JPH03502924A - 高度に完全なリポソームおよびその製剤法と用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 に６　なリポソームおよびその　　′　と　′この出願は、共係属中の１９８７ 年６月１１日付米国特許出願第７７０６１　、１８６号および１９８７年１２月 ４日付米国特許出願第１２８，９７４号の一部継続出願（ｃｏｎｔｉｎｕａｔｉ ｏｎ−ｉｎ−ｐａｒｔ）である。

見咀立分更 本発明は少なくとも１個の安定な脂質と、リポソームに会合した少なくとも１個 のペプチド様の治療剤を含有する。動物や人への非経口投与に用いられる高度に 完全なリポソームおよびその製造法や用途に関する。特に、このようなリポソー ムはペプチド治療剤の長期化された放出に有用であり、生理的環境における上述 の剤の崩壊防止にも有用である。

見胛夏！見 ペプチド治療剤はよく知られており、製薬技術においても用途が増大している。

ホルモン、免疫調節剤、多数の新しく発見されたペプチドやペプチド様化合物は 現在、ヒトを含めた動物に対して食餌療法として投与されている。

このようなペプチド化合物の経口投与の一貫した欠点は、生理的環境におけるこ のような化合物の急速な崩壊または変性（生来の状態の形態の喪失）とこのよう な薬剤の長期間の治療効果を持つ膜量水準を得ることの難しさである。ペプチド 様治療剤の存在を長引かせるためとこれらの薬剤を完全な状態に保存するための 努力の結果、ロウや油の挿入ばかりでなく、治療剤の長期的投与のために注入ポ ンプが用いられてきた。

さらに、ペプチド様の治療剤（蛋白質またほやへブタンを含むと理解される）が 免疫原として機能する特殊な場合において、ペプチド様治療剤は（特にペプチド 様治療剤の各々の抗原決定基（エピトープ）を参照して）、理想的には長期間に 亘って生来の状態のままの形態を保ち、さらに投与された動物中の免疫原性応答 のきっかけになる好適な方法を与えられるべきである。

見旦兎！豊 本発明は、少なくとも１個の安定な脂質とリポソームに会合した少なくとも１個 のペプチド様の治療剤を含有し、動物への非経口投与に適応した高度に完全なリ ポソームを包含する。具体的に言えば、この安定した脂質は水素化されたホスフ ァチジルコリンまたはジステアロイルホスファチジルコリンである。特に具体的 にいえば、この治療剤は抗原を含む。本発明は更に、コレステロールのような脂 質の希釈液を含むリポソームを包含する。コレステロールを含むということを具 体的に表現すれば、このコレステロールは脂質とコレステロールのモル比率が約 ４＝１ないし約１：１（モル重量基準）で存在する。具体的に言えば、ジステア ロイルホスファチジルコリンとコレステロールは、リン脂質とコレステロールと のモル比率が約７＝３で使用される。

本発明のリポソーム中のペプチド様治療剤はホルモン、免疫調節剤、グリコジル 化担体蛋白質またはガラクトシル化担体蛋白質を含む、特に、ペプチド様治療剤 がガラクトース−アルブミンであるもの、またはその類似化合物とか誘導体を含 むソマトトロピンまたはカルシトニンであるホルモンを含んでいる。具体的に言 えば、治療剤が免疫調節剤のものであり、特殊な例を挙げれば工Ｌ２のようなイ ンターロイキンである。

本発明はまた高度に完全なリポソーム中にカプセル製剤した治療学的に有効な量 のペプチド様治療剤を投与して動物を治療する方法を含んでいる。比の方法を具 体的に説明すれば、ホルモンまたは免疫調節剤であるペプチド様治療剤の筋肉内 　（ｉｎｔｒａｍｕｓ−ｃｕｌａｒ）、非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、動脈 内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｅｒｉａｌ）　、皮下（Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、 静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）および腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅ−ｒｉｔｏｎ ａａｌ）投与である。

動物治療法はまた。ペプチド様治療剤がホルモン、免疫調節剤。

グリコジル化担体蛋白質、ガラクトシル化担体蛋白質のものを含み、この中でペ プチド様治療剤はホルモン、ウシソマトトロピンもしくはカルシトニンのもの、 またはペプチド様治療剤が免疫調節剤ＩＬ２（前述したものの類似物および誘導 体を含む）であるようなものを含む。

包含される動物治療法の実施態様としては、動物がブタ、鶏、鮭、牛またはヒト であるものと同様、ペプチド様治療剤が成長促進剤であるようなものがある。

特別な側面から見れば１本発明は高度に完全なリポソームの中の治療に有効な量 のソマトトロピンを動物に投与することにより酪農動物の乳牛産量を増加する方 法を提供しているのである。

別の側面から言えば、この酪農動物は牛であり、ソマトトロピンはウシソマトト ロピンまたはその類似物あるいは誘導体なのである。

なお具体的に言えば１本発明は少なくとも１個の安定な脂質とリポソームに会合 した少なくとも１個のペプチド様治療剤を含有する高度に完全なリポソームを含 んでおり、動物への局所的投与に適している。

月ＪＢ欠厘」シＵ区朋− 第１図は、高度に完全なリポソームと水素化していない脂質のリポソームとの、 原位置での保持（ｉｎ　５ｉｔｕ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）を比較したグラフであ る。

第２図は、高度に完全なリポソーム中のＢＳＴＨを投与した下垂体を切除した（ ｈｙｐｏｐｈｙｓｅｃｔｏｍｉｚｅｄ）ラットの体重増加を示したグラフである 。

第３図は、注射部位における投与量（ｄｏｓａｇｅ）の原位置での保持を示した グラフである。

日の　　なツ日 リポソームは取り込まれた（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ　）水性容量（ａｑｕｅｏｕｓ ｖｏｌｕ■ｅ）を含む完全に閉鎖された脂質単分子膜（ｂｉｌａｙｅｒｍｅｍｂ ｒａｎｅｓ）である、リポソームは、多分、単層小胞体（ｕｎｉｌａ＋５ｅｌ− １ａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ）　（単一の二分子膜を有する）または多層小胞体（ ＭＬＶ：＋ｉｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ）　（水性層によっ て、隣のものと仕切られている多くの二分子膜を持つタマネギ様構造）であろう 、この二分子膜は疎水性の（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉａ）尾部部位と親水性の（ｈ ｙｄｒｏρｈｉｌｉｃ）の頭部部位を持つ二つの脂質の単層より成っている。こ の二分子膜の構造は、脂質単分子膜の疎水性の（無極性）尾部は二分子膜の中心 に配向し、一方親水性の（極性）の頭部は水性相（ａｑｕｅｏｕｓ　ｐｈａｓｅ ）に配向しているというようなものである。

パンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）等［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ ー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１９６５．１２：２３８−２５２）］の初 期のすポソームの調製は、燐脂質を有機溶媒中に懸濁し、蒸発乾燥させて反応容 器上に燐脂質膜を残留させることにある０次に水性溶液の適当量を加え、混合物 を膨潤し、得られたマルチラメラ小胞体（ＭＬＶｓ）からなるリポソームは機械 的手段で分散させる。この技術は、バパハジオパウロス（Ｐａｐａｈａｄｊｉｏ ｐｏｕｌｏｓ）等［バイヒミカ・エト・バイオフィジカ・ラント・アクタ（Ｂｉ ｏｃｈｉ＠、Ｂｉｏｐｈｉｓ、　Ａｃｔａ、、　１９６８，１３５：６２４−６ ３８）コによって記載された、超音波処理された（ｓｏｎｉｃａｔｅｄ）小さい ユニラメラ小胞体および大きいユニラメラ小胞体類の開発のための基礎を提供す る。

ユニラメラ小胞体は、キュリス（Ｃｕｌｌｉｓ）等の１９８６年１月１６日公開 ＰＣＴ出１１ｉＷ０８７１００２３ｇ、発明の名称「単層小胞体製造のための押 し出し技術Ｊ　（Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｄ ｕｃｉｎｇ　Ｕｎｉａｉ＋ａｌｌａｒ　Ｖｅｓｉｃｌｅｓ）中に記載された方法 による押し出し装置を用いて製造することができるが、このことは本書中に引用 されている。

この技術によって作られた小胞体はＬＵＶＥＴＳと呼ばれ、圧力下で膜フィルタ ーを通して押し出される。

他の種類のりボゾームも実質的に同じ暦溶質分布（ｌａｉ＋ｅｌｌａｒｓｏｌｕ ｔｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）をもつりポゾーム類である。この種類のりポ ゾームはレンダ　（Ｌｅｎｋ）等の米国特許４，５２２，８０３中で安定な多層 小胞体（ＳＰＬＶ：　５ｔａｂｌｅ　Ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ　Ｖｅｓｉｃ ｌｅｓ）と呼ばれており、ファウンティン（Ｆｏｕｎｔａｉｎ）等の米国特許４ ，５５８，５７９中では単相（ｍｏｎｏｐｈａｓｉｃ）小胞体と呼ばれている。

小胞体が存在する凍結・融解された多層小胞体（ＦＡＴＭＬＶ：　Ｆｒｏｚｅｎ 　Ａｎｄ　ＴｈｏｗｅｄＭｕｌｔｉｌ、ａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ）は 少なくとも１回の凍結と融解の繰り返しを受ける。この工程はバリイ（Ｂａｌｌ ｙ）等の１９８７年１月１５日公開ＰＣＴ出！！’８７１０００４３、発明の名 称「改良された取り込み効率を有する多層リポソーム」中に記載されており、い ずれも本書中に引用されている。ホンダ（Ｈｏｎｄａ）等の日本国公開特許６０ −１５５１０９号は、水素化したリポソーム類は５％の脂肪酸を必要とすると記 載している０本発明のリポソーム類は、事実上、５％以下の脂肪酸または脂肪酸 なしで調製できるだろう。

本発明における用途において、種々のステロール類およびその水溶性誘導体類が リポソームを生成するために使用されるであろう、その際には、特にジャノフ（ Ｊａｎｏｆｆ）等の１９８５年１０月２４日ｐｃＴ公開ｗ０８５１０４５７８、 発明の名称「ステロイド性のりポゾーム類」（Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ　Ｌｉｐｏｓ ｏ＋＊ｅｓ）を参照するとよい、メイヒュー（Ｍａｙｈｅｖ）等１７１１９８５ 年３月１４日ＰＣＴ公開ＶＯ３５１００９６８は薬剤の毒性を減少させる方法を 記載している。すなわち、薬剤をα−トコフェロールとその成る誘導体を含有す るリポソーム中にカプセル包囲する（　ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）　、ｌこのこ とは何れもここに引用されている。また。

種々のトコフェロールおよびそれらの水溶性誘導体がリポソームを生成するため に使用されている。ジャノフ（Ｊａｎｏｆｆ）等の１９８７年４月２３日ＰＣＴ 公開１０８７１０２２１、発明の名称ｒ　Ｃ！　−ト：１７　ｘ　Ｏ−ルー基体 小胞体類Ｊ　（Ａｌｐｈａ　Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ−Ｂａｓｅｄ　Ｖａｓｉｃｌ ｅｓ）を参照するとよい、それは参考のためここに引用されている。

ここに用いられている用語の「脂質Ｊ　（ｌｉｐｉｄ）は、脂質物質の疎水性部 分は二分子膜の内部に配向し、一方親水性部分は水性■に配向する二分子膜にな るようないずれの物質をも意味する。脂質はさらにトリグリセリドのような高度 に疎水性の化合物や二分子膜に結合しうるコレステロールのようなステロール類 を含む。

脂質という用語は脂肪酸類は含まない、特定の脂質としては、ホスファチジルコ リン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、デステアロイルホス ファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスファチジルセリン（ｐｓ）、ホスファチイ ジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチドｍ　（ＰＡ）、ホスファチジルイノシ トール（ＰＩ）、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）などの燐脂質の単独、または組 合せが挙げられる。燐脂質類は合成することもできるし、卵とか大豆のような天 然資源に由来することもできる１合成燐脂質類の中にはシミリストイルホスファ チジルコリン（ＤＭＰＣ）やシミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭ ＰＧ）がある、リポソームはまたコレステロールのポリエチレングリコール誘導 体（ＰＥＧ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｇ）、コレスタノール、コレスタノールま たはコレスタンのような他のステロイド化合物およびＰＣとコレステロールの組 合せを含む。

リポソームは糖脂質をも含むことがある。

「安定な脂質」は、ｐＨ１温度、酸素原子のない基（ｏｘｙｇｅｎ　ｆｒｅｅｒ ａｄｉｃａｌ）　（たとえば炎症反応中に免疫細胞を浸潤させることによって生 じるところのもの）の変化または他の生理的環境の圧迫によって起こる酸化異化 作用の変化または他の生理的環境の圧迫によって起こる酸化異化作用（ｏｘｉｄ ａｔｉｖｅ　ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ）に抵抗性のある脂質であると理解されるだ ろう。

安定とは正常な脂質の剛性が水素化のような安定化の過程で改質される連続体の 性質の特性であると理解さるべきである。胃の中の（ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ ）ような低いｐＨの環境で使用された場合、安定な脂質のグループから除外され た脂質は動物の胃腸系（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｓｙｓｔｅｍｓ） 内に見られる生理的Ｐ）Ｉの範囲で分解するヘミ砿珀酸コレステロールまたはヘ ミ琥珀酸トコフェロールのような脂質である。このような低いｐＨ適用において 、これらのものは剛性に関係無く排除される。このようにして安定な脂質は第一 に、ｐ）Ｉの変化によって起こる酸性異化作用に抵抗性のある脂質である。勿論 、温度、酸素原子を欠く基または他の生理的環境の圧迫に対して抵抗性がある。

第二に、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）環境において使用された場合、通常の生理的 ｐＨ範囲内では分解しない、安定した脂質は、リポソーム中に取り入れられると 、長期間構造の完全性を持ち続けるものである。とくに他のリポソームと比較し た場合にそうである。

ペプチド様という用語は蛋白質類ばかりでなく短い連鎖を持つペプチド類を意味 すると理解されるが、また便宜上、ビタミン、小ステロイド、アジドチミジンま たは遊離のプリマキンのような非蛋白質の不安定な分子を含む、好まれる種類の ペプチドはインターロイキン、コロニー刺・激因子およびインターフェロンのよ うな免疫調節剤である６好ましいものとして追加される蛋白質はワクチンに使わ れているような抗ｆＭ（ａｎｔｉｇｅｎ）である。

生来の状態の形態（ｎａｔｉｖｅ　５ｔａｔｅ　ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ） という用語は組織の部分が少なくとも一つの抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）を持 っていると理解されよう、このようなペプチドは生体内にあるときと生来の状態 とは異なる形態（変性）にあるときとが識別できる。

ここにおいて、其の部分は生物活性または免疫反応が生体内組織にあるときの状 態とは変わってしまうのである。

抗原決定基という用語は免疫グロブリンの結合部位によって識別され得る抗原の 最も小さい部分を意味すると理解されよう。

蛋白質を、単に治療剤の蛋白質巨大分子担体として使用するならば、担体として の機能が実質的に傷つけられないかぎり、蛋白質の生来の状態の維持はそれほど 重要でなくなる０例えば、アルブミンは治療剤の担体蛋白質として報告されてき た。とくに、ガラクトース（ガラクトース−アルブミン）とかグルコース（グリ コジル化アルブミン）に結合した場合にはそうであった。このようにして、リポ ソームの形で存在する場合に肝臓からの吸収を容易にする（例：米国特許Ｓｅｔ 、Ｎｏ４，３７６．７６５）。ここに用いられているように、ガラクトース−ア ルブミン（同様にグリコース−アルブミンも）はアルブミンと結合したガラクト ース（またはグルコース）の部分を引用している。このような部分、即ち一−グ ルコースまたはガラクトース／担体蛋白質−一、は肝臓に治療剤を適用する場合 に役に立つ。この部分は優先的に肝臓に摂取され、治療剤を担体蛋白質に共有結 合（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　ｊｏｉｎｉｎｇ）させることにより治療剤は同様に 肝臓に摂取される０例えば、治療剤のドキソルビシン、ダウノルビシンまたはプ リマキンは担体蛋白質に結合し、それから肝臓内に集結する。このようにして薬 剤の治療作用を局在化させる（ここでは制癌剤および翻虫剤）。

具体的実施態様においては、本発明のリポソームはペプチドに会合してアジュバ ントとして機能する。

ここで使用される「不安定な」治療剤は、動物中において意図した治療作用以外 の作用による治療剤の崩壊または変性への傾向（ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ）に関係 している。

本発明の好ましいリポソームは充分に水素化した大豆のホスファチジルコリンと コレステロールを約４：１乃至約１＝１モル比（ホスファチジルコリン：コレス テロールモル比）から調製された。これらのリポソームは動物に投与して、投与 後２週間、投与物質の保持状況を調査した。筋肉内または皮下注射した場合、投 与物質は投与された部位に２週間後も２０％残存していることが分った。注射部 位における長期間の保持はこの期間を越えてペプチドの長期化された放出を助長 した。一方、投与物質が完全のまま多量に保持された物にペプチドが多かった。

その他好ましいリポソームはＤＳＰＣのリポソームである。

治療学的に説明したおおよその投与法は安定な脂質を取り扱う容易さが増大する ことを含めて多大の考慮をすることによって影響を受ける。すなわちリポソーム に含まれるべき治療剤、リポソーム製剤投与部位、治療する動物の性状および状 態を考慮することによって影響を受ける。

ここに使用されている長期化された同化作用（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）という 用語は、カプセル化したリポソームから治療剤を２４時間を越えて放出させるこ と、ある実施態様では２週間ないし３週間も放出させることを意味する。

ここで使用されるリポソームの構造上の完全さとは、長期化された同化作用（ｅ ｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）の期間の間の、カプセル化した物質の薬理作用の実質的 な維持を意味する。この構造の完全さは多分リポソームを含む脂質物質の二分子 膜の配列の持続性および長期化された同化作用の期間に取り込んだ水相の付随す る（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）実質的な維持に起因しているのであろう、構造の 完全さは多分、対象動物に存在する生理的状態によって要求された時に必要な構 造を維持するに充分な安定な脂質を含む脂質類の結合物からリポソーム類を生成 することによって与えられるのであろう。

特に詳しく述べるならば、本発明の高度に完全なリポソームの構造の完全さは、 安定な脂質が希釈した脂質または不安定な二次的な脂質と混合されても維持され るであろう０本発明を実用に供する場合、意図する用途のために構造上の完全さ が充分なリポソームは、脂質膜の成分（ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ）の剛性を変 えるか、安定な脂質が希釈された脂質または二次的な脂質と混合される割合を変 えることによって設計することができよう。

リポソームを生成する前記の工程について即座に発明の修正をすることは安定な 脂質の高度の剛性の故に必要である。充分に水素化したホスファチジルコリンの ような大抵の安定な脂質は、製造過程で脂質膜が有機溶媒中に高温下で、時には 約５０〜６０℃で可溶性にすることができる。このことは脂質の適応性を増大し 、リポソーム生成を可能にする。

適応性が増大した安定な脂質は種々な方法で製剤することができる。脂質を不十 分に水素化すると剛性は増加するが最高剛性には至らない、しかも充分にあるい は部分的に水素化した脂質または他の安定な脂質は不飽和の順応性のある脂質と 混合することができる。混合用物質としてのコレステロールは独特なものであり 、この中でコレステロールは安定な脂質をより順応性の高いものにし、一方、逆 に順応性の成る脂質をより剛性のものにする。コレステロールは本発明のリポソ ームの安定な脂質成分の順応性を増大するのに好ましい混合用脂質である。これ に加えてα−トコフェロールは混合用脂質として機能することができる。

本発明の高度に完全なリポソームは、米国特許Ｎαｓ、４，５２２，８０３と４ ，５８８，５７８および前記のメイヤー（Ｍａｙｅｒ）の論文にあるような技術 中のよく知られた方法を用いて治療剤に、結合することができる。本発明の実施 に際して特別の実施態様としては成長ホルモンまたは成長ホルモン放出因子のよ うなペプチド治療剤の導入である。

本発明中のリポソーム類の特別の利点はリポソーム生成に当って薬剤を取り込む ことを増進することと脂質の量に対する薬剤の充填（ｌｏａｄｉｎｇ）量を増強 することである。

有用なペプチド様治療剤の約７０％まで取り込むことは本発明の方法で達成する ことができる。ペプチド取り込みの水準は特定のペプチド様治療剤の取り込み如 何にかかつていることを銘記することが大切である。

リポソームは二分子膜脂質に囲まれた水性媒体を取り込む。水性媒体は、例えば 、水または溶解した塩または緩衝剤を含む水である。このような塩類や緩衝剤の 例は塩化ナトリウムや燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、他の緩衝液は次のも のを含むが、これに限ったものではない。すなわちホウ酸塩（ｂｏｒａｔｅ）、 クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）、トリス−ＭＣＩ（トリス−（ヒドロキシメチル） −ア　　　　　−ミノメタンハイドロクロライド）およびＨＥＰＥＳ　（Ｎ　− ２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ１−２−エタンスルホン酸）である。

緩衝液は約２．０ないし約１４．０のｐＨ範囲内にある。特記すれば、この製剤 は次の緩衝液を使用して水和する。すなわちＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ　Ｎ ａＣ＋Ｑ　、　２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ）、　ｐＨ７，０、ホウ酸塩緩衝液（１０ ０！ＩＭＮａ、ＨＣＯ，、５０ＩＩＭ、　Ｈ，Ｂｏａ）　ｐＨ８，５またはクエ ン酸緩衝液（１５０ｍＭクエン酸ナトリウム）、　ＰＨ８，５または０．０１Ｍ 炭故ナトリウム緩衝液（ｐＨ９−１１）である。

本発明の実用に際してはリポソーム（例：脂質：ペプチド）充填はまた安定な脂 質を使用することによって増大される０例えばＢＳＴＨを取り込んでいるリポソ ームが脂質：　ＢＳＴ）Ｉが２：１の存在で生成される時、この生成されたリポ ソームが６．１：１の脂質：ペプチドであり、水素化しない脂質から生成される 同様のリポソームの１６．２：１とは相反している。他の例では、脂質ニガラク トース−アルブミン（１，８：１飼料）から調製した同様の脂質は４．３：１の 脂質ニガラクトース−アルブミンリポソームを生成したが、これは同様の脂質ニ ガラクトースアルブミンの水素化しないリポソームの供給比７．１：１と相反し ている。

もう一つの例は、任意にコレステロール（コレステロールに対する燐脂質のモル ％比率が７：３で有ることが望ましい）と混合したＤＳＰＣリポソームはカルシ トニンを取り込んで形成された。カルシトニンは多くの形式で利用されており、 カルシトニンの類似化合物および誘導体は開発中であり、また現在使用されたり 、これらのすべてがカルシトニンという用語に含まれることが了解されるべきで ある。　ＤＳＰＣははアバンチ・ポラ−・リピツド（ＡνａｎｔｉＰｏｌａｒ　 Ｌｉｐｉｄｓ　：　Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、　Ａｌａ、）から手に入れることが できる０本発明の高度に完全なリポソームは検出できるカルシトニンの残存を、 遊離したカルシトニンの残存の約１時間にくらべて。

約３日ないし７日の長期間に引き延ばした。

リポソーム剤搬送系において、治療剤はリポソーム中にカプセル化されて（脂質 中または水質相の何れかで）、治療中の対象物に投与される。例えば１次のもの を参照するとよい。ラーマン（Ｒａｈｍａｎ）等の米国特許は３，９９３，７５ ４、シアーズ（Ｓｅａｒｓ）の米国特許４，１４５，４１０．パパハジョポロス （Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）等の米国特許４，２３４，８７１．シュナ イダ−（Ｓｃｈｎｅｉｄａｒ）の米国特許４，２２４，１７９、レンダ　（Ｌｅ ｎｋ）等の米国特許４，５２２，８０３およびファウンテイン（Ｆｏｕｎｔａｉ ｎ）等の米国特許４，５８８，５７８゜リポソームは脱水して、使用するまで長 期間貯蔵することができる。標準的な凍結・乾燥設備または同等の装置がリポソ ームを脱水するために使用される。リポソームはまた単に減圧下に置くことによ って脱水することができる。また一方、リポソームとこれを取り巻く媒体は脱水 する前に液体窒素中で凍結させることができる。凍結後の脱水は製剤中に一つま たはそれ以上の保護用の糖類の存在下で、参考のためここに引用されたジャノフ （Ｊａｎｏｆｆ）等１９８５年７月２６日付米国特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｎ７ ５９，４１９特許の名称「脱水されたリポソーム」の工程に従って行われる。使 用可能な保護用糖類の例を次に挙げるが、これらのものだけに限ったことではな い。即ち、トレハロース、マルトース、シュークロース、グルコース、ラクトー スおよびデキストランである。脱水されたリポソームを使用するときは、たとえ ば蒸溜水のような水性液をリポソームに加えるだけで再水和するという方法で再 水和を行なう。

本発明の治療剤は、リポソームと会合して、意図した投与経路と標準的な薬理学 的慣習に従って選定された薬理学的に許容し得る担体と混合して投与される。

治療剤としては薬理的活性剤、診断薬、アジュバント、対照薬剤、放射性薬剤、 ガラクトース−アルブミンのような薬剤標的担体剤等がある。望ましい薬剤は、 ガラクトースアルブミン担体のようなペプチド様薬剤、免疫調節剤（例えばイン ターロイキン）およびホルモン（例えばソマトトロピン）を含むペプチド様治療 剤である。特に言及したい治療剤は、特に含まないと指示しないかぎり生物活性 のある部分を含むようなその剤の類似化合物および誘導体を含むものと理解され る。

本発明の薬理学的投与形態はリポソームと何等かの適切な薬剤担体から成ってい る。好ましい等級の担体は蒸溜水および等強性の（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）食塩水の 両者を含む水性液である。高度に完全なリポソームの投与は皮下注射および筋肉 内注射に特に関連した通常の経路によって行われる。ここで使用されている非経 口投与とは筋肉内、静脈内、関節内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｉｃｕｌａｒ）および 眼内（ｉｎｔｒａ−ｏｃｕｌａｒ）投与のことである。しかし、非経口投与に使 用される投与量は種々の投与法に応じて使用される。

リポソームと結合した治療剤の投与量はしばしば治療剤単独の際の投与量である 。投与量は年齢、体重、患者の状態を含む多くの要素を考慮した。医者の処方箋 によって決められる。担体に対する治療剤の比率は熟考された投与量は勿論のこ と、化学的性質、溶解性、取り込み効率および治療剤の安定性によって決まる。

静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、乳房内径路のような非経口投与または注射のた めにはリポソーム組成物の滅菌した溶液が調製される。静脈内注射用には溶質（ ｓａｌｕｔｅ）の濃度の総計が製剤を等強性になるように調節しなければならな い。

本発明を畜産業に適用する場合、技術に熟練した人達は、ＢＳＴＨのような泌乳 促進剤と同様に成長促進剤（例えば成長ホルモンや成長ホルモン放出因子）を含 む多数の治療剤の投与に高度に完全なリポソーム中挌用することを理解するであ ろう。このような薬剤を治療的有効量を投与すると生産性を増大することができ る。

本発明における治療剤の投与量と投与法は治療的有効量を推定する。ここに用い られた治療剤の治療的有効量とは治療作用を生ずる治療剤の量を意味する。この 量は特定の薬剤、その類似化合物または誘導体、処理条件、部位、投与法、投与 時間およびその技術に熟練している人達に知られている考慮とともに変化するこ とが理解されよう。

本発明をワクチン技術に適用するに際して必要な投与量は免疫原の投与量である と理解されるだろう。０Ｍ２のような抗原蛋白質の免疫原の量は、抗原（ここで は０Ｍ２）に対する免疫グロブリンを生ずるように対象動物（０Ｍ２を例にとれ ば人が対象動物で応答細胞がＢ細胞であるとするならば）の応答細胞を刺激する 量である。この量は、アジュバントの効力、投与の仕方、動物の種類および状態 によって変化する。しかし、免疫原の応答を表わす免疫グロブリンの増加ととも に周知の免疫グロブリン試験の何れによってでも決定することができる。

これらの用途のもう一つの例では、高度に完全なリポソームは広範囲の局所的投 与形態に含まれることができ、ゲル、油、乳濁液がその例として挙げられるが、 これらに限られたものではない。

例えば、高度に完全なリポソームを含有する懸濁液はリポソーム製品の成分とし て水性相に加えられる。このような製品は局所的クリーム、ペースト、軟膏、ゲ ル、ローションおよびその類似物として直接適用のために投与することができる 。

失１匠よ １１コりし念なリポソームの １４ｇのウシソマトトロフィックホルモン（Ｂｏｖｉｎｓ　Ｓｏ＋１ａｔｏｔｒ ｏｐｈｉｃ　ｈｏｒｍｏｎｅ）（ＢＳＴＨ）を溶解した１４０ｍ　Ｑの炭酸塩緩 衝液ρ旧０．９を調製した。次に、　２１．１ｇの水素化した粉状大豆ホスファ チジルコリンと６．９ｇの粉状コレステロールを５（Ｉｎ　ｍのクロロホルム中 に溶解し、次いで回転蒸発法によって乾燥、粉状化した。このようにして作られ た脂質膜を再び１４０ｍ　Ｑのジエチルエーテル中に懸濁させ。

丸底フラスコ内に入れた。それからＢＳＴＩ（を緩衝液に加えながら水浴中で４ ７℃で超音波処理をした。超音波処理はすべてのエーテルが蒸発するまで続けら れた。それから、２０℃の窒素流を、実質的に残留したエーテルが除去されるま で、反応生成物に適用した。

反応生成物をそれから８００１１Ｑの緩衝液中に４７〜５０℃で再び懸濁し、そ の中のリポソームを３０分間約２０，０００回の重力で遠心分離を繰り返すこと によって２回洗浄した。洗浄リポソームを再び懸濁し、最終的に１６４ｍＱとし た。その結果生成された高度に完全なリポソーム懸濁液は１１１Ｑ中にＢＳＴＨ ２７，５■、）ＩＳＰＣ１２８，Ｏ■、コレステロール４２．０■を含んでいた ６ 夫五旌ｌ 土１１１ｍ例ｉ人 実施例１におけるリポソーム製剤を雌牛１頭につき３５０■の割合で投与した。

第２回目の投与は最初の投与の２週間後であった。

この食餌療法は牛乳の生産量を、無処理の雌牛に較べて、１４．９％増加させた 。さらに、１２．５１１Ｉｇの遊離のＢＳＴＨを毎日注射した雌牛に較べて、水 素化した大豆ホスファチジルコリンリポソームに溶かしたＢＳＴＨの２回注射は ２８．８％の効果があった。水素化していない大豆ホスファチジルコリンのリポ ソームを、３週間以上に亘って１週間ごとに３回投与した場合は、毎日投与の場 合の１５．７％の効果しかなかった。

炙旌匠ｌ に６　なリポソームの　来の　　に百るロヒ　　・Ｅ１ｍ製： ６．０ｇのＢＳＴ）Ｉを６０．Ｏｖａ　１１　ノＰ）１９．４ｆ７）炭酸塩緩衝 液中に溶解した。

次に、　３．５２ｇの粉状Ｈ５ＰＣと］、、７３ｇの粉状コレステロールを５０ ０＋ａ　Ｑの丸底フラスコ中で２０ｔａ　Ｑのクロロホルム中に溶解した。この 溶液に１．２Ｘ　１０’ｄｐＩ１１の３Ｈ−ジパルミトイルホスファチジルコリ ンを加えた。この脂質を続いて回転蒸発法により乾燥し、７５−Ｑのジエチルエ ーテル中に再懸濁させた。このフラスコと内容物は４５℃の水浴超音波処理機中 に置いた。このＢＳＴＨ溶液を、エーテルが蒸発しているときに超音波処理しな がら、ジエチルエーテル中に加えた。１５分後にフラスコの内容物に窒素流を適 用することにより残留エーテルを除去した。フラスコの内容物はそれから１５０ １１Ｑの炭酸塩緩衝液中に再び懸濁させ、その結果得られたリポソームは遠心分 離して２回洗浄し、最終容量を３４．０ｍＡとした。

同化作用・保持： ０．３２０ｍｆｌのリポソーム懸濁液を３０頭のスイス−ウィスターマウス（Ｓ ｖｉｓｓ−Ｗｉｓｔａｒ　ｍ１ｃｅ）の各画に（脚部）筋肉内注射した。これは マウス１匹につき９．７７Ｘ　１０’ｄｐｍに相当する。２７日の期間が過ぎて から、各時点で３匹のマウスが屠殺された。注射部位に残留する放射能の比率を 、水素化しないリポソーム（卵ホスファチジルエタノールアミンを持つ卵ホスフ ァティジルコリン）の同様の注射の場合と比較した。高度に完全なリポソームを 注射されたマウス中の放射能は２７日後もなお残存していた。一方、水素化しな いリポソームの放射能は第１図に示されているようにほとんど完全に消散してし まっていた。

炎度粁生 に６　ｔ゛ｉｉポソーム　の　　に百るー　　　・調製： ０．７５　ｇのＢＳＴＨを１５ＩＱの炭酸塩緩衝液中に溶解しＰＨ１０，９に調 整した。　１．１３ｇの１（ＳＰＣと０．３７　ｇのコレステロールを５ｍＱの クロロホルム中に溶解した。この混合液を、実施例３の方法にしたがって回転乾 燥法により乾燥し、脂質は２０ｍ　ｌのジエチルエーテル中に再び懸濁させ、丸 底のフラスコ中に入れた。

このフラスコと内容物を４７℃の水浴超音波処理機中に置き、始動させ、続いて 水性相中のＢＳＴＨを加えた。超音波処理は、混合液の重量が乾燥脂質膜と水性 相の相加重量に等しくなるまで続けられた０次いで、残留したエーテルの総てを 除去するために窒素ガス流を適用した。このフラスコの内容物を４０■Ωの炭酸 塩緩衝液中に４７−５０℃で再懸濁し、その中のリポソームを３０分間約２０， ０００回の重力で遠心分離を繰り返して２回洗浄した。リポソーム懸濁液は最終 的に１１．１ｍＲの容量にした。

第２図は高度に完全なリポソーム中のＢＳＴＨを投与された下垂体を切除された ラット（７５−８５ｇ　／ラット）が、水素化しないリポソーム中のＢＳＴＨを 同量の日毎に８０ｍｇ　　（１匹につき総量２，４００ｕ　ｇ　）を後脚に筋肉 内注射した下垂体を切除されたラットに較べて２８日間にわたって実質的に体重 が増加したことを示している。

１庭五旦 ＩＬ２の　　および ６７．０■のＨ５ＰＣと３３．０■のコレステロールを丸底フラスコ中でクロロ ホルム溶液中より回転式蒸発機によって乾燥した０次に、５■０の無水ジエチル エーテルを該フラスコに加えた。このものに。

１菖Ωの５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５）中に溶解した１■のＩＬ−２，０， ９％塩化ナトリウムおよび６．０Ｘ１０ゝＤＰＭ’Ｈ−ＩＬ−２を加えた。

このようにして得られたエーテル中の水溶液の分散液を水浴中で４５〜５０℃で 超音波処理し、同時に、窒素ガス流を適用して嗅いだけではエーテルを全く検知 できなくなるまで乾燥した。得られた乾燥リポソームペーストを１０＋ａＱの燐 酸塩緩衝生理食塩水に加えた。フラスコの壁に固着している物質を総て除去する ためにこの混合液を勢いよく掻きまわした。この混合物の一定量（Ａ１１ｑｕ。

ｔｓ）を取り出してトリチウムを数えた。

後に残った混合物であるリポソーム懸濁液をＪ−２００回転（ベックマンインス ツルメンツ、マウンテンビュー、カナダ）で１０．０ＯＯｒｐ１１で２０分間遠 心分離した。上澄液を除去し、１０ｍＱの燐酸塩緩衝液を加えてリポソームのペ レットを再び懸濁させた。

第１表は高度に完全なリポソーム１０■中の２．７■／ｋｇを投与されたマウス の注射部位に几−２が残留する実質的な期間（１４日）を示している。

第２表は保持にともなって有用な生物活性のあるインターロイキンが残留してい ることを示している。このような残留は、遊離のインターロイキンまたは高度に 完全なリポソームでないリポソームのインターロイキンと較べて全く顕著である ことが分る。

１五纒且 ガラクトース−アルブミン−プリマキンＨ５ＰＣ：コレステロールリポソームを 実施例１の方法にしたがって調製した。簡潔に言えば、クロロホルム中の脂質が １回転蒸発法により丸底フラスコの底の上の薄膜として乾燥された。５■ａのジ エチルエーテルをこのフラスコに加え、脂質がフラスコの壁により掻き回すこと により剥ぎ取られた。この実施例においては取り込むべき原料はトリチウムガラ クトース（ガラクトースーアルブミン）およびプリマキン（ガラクトース−アル ブミン−プリマキン）と結合した人の血清アルブミンであった。　０．３ｖａｎ の水溶液中のガラクトース−アルブミン−プリマキンを５１１Ｑのエーテル脂質 混合物に加えた。

超音波処理および同時に行う穏やかな窒素流を使った混合物の乾燥によって結合 の形成は影響を受けた。超音波処理と乾燥処理はエーテルの匂いが検知されなく なったときに中断された。結合物はペースト状で、このものは１０〜２０ｒｓ　 Ｑの燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄された。このことはＰＢＳをフラス コに加えてフラスコの壁から総べての残留物を除去するために激しく掻き回すこ とにより達成された。

得られたリポソーム懸濁液はそれから４℃で１０〜２０分間１０，０００ｒｐＩ Ｉｌ（Ｊ−２０セントリフユージ、ＪＡ−２０ローター、ベックマン）で遠心分 離した。その結果得られた上澄液は流し出し、ペレットを新しいＰＢＳ中に再懸 濁した球粒は取り込みを免れた材料を除去するために同じ条件下で掻き回して再 び遠心分離することを２回くり返した。

】秒につき１０７崩壊を含むカプセル化した物質の１９３■をマウスの後脚に筋 肉内注射した。

ガラクトース−アルブミンを含有する高度に完全なリポソームの保持が少なくと も１４日間あることが、第３表と第４表から読み取れる。第３表は、注射部位に 、放射性物質が高度に完全なリポソームの中にカプセル化された場合に放射能が １４日間も保持されるが、−力対照的に遊離の放射性物質はたった１日で除去さ れてしまうということを示している。第４表は、注射部位に残留しているカプセ ル化物質が、カプセル化されていない物質の活性保持に較べて長期間生物活性を 保持するということを示している。

失１匠ヱ カルシトニン−ＤＳＰＣ ８，２７■のＤＳＰＣ（当初のＬＡＤが１：１）と１．７３■のコレステロール （ＤＳＰＣ：コレステロールのモル％比で７：３）、ともにクロロホルム中、を ５０＋＊　Ｑの丸底フラスコ内に移した。この脂質は真空下で回転蒸発法により 乾燥して膜にした。それからこの脂質を６０℃の水浴中で、０．５００ｍＱのメ タノール中で１〜２分間加熱して可溶性にした。

１０、のカルシトニン（日本二三菱化成［ＭＣｌ−５３６）を０．１００ｍＱ酢 酸ナトリウム緩衝液中で可溶性にした。この溶液を溶媒混合物に加えた。

この溶媒を６０℃の水浴中で真空下回転蒸発法により除去した。

溶媒が除去されたら、この脂質／剤の膜を６０℃の０．５＋ｎＱ酢酸ナトリウム 緩衝液中に再び懸濁させた。この調製物に６０℃の０．５ｍ１２酢酸ナトリウム 緩衝液を加えて洗浄し、次に１２．１００ｘ　ｇで１０分間遠心分離した。上澄 液は、傾瀉して（ｄｅｃａｎｔｅｄ）、リポソームペレットを６０℃の１ｍ＋２ 酢散ナトリウム緩衝液中に再び懸濁した。その懸濁液は再び１２，１１０Ｏｘで １０分間遠心分離して、また懸濁した。

再懸濁したカルシトニンを含有するＤＳＰＣ−コレステロールリポソームをマウ スに皮下注射し、リポソーム調製剤の保持を遊離カルシトニンの保持と比較した 。遊離カルシトニンはマウス中で１時間後には検出されなかった。本発明のリポ ソームのカルシトニンは投与の１日後は少なくとも７０％存在し、３〜７日間残 留し、遊離カルシトニンの保持時間に対して実質的な増加を示した。

第１表　マウス中のＨ５ＰＣ／　Ｃリポソームから採取した３Ｈ標識ペプチドの 徐々な放出 注射後の　　　　注射部位に残留する薬剤の残留量比率（％）経過時間　　　　 　インターロイキン２１時間　　　　　　　　　　８４．４ ３時間 １日　　　　　　　　　　７８．１ ３日 ４日　　　　　　　　　　　６４．９ ５日 ７日　　　　　　　　　　　６９．４ ９日 １０日　　　　　　　　　　　　　　５８．９１２日 １４日　　　　　　　　　　　　　　２８．１１９日 ２３日 ２７日 第２表　注射部位からの生物活性のあるペプチド（ＩＬ２）の回収 経過　注射部位における初期生物活性のあるＩＬ２の残留率時間　　遊離ＩＬ２ 　　　ＩＬ２−ＥＰＣＩＬ２−Ｈ５ＰＣ／ＣＨＯＬ１時間　　２．１　　　５３ ．５　　　　　５２１日　　　ＭＤ　　　　Ｉｓ　　　　　　４４４日　　　阿 Ｄ　　　　　４．８　　　　　２０７日　　　ＭＤ　　　　　１．３　　　　　 １１１０日　　　　ＭＤ　　　　　　ＭＤ　　　　　　　　１８１４日　　　　 ＭＤ　　　　　　ＭＤ　　　　　　　　１４第３表　マウス中のＨ５ＰＣ／　Ｃ リポソームからの３Ｈ標識ペプチドの筋肉内の除々な放出注射後の　　　　注射 部位の残留量比率（％）１時間　　　　　　１０９　　　　　　　　　　５５． ７７時間　　　　　　　　　　　　　　　　　　２９．７５１日　　　　　　　 １０７　　　　　　　　　　２５．５１．７５日　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　１１．２３第４表　リポソームのカプセル化に続くペプチド の断片化における変化 経過　　注射部位における断片化されたペプチドの％時間　　　遊ＨＨ５ＰＣ／ 　Ｃカプセル化されたガラクトース−フルブミンープリマキン］　　　　　　ガ ラクトース−アルブミン−プリマキン１時間　　　　　１６１ ７時間　　　　　８７１ ２日　　　　　１００１ ３日　　　　　１００７ ５日　　　　　１００　　　　　　　　　　　１５７日　　　　　１００　　　 　　　　　　　　２１１０日　　　　　　　１００　　　　　　　　　　　　　 　　１７日数 第２図 日数 パーセントＬ　Ｄ。

国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１個の安定な脂質とリポソームに会合した少なくとも１個のペプ チド様治療剤を含有し、動物への投与に適した高度に完全なリポソーム。
2. ２．安定な脂質が水素化したホスファチジルコリンである請求の範囲第１項記載 のリポソーム。
3. ３．安定な脂質がジステアロイルホスファチジルコリンである請求の範囲第１項 記載のリポソーム。
4. ４．治療剤が抗原を含有する請求の範囲第１項記載のリポソーム。
5. ５．さらに脂質希釈剤を含む請求の範囲第１項記載のリポソーム。
6. ６．希釈剤がコレステロールである請求の範囲窮５項記載のリポソーム。
7. ７．脂質とコレステロールのモル比が約４：１から約１：１の範囲内でコレステ リンが存在する請求の範囲第６項記載のリポソーム。
8. ８．ペプチド様治療剤がホルモン、免疫調節剤、グリコシル化担体蛋白質、また はガラクトシル化担体蛋白質である請求の範囲第１項記載のリポソーム。
9. ９．ペプチド様治療剤がガラクトースーアルブミンまたはその類似化合物か誘導 体である請求の範囲第８項記載のリポソーム。
10. １０．ホルモンがカルシトニンまたはその類似化合物か誘導体である請求の範囲 第８項記載のリポソーム。
11. １１．ホルモンがソマトトロピンまたはその類似化合物か誘導体である請求の範 囲第８項記載のリポソーム。
12. １２．免疫調節剤がインターロイキンまたはその類似化合物か誘導体である請求 の範囲第８項記載のリポソーム。
13. １３．免疫調節剤がインターロイキン−２である請求の範囲第１２項記載のリポ ソーム。
14. １４．筋肉内、非経口、動脈内、皮下、静脈内、腹腔内投与の中の任意の方法で 、動物に治療的に有効な量を投与して動物を治療するときに使用する、高度に完 全なリポソーム中にカプセル化した、ペプチド様治療剤を含む製薬学的製剤の製 造。
15. １５．ペプチド様治療剤がホルモン、免疫調節剤、グリコシル化担体蛋白質また はかラクトシル化担体蛋白質である請求の範囲第１４項記載の製造。
16. １６．ペプチド様治療剤が成長促進剤、任意的にはホルモンウシソマトトロピン またはその類似化合物か誘導体である請求の範囲第１５項記載の製造。
17. １７．ペプチド療治擦剤が免疫調節剤ＩＬ２である請求の範囲第１５項記載の製 造。
18. １８．ホルモンがカルシトニンまたはその類似化合物か誘導体である請求の範囲 第１４項記載の製造。
19. １９．動物が豚、鶏、鮭、牛または人である請求の範囲第１４項記載の製造。
20. ２０．高度に完全なリポソーム中のソマトトロピン、任意的にウシソマトトロピ ン類似物もしくはその誘導体の治療的に有効量を酪農動物に投与することにより 該動物の乳生産量を増加する方法。
21. ２１．少なくとも１個の安定な脂質とリポソームに結合した少なくとも１個のペ プチド様治療剤を含有し、動物の局所投与に適応した高度に完全なリポソーム。