JPH03502685A - 医薬組成物の製造のためのトリペプチドの使用および医薬組成物と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 医薬組成物の製造のためのトリペプチ ドの使用および医薬組成物と方法 本発明は、トリペプチドの新しい医学的使用およびそのトリペプチドを含有する 組成物に関する。

そのトリペプチドは、式 （式中、ピログルタミルおよびヒスチジル残基ばＬ−立体配置を有する）で示さ れるし一ピログルタミルーし一ヒスチジルーグリシンである。

このトリペプチドは米国特許第４．２６０．６０１号に開示され、これは「興味 ある食欲低下作用」をもつと述べられている。そしてこの特許には、過食によっ て起こった肥満に対して使用できる可能性がある旨述べられている。しかしなが ら、この特許はまだ工業的に利用されてはいない。

本発明の基盤は、これまで報告されたことがなく、従来技術からは全く予期し得 ない、驚くべきことと考えられる最近の発見にある。

すなわち、このトリペプチドは、大腸上皮における正常細胞増殖ならびに良性お よび悪性の病変を生じる過増Ｎｉ（過剰な制御されない細胞増殖）を阻止し、し たがって癌のようなある糧の疾患および病変の処置に有用と考えられることが明 らかにされた。

生理的条件下には、結腸の管腔表面からの上皮細胞の喪失は、陰間の下部におけ る細胞増殖によって補われている。大腸上皮における細胞増殖のパターンは、正 常な定常状態での細胞の再生のみでなく、実験的に誘発した攪乱後についても詳 細に検討されてきた。しかしながら、正常な細胞の再生を調節する主要な因子は まだほとんどわかっていない。

腸または蛍離腸上皮細胞から得られた組織抽出物中の部分精製インヒビターがｉ ｎ　ｖｉｖｏ　において小腸および大腸の上皮の細胞増殖を低下させることがこ れまでに明らかにされている（　Ｂｒｕｇａｌ　＆　Ｐｅｌｍｏｎｔ：　Ｃｅ１ ｌ〜２１６．１９７１゜また、ラット小腸上皮細胞系（Ｍａｙら：　Ａｌ１１． 　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２４１　：　５２０〜５２７゜１９８１）および結 怪１瘍細胞系（Ｋａｎａｇａｌｉｎｇａｍ　＆Ｈｏｕｃｋ　：　Ｉｎ　：　Ｃｈ ａｌｏｎｅｓ、　Ｈｏｕｃｋ、　Ｊ、Ｃ，縄、　Ａｍｓｔｅｒ−ｄａｍ、　　０ ｘｆｏｒｄ、　　ＮｅＷ　　Ｙｏｒｋ　　：　　Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　 　ａｎｄ　　Ａｍｅｒｌ−ｃａｎ　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　１９７６　、４５９〜 ４８２頁；　Ｌｅｖｉｎｅら：　Ｐｒｏｃ、　Ａｎｎｕ、　Ｍｅｅｔ、　Ａｍ、 　Ａｓ５ｏｃ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、。

２７：２１１．１９８６）を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏの実験でも、正常および悪 性細胞の両者がＯのような内因性インヒビターに感受性をもつＯとが示されてい る。しかしながら、このインヒビターを精製して特性を明らかにすることの困雌 性が、その生物学的性質および成長調節因子としての重要性をさらに検討するこ とを妨げてきた。大腸上皮内に細胞増殖の内因性インヒビターが存在する可能性 についてさらに証拠を得るため、本発明者らはマウス腸の水抽出物を調製した。

粗抽出物に腸細胞増殖に対する可逆性の阻害効果を発見したことから、本発明者 らは精製操作を進めたところ、粗抽出物と同様に作用するトリペプチドを同定す ることができた。さらに本発明者らは、このトリペプチドが、ｐ　Ｇｌｕ−Ｈｉ ｓ−Ｃ）ｌｙ（ＯＨ）の構造（上記式参照）を有すること、このトリペプチドの 合成サンプルが、大腸上皮に対する阻害効果に関し、精製した生物学的抽出物の 場合と同じ至適用量を示すことを明らかにした。

スべてのｉｎ　ｖｉｖｏ実験はヌードマウスを用い、午前８時から９時の間に実 施した、。分画は蒸留水に懸濁し、わずかに酸性（ＰＨ＝６）とし、分画の納変 に応じて様様な用量で１．ｐ、注射した。対照には溶媒のみを与えた。ペプチド 注射後の細胞増殖のパターンは、処置から層殺までの時間を変えて調べた。

トリペプチドの組織特鴎性の可能性を試験するため、８匹の動物の背部皮膚と回 、腸の所定の部分を層殺ｖｋ＠ちに固定した。これらの組織からの切片での分裂 速度（下記参照）を溶媒処置動物の相当する値と比較した。

４匹の動物に一側性の腎切除（ｕＮＸ　）を行い、手術１８時間後にこれらの動 物をトリにブチドで処置した。

対照にはｕＮＸを行い、溶媒のみを与えた。これらの動物には４８時間目の層殺 ６時間前にコルセミドを投与した。分裂速度（細胞１．０００個あたｖ３時間で 蓄積された中期の数）を腎皮質の外側部で記録した。

層殺２時間前に（腎における組織特異性を試験する実験の場合を除く）、全動物 に、１匹あたり０．１５１９のコルセミドを１．ｐ、投与した。屠殺前３０分に ３ＨＴｄＲ（トリチウム化チミジン）を注射した（各動物あたり６０μＣｉ、　 ｉ、ｐ、　）。

血液調節にンタペブチド（米国特許第４．．４９９，０８１号）およびマウス表 皮から単離された有糸分裂阻害ペンタペプチド（ｖｙｏ８７１００１８０）の作 用を、トリペプチドについて述べたのと同じ実験で動物あたり１０−１２モルの 用量を用いて小腸卦よび大腸における分裂速度を調べることにより試験した。

細胞動力学測定値 分裂速度：常法の脱水およびパラフィン包埋後に、切片を５μｍに切断してヘマ トキシリンで染色し念。

５００個の陰間細胞あたフのコルセミド停止有糸分裂と、回腸および結腸の縦に 切断された陰間１０個について測定した。厳密に縦に切断された陰間、すなわち 陰間の内腔が腺の底部から腸の管腔まで追跡できるもののみを採用した。終期は 認められなかった。表皮中に蓄積した中期の数を、毛嚢間表皮の２５の視野（接 眼鏡１２．５、対物鏡４０）について計数して求め、２時間についての視野あた りの分裂として表した。

標識指数：５μｍに切断したパラフィン切片をＫｏｄａｋ−ＮＴＢ乳液中に浸漬 し、３週間０〜４℃で曝露し、現像し、ヘマトキシリンで染色した。標識細胞の 数を、上述のように縦方向に切断された陰間の５００個の陰間細胞あたり計数し た。同様に毛嚢間表皮の４０の視野（接眼鏡１２．５、対物鏡４０）における標 識細胞数を測定した。粒子数が５以上の場合に細胞は標識されたとみなした。

結果はすべてＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定で評価し、ｐ＜０．０５の差を有意 と入なした。

大腸上皮における分裂速度に対するトリペプチドの様々な用量での作用を第１表 に示す。ＩＱ−１２モル／動物の用量で、蓄積された中期の数は５０係以上まで 低下した。これより弱いが有意な阻害は１０−１１モル／動物の用量でも昭めら れた。これらより高い用量でも低い用量でも、細胞増殖の有意な低下はみられな かつた。

第　　１　　表 様々な用量の合成トリペプチドｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（ＯＨ）の大腸上皮で の細胞増殖への影響処置　ＳＥＭ　　対照　ＳＥＭ １（３−１８モル／動物　　０．０３５　０．００３　０．０４４　０．００４ １０−１５モル／動物　　０．０４２　０．００６　０．０４３　０．００５１ ０−１２モル／動物”　　０．０１８　０．００１　０．０４２　０．００３１ ０−１１モル／動物ゝ　［１，０２１０，００３０，０３５０，００３１０−９ モル／動物　　０．０４４　０．０１０　０．０３８　０．００７１０−６　モ ル／動物　　０．０４７　０．０１１　０．０４９　０．００７”　ｐ　＜　０ ．０５ 第２表には、動物あ九り１０″″１２モルの用量でペプチドを１回ｉ、ｐ、注射 してから２４時間の大腸上皮における分裂速度の時間経過を示す。蓄積した中期 の数は注射２〜４時間後に有意に低下した。ついで、処置群の分裂数は６〜８時 間後には対照のレベルを越えた（形式的に有意ではない）。続いて、注射約１５ 時間後に、新しい阻害の波が観察された。この作用は最初のものほど著しくはな い。

第３表には、大腸上皮における標識指数に対するペプチドの作用を示す。標識指 数（ＬＩ　）の著しい低下は、ペプチドの註射４時間後にみられた。この場合も ２つの阻害期間が観察された。標識細胞数の最初の低下から約８時間後に、同程 度の第二の阻害が認められた。ペプチド処置１５および１８時間後にみられたＬ Ｉの低下は統計的に有意ではない。

合成トリペプチドｐＧ１ｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（ＯＨ）を用量ＩＱ−１２モー１２ モル１回注射後の細胞増殖パターン（時間間隔を示す） 第　　２　　表 分裂速度：　　　　処置群　　　　　対照群２　ｈ　　　　０００２１ゝ０．０ ０３０．０４８　０．０１２４　ｈ　　　　Ｏ，０１８ゝ０．００１　　０．０ ４２　０．００４６　ｈ　　　　Ｃ１，０２７０，［］０３　　０．Ｇ５１　０ ．００１８ｈ　　　　Ｏ，０３１０，０１００，０２５０，００４１２ｈ　　　 　Ｏ，０１９［１，００１［１，０１５０，［］０２１５　ｈ　　　　Ｏ，０１ ０“０．００２　　０．０２２　０．００４１８　ｈ　　　　Ｏ，０２７０，０ ０２０，０３４０，００６２４ｈ　　　　Ｏ，０５７０，０１００，０６１０， ００９第　　３　　表 標識指数：　　　　処置群　　　　　対照群２ｈ　　　　Ｏ，０８６０，００６ ０，０９２０，０１６４ｈ　　　　Ｏ，０６７４″０．００９　　　［１，１１ ０，［ｌ［］３６ｈ　　　　Ｏ，０６７０，００５０，０７５０，００３８ｈ　 　　　Ｏ，０５８０，０１５０，０５４０，００８１２ｈ　　　　Ｏ，０４８ゝ ０．００４　　０．０７１　０．００７１５　ｈ　　　　Ｏ，０６８０，００８ ０，０８４０，０１０１８ｈ　　　　Ｏ，１１０，０１０，１り　　０．０１２ ２４　ｈ　　　　Ｏ，０９８０，０１３０，０８６０，００５組織＄５％性の試 験は、絶えず増殖している上皮（表皮および小鳴）、ならびに安定な細胞集団（ 腎尿細管上皮）に対何の腎切除によって細胞増殖を誘導して、トリペプチドの作 用を調べることにより実施した。これらのいずれの組織にも、試験した時間およ び用量で、阻害作用は認められなかった。

大腸上皮における細胞増殖は、表皮ペンタペプチドｐ（）ｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ −８ｅｒ−Ｃ１ｙ（ＯＨ）　（Ｗ○／８７１００１８０）ならびに血液調節ペン タペプチドｐＧ１ｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｙｓ−Ｌｙｓ　（米国特許第４．４９ ９．０８１号）による処置では試験した時間および用量で変化しなかった。大腸 上皮の分裂速度に対する合成トリペプチドの阻害作用は第４表に示す。

第　　４　　表 大腸上皮における分裂速度に対するｐＧｌｕ−ＨｌＳ−Ｇｌｙ（ＯＨ）の阻害作 用（結果はマウスでの７回の同じ実験によるものである）　ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ− Ｇｌｙ（ＯＨ）は動物あた！７１０−１２モルの用量で注射した（合成ペプチド ） 処置群３　　　　　　　対照群 平均　　ＳＥＭ　　　　　　平均　　ＳＥＭＯ，０１８０，［］０５　　　　０ ．０４２　０．００３０．０２１　０．［］０３　　　　０．０３３　０．００ ３０．０２６　０．（）０７　　　　　［］、０４０　０．００９０．０１８　 ０．００１　　　　０．０４２　０．００４０．０２６　０．００４　　　　０ ．０５０　０．［］０４０．０４３　０．００１　　　　０．０７０　０．０１ １０．０２５　０．００４　　　　０．０３９　０．００８ゝｐ＜　ｏ、ｏ　５ 大腸癌細胞系ＨＴ２９の増殖に対するトリペプチドｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ　 ＯＨの作用のｉＨｖｉｔｒｏでの検討細胞培養：ＭＴ２９細胞、９６ウ工ル組織 培！クラスター中各ウェルあたり２００００細胞、メジウム：ＲＰｌ、４Ｉ　１ ６４０．１％ウシ胎仔血清、トリペプチド濃度：　１８−８ＭＸＮ結乾燥ペプチ ドをメジウムに溶解増殖の検定ニトリチウム化チミジン（３ＨＴｄＲ）の導入、 ６時間、３ＨＴｄＲ１μＣｉ　／ウェルトリペプチドは３８目（対数期）に培！ 体に添加し、ペプチドのウェルへの添加後１６時間、２４時間および４０時間に ６時間のトリチウム化チミジンの導入を測定した。

結果は処置群および対照群（対照には５０μ乙のメジウムのみを与えた）の平均 およびＳＥＭとして示す。

ペプチド添 加後の時間　　対照群　　ＳＥＭ　　　処置群　　ＳＥＭ２４　　　１６４３０ 　　１６５９　　　９０８０“　　１１９６ペプチドを１０−８Ｍａ度で用い、 ３ＨＴｄＲの導入の有意な低下が処置後２４〜３０時間に観察された。血清の添 加を１０係に増加すると、結果は有意な阻害から効果なしまでの間を変動した（ １０％血清よって多分強力な成長刺激が得られたためと思われる）。トリペプチ ド１０−１０Ｍの濃度では同じ検定で、弱いがなお有意な阻害を示した。

本発明によって用いられるトリペプチドは有利な任意の方法により、たとえば米 国特許第４．２６０．６０１号の記載に従って製造できる。この特許の記載を参 考として本明細書に導入する。

本発明の組成物は、任意の貫用の投与用剤形、たとえば錠剤、コート錠、８鼻投 与スプレー、溶液剤、乳化剤、粉末剤、カプセル剤、または持続放出型剤形とす ることができる。これらの剤形の製造にあたっては、慣用の医薬用賦形剤ならび に通常の製造方法を使用できる。錠剤はたとえば、活性成分を公知の賦形剤たと えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくは乳糖のような希釈剤、トーモロ コシデンプンもしくはアルプン酸のような崩壊剤、デンプンもしくはゼラチンの ような結合剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはタルクのような滑沢剤、およ び／″またはカルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセルロース、セルロー スアセテートフタレートもしくはポリビニルアセテートのような持続放出性を得 るための試剤と混合することによって製造される。

錠剤は所望によジ数層から構成させることができる。

コート錠は、錠剤と同様にして得られた中心錠を、錠剤のコーティングに慣用さ れる試剤たとえばポリビニルピロリドンもしくはシェラツク、アラ♂アビム、タ ルク、二酸化チタンまたはＦＲ′１ＩＩｉでコーティングすることによって製造 できる。持続放出性を得るためまたは不適合性を回避するためには、中心錠も数 層に製造することができる。錠剤の被覆を数層にして持続放出性を付与すること もでき、この場合、錠剤について上述した賦形剤が使用できる。

注射用溶液は慣用方法により、たとえば、ｐ−ヒドロキシベンゾエートのような 防腐剤、ＥＤＴＡのような安定剤を添加して製造できる。ついで溶液を注射用バ イアルまたはアンプルに充填する。

経鼻投与用スプレーは水溶液中に同様に調剤し、エアゾル噴射剤とともにまたは 手動圧縮手段を装備してスプレー容器中に充填する。１稽または数種の活性成分 を含有するカプセル剤は、たとえば、活性成分を乳糖またはソルビトールのよう な不活性担体と混合し、この混合物をゼラチンカプセルに充填する。

適当な型剤ば、たとえば、活性成分または活性成分配合物をこの目的に企図され た慣用の担体たとえば天然の脂肪もしくはポリエチレングリコールまたはそれら の誘導体と混合して製造する。

本発明の化合物を含有する投与量単位は、式（１）のペプチド好ましくは１〜１ ００μ９たとえば５０μｙを含有する。

本発明のさらに他の態様としては、上に定義した医薬組成物の有効量を対象に投 与することを特徴とする大腸上皮における過増虐性の良性または悪性病変を阻止 する方法が提供される。

補正書の翻訳文提出書　（特ｎ４８４条（＋）８）平成　２　年　３　月　１５ 　　後層

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、ピログルタミルおよびヒスチ ジル残基はＬ−立体配置である）で示されるトリペプチド、Ｌ−ピログルタミル −Ｌ−ヒスチジル−グリシンの、大腸上皮における過増殖性良性または悪性病変 に対して活性な医薬組成物の製造のための使用。
2. ２．大腸上皮における過増殖性良性または悪性病変の処置用組成物であつて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、ピログルタミルおよびヒスチ ジル残基はＬ−立体配置である）で示されるトリペプチド、Ｌ−ピログルタミル −Ｌ−ヒスチジル−グリシンの上記疾患の処置に有効な量を含有する組成物。
3. ３．大腸上皮における過増殖性良性または悪性病変の処置方法において、上記病 変を有する対数に、式▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、ピログ ルタミルおよびヒスチジル残基はＬ−立体配置である）で示されるトリペプチド 、Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−ヒスチジル−グリシンの上記疾患の処置に有効な量 を投与する方法。