JPH03502967A - 塩基処理を用いるクラミジア検定 - Google Patents
塩基処理を用いるクラミジア検定Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
い −; ジ
Hの
本発明は、泌尿生殖器の臨床標本におけるクラミジア・トラコマチス(Chla
mydia trachomatis)抗原の検出のための免疫検定方法に関す
る。
日 の ゴ
クラミジア・トラコマチスは、尿道炎、女性の粘液膿性子宮頚炎、ならびに封入
体結膜炎および新生児の肺炎を包含する様々なタイプのヒト感染症における病因
菌である。
抗りラミジア剤治療は存在するけれども、現在の診断法に関連した限界のために
多くのクラミジア感染症は治療に至らない。これは、多(の頚部感染症が無症候
性であり、そしてもし治療されなければ、不妊症となる可能性のある骨盤に炎症
を起こす疾患に進行するかもしれず、女性にとっては重大な問題である。クラミ
ジアを検出するための通常用いられている方法は培養技術に依存している。この
技術は困難で、そして時間がかかる。従って、適当な治療が開始され得るように
、当該生物を同定するための、信頼でき、迅速で、しかも低価格の試験は望まし
い。
免疫検定、例えば、種々のクラミジア抗原例えばリボ多糖(LPS)および主要
外層膜タンパク質(MOMP)を検出する酵素および直接蛍光免疫検定が、患者
の試料中にクラミジアの存在を検出するために現在使用されている。酵素免疫検
定の場合、試料は通常、次の抗体結合のためにMOMPまたはLPS抗原を可溶
化する界面活性剤と前もって処理される。しかしながら、そのような免疫検定か
ら偽陰性および偽陽性の結果が相当数生じる傾向がある。標本と界面活性剤との
前処理は、上記偽陽性および偽陰性の結果の発生を排除しない。
日 の ・
患者の標本からのクラミジア・トラコマチスの界面活性剤抽出が強塩基性条件下
で起こり得ること、およびこれらの条件が特定の免疫検定形態における偽陽性お
よび偽陰性の結果の出現を著しく減少させることが今見出された。
患者の標本中のクラミジア抗原に対する免疫検定における偽陰性および偽陽性の
結果の発生は、本発明に従って、強塩基溶液中で患者の標本を抽出し、次いで検
定を行う前に標本溶液を中和することにより、減少させることができる。強塩基
は水酸化ナトリウム(NaOH)または水酸化カリウム(KOH)であってよい
。水酸化アンモニウム(NH,OH)および同様の強度の塩基はあまり有効でな
い。強塩基溶液は、少なくとも約0.05M。
そして好ましくは少なくとも0.1 Mまたはそれに等価な強塩基の濃度からな
るのが望ましい。
い − の な B本発明の方法は、通常の医学的および微
生物学的技術を用いてクラミジア感染を有することが推察された患者から得られ
た患者標本に対して用いられ得る。該標本は目、鼻奥部の鼻孔、子宮頚管、尿管
、咽喉または直腸から採取したスワブ標本を包含する。この方法は泌尿生殖器の
スワブ標本に対して特に有用である。
本発明の一方法において、適当な抽出界面活性剤、例えば膜成分の抽出において
一般に使用されているもの、すなわち3−[(3−コラミドプロピル)−シアメ
チルアンモニオツー1−プロパンスルホネート(CHAPS)と強塩基との溶液
は、泌尿生殖器のスワブを含むチューブに添加される。スワブはこの溶液中に放
置され、そして十分に混合され、次にスワブ中の過剰な液体の排除およびスワブ
の除去を行う。チューブ中の溶液を次に中和する。中和された溶液の適当容量を
次に標準サンドイッチ型酵素免疫検定(E I A)の実施に使用し、クラミジ
ア抗原の存在を検出する。
本発明の変法において、適当な抽出界面活性剤の溶液は患者のスワブを含むチュ
ーブに直接添加される。患者のスワブは混合しながらこの溶液中に放置され、次
にスワブから過剰な液体の排除およびスワブの除去を行う。
最低濃度1.OMの強塩基10分の1容量を次に患者の抽出物に添加し、最初の
方法において使用された塩基の濃度に等価な0.1M塩基の最終濃度とする。試
料を放置し、混合し、そして次に中和する。中和された溶液の適当容量を次いで
標準サンドイッチ型EIAに使用し、クラミジア抗原の存在を検出する。
サンドイッチ型EIAは、抗体:抗原:抗体サンドイッチが固体支持体上に形成
されているものが好ましい。
典型的には、クラミジアを特異的に結合するであろう抗体は、固体支持体、例え
ば口紙、またはポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレンもしくはその他の
適当な材料からなる試験管、ラテックス粒子、ガラスピーズ、金属粒子等に結合
される。クラミジアを含むと推察された試料を固体支持体と接触させ、そして該
試料中に存在するクラミジア抗原は適当な保温期間の間に、結合された抗体に結
合するであろう。固体支持体を洗浄して、残留試料および非結合抗原がもしあれ
ば、それを除去し、次いで既知量の第2の抗体を含む溶液と接触させる。該第2
の抗体は酵素で(例えば第2の抗体に対する抗体で)直接または間接的に標識さ
れたクラミジアに対して特異的である。第2の抗体が直接標識されるならば、そ
のときは固体支持体が洗浄された後に、酵素基質が固体支持体に添加され、そし
て酵素決定が慣用の比色分析または分光光度分析により行われる。第2の抗体り
標識されないならば、そのときは第2の抗体に対して誘導された標識抗グロブリ
ンが添加され、溶液を予め決められた時間放置し、そして固体支持体を洗浄する
。標識抗体の量は慣用技術により決定される。
クラミジアに対して特異的な抗体は、公知技術に従ってクラミジア・トラコマチ
スの1またはそれ以上の菌株の基本小体での免疫化により、ヒi・またはヒト以
外の種、例えばウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、テンジクネズミその他において生
成され得る。クラミジアに対するモノクローナル抗体もまた本発明の方法に使用
され得る。
本発明に有用なりラミシア抗原は、クラミジア・トラコマチスの優勢菌株に共通
なあらゆる抗原を包含する。
そのような抗原は当業者により容易に確認され、そして例えばLPSまたはMO
MPを包含する。本発明に有用な酵素は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等を包含し得る。酵素免疫検定
は診断分野でよく知られており、そしてさらに詳しく記載される必要はない。
以下の説明により制限されることなく、本発明にかかるも者の試料処理は、免疫
学的検定を妨害して偽陽性および偽陰性の結果を引き起こす試料中の物質を排除
するか、または不活性化すると、発明者等は信じる。これらの妨害性物質は、溶
液のpHがpH12程度またはそれ以上に高められ、次に中和されるとき、排除
されるように考えられる。
免疫検定を用いて得られた偽陽性および偽陰性の結果は、種々の方法、すなわち
直接蛍光分析、培養技術等により検出され得る。直接蛍光標識技術は、クラミジ
アが次のように試料中に存在するか否かを決定するために用いられてきた。蛍光
物質で標識されたクラミジアに特異的に結合する抗体が得られた。このタイプの
標識された抗体は、カレスタッド・ダイアグノスティクス(Kallestad
DiaHnostics)またはシバ・カンパニー(Syva Co@pan
y)から市販されて利用できる。ある容量の標本抽出物が得られ、そして遠心分
離されて、試料からのクラミジア基本小体および残骸からなるベレットを形成す
る。ペレットを最低容量の緩衝液中に再懸濁し、顕微鏡用スライドに落とし、メ
タノールで固定し、そして標識された抗体試薬で染色する。抗体は、もしクラミ
ジアがスライド上に存在すれば結合する。次いで、クラミジアが存在するか否か
を決定するために適当な顕微鏡を用いて、スライドを読み取る。EIAを行う前
に本発明に従って強塩基溶液で処理されなかった試料において、直接蛍光法で試
験され陽性だった非常に多くの試料が陰性EIA結果を示した。同様に、直接蛍
光法を用いて陰性だった種々の試料がEIA法により陽性だった。
信号回収研究は、上記した第2の方法のように緩衝化界面活性剤溶液中に抽出さ
れた患者標本を用いて機能的偽陰性の存在を示した。機能的偽陰性の試料は、ク
ラミジア抗原が試料に外因的に添加された場合でさえも、低いEIA吸光度値を
示した。
水性溶液中に抽出された各試料の4つの等容量部分が取り出された。2つの部分
は10分の1容量の精製クラミジア基本小体を受は取り(スパイクあり)、そし
てその他の2つの部分は等容量の緩衝液を受は取った(スパイクなし)。1つの
スパイクありの部分と1つのスパイクなしの部分を次いで10分の1容量の1.
0MNa。
Hで処理し、そしてその他の部分を等容量の脱イオン水で処理し、そして10分
間放置した。塩基で処理された部分を、試料に1.0MHC+(予めpH8,0
に調整した1、 0 M トリスHCI中に希釈された> o、 i o−添加
することにより中和し、そして試料を10秒間かきまぜた。
非処理部分を等容量の1.0 M +−リスHCI緩衝液で希釈した。中和後、
全ての部分をクラミジア特異的ErAで試験した。表1に示したように、強塩基
での前処理を行わなかった場合、外因的に添加したクラミジアは非常に多くの患
者試料において検出されなかった。しかしながら、強塩基での前処理を行った場
合、外因的に添加したクラミジアは全ての試料において検出された。
1上
塩基処理による偽陰性応答の排除
機能的偽陽性試料もまた、上の方法1において記載したように緩衝化界面活性剤
溶液中に抽出された患者標本を用いて評価された。臨床標本からのEIA吸光度
値は、同様の標本に対する直接蛍光技術を用いて得られた結果と比較され、それ
より上で試料が陽性であるとみなされ、そしてそれより下で試料が陰性であると
みなされるであろう吸光度レベル(中間点)を生じる。
溶液中に抽出された各試料の2つの等容量部分は取り出された。一方の部分は1
0分の1容量の1.0MNaOHを受は取り、他方の部分は等容量の脱イオン水
を受は取った。これらの部分を10分間放置した。塩基で処理された部分を、上
記のように中和し、そして他方を等容量の緩衝液で希釈した。慣用の希釈用緩衝
液中に希釈されたポリクローナル抗クラミジア抗体および西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ(HRP)標識検出抗体を用いて、慣用のサンドイッチ型EIAにおいて
試料を検定した。
この試験に対する吸光度中間点は0.22だった。表2に示された結果は、非常
に多くの試料に関して、塩基で処理していない標本からの吸光度値は見かけ上高
(、そしてこれらの試料の塩基処理はこの結果を排除した。下記のような見かけ
の値は、クラミジア抗原が試料中に存在するという誤りの結果を導いたかもしれ
ない。
」ヨL
塩基処理による偽陽性応答の排除
1 .963 .3122 、105
、1633 、095 、0874 .101
.2065 .121 .0996 2、0
58 、200? 、 108 、1098
1.014 .2229 、953 、
5671O。262 、132
種々の異なる塩基を用いた実験は、強塩基、例えば水中で完全にイオン化する(
すなわち1. ONの溶液がpH14,0を生じる)水酸化ナトリウムおよび水
酸化カリウムが最も効果的であることを示した。より弱い塩基、例えば水酸化ア
ンモニウム、リン酸三ナトリウム、炭酸ナトリウム、アミン含冑化合物はあまり
有効でなかった。
より弱い塩基は全て13より小さいpKa値を有する。
以下の説明のための実施例により本発明をさらに明示する。
一叉JL例」−
泌尿生殖器のスワブ標本を患者から得、そして12×75m+のガラス試験管中
に入れた。O,OO5Mのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(N a t
E D T A )および5%重量/容量のCHAPSを含む0.1 MのNa
OHまたはK OH1,0−容量をスワブからの試料を抽出する試験管に添加し
た。
スワブを上記溶液中に少なくとも10分間放置し、かきまぜ、モしてスワブを試
験管の側面に押しつけてひねることにより吸収された液体を放出し、スワブを取
り出した。1.0MHClまたはその他の酸0.lO−を溶液に添加し、塩基を
中和した。中和剤は2.0Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンヒドロク
ロライド(トリスHCI)溶液(初期p H8,0)中に添加された。試料を1
0秒間かきまぜ、中和工程を完了した。
実施例3に記載したようなりラミシア特異的E■Aにおける検定のために、適当
容量の試料を分離した。
11皇1
泌尿生殖器のスワブ標本を12X75mのガラス試験管中に入れ、そして0.1
g M l−リスHCI、0.005MのNa*EDTA、o、05%w /
vのCHAPSの溶液1、0 I11/($) H8,O)中に抽出した。ス
ワブを上記溶液中に少なくとも10分間放置し、そした約30秒間かきまぜた。
スワブを試験管の側面に押しつけてひねることにより吸収された液体を放出した
後、0.1 MのNaOHまたはKOHo、100Mtを試料に添加し、そして
さらに10秒間かきまぜた。10分後、1.0MのトリスHCI(pH&0)中
に希釈した1、0MのHCI 0.100−を添加した。試料を含む標本を10
秒間かきまぜて中和を完了した。実施例3に記載したようなりラミシア特異的E
TAでの使用のために、適当容量の試料を分離した。
前処理した標本、陽性の対照および陰性の対照200μlを各々抗体被覆検定チ
ューブに添加した。試料を該被覆チューブ中に入れた後、チューブをゆっくり振
り、そして室温で約1時間放置した。
H,D、 Caldwell、仁KuoおよびG、 E、にenny、 115
JournaL of ImmunoLogy、 969−975頁(+975
)に記載されたものと同等のよく知られた操作を用いて、製造および精製された
クラミジアに対して特異的なポリクローナル抗体100μlを各チューブに添加
し、そして各チューブをゆっくり混合し、そして室温で約1時間放置した。
クラミジア特異的なポリクローナル抗体に対して誘導された抗体に結合した西洋
ワサビペルオキンダーゼ(HRP)および市販のもの、例えばジャクソン・イム
ノ・リサーチ0ラボラトリーズ(Jackson Immuno Re5ear
chLaboratories)から得られるもの100ufを各チューブに添
加した。各チューブをゆっくり混合し、そして室温で1時間放置した。各チュー
ブの混合物を次に取り出し、そして該チューブを脱イオン水で十分に洗浄した。
基質緩衝液(0,05Mクエン酸ナトリウム、0.05Mホウ酸、0.012%
容量/容量の過酸化水素、pH4,2)25部に対してクロマゲン(0,1MH
Cl中のテトラメチルベンジジン3.0■/m/) 1部からなる新たに調製し
た基質溶液500μlを各チューブに添加した。
酵素反応を15分間進め、そして1.0M硫酸(H)1、0 m7で停止させた
。試料の吸光度は450ナノメートルでの分光光度分析によった。色強度は試料
中に存在するクラミジア抗原の量の関数であり、そして抗原の量はそれにより決
定された。
本発明の好ましい実施態様を記載したけれども、それらの中で種々の変更、修正
および改良が本発明の精神および添付した請求の範囲の領域から逸脱しない限り
なされ得ることは理解されるべきである。
国際調査報告
Claims (12)
- 1.強塩基を含む水性溶液で患者の標本を処理し、次いで酸素免疫検定を行う前 に板本含有溶液を中和することからなる、患者の標本中のクラミジア抗原に対す る酵素免疫検定における偽陰性および偽陽性の結果の発生を減少させる方法。
- 2.前記処理が、強塩基の水性溶液中に標本を抽出することからなる請求項1記 載の方法。
- 3.前記処理が、水性溶液中に標本を抽出し、そして次に強塩基を添加すること からなる請求項1記載の方法。
- 4.標本が抽出される強塩基溶液がNaOHまたはKOHである請求項1記載の 方法。
- 5.標本が抽出される溶液が少なくとも約0.1MのNaOHまたは0.1Mの KOHである請求項2記載の方法。
- 6.クラミジア抗原がリポ多糖である請求項1記載の方法。
- 7.標本が泌尿生殖器の標本である請求項1記載の方法。
- 8.標本がスワブ標本である請求項7記載の方法。
- 9.標本が約13より低くないpHの水性塩基性溶液で処珪される請求項1記載 の方法。
- 10.少なくとも0.1MのNaOHの塩基濃度を有する溶液またはその同等物 と患者の標本を一緒にし、次に酵素免疫検定を行う前に中和することからなる、 患者の標本中のクラミジア抗原に対する酸素免疫検定における偽陰性および偽陽 性の結果の発生を減少させる方法。
- 11.クラミジア抗原がリポ多糖である請求項10記載の方法。
- 12.約13より低くないpHの水性塩基性溶液で泌尿生殖器の標本を処理し、 前記溶液を中和し、そして前記溶液をクラミジア抗原に対して特異的な酵素免疫 検定に供することからなる、泌尿生殖器の試料中のクラミジア抗原を検出する方 法。
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