JP2516841B2 - 抽出方法 - Google Patents

抽出方法

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JP2516841B2 JP2506019A JP50601990A JP2516841B2 JP 2516841 B2 JP2516841 B2 JP 2516841B2 JP 2506019 A JP2506019 A JP 2506019A JP 50601990 A JP50601990 A JP 50601990A JP 2516841 B2 JP2516841 B2 JP 2516841B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、バクテリアのような細胞生物物質から可溶
化形態の抗原物質を抽出する方法に関する。抽出された
可溶化抗原物質は細胞物質の存在もしくは正体を決定す
る検出方法に使用され得る。
界面活性剤を抽出媒体中で昇温下使用することが提案
されている。EP167395及びEP183383に例示れており、こ
の両者は特にクラミジア（Chlamydia）種に適用し得る
抽出方法に関する。
EP183383には、抽出方法の加熱工程に２価の陽イオ
ン、特にマグネシウムおよび亜鉛イオンを存在させるこ
とが有用であると記載されている。
しかしながら、我々は、上記に反して２価の陽イオン
の非存在下で抗原物質が良好に抽出され得ることを見出
した。
本発明により提供されるバクテリアのような細胞生物
物質から可溶化抗原物質を抽出する方法では、細胞物質
を実質的に２価の陽イオンが存在しない界面活性剤水溶
液で処理する。好ましい界面活性剤は両性イオンのもの
である。更に好ましい界面活性剤は、３−（３−コール
アミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンス
ルホネート（便宜上、CHAPSとして知られる）、３−
（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２
−ヒドロキシル−１−プロパンスルホネート（便宜上、
CHAPSOとして知られる）またはそれらの混合物である。
特に、我々は、両性イオン界面活性剤、特にCHAPS及
び／又はCHAPSOの水溶液を用いて抽出を行うと、リポ多
糖抗原がトラコーマ・クラミジア（Chlamydia trachomi
tis）、オウム病クラミジア（C.psittaci）およびクラ
ミジア・ツワー（C.twar）のようなクラミジア種から特
に効果的に抽出されることを見出した。
我々は、両性イオン界面活性剤、特にCHAPS及び／又
はCHAPSOの水溶液を用いて抽出を行うと、蛋白質抗原が
淋菌（Neisseria gonorrhoeae）から特に効果的に抽出
されることも見出した。
好ましくは、抽出は昇温下、例えば約50℃以上の温度
で抗原物質を可溶化するのに十分な時間行われる。更に
好ましくは、抽出温度は少なくとも約60℃である。一般
に、抽出温度は約100℃以上である必要はなく、好まし
くは約90℃以下である。理想的には、抽出温度は約80℃
である。このような昇温下で行う抽出工程は、通常少な
くとも約５分間続けられる。
好ましくは、水性抽出媒体中の界面活性剤の量は、少
なくとも約0.1重量％である。界面活性剤の量は好まし
くは約２重量％以下、更に好ましくは約１重量％以下で
ある。
抽出媒体のpHは通常約7.5〜約９の範囲である。
上述のように、抽出媒体は実質的に２価の陽イオンを
含まないものでなければならない。特に、亜鉛イオン及
びマグネシウムイオンが感知し得る量存在すべきではな
い。このことは、抽出媒体を調製する際にイオンを含ま
ない水及び他の成分を用いることによって達成される。
その代りに、またはそれに加えて、EDTA、EGTA又はDPTA
のようなキレート化剤を抽出媒体に混合して、存在する
かもしれない２価の陽イオンを実際上除去することもで
きる。その後抽出抗原溶液に適用される検出の性能がイ
オン濃度により不利な影響を受ける場合には、キレート
化剤をナトリウム塩のような水溶性塩としてよりもむし
ろ遊離酸の形で使用するのが好ましい。このことはナイ
セリア属からの抽出の場合には重要と考えられる。我々
は、２価の陽イオンの実質的な非存在が上皮細胞物質の
破壊を促進し、よって細胞内寄生体であるクラミジアの
ようなバクテリアの抽出が促進されるものと考える。
本発明の代表的な抽出方法では、例えばクラミジア病
原菌の疑保菌患者から得た生物学的試料をCHAPS及び／
又はCHAPSOを含む抽出媒体と接触させる。適当な試料
は、例えば生殖器スワブ、直腸スワブまたは眼スワブの
形、または早朝尿のような液体からの遠心ペレットの形
をとることができる。例えば80℃で10分間の抽出後、短
時間、例えば５分間放置し、この間に抽出媒体を冷却す
る。その後、例えばスワブを除去し、溶液を過するこ
とによって抽出媒体を固体物質から分離すると、適当な
検出方法に使用し得る抽出抗原を含む試料液体が得られ
る。その後の検出方法には、ラジオイムノアッセイまた
はエンザイムイムノアッセイのような一般に行われてい
る検出技術が包含され得る。抽出した試料は、特にニト
ロセルロース固相および着色ラテックス粒子のような直
接粒子標識で標識した抗体試薬を用い、GB2204398Aに記
載されているような免疫クロマトグラフィー検出方法に
使用するのに適している。CHAPS及び／又はCHAPSOを使
用すると、特定の結合試薬として抗リポ多糖抗原抗体を
含むクラミジアの検出感度が高くなる。
実施例１ トラコーマ・クラミジアの抽出は次のようにして行う
ことができる。これにより、イムノアッセイに使用する
のに適した抽出物が得られる。
抽出は以下の手段を使用する。
ａ）それぞれ一定量（例えば5ml）の液体を保持でき、
かつ一般的な試料スワブの末端を収容できる使い捨て式
可撓性プラスチックの“テスト管” ｂ）前記管をさし込んで、管の内容物を50〜100℃の温
度に加熱し、その温度で少くとも数分間保持する加熱ブ
ロック ｃ）抽出方法の最後に、管の液状内容物を過する手
段。管を閉じることができ、かつ液状の内容物を取り出
せるように穴あきストッパーにフィルタープラグを組み
込んだ形のものが便利である。
ｄ）次の組成を有する抽出緩衝液 0.85％塩化ナトリウム 0.25％CHAPSO １％ウシ血清アルブミン ５ミリモルEDTA を含有する0.1モルTRIS,pH8.5。
抽出を行うために、所定量（例えば600μｌ）の抽出
緩衝液を管に仕込む。クラミジア病原菌の疑保菌患者か
らの生殖スワブを管にとり、次に管および内容物を加熱
ブロック中、約80℃の温度で10分間培養する。管を加熱
ブロックから取り出し、５分間冷却する。スワブを抽出
緩衝液から引き上げ、スワブを管から完全に取り出す前
に、管の両側を手でやさしく押して液体をスワブから絞
り出す。次いでスワブを管から完全に取り除き、捨て
る。フィルタープラグを有する穴あきストッパーを管の
頂部にさし込み、ストッパーを介して管の液状内容物を
排出すると、次の検出に使用される。抽出クラミジアリ
ポ多糖抗原を含む実質的に澄んだ液体試料が得られる。
必要に応じ、フィルター／ストッパーを管にとりつける
前に標識抗体のような検出試薬を１つ又はそれ以上管の
内容物に加えてもよい。
実施例２ 実施例１と同様の抽出手順に従った。但し、抽出緩衝
液は次の組成を有する： 1.25％塩化ナトリウム 0.25％CHAPSO １％ウシ血清アルブミン ５ミリモルEDTA 10ミリモルＬ−アスコルビン酸 を含有する0.1モル TRIS,pH8.5 高量の塩化ナリトウムにより、次の免疫検出において
起るかもしれない非特異的な結合が防止される。アスコ
ルビン酸（好ましくはＬ型）が存在すると、緩衝液が不
利な条件（例えば分配の際の高温又は長期間の冷凍保
存）を受ける場合にアスコルビン酸が安定剤として作用
し、抽出緩衝液の貯蔵寿命が延びることを見出した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，ＶＯＬ. 168，ＮＯ．３，（1986），Ｐ．1070− 1074 Ｊ．ＩＭＭＶＮＯＬ．ＭＥＴＨＯＤ Ｓ，ＶＯＬ．112，ＮＯ．１，（1988）, Ｐ．133−138

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】３−（３−コールアミドプロピル）ジメチ
    ルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（CHAPS）お
    よび３−（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモ
    ニオ−２−ヒドロキシル−１−プロパンスルホネート
    （CHAPSO）ならびにこれらの混合物から選択される両性
    イオン界面活性剤0.1〜２重量％を含み、２価の陽イオ
    ン、特に亜鉛およびマグネシウム陽イオンを含まない水
    性抽出緩衝液であって、クラミジア病原菌の疑保菌患者
    から得た生物学的試料からの可溶化リポ多糖抗原物質の
    抽出に使用するための水性抽出緩衝液。
  2. 【請求項２】EDTA、EGTAまたはDPTAのようなキレート試
    薬を含む請求の範囲第１項に記載の水性抽出緩衝液。
  3. 【請求項３】約7.5〜約９のpHを有する請求の範囲第１
    項または第２項に記載の水性抽出緩衝液。
  4. 【請求項４】クラミジア病原菌の疑保菌患者から得た生
    殖器スワブ、直腸スワブまたは眼スワブの形の生物学的
    試料を請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の水
    性抽出緩衝液に接触させて、可溶化リポ多糖抗原物質を
    含む試料液を得る方法。
  5. 【請求項５】約50℃よりも高いが約100℃を超えない温
    度で行う請求の範囲第４項に記載の方法。
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EP0392865B1 (en) 1994-07-13
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