PT90043B - Processo para a preparacao de uma nova proteina de reconhecimento da gestacao nos mamiferos e suas aplicacoes para a deteccao precoce da gestacao - Google Patents

Description

INSTITUTE NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIOUE (INRA)

Processo para a preparação de uma nova proteína de reconhecimento da gestação nos mamíferos e suas aplicações para a detecção precoce da gestação

A presente invenção diz respeito a um processo para a preparaçao de uma proteína de reconhecimento da gestação nos ruminantes e às suas aplicações em especial para a detecção precoce da gestação.

A implantação de um embrião na vaca não ocorre antes do 202 dia de gestaçao. Contudo, para sobreviver, o conceptus deve enviar antes do 17² dia, uma mensagem ao organismo materno para impedir a regressão do corpo amarelo. Existem portanto, como tudo indica, substâncias embrionárias produzidas ou estimuladas pelo conceptus, que estão implicadas nos mecanismos de reconhecimento da gestação. BUTLER, HAMILTON, SASSER, RUDER, HASS e WILLIAMS (Biol. Reprod. 26, 925, 1982) identificaram e isolaram uma proteína B específica da gestação. Esta proteína, isolada a partir de extractos de membranas placentárias bovinas de fetos com idades compreendidas entre 25 e 270 dias, apresenta um peso molecular compreendido entre 47 e 53 kDa e um ponto isoéléctrico compreendido entre 4,0 e 4,4. Esta proteína B foi obtida a partir de membranas placentárias de embriões com idades compreendidas entre 16 e 280 dias de gestaçao, colhidos em vacas grávidas abatidas, depois congeladas a -20°C. As membranas foram finamente cortadas em fatias delgadas com uma lâmina de barbear e foram homogeneizadas, centrifugou-se

depois a preparação a lOOOOg durante 30 minutos a + 4°C. Conserva-se o sobrenadante resultante.

Coloca-se o extracto placentário em um banho de gelo e dissolve-se a fracção que precipita entre 50 e 65% de saturação pelo sulfato de amónio e dissolve-se em tampão Tris-HCl 0,01M, pH 7,5 a 4-°C, após o que se dialisa durante 4-8 horas a 4-°C contra este tampão, com um limite de exclusão compreendido entre 12 000 e 13 000 Da. Concentra-se o dialisado e submete-se depois a um processo de cromatografia por permuta iónica. Este processo realiza-se era uma coluna de DEAE-celulose na qual a proteína é carregada no tampão Tris-HCl 0,01M (pH 7,5) com um débito de 1 ml/minuto e, após eluição das proteínas não fixadas, aplica-se um gradiente linear de NaCl de 0 a 0,3M. Elui-se as fracções recolhidas. Reúne-se as que apresentam uma actividade antigénica específica da gestação, congelam-seearmazenam-se a -20°C, realiza-se então uma filtração sobre gel em uma coluna de Bio-Gel A-05 cujo limite de exclusão é de 500 000 Daltons e a gama de fraccionamento compreendida entre 10 000 e 500 000 Daltons. Concentra-se a proteína específica da gestação, recuperada mediante cromatografia de permuta iónica, por ultrafiltração.

pedido de patente de invenção europeia N° 132 750 de 16 de Julho de 1984-, depositado reivindicando uma prioridade norte-americana de 21 de Julho de 1985, está limitado no seu objecto a um processo para a detecção da gestaçao nos mamíferos, que consiste, em detectar a presença de um imunocomplexo entre um anticorpo anti-proteína B e um antigénio, em um fluido fisiológico do mamífero grávido, exterior ao feto, enquanto a proteína B é marcada, de preferência mediante conjugação, de·. maneira

- 5 a fornecer um sinal detectável.

Os Inventores têm por objectivo a obtenção de uma proteína para o reconhecimento da gestação nos ruminantes que apresente um alto grau de pureza, perfeitamente identificada e cuja preparação seja rigorosamente reproductível; os Inventores têm igualmente por objectivo a utilização dos meios, e em particular da referida proteína, para a realização de um diagnóstico precoce específico da gestação e de um diagnóstico de mortalidade embrionária; os Inventores têm igualmente por objectivo, mediante a preparação de uma tal proteína pura e perfeitamente identificada, o esclarecimento das propriedades fisiológicas desta molécula.

A presente invenção tem por objectivo uma proteína específica da gestação, análoga à PSPB-Pregnancy Specific protein B de Sasser- que será denominada no que se segue por PSPgQ (ou Pregnancy Serum Protein, de peso molecular igual a cerca de 60 KDa), caracterizada pelo facto de apresentar a sequência N-terminal em aminoácidos representada pela fórmula I a seguir:

-X-Gly-Ser-X-Leu-Thr-Thr-Hís-Pro-Leu-Arg-Asn-Ile-Lys-Asp15 10 15 (I)

-Leu-Val-Tyr-Met-Gly-X-Ile-Thr-Ile-Gly-Thr-Pro-Pro-Gln20 28

-Glu-Phe-Gln-Vai-Val-Phe-Asp-Thr-Ala-Ser-X- (I)

55 40 ( representando ο X provavelmente asparaginas).

De acordo com a presente invenção, a PSP^q apresenta um peso molecular de cerca de 60 kDa ( por análise mediante electroforese sobre gel de poliacrilamida em meio desnaturante) e um ponto isoeléctrico compreendido entre 5,1 θ 5,5 após electrofocese bidimensional.

A presente invenção tem, além disso, por objecto um processo para a preparação da PSP^q a partir de placentas de mamíferos, caracterizado pelo facto de se submeter placentas homogeneizadas e extraídas em um tampão apropriado a uma precipitação ácida e de se submeter o sobrenadante a uma precipitação salina, de se submeter depois o precipitado a uma cromatografia sobre um permutador de iões e sn seguida a uma filtração sobre gel, e purificação das fracções que apresentam uma actividade ΡδΡθθ mediante passagem em uma coluna de HPLC permutadora de catiões, seguida de uma eluição com um gradiente salino em um tampão apropriado de pH ácido, o que permite isolar a PSPgQ.

De acordo com a presente invenção, a ΡδΡθθ pode obter-se de acordo com outras vias, particularmente por outras vias de purificação das proteínas ou por via biotecnológica (abrangendo a engenharia genética, síntese bacteriana ou celular, animais transgenéticos, etc.).

A presente invenção tem igualmente por objectivo um estojo para a realizaçao de um teste para o diagnóstico precoce da gestação, nos mamíferos e principalmente nos ruminantes, caracterizado pelo facto de, para além dos reagentes, tampões e/ou diluentes usuais, compreender uma quantidade útil de anticorpos policlonais ou monoclonais anti-PSPgQ._;

De acordo com a presente invenção, os anticorpos obtêm-se a partir de soros de mamíferos imunizados pela PSP^q quer mediante fusão de células de mamíferos imunizados pela PSP^q

com células malignas de mamíferos apropriados (tais como o murganho, especialmente).

Para além das disposições anteriores, a presente invenção diz respeito ainda a outras disposições, que sobressairão da descrição que se segue.

A presente invenção será melhor compreendida com a ajuda do complemento da descrição que se segue que se refere a exemplos de realização do objectivo de acordo com a presente invenção.

Deve ficar bem esclarecido, contudo, que estes exemplos de realização são dados unicamente a título ilustrativo do objecto da presente invenção, pelo que não constituem de maneira nenhuma uma limitação.

A PSPB foi evidenciada por uma equipa norte-americana (BUTLER e colab., 1982), mas não foram resolvidos numerosos problemas: fiabilidade e limites de aplicação do doseamento da PSPB ao diagnóstico da gestação, interesse na avaliação da mortalidade embrionária, origem real da secreção, caracteristicas bioquímicas precisas da molécula da qual as preparações mais puras (preparações de radioiodação) são heterogéneas, imuno-soros dirigidos contra homogeneizados de trofoblasto ou preparações proteicas insuficientemente purificadas, método de purificação impreciso e/ou desnaturante (isoelectrofocalização) presença mal conhecida na circulação do feto e nos líquidos dos envólucros embrionários,.propriedades biológicas totalmente ignoradas. Por outro lado, dispõe-se de um doseamento radioimunológico (cf. pedido de patente de invenção europeia referida antes) utilizável para o doseamento de proteínas mal definidas, específicas da gestação nos bovinos. 0 doseamento da PSPB representa, contudo, um grande interesse visto que deve permitir efecuar diagnósticos específicos da gestação. Com efeito, o doseamento da progesterona, reflecte a actividade lútea, largamente divulgada actualmente, constitui um excelente meio de diagnóstico de não gestação, mas pode estar na origem de um certo número de falsos diagnósticos positivos de gestação no caso de corpos amarelos persistentes a seguir à mortalidade embrionária (a partir do 162 dia na vaca). Além disso, em virtude da secreção da progesterona durante cada fase lútea do ciclo estriano (cio) é indispensável conhecer rigorosamente a data da cobriçao ou da inseminação artificial, o que nem sempre é o caso (numerosos bovinos de raças para carne, por exemplo).

Exemplo 1

Purificação da PSP^q bovina mediante HPLC. Homogeneizam-se cotilédones fetais congelados e extraem-se em tampão de fosfato KC1 (0,1 M) pH 8,6. Submete-se o extracto placentário a uma precipitação ácida (a pH 4,5) e precipita-se o sobrenadante com sulfato de amónio (40% e 65% de saturação pH 5,2). Em seguida dialisa-se o precipitado e submete-se a uma cromatografia em DSAE-Sephadex, depois a uma filtração sobre gel. A presença da PSP^q nas fracçoes determina-se mediante radioimunologia com a ajuda de preparações de PSPB impuras tais como as descritas na publicação BUTLER e colab. As fracçoes PSP - positivas aplicam-se sobre uma coluna de HPLC permutadora de catiões (TSK SP 5 PW ; 75 mm x 7,5 mm diâmetro interior) e elui-se proteínas com um gradiente linear

de KC1 em tampão de fosfato 0,05M a pH 5,4 em coluna analítica ou a pH 5,85 θ® coluna preparativa. A figura 1 anexa mostra um pico maior distinto, (ΡβΡθθ) eluída da coluna de HPLC com a concentração de O,195M de XC1, apresenta uma reactividade imunológica no ensaio do doseamento radioimunológico da PSPB proposta por SASSER e colab. Por análise mediante electroforese em gel de poliacrilamidc em meio desnaturante, este pico de PSPgQ corresponde a uma única banda e a um peso molecular aparente de 60 kDa aproximadamente.

Após radioiodação, esta proteína precipita com o imuno-soro anti-PSPB e apresenta a mesma mobilidade electroforética que uma das proteinas contida na preparação de PSPB radioiodada, obtida por BUTLER, SASSER e colab. Contudo, as caracteristicas da PSPB de BUTLER e colab., - 47-55 kDa, ponto isoeléctrico 4—4,4-, fazem parecer que não se trata na presente invenção da mesma molécula, visto que a ΡΞΡθθ tem um P.M. de 60 kDa e um ponto isoeléctrico de 5,1-5,5·

Exemplo 2

Caracterização da PSPgQ bovina

2.1 Caracterização fisicoquimica

Após análise mediante electroforese sobre gel de acrilamida em meio desnaturante, o pico da ΕδΡθθ purificada mediante HPLC apenas apresenta uma única banda de PM aparente de 60 kDa ( em vez de 47 a 55 kDa por BUTLER e colab., 1982). Contudo, nas mesmas condições experimentais, a PSPB de SASSER apresenta, após radioiodação, uma proteína de RM aparente de 59 kDa e uma outra menor de 51 kDa. 0 ponto isoeléctrico da PSPgQ purificada por HPLC foi determinado a 5,5 após isoelectro-

focalizaçao. Difere portanto sensivelmente do da PSPB descrita por SASSER e BUTLER. A proteína PSP^q purificada pelo processo de acordo com a presente invenção é todavia precipitável pelo imuno-soro anti-PSPB de SASSER .

2.2 Caract erizaçao por sistema de tradução acelular Determinou-se a capacidade sintética do ARN poli (A)⁺ de embriões ovinos com 29 dias de idade em um sistema acelular (lisado de reticulócitos) na presença de ^^S-metionina. Calculou-se a quantidade de PSP^q sintetizada mediante imunoprecipitaçao específica com a ajuda do imuno-soro anti-PSPB bovino, seguida de elctroforese-SDS: o precursor da PSP^q corresponde 'a uma proteína de 4-9 kDa, cujo o PM aparente é nitidamente inferior ao da PSP^q (60 kDa), o que marca muito provavelmente a natureza glicoproteica da proteína nativa.

Esta tradução da PSPgQ em meio acelular sugere que a sua fracção proteica segregada apresenta um PM aparente de cerca de 46 kDa.

Exemplo 3

Doseamento radioimunológico da PSP^_Q Os Inventores afinaram um método quantitativo para a detecção da PSPgQ. Esse método consiste num doseamento radioimunológico, utilizando dois anticorpos, nas seguintes condições; a PSPgQ utilizada para a marcação com Iodo 125 e para as curvas de aferição, é resultante da última etapa de purificação mediante cromatografia de HPLO. Um anti-soro anti-PSPg₀, obtido após imunização de coelhos, é utilizado com a diluição final de 1/1 600 000; liga 25 a 50% da PSPgQ radioio- 9 dada nas condições de doseamento estabelecidas pelos inventores.

Características do doseamento :

- sensibilidade: este método permite detectar 20 pg de PSPgQ em 100 yil de amostra;

- a reprodutibilidade intra- e inter-doseamento, expressa pelo coeficiente de variação, é de 6# e 12% respectivamente para uma amostra de soro contendo 1,3 ng/ml de PSPgQ-,

- paralelismo: o soro ou o plasma de vaca em gestação e o meio de cultura de embriões bovinos apresentam curvas doses-respostas paralelas à curva de referência, como o mostra a figura 2 que representa a curva de inibição da ligação ΡδΡ^θ radioiodada/anticorpos anti-PSPgQ obtida mediante diluições crescentes de soro ou de meio de cultura. Os outros compostos presentes no sangue, ou segregados no meio de cultura pelos embriões, não interferem portanto com o doseamento da PSPg-θ.

soro de ovelhas grávidas e o meio de cultura do embrião ovino cruzam com a PSP^q, mas de um modo não paralelo (ver a figura 2).

- especificidade do doseamento: não há reacção cruzada com a 'ò/á—feto-proteína bovina.

Exemplo 4

Caracterização da secreção da PSP^q

Secreção_2)in_vitr o _da_PSPgQ_pelo_ embrião

Graças ao doseamento descrito no exemplo 3* pode-se seguir a evolução da secreção da PSP^q pelos embriões cultivados in vitro.Na vaca, a PSP^q está presente desde o

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162 dia de gestação em meios de cultura, altura em que ainda não se detecta no sangue. A 25 dias de gestação, uma dezena de explantes de tecidos trofoblásticos (cerca de 0,5 mg de proteína) segrega mais de uma centena de monogramas por 24 horas. Na ovelha, a PSP^q não se detecta em meios de cultura de embriões de 14 dias, mas sendo no entanto detectável desde os 15 dias de gestação (24 a 180 ng/embrião entre 15 e 24 dias de gestação) com um doseamento heterólogo. 0 doseamento da PSPgQ bovina não permite portanto determinar nas ovelhas, de modo preciso, as quantidades segregadas pelo embrião.

imunocitofluorescência

A técnica de imunocitofluorescência evidencia uma localização específica da ΡβΡθθ no citoplasma de células gigantes binucleadas do trofoblasto de ovelha com 24 dias de gestação (os outros tipos celulares não são marcados). A figura 5 reproduz uma fotografia do alanto-córion de ovelha no 242 dia: a localização da PSP^q efectua-se mediante imunocitofluorescência em células binucleadas.

Secreção_durante_a_gesta2ão_na_vaca_.

A ΡβΡθθ aparece no sangue materno cerca do 25²-502 dias de gestação. Aumenta progressivamente até uma trintena de dias antes do parto: 1,9- 0,58 ng/ml (X i SE) aos 65 dias (n=5); 10,6 i 1,67 ng/ml aos 95 dias (n=4) e 71,1 í 16,1 ng/ml aos 255 dias (n=8). Um mês aproximadamente antes do parto, o nível de PSPgQ eleva-se brutalmente (514 ± 151 ng/ml aos 261 >

dias, n=8) para atingir 0 máximo no parto (790 ng/ml na vaca), (figura 4).

bost-£arto

A ΡδΡθθ está presente na circulação materna com taxas não desprezáveis até aproximadamente 10 semanas depois do parto; em seguida as taxas aproximam-se de zero (figura 5)· doseamento da ΡβΡθθ, cada semana, entre 3 θ 16 semanas post-parto em 25 vacas, permitiu estabelecer a recta de regressão do logaritmo da concentração da ΡθΡθθ em função do tempo (em semanas) (figura 6).

Y= -0,25 x-3,24

Assim, a semi-vida da ΡβΡθθ é calculada em 8,4 dias.

Exemplo 5

Diagnóstico da gestação mediante doseamento da PSP_6&.

Realizou-se um primeiro diagnóstico de gestação mediante doseamento da PSP^q em 61 vacas e 79 vitelas,

25, 26 ou 27 dias após inseminação artificial. Para confirmar o diagnóstico, efectuou-se uma palpaçao rectal e uma colheita de sangue para o doseamento da ΡδΡθθ aos 90 dias em todos os animais com calores (apetite veterinário). A exactidao dos diagnósticos positivos (número de diagnósticos positivos exactos, número total de diagnósticos positivos) é de cerca de 78% aos 25 e 26 dias e ultrapassa 90%aos 27 dias nas vacas, enquante nestes três estádios a excatidão dos diagnósticos positivos, nas vitelas, é superior a 90%, como sobressai do quadro I que se segue.

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Em todos os casos, a exactidão aumenta com o estádio da colheita e é significativamente mais elevada nas vitelas do que nas vacas (P/0,05). Scquatro vacas foram inseminadas antes do 702 dia depois do parto e apresentam uma concentração residual de PSP^q post-parto que implica um diagnóstico de gestação errado.

Exemplo 6

Demonstração de mortalidades embrionárias mediante doseamento da PSP^q

Nas vacas ou nas vitelas que apresentam uma mortalidade embrionária tardia (cf. quadro II a seguir), o doseamento da PSPgQ aos 26, 55, 50 e 90 dias depois da inseminação artificial demonstra um decréscimo das concentrações de ΡβΡθθ e permite situar o momento desta mortalidade embrionária, confirmada mediante ecografia e palpação rectal.

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Α ΡδΡθθ identificada e isolada pelo processo de acordo com a presente invenção tem numerosas aplicações tais como:

utilização para fins de diagnóstico de gestação, de diagnóstico de viabilidade ou de mortalidade embrionária, de determinação da fertilidade para fins de selecção genética.

Além disso, o aprofundamento dos conhecimentos relativos à ΡδΡθθ identificada pelo processo de acordo com a presente invenção permitirá precisar as suas propriedades fisiológicas e as suas aplicações eventuais.

Tal como sobressai na descrição anterior, a presente invenção não se limita de modo nenhum a estes modos de utilização, de realização e de aplicação que acabam de ser descritos de uma maneira mais explícita, pelo contrário, engloba todas as variantes que possam vir ao espírito do entendido na matéria, sem se sair do quadro, nem do alcance da presente invenção.

Claims (3)

1. i·^- Processo para a preparação de uma proteína específica da gestação nos mamíferos, denominada PS?,_, aoresentando a bO sequência N-terminal em aminoácidos representada pela fórmula I a seguir:

   -X-Gly-Ser-X-Leu-Thr-Thr-His-Pro-Leu-Arg-Asn-Ile-Lys-Asp 1 5 10 15

   -Leu-Val-Tyr-Met-Gly-X-Ile-Thr-Ile-Gly-Thr-Pro-Pro-Gln20 28

   -Glu-Phe-Gln-Val-Val-Phe-Asp-Thr-Ala-Ser-X- j j

   30 35 40 a partir de placentas se submeter placentas um tampão apropriado, de mamíferos, caracterizado pelo facto de homogeneizadas e extractos, no seio de a uma precipitação ácida e de se submeter o sobrenadante a uma precipitação salina, de se submeter depois o precipitado a uma cromatografia em coluna permutadora de iões depois a uma filtração sobre gel e purificação das fracções que apresentam uma actividade PSPg_Q mediante passagem em coluna de HPLC permutadora de catiões, seguida de uma eluição com um gradiente salino em um tampão apropriado de pH ácido, o que permite isolar a PSPg_Q.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a proteína apresentar um peso molecular de 60 KDa aproximadamente (mediante análise electroforética sobre gel de poliacrilamida em meio desnaturante) e um ponto isoeléctrico de cerca de 5,5 após electroforese bidimensional.
3. 3. - Estojo para a realização de um teste para o diagnóstico precoce da gestação ou para o diagnóstico de mortalidade embrionãria, caracterizado pelo facto de, para além dos reagentes, tampões e/ou diluentes usuais compreender uma quantidade útil d€ anticorpos policlonais ou monoclonais anti-PSP, , _Lisbp O Ageníe

   RESUMO

   Processo para a preparação de uma nova proteína de reconhecimento da gestação nos mamíferos e suas aplicações para a detecção precoce da gestação

   Descreve-se um processo para a preparaçao de uma nova proteína específica da gestação nos mamíferos, denominada PSPg_Q, apresentando a sequência N-terminal em aminoãcidos representada pela fórmula I a seguir:

   -X-Gly-Ser-X-Leu-Thr-Thr-His-Pro-Leu-Arg-Asn-I le-Lys-Asp 1 5 _(I) 10 15

   -Leu-Val-Tyr-Met-Gly-X-Ile-Thr-Ile-Gly-Thr-Pro-Pro-Gln20 28

   -Glu-Phe-Gln-Val-Val-Phe-Asp-Thr-Ala-Ser-X30 (I) a partir de placentas de mamíferos, caracterizado pelo facto de se submeter placentas homogeneizadas e extractos, no seio de um tampão apropriado, a uma precipitação ácida e de se submeter o sobrenadante a uma precipitação salina, e de se submeter depois o precipitado a uma cromatografia em coluna permutadora de iões, depois a uma filtração sobre gel e purificação das fracções que apresentam uma actividade ΡβΡ^θ mediante passagem em coluna dê

   HPLC permutadora de catiões, seguida de uma eluição com um gradiente salino em um tampão apropriado de pH ãcido, o que permite isolar a PSP

   Aplicações aos testes para o diagnóstico precoce da gestação nos mamíferos.