓ及びＷｉｌｌｉａｗ＋ｓ　（Ｂｉｏ ｌ、　ＲＥＰＲＯＤ、　２６巻、９２５頁、１９８２年）は妊娠特異的なタンパ ク質Ｂｔ−単離同定した。このタンパク質は、２５日目〜２７０ロ目の胎仔のウ シ胎盤膜の抽出物から単離されたが、分子量は４７〜５３ＫＤａで等電点は４， ０〜４，４である。このタンパク質Ｂは、妊娠の１６〜２８０日後の胎仔の胎盤 校から得たが、屠殺された妊娠雌牛から採取し一２０℃に凍結した。その膜をか みそりの刃で細かく切り、ホモジナイズしそれを＋４℃で３０分間１ｏｏｏｆｌ 　ｇで遠心分離し、た。得られた−１−、澄み液を保存した。

得られた胎盤抽出物を水浴中に置き、硫酸アンモニウムで５０〜６５％に飽和し て沈殿した両分を、４℃でトリスＩＩｃＩ緩衝液ｐｉ（７．５に溶解し、１２０ ００−１３０００Ｄａの排除限界で同じ緩衝液に対して４℃で４８時間透析する 。透析液を濃縮し、それからイオン交換クロマトグラフィーにかける。このクロ マトグラフィーはＤＥＡＥセルロースカラムで行われ、上記のタンパク質はＯ， ＯＩＭトリスＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）中で上記カラムに１ｍｌ／秒の速度で チャージされた。そして固定されていないタンパク質を溶出した後、Ｏ−０，３ ＭのＮａＣ１の直線濃度勾配液を適用する。集めた両分から選択した。妊娠特異 的抗原活性を有する両分をプールし、凍結し一２０℃に保存する。次いでｓｏｏ 、ｏｏｏダルトンの排除限界と１万〜５０万Ｄａの分画域を有するＢｌｏ−Ｇｅ １Ａ−０，５のカラムでゲル濾過を行う。イオン交換クロマトグラフィーで０収 された妊娠特異的タンパク質を限外濾過により濃縮する。

１９８３年７月２１日付けの米国特許畷の優先権主張して出願された１９８４年 ７月１６日のヨーロッパ特許願事１３２，７５０号は、胎仔の外側にある妊娠哺 乳動物の生理液の中で抗タンパク質Ｂ抗体と抗原との間の免疫複合体の存在を検 出することからなる、哺乳動物の妊娠検出法にその主題を限っているが、この場 合、タンパク質Ｂは、検出可能なシグナルを出すように接合によってラベルする のが好ましい。

発明者のｉつの目的は、高純度でかつ完全に同定され、しかもその製造が厳密に 再現しうる、哺乳動物、特に反すう動物の妊娠の認知に関するタンパク質を提供 することである。発明者のもう１つの目的は妊娠の初期の特異的な診断や胎仔の 死亡率の診断を行うための手段、特に１ｉ７１記タンパク質を提供することであ る。発明者のさらに他の１４的は純粋で完全に同定された１１７１記タイプのタ ンパク質を製造する際にこの分子の生理学的特性を明らかにすることである。

本発明は、ｌ’ｓＰＢ、すなわちサッザー（５ａｓｓｅｒ　）の妊娠特異的タン パク質Ｂ（ごこではｒ’ｓｒ’、。と呼ぶ）に類似の妊娠特異タンパク質に関し 、このタンパク質は以下の式Ｉに示ずＮ末端アミ（Ｉ） （式中記号Ｘはおそらくアスパラギンである）本発明によればＰＳＰａ。は分子 量約６０にダルトン（変性媒体中でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分 析された）で２次元電気泳動後の等電点は約５．１〜５．５である。

本発明はさらに、哺乳動物胎盤からＰＳＩ’＠。を製造する方法であって、ホモ ジナイズして適当な緩衝液中で抽出された胎盤を、酸沈澱させ得られた上澄み液 を塩析沈澱させ、次にその沈澱をイオン交換クロマトグラフィーと次いでゲル濾 過法に付し、ｒ’ｓ＋”＠。活性を有する画分を陽イオン交換１１＋’ｌ、Ｃカ ラムを通過させ次いで酸性ｐＨの適当な緩衝液のＩＩａＣＩｊｌｔ度勾配液によ り溶離してｐｓｒ、。を単離できる方法に関する。

°本発明によれば、ＰＳｈ−は、他の方法、特に他のタンパク質精製法又は生物 工学的手法によって（遺伝子工学、細菌又は細胞の合成法、トランスジェニック 動物等を含む）で得ることができる。

本発明はさらに哺乳動物、特に反すう動物の妊娠の早期診断のテストを行うため のキットに関し、通常の試薬である緩衝液及び／又は希釈液１こ加えて、抗ＰＳ Ｐ＠。ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の必要攪で構成されている。

その発明によれば、その抗体は、ＰＳＰｓ。によって免疫化された哺乳動物の血 清、またはｐｓｐ、。で免疫化された哺乳動物の細胞と、適切な捕乳動物（特に マウスのような）の悪性腫瘍細胞との融合によって得られる。

前述の条項に加えて、その発明は次のような記述から明らかになる他のことも含 む。

この発明は、本発明の主題をいかに実施するかの例を示す以う。しかしながら、 これらの実施例は単に発明の主題を例証するためにのみ記載されているだけで、 この発明を限定するものでないことは明らかに理解されねばならない。

ＰＳＰＢの存在はアメリカのチームＣＢｕｔ　Ｉｅｒら（１９８２））によって 証明されたが多くの問題は解決されなかった。すなわち、１’ＳＰＢ測定の妊娠 診断への応用の信頼性と限界、胎児の死亡率を評価することの重要性、実際の分 泌源、最も純粋な製剤（放射性ヨー素化製剤）が不均一であった分子の正確な生 化学的特質、栄養胚葉ホモジネートもしくは不充分に精製されたタンｌくり質製 剤に対する免疫血清、不正確およびもしくは変性した精製法（等電点電気泳動法 ）、胎児の緩衝系及び胎児の外膜液中における存在の不充分な理解、および全体 的な生物学的性質が知られていないことである。さらに充分明らかにされていな いウシ妊娠特異タンパク質の測定のために利用できるラジオイムノアッセイ法を 入手できた（上記のヨーロッパ特許願参照）。

しかしながら、ＰＳＰ　Ｂの測定は、それが妊娠特異的診断を行うことを可能に させるので非常に重要である。実際、黄体の活性を反映し現時点で広く用いられ るプロゲステロンの測定は、非妊娠を診断するすぐれた手段になっている。しか しそれは黄体が胎児の死亡後も存続する際に（雌牛では１６日０から）、多数の 偽陽性の妊娠診断の原因となる場合がある。さらに発情サイクルの各々の黄体期 の間にプロゲステロンが分泌するので、自然もしくは人口の受胎・の日をきわめ て正確に知ることが必須であるが、いつもそうとは限っていない（例えば肉用種 のウシの集団）。

実施例１ ウシＰＳＰ＠。のＩＩＰＬＣによる精製凍結した胎仔の胎盤葉をホモジナイズし 、リン酸−ＫＣＩＩＩ衝液（０，１Ｍ）　ｐＨ８，６で抽出した。得られた胎盤 の抽出液の酸によって沈澱（ｐＨ４，５）させ、そのの上澄み液を硫酸アンモニ ウム（４５及び６５％飽和、ｐＨ５，２）で沈澱させた。その沈澱を次に透析し 、ＤＥＡＥ−セファデックスのクロマトグラフィーに付し、次ｔ１でゲル濾過に かけた。各画分中のＰＳＰＢ。の存在は、Ｂｕｔｌｅｒらによる報文に述べられ たような不純なＩ’ＳＰＢ製剤によるラジオイムノアッセイによって測定した。

ＰｓＰ陽性の両分を、陽イオン交換ＨＰＬ（、カラム（ＴＳＫ　Ｓ［’　５ＰＷ 　：　７５ｍｍＸ　７．５ｍｍ内径）に注入し、タンパク質を、分析カラムでは ｐｌＩ５．４のまたは分取カラムではｐｕｓ、ｇ５の、００５Ｍリン酸緩衝液中 のＫＣＩの直線状濃変勾配液で溶出した。第１図は０．１９５ＭのＫＣＩ濃度で ＩＩＰＬｃカラムから溶出された大きく明確なピーク（ＰＳＰ、＋＋）を示し、 それはサッサーらにより提案されれたＰＳＰＢラジオイムノアッセイにおいて免 疫学的反応性を示す。変性媒体中ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分 析された場合、このＰＳＰｓｏのピークは単一バンドに相当し、約６０にダルト ンの見かけの分子量ををする。放射性ヨー素化の後、このタンパク質は抗ＰＳＰ Ｂ免疫血清によって沈澱し、Ｂｕｔｌｅｒ、　５ａｓｓｅｒらによって得られた 放射性ヨー素化ｐｓｐＢの製剤の中に含まれるタンパク質の１つと同じ電気泳動 度を有する。

しかしながら、Ｂｕｔｌｅｒらによって得られたＰＳＰＢの性状、すなわち分子 量約４７〜５３キワダルトン、等重点４〜４．４は、本発明におけるＰＳＰｓｏ が分子ｆｆ１６０にダルトンで等電点５．１〜５５であるので同じ分子でないこ とを示す。

実施例２ ウシＰＳＰｅｏの特性決定 ２、　１　　物理化学的性状 変性媒体中のアクリルアンドゲル電気泳動による分析後、ＩＩＰＬＣによって精 製されたＰＳＰｅ。のピークは６０ＫＤａの見かけの分子量を有する単一バンド だ（Ｊを示す［ＢｕＬｌｅｒ（１９ｇ２）らによって得られた４７〜５３Ｋａと は異なる］。しかしながら、同一実験条件下、５ａｓｓｅｒのＰＳＰＢは、放射 性ヨー素化後、５９Ｋｐａの見かけの分子量をもった１つのタンパク質ともうひ とつの５１Ｋａの分子量を有する少量のタンパク質を与える。ＨＰＬＣによって 精製されたＰＳＰ、。

の等電点は等電点電気泳動後５．５であることが見出された。それ故、この等電 点は５ａｓｓｅｒやＢｕｔｌｅｒによって報告されているＰＳＰＨの等電点とは 著しく異なる。それにもかかわらず、本発明によって精製されたｐｓｐ、、は５ ａｓｓｅｒの抗ＰＳＰＢ免疫血清にょっ２．２　無細胞翻訳系による特性決定 ３ＳＳ−メチオニン存在下での、無細胞系（網状赤血球の溶解物）の２９日目の ウシの拍子のポリ（Ａ）　’ｍＲＮへの合成能力を測定した。合成されたｐｓｐ 、。の量は、ウシ抗ＰＳＰＢ免疫血清による特異的免疫沈降、次いで５ＤＳ−電 気泳動によって測定された。ＰＳＰ、。

の前駆体は４９ＫＤａにタンパク質に相当し、その見かけの分子量はＩ’ＳＰ、 、、　（、，６（ｌＫＤａ）の分子量より幾分車さい。すれはおそらく天然のタ ンパク質の糖タンパク質性を示している。この無細胞媒体におけるｐｓｐ、、の 翻訳は、その分泌タンパク質画分が約４６Ｋａの見かけの分子量を有することを 示唆している。

実施例３ ＰＳＰ、。の定量的検出法が本願の発明者によって開発された。

それは２つの抗体を次のような条件下に用いるラジオイムノアッセイで構成され ている。１″１によって標識化し検量線を作成ずろために用いるＰＳＰ、、はＩ ＩＰＩ、Ｃによる最終の精製段階から誘導される。ウサギを免疫化した後に得り れる抗ｐｓｐ、、抗血清は１６０Ｍ分の１の最終希釈に用いられ、それは発明者 らによって確立されたアッセイ条件下、放射性ヨー素化ＰＳＰｅｏの２５−３０ ％と結感度：この方法は１００μｍサンプル中のＰＳＰｅｏの２０ｐｇを検出で きる。アッセイ内、アッセイ間の再現を変動係数で表すと、ＰＳＰ、。

の１．３ｎｇ／ｍｌを含む血清サンプルについて、それぞれ６％と１２％でδ５ る。

平行関係：妊娠雌牛の血清または血漿及び牛の胚細胞培養液は、第２図に示すよ うに、参照曲線と平行な用量−反応曲線をもっている。この曲線は血清又は培養 液の希釈を上げていくことによって得られる放射性ヨー素化ｐｓｐｅｏ／抗ＰＳ ４’−０抗体結合の阻害曲線を示す。したがって血液中に存在するか、または胚 によって培養媒体内に分泌される他の化合物は、ＰＳＰｅｏのアッセイを妨害し ない。妊娠羊の血清と、牛の胚培養液はＰＳＰ、、と交差し平行とならない（第 ２図参照）。

アッセイの特異性：ランα拍子仔タンりク質との交差反応は全くない。

実施例４ ＰＳＰｓａ分泌の特性決定、胚にＪ：るｐｓｐ、、の生体外分泌実施例３によっ て述べられたアッセイ法によって、生体外で培養された胚によるＴ’ＳＰｅ。の 分泌の進展を追跡することができる。雌牛においてｐｓｐ＊。は妊娠１６日目か ら培養液中に存在するが、まだ血中には検出されない。妊娠２５日目で、栄養膜 組織の約１０ケの体外移植組織（約０．３＋ｎｇのタンパク質）は、ＰＳＰ、。

を２４時間につきＩＯ’（ｌｎｇ以上分泌する。羊においては１４日目の胚の培 養液中にはＰＳＰ、。は検出されないが、非規同アブセイで妊娠１５日目から（ 妊娠１５日〜２４日の間の２４〜＋８０ｎｇ／’胚）検出可能である。

ウシｐｓｐ、。のアッセイ法では羊１こおける胚の分泌量を正確に測定できない 。

免疫細胞蛍光法にＪ、６ｇ５Ｐｅ。の細胞曳邑坦免疫細胞蛍光法の技術は、妊娠 ２４日目における羊栄養膜の三核小体巨大細胞の細胞質中のＰＳＰ、、の特異的 局在化を証明する（他の型の細胞は標識化されない）。第３図は２４日目におけ る羊の尾翼絨毛膜の写真を示す。ＰＳＰｓｏの局在化は免疫細胞蛍光法によって 三核小体細胞中に行われる。

雌牛の妊娠中の分泌 ＰＳＰａ。は母の血中に妊娠２５日目から３０日口重に現われる。それは分娩前 約３０日間まで徐々に上昇する。６３日口重、９±０．５８ｎｇ／ａ＋Ｉ（Ｘ± ５Ｅ）（ｎ＝３）、９５日口重Ｏ１６±！、６７ｎｇ／ｍｌ　（ｎ　＝４）、お よび２３３日目７ｌ、１±１６．１ｎｇ／ｍｌ　（ｎ　＝　８　）である。分娩 前約１ケ月に、ＰＳＰ、。レベルは急に上昇しく３１４±１５１ｎｇ／＋＋１２ ６１日目（ｎ＝８））分娩時には最大値に達ずろ（７９０ｎｇ／艶１雌ウシ中） （第４図）、。

ＰＳＰ、。は分娩倹約１０週間まで無視できないレベルで母体循環系中に存在し 、対でそのレベルはゼロに近づく（第５図）。２５頭の雌牛で分娩後３〜１６週 間の間、各週ｐｓｐ、。のアッセイをすると、時間（週）の関数としてｐｓｐａ 。の濃度の対数の減衰曲線が作れる（第６図）。

Ｙ　＝　−０，２５Ｘ　−３，２４ したがってＰＳＰｓ。の半減期は８．４日と推定される。

実施例５ ＰＳＰ＠。のアッセイによる妊娠の診断６１頭の雌牛と７９頭の若雌牛でｐｓｐ ａ。のアッセイによる最初の妊娠診断が人口受精後２５．２６又は２７日目に行 われた。診断を確実にするために直腸触診とＰＳＰ、。アッセイのための血液の サンプリングは発情期に入った全動物について９０日目に行われた。

陽性診断の正確さく正しい陽性診断数／全陽性診断数）は雌牛において２５及び ２６日目で７８％に近づき、２７日目で９０％を越えた。

それに対し、若雌牛ではこれら３段階における陽性診断の正確さは以下の第１表 に見られるように９０％以上である。すべての場合、その精度はサンプリングの 段階（日）によって増加し、雌牛より若雌牛の方が著しく高い（ｐ　＜０．０５ ）。４頭の雌牛だけが出産後７０日目までに受精し、出産後にＰＳＰ＠。の残留 濃度があり、誤った妊娠診断をまねいた。

１１表 ＰＳＰｓａＲＩＡによる人工受精（Ａ１）後２５．２６又は２７０目の妊娠診断 の精度陽性結果の精度 ２５日目　　　２６日目　　　２７日目　　２５〜２７日目％ｎ口重％ロ％ｎ 雌ウシ　　７８．３　（Ｉ８／２３）’　　７８．９　（Ｉｓ／１９）　　９４ ．７（１ｇ／１ｌｌ）　　８Ｌ８　（５１／１ｆｔ）ｂ若雌ウシ　９１．７（２ ２／２４）　　９Ｓ、ｌｉ　０２／２ｍ）　　１１８．９　（ｍｌ／３２）　　 ９４．１１　（７５／８１）ｃ合計　１１５．１　（４１１／４７）　８１１． １　（２７／４υ９１１　（４１１５１）ｂ対ｃ　　ｐ＜０．０５ 陽性の結果の精度＝　Ａ／Ｂ Ａ：９０日目においてＰＳＰ＠。のアッセイ及び直腸触診による陽性の動物数 Ｂ　：　ＰＳＰ、。アッセイによる陽性の動物数実施例６　　、 ＰＳＰ・０のアッセイによる拍子死亡率の決定後期拍子死を有する雌牛または若 雌牛において（下記第ｎ表参照）、人口受精後２Ｂ、　３５．５０及び９０日目 のＰＳＰ＠。のアッセイは、ＰＳＰ・。濃度の減少が確認され、この拍子死亡の 時間の決定が可能になった。それは超音波診断や直腸触診によって確かめられた 。

第１表 胎仔の死亡率 ２６日目の　３５日目の　５０日目の　５０日目の　　９０日目の　９０日目の ＰＳＩ’ｌｌＯＰＳＰ８０　　１’５Ｐ６０　　　超音波診断　ＰＳＰ１５１１ 　　　ＩＩＩ触診（ｕ／ｎ）　　　　　Ｃｍｇ／ａｌｌ）　　　　（＋＋ｓ／ｍ ｆｆ）　　　　　　　　　　　　　　　　　（ａｇ／ｍｌり雌つシ ５Ｏ１３ｆ１．７　　　　　Ｌ２　　　　、、’１．Ｂ　　　　　＋　　　　　 　１．１　　　　−５０１７０　　　　　１．４　　　０．６　　　　−　　　 　　０　　　　　−５０４１（１，３４，７２，８＋　　　　　　０　　　　　 −５ｏｓｓｏ　　　　　ｏ、ｚ　　　　ｏ　　　　　　−５０６７０，８１４０ ，４− ５Ｇ９４０　　　　　０．１１　　　０Ｊ　　　　　−０−若雌ウシ ロ０３４　０　　　　　１．３　　　　（１，９＋　　　　　　　　　　　−生 育能力？ ６２９Ｂ　　　　０．５　　　　　　　　０　　　　　　　　覧ＩＩにみられる 本発明によって固定され単離されたＰＳＰ＠。は次のような多数の用途を有して いる。すなわち妊娠の診断、拍子の生存率又（よ死亡率の診断、及び遺伝的選択 をするのを目的とする受精能力の測定の用途である。

さらに本発明によって同定されたＰＳＰｓ。の我々の知識を拡げると、その生理 学的性質やそれらの可能な応用を特定することが可能になるだろう。

記述の説明から明らかなように、本発明は、明確に述べられ本発明は、構成と範 囲からはずれることなく当業者ｈ（考えつくすべての変形を包含するものである 。

ＬｏｇＺｔ　　ｔｚ　　Ｍｌ；ｌｙｌミｌコ５′１　ｆ町＞６．、　）ＰＳＰｓ ａの濃度　　（ｒｇ／ｍ　ｊ 国際調査報告 国際ｖ４斎報告 ＦＲ８９００１１５ Ｓ＾　　　２７５７！１

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．下式（Ｉ）： 【配列があります】（Ｉ） （式中、Ｘは未確定アミノ酸を示す。）で表されるＮ末端アミノ酸配列を有する ＰＳＰ８０と称する哺乳動物妊娠特異的タンパク質。
2. ２．ポリアクリルアミドゲル電気泳動（変性溶媒中）で分析さわたとき約５７〜 ６３ＫＤａの分子量を有し、２次元電気泳動後に約５．１〜５．５の等電点を有 するＰＳＰ８０と称される哺乳動物妊娠特異的タンパク質。
3. ３．胎盤をホモジナイズし、適当な緩衡液で抽出し、酸で沈澱させ、その上澄み 液を塩析沈澱させ、その沈澱をイオン交換体のクロマトグラフィ次いでゲル濾過 法に付し、得られたＰＳＰ８０活性を有する画分を陽イオン交換ＨＰＬＣカラム を通過させて精製することからなり、この精製が酸性ｐＨの適当な緩衝液中の食 塩の勾配液による溶離で行われ、ＰＳＰ８０を単離することがでまる、哺乳動物 胎盤からのＰＳＰ８０の製造法。
4. ４．通常の試薬である緩衝剤および／または希釈剤に加えて、抗ＰＳＰ８０ポリ クローナル抗体もしくは抗ＰＳＰ８５モノクロナール抗体の有用量からなる妊娠 の早期診断または胎児の死亡率の診断の試験を実施するためのキット。