JPH03501622A - 蛋白誘導体及びその調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、蛋白複合体、その調製法、及び医学の分野で荷動である新規蛋白複合 体の調製におけるその使用に関する。さらに詳しくは、本発明は蛋白のアミノ− アルコール誘導体及びアルデヒド及びその！１１製法（特に酵素に触媒された逆 蛋白分解による調製法）に関する。

発明の背景 医学の分野において、治療又は診断のための蛋白複合体の使用に対して大きな興 味が持たれている。この複合体は一般的には、エフェクターやレポーター基（例 えば細胞毒性物質や放射能標識されることができる基〕の結合した蛋白（例えば 抗体）よりなる。

−１ｌｓｌ”ｌにエフェクターやレポーター基の蛋白への結合は、基特異的反応 により、領域特異的反応（例えばチロシン残基のヨード化、又はリシン残基のア シル化）ではない。従って１つの物質とだけ反応した物質でも一般的にそれ自身 は不均一であり、修飾反応に関与するタイプのいくつかの残基のうちの１つに１ つの基が結合した種の混合物である。

医学分野での使用が目的の蛋白複合体については、上記の非領域特異的方法によ り得られ１こ生成物よりも、目的の基の部位特異的結合法による生成物の均一性 により、多くの情報が得られる。即ちｘｇｏ型の抗体の部位特異的修飾の利点に ついては、すでに報告されている（ムラヤマら（Ｍｕｒａｙａｍａ　ｅｔ　ａＬ 　）、イミュノケミスト　リ　−（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　第　 ｊ　５　巻　、　５２３−５２８頁（１９７８年）；ジエイ・ディー・ロッドウ ェルら（Ｒｏｄｗｅｌｌ、　Ｊ、　Ｄ、　ｅｔ　ａＬン、プロシーデイングズオ ブナショナルアカヂミーオプサイエンシーズユーエスエ−（Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　）第８６巻、２６５２−２６３６頁（１９８ ６年ン、及びヨーロッパ特許明細書第８８６９５号〕。この場合、１６０分子の 炭水化物を酸化した後に還元性アルキル化を行うことにより、領域特異性が達収 された。このような方法がうまくいくかどうかは、適当なグリコジル化があるか 否かに依存するため、他のクラスのポリペプチドには一般的には適用できない。

１１こ１６０分子はグリコジル化の部位が２つ以上あるため、この方法は必ずし も部位特異的とは限らない。

活性基をポリペプチドのＣ末端にのみ結合させるため國、逆方向に動くプロテア ーゼの特異性が利用されている（アール・イー・オフオードとケー・ローズ（０ ｆｆｏｒｄ　、Ｒ，Ｆａａｎｄ　１ｏｓｅ、に、　）、「生体液のゾロタイドＪ 　（Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｉｏユｏｇｉｃａｌ　Ｆｌｕｉｄｓ　 ）、エイチ・ぎ−ターズ（Ｈ０ｐｅｓｔθｒｓ　）編、パーガモン（ｐｅｒｇａ ｍｏｎ　）、オックス７７１−−ド（ｏｘｆｏｒｄ　）、３５−３８頁（１９８ ６年）；アール・イー・オフオードら（０ｆｆｏｒｄ、Ｒ，Ｅ、ｅｔ　ａｌ、　 ）　［ペプチドＪ１９８６年（ディー・チオドロポーロスＣＤ、　ＴｈｅＯｄＯ ｒＯｐＯｕ１０８　）　編）、、ダブリュー・デグルイタ−（Ｗ、ｄｏ　（）ｒ ｕｙｔｅｒ　）、ベルリン、２７９−２８１頁（１９８６年）；ケー・ローズら （Ｒｏｓｅ、ｘ　ａｔ　ａｌ、　）　「ペプチド」（同上〕、２１９−２２２頁 （１９８６年）；ケーーｏ−ズら（Ｒｏｓｅ。

Ｋ　ｅｔ　ａｍ、　）、バイオケミストリージャーナ／ｌ／　（Ｂｉｏｃｈ’ｅ ｍ。

Ｊ、　）、第２４９巻、８３−８８頁（１９８８年）；及びヨーロッパ特許明細 書ｌＧ２４３９２９号）。この後の化学反応において、エフェクターやレポータ ー基は特異的に、修飾されたポリペプチドの活性基に向かう。

（酵素の特異性という点と、酵素の結合反応な高収率にするために大量のアミノ 底分が一役的に必要であるという点から、目的の基を直接ポリペプチド鎖に酵素 的に結合させることは、普通可能ではないし、好１しくもない。］エフェクター やレポーター基と活性ポリペプチドの結合反応の特異性は、エフェクターやレポ ーター基とポリペプチド中の反応性基の化学的相補性により、またエフェクター やレポーター基自身がポリペプチド断片の場合は立体配置的に助けられて、達成 される。

上記のタイプのプロテアーゼ反応に、芳香族アルデヒド、脂肪族アルデヒド又は 芳香族アミンである活性基の使用が、記載されている。シッフ塩基の生成と還元 （還元アルキル化〕により結合し、低−における芳香族アミンと目旨肪族アミン の相対的反応性により特異性が得られている。

蛋白のカルボキシル末端に特異的にアミノ−アルコール基を結合させるのに、酵 素に触媒された逆蛋白分解（酵素触媒逆蛋白分解）を使用できることを、われわ れは見いだした。側鎖の保護は必要でなく、蛋白の変性が最小に抑えられる非常 に穏和な条件下で及び水溶液中で結合反応が有効に実施できる。アミノ−アルコ ール基は通常蛋白中には存在せず、エフェクターやレポーター基が酵素的に蛋白 に結合している場合は、適当に修飾したエフェクターやレポーター基を直接ヒド ラジド基に向かわせることにより、部位特異的結合が可能である。得られる複合 体はこれ以上の処理は不要であり、これはシッフ塩基で還元的安定化が必要であ るという部位特異的結合の従来の報告とは異なる（ニー・ムラヤマら（Ｍｕｒａ ｙａｍａ、　Ａ　ｅｔ　ａｍ、　）、ジエイ・ディー・ロッドウェルら（Ｒｏｄ ｗｅｌ’ｉ、Ｊ、Ｄ、　ｅｔ　ａＬ　）、アール・イー・オフオードとケー・ロ ーズ（０ｆｆｏｒｄ。

Ｒ，Ｅ、　ａｎｄ　Ｒｏｓｅ、に、　）、アール豊イー・オフオードら（０ｆｆ ｏｒｄ、Ｒ，に、ｅｔ　ａ’１．　）、同上）。このような還元を使用すると好 １しくない分子間及び分子内架橋の不可逆的生成の原因となりやすく、アミノ− アルコール形成による結合を使用することにより高度の特異性が得られる。

発明の要約 本特許−家式（１）の化合物とその塩を与える：Ａ−Ｃ！０−Ｎ（Ｒ１）ＯＨ２ −Ｚｌ−Ｒ２ｉｌｌ（式中、Ａ−Ｃｏ−は蛋白又はペプチドＡ−ｃｏ２Ｈの残基 であり； Ｒ１水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基であり； ｚｌは存在するか又は欠如しており、スペーサー（５ｐａＣｅｒ　）基であり； Ｒ２は−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ３）ＯＨ２ＮＨＲ’　（ここでＲ３とＲ′は同じか又は 異なっており、それぞれ水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基 である）、又は−〇　（Ｒ３）０であり； Ａ−Ｃｏがインスリンの残基である場合、Ｒ１は水素原子以外のものである）。

式（１）の化合物において、Ａ−Ｃ１：Ｏ−で示される蛋白又はペプチドＡＯＯ ２Ｈの残基は、任意の天然に存在する台底又は半合成蛋白又はペプチド（ハイプ リドーマや組換えＤＮＡ法により産生されたものを含む）の残基でもよい。具体 的な例としては、免疫グロブリン（例えばポリクローナル抗体、七ツクローナル 抗体、及び組換え抗体やその断片）、フィブリノ−ｒン、アルブミン、トランス フェリンなどの血漿蛋白、ホルモン（例えばニストロビンのよウナステロイドホ ルモン、インスリン、エリスロポエチン、ソマトスタチン〕、リンフ才力イン（ 例えばインターロイキン１又はインターロイキン２）、組織壊死因子（ＴＮＦ　 ）などのサイトカイン、そして治療上有効な酵素（例えば組織プラスミノーグン アクチペータ（ＴＰＡ　）　）や酵素インヒビター（例工ばメタロプロテイナー ゼの組織インヒビター）などがある。

式（１）の化合物のＲ１、Ｒ３、又はＲ４がアルキル基の場合、それは例えばＣ １−６アルキル基（メチル又はエチル基）でもよい。Ｒ１、Ｒ３、又はＲ４で示 されるアリール基の例はＣ６−１２アリール基（例えばフェニル基）がある。Ｒ １，Ｒ３、又はＲ４で示されるアラルキル基は、芳香族Ｃ１−３アルキル（例え ばペンシル又は７エネチルナトのフェニルＣ１−３アルキル）がある。

式１１＞の化合物の２１がスペーサー基である場合、それは例えば、−〇−又は −Ｓ−又は１つ又はそれ以上の−Ｎ−（Ｒ５片（ここでＲ５は水素原子又はＣ１ −６アルキル基である）、環状脂肪族又は芳香族基より選択された１つ又はそれ 以上の異種原子が随時介在する、随時置換された脂肪族ハイドロカルビル鎖であ る。

即ち具体的にはｚｌは、−〇−又は−Ｓ−又は１つ又はそれ以上の−Ｎ（Ｒ５） 　（例えば−ＮＨ−又は−Ｎ（ＯＨｓ）−）　、環状脂肪族（例えばシクロヘキ シレンのよ５なＧ３−８シりｏ　７　ル’ｆ　Ｖ　：／　）又は芳香族（例えば フェニレンノようなＣ６−１２アリレン）基より選択される１つ又はそれ以上の 異種原子が随時介在する、随時置換された直鎖又ハ分岐鎖Ｃ１−１０アルキレン 、Ｃ２−１０アルケニレン、又ハＣ２−□。アルキニレン鎖である。

Ｚ１ノＡ体的例、！＝　１．　テ＆！、−ｃａ２−１−（ＯＨ２）２−１−ＣＨ ２０ＣＨ２−１−ｃＨ２ｓｃｇ２、−（ＣＨ２）ｚ−又は−（ＣＨ２）４がある 。

式（１）の化合物の埴には、酸や塩基との壇（例えば垣酸塩やシュウ酸塩などの 酸付Ｖａ塩、又はすｌ、　ＩＪウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩）があ る。

一般的に式（１１の化合物のＡ−ｃｏ−基は、蛋白又はペプチドＡ−００２Ｈ（ ここで−Ｃｏ２Ｈは蛋白又はペプチド中に存在する任意のカルボキシル基である 〕の残基である。

しかし好ましくは式ｆｉ＋の化合物のＡ−Ｃｏ−基は、−Ｃｏ２Ｈは蛋白又はペ プチド中のＣ末端カルボキシル基である蛋白又はペプチドのＡ−Ｃ！０２Ｈの残 基である。

式＋Ｉ＋の化合物の好適な基は、Ａ−Ｃｏ−が、フィブリノーダンや免疫グロブ リン又はそれらの断片などの血漿蛋白、インスリンなどのホルモン、組織壊死因 子（ＴＮＴ　）などのサイトヵイン、又は治療上有効な酵素（例えば組織プラス ミノ−ｒンアクチベータ（ＴＰＡ　））などの残基であるものである。

具体的にはＡ−Ｃ！Ｏ−は免疫グロブリン又はその断片であることが好ましい。

免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片は一般的には、免疫グロブリンクラスに 属する。例えばそれは免疫グロブリンＭクラスに＠′１″ろ抗体、又は特に免疫 グロブリンＧクラスに属する抗体である。抗体又はその断片の起源は、動物、例 えば有孔類（例えばマウス、ラット、又はヒト）でもよい。１にそれは天然の抗 体又はその断片、又は必要な場合は、組換え抗体又は抗体断片（即ち組換えＤＮ Ａ法を使用して産生される抗体又は抗体断片）でもよい。

具体的な組換え抗体又は抗体断片には、（１）少なくとも一部は、異なる抗体由 来の抗原決定基を有するもの、例えば１つの抗体の高度可変域又は相補性決定域 が１、第２の異なる抗体の可変フレームワーク領域に移植されているもの（ヨー ロッパ特許明細書第２３９４００号に記載）；ｆ２）非ＦＶ配列が池の異なる抗 体のＦ’＋７配列で置換されている組換え抗体又は断片（ヨーロッパ特許明細書 第１７１４９６号、１７３４９４号、１９４２７６号に記載）；又は（３）実質 的に天然の免疫グロブリンの構造を有しているが、ヒンジ部位のシスティン残基 の数が天然の免疫グロブリン中の数と異なるもの、又は組換え抗体又は断片の表 面ポケット（５ｕｒｆａｃｅ　ｐｏｃｋｅｔ　）中の１つ以上のシスティン残基 が天然の免疫グロブリン中に存在′１″る他のアミノ酸の鳴所罠あるもの（それ ぞれ国際特許出願ＰＣＴ／／ＧＢ８Ｂ１００７３０どＰＣＴ／ＧＢ　８８　／　 ００７２９に記載）がある。

抗体又は抗体断片は、ポリクローナル、好ましくはモノクローナルであり、複数 の抗原決定基に対して特異性を有していてもよいが、１つにのみ特異的であるこ とが好ましい。抗原決定基は任意のハプテン、はヒトなどの動物（例えば正常動 物の組織又は器官細胞に関連した抗原、腫瘍細胞関連抗原（例えば癌胎児性抗原 又はアルファフェトプロティンなどの腫瘍胎児抗原、絨毛性ゴナドトロピンや胎 盤性アルカリホスファターゼなどの胎盤性抗原、前立腺酸性ホスファターゼや前 立腺特異抗原などの前立腺抗原）、及びフィブリン、血小板のどの体液に関連し た抗原）、ウィルス、細菌そして菌類に関連した抗原決定基である。

抗体断片は例えば、全抗体の蛋白分解により得られた断片、例えばＦ（ａｂつ２ 、Ｆａｂ’又は？ａｂ断片、又は組換えＤＮＡ法により得られる断片（例えばＦ Ｖ断片）がある（国際特許出願ＰＯＴ為Ｂ８８１００７４７に記載　ン　。

弐（１１の化合物のＲ１、Ｒ３、Ｒ４（Ｒ３、Ｒ４が存在する場合〕は好ましく は水素原子、又はアルキル（特にメチル〕基である。Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４（Ｒ３、 Ｒ４が存在する場合〕がそれぞれ水素原子である式（１）の化合物が特に好筐し 一部。

式ｉｌ＋の化合物の２１が存在する時、それは好ましくは１つ以上の一〇−又は −Ｓ−又は−Ｎ（Ｒ５）−基が随時介在する”１−１０アルキレン鎖である。

本発明の化合物の特に有用な群は式（１ａ）を有する：Ａ−Ｃｏ−Ｎ（Ｒ”）Ｃ １１２−Ｒ”　（１ａ）（式中、Ａ−Ｃｏ−、Ｈｌ、　Ｒ２は式ｆｉｌの化合物 及びその塩で定義されたものである（　Ａ−Ｃｏがインスリンの残基であるとき 、Ｒ↓は水素原子以外のものである））。

この型の特に有用な化合物は式（１ｂ）を有する：Ａ−Ｃｏ−ＮＨＣＨ２（Ｈ（ ＯＨ）（８２ＮＨ２（１ｂ）（式中、Ａ−Ｃｏ−は式ｉｌ＋の化合物及びその塩 で定義されたものであるが、インスリンではない）；又は式（ＩＣ）　： Ａ−Ｃｏ−ＮＨＣＨ２ＣＨＯ（１ｃ） （式中、Ａ−Ｃｏ−は式（１）の化合物及びその塩で定義されたものであるが、 インスリンではないン；Ａ−Ｃ！Ｏ−が蛋白又はペプチドＡ−ＣＯ２Ｔｉ　（こ こで−Ｃｏ２Ｈは蛋白又はペプチドのＣ末端カルボキシル基である）の残基であ る式（１ａ〕、（ｉｂ）　、、ｃｉｃ、＋の化合物は特み好ましい。Ａ−Ｃｏ− が免疫グロブリン又はその断片の残基である、この型の化合物は特に好ましい。

式ｉｌ＋の化合物は以下の方法で調製される（ここで特に明記していない場合は Ａ−００−１ＲＩＳＲ２、ｚｌは式（１）で定義したものである）。

即ち本発明は、式（２）の化合物： Ａ−Ｃｏ２Ｈｔ２） 又はその活性化誘導体を、式（３）の化合物：ＲＩＮＨＣ！Ｈ２−ＺＩＣ（ＯＨ ）（Ｒ３）ｆｌｌ：Ｈ２Ｎ１（Ｒ’　（３＋と、溶媒（例えば水性溶媒）中で適 当な＠Ｋ（例えば大体周囲〜温度）で縮合することよりなる、式（１）の化合物 （コ、ｍ　テＲ２バーＣ（ＯＨ）（Ｒ３）ＣＨ２ＮＨＲ’である〕の調製法を与 える。

本発明の上記の一般的方法の具体的な点は、ペプチド結合の形成を触媒すること ができる酵素の存在下で、式（２）の化合物を式１３１の化合物と縮合させるこ とよりなる、式（１）の化合物（式中、Ａ−Ｃｏ−は蛋白又はペプチドＡ−Ｃｏ ２Ｈの残基であり、−Ｃｏ２Ｈは蛋白又はペプチドのＣ末端カルボキシル基であ る）の調製法が与えられることである。

本発明のこの点での使用に適した酵素は、セリンゾロティナーゼ（例えばトリプ シン、又はキモトリプシン）、又はりジルエンドペプチダーゼ、エクソペプチダ ーゼ（例えばカルボキシベゾチダーゼＹのようなカルボキシベノチダーゼ）など のプロテアーゼがある。

一般的に、式：２）の化合物と式（３）の化合物の縮合を促進するの罠選ばれる 、有利な穏和な条件で反応が行われる。正確な条件は使用する酵素により異なる 。即ち例えばトリプシンな酵素として使用する場合、反応は溶媒、特に水性溶媒 （例えば水又は水性有機溶媒（例えば水溶性ジメチルスルホキサイド、水性ジメ チルアセトアミド又は水溶性ブタン−１，４−ジオール〕中で適当なｐＨ（例え ばｐｉ−１４−８）、適当な温度（例えば大体周囲＠度〕で実施される。

口じ条件又は類似の条件を使用して他の酵素も使用される。その正確な条件は、 縮合反応を実施する前に通常の方法により適当な小規模実験を行い、実験的に決 定される。

Ｒ２は一〇（Ｒ３）Ｏである式（１）の化合物は、例えば過ヨー素酸のような酸 化剤を使用して、エチレングリコースのような適当な溶媒中で、適当な温度（例 えば大体周囲温度）で、式（１）の対応する化合物の酸化により調整される。

式（１）の化合物の塩（・家、標準的方法（例えば水性溶媒中で式１１）の化合 物を酸又は環基と反応させる）で調製される。

式（２）の蛋白又はペプチドは、容易に入手できるか、又は標準的方法を用いて 得られる。

式（３）の中間体は公知の物質であるか、又は該公知の物質の調製に使用される 方法に類似の方法を使用して公知の出発物質より調製される。

式（１）の化合物は、蛋白が目的の別の分子（例えば他の蛋白又はペプチド、又 はエフェクターやレポーター分子〕に結合しており、結合は −Ｎ（Ｒ１）ＣＨ２−Ｚｌ−Ｃ（０Ｈ）（Ｒ３）ＣＨ２Ｎ＝又は−Ｎ（Ｒ１）Ｃ ！Ｈ２Ｚ１−ＯＨ＝基である、蛋白複合体の調製に有用である。

即ち本発明のさら国別の点において、蛋白複合体の調製に使用できる式１１）の 化合物を与える。

本発明のさらに別の点において、結合は−Ｎ（Ｒ１）ＣＨ２−２’−Ｃ（ＯＨ） 　（Ｒ３）ＯＨ２Ｎ−又は−Ｎ（Ｒ１）ＣＨ２Ｚ１−ＣＨ＝基であることを特徴 と￥る、蛋白が他の蛋白又はペプチド、又はエフェクターやレポーター分子に結 合している蛋白複合体を与える。

この型の複合体において　ＲＩＳＲ３、ｚｌは式（１）で定義されたものであり 、式（１）に関連してこれらの基のある型について説明した種々の選択は、本発 明の蛋白複合体にも適用されると理解するべきである。

本発明の具体的な蛋白複合体は、式（４）の化合物よりなる： Ａ−Ｃ！０−Ｎ（Ｒ１ンｃＨ２−Ｚｌ−Ｙ−Ｒ（４）（式中、Ａ−００−５Ｒ１ と２１は式（１）で定義したものであり、Ｒは蛋白又はペプチド又はエフェクタ ーやレポーター基であり、Ｙは一〇（ＯＨ）（Ｒ３）（ＩＨ２ＮＨＲ’又ｉ’！ 、　−〇（Ｒ３）０を只の反応性基と結合させろことにより形成される結合基で ある）。

式（４）の具体例は式（５）の化合物を含む：Ａ−Ｃｏ−Ｎ（Ｒ１）ＯＨ２−Ｚ ｌ−ＣＨ＝Ｎ−Ｒｔ５＋（式中、Ａ−００−１Ｒ１、ｚｌ、Ｒは上で定義したも のである）。

式（４）と式（５）の化合物において、Ｒは例えばＡ−ＣＯ−１又はエフェクタ ーやレポーター基について定義した蛋白又はペプチドである。エフェクター基は 、例えば任意の生理的に活性り化合物、抗細菌、抗ウィルス、抗菌化合物である 。具体的な生理的に活性な化合物としては、抗新生物物質（細胞毒性物質や細胞 増殖抑制性物質など〕、毒素、ホルモン、抗炎症化合物、及び心臓血管系（線溶 系）物質や中枢神経系物質として活性な物質などがある。レポーター基は、例え ば分析法によりインビトロ及び／又はインビボで検出される基（例えば放射能標 識が可能な基、螢光性の基、又はＮＭＲやＥＳＲ分光法で測定可能な基）がある 。

式（４）と式（５）の化合物を生成させるために、出発物質Ｒは、弐（１１の化 合物のヒドラジド基と反応できる基を有しでいなければならないことは理解され るで無あろう。このような基は容易に同定可能であり、特にアルデヒド基がある 。適当な基は出発物質中に存在することもあり、必要な場合には、例えば本実施 例中に記載した従来法を使用して導入することができる。

以下の中間体と実施例により本発明を説明する＝１．６−ジアミツー２−）ロバ ノール（９４■−フル力（Ｆｌｕｋａ　）　）を、ブタン−１，４−ジオール（ フル力（Ｆｌｕｋａ　）、９部）と蒸留水（１部）の混合液２ｍ１に溶解した。

酢酸（フル力（Ｆｌｕｋａ　）　）を加えて見かけのｐＨＣ未補正ガラス電極） を６．８とした。このやや粘性のある溶液を充分混合し、このような溶媒中での 電極の応答の遅さのための時間を考慮して、酸性化は注意して行なわなければな らない。ＤＡＩ（３０Ｈ１ｇ）を１．５ｍｌの上記溶液に溶かし、次に３Ｔｎｇ のＴＰＣＩ処理ウシトリプシン（ワーシントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　）　 ）を６０μｍの水Ｉ（溶かして７１０えた。酵素溶液を急速かつ完全に混合した 。２２℃で４時間インキュベート後、反応混合液を、他の核性分子の結合で記載 されていルヨうに処ｙしｒ、：、＜ｏ−ズら（Ｈｏ５ｅ　ｅｔ　ａｌ、　）　、 バイオケム・ジエイ（Ｂｉｒｃｈｅｎ、　Ｊ、　）　第２１１巻、６７１−６７ ６頁（１９８３年ン；酸性化、１％酢酸中でＧ５Ｄファインで・ビル濾過、イン スリン誘導体のピークを凍結乾燥して、溶媒、試薬、トリプシンを除去〕。

粗物質の収率は約２８曙であつ１こ。ｐ）ｔ８で酢酸セルロース電気泳動で粗物 質を分析すると、少量の残存ＤＡＩと、陽極に向かって非常にゆっくり移動する 多量（約７０％）の物質が証明された。これはＤＡＩより真の陰性荷電が２個少 ない化合物に予想されることである（ａ−ズら（Ｒｏｓｅ　ａｔ　ａｌ、　）　 、バイオケムφジエイ（Ｂｉｏｃｈｓｍ、　Ｊ、　）　第２１１巻、６７１−６ ７６頁（１９８３年）参照）。これは構造ＤＡエニーＨＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ ２ＮＨ２の生成物に一致ｊる。低−（１０係酢酸〕での酢酸セルロース電気泳動 での分析では、陰極に向かってインスリンより速く移動する生成物が証明され、 これは低よで１つ余分の陽性荷電を有していることに一致する。逆相ＨＰＬＣ分 析によりこの生成物は、ＤＡＩよりも親水性（速く溶出する）であり、任用で１ つ余分の陽性荷電を有していることに一致する。

結合収率は約７０係であった。システム１のＨＰＬＣでＤＡニーＮ！（ＣＨ２０ Ｈ（ＯＨ）ＣＨ２Ｎｌ（２を精製した。

システム１：　ベツクマンビールドシステム。カラムはマシェリーナケ９ルヌク １／オシ／１／　（Ｍａｃｈθｒｙ　ＮａｇｅｌＮｕＣｌｅｉｏｓｉｌ　）　（ ３Ｄ　ＯＡ　％　５　ｐｒｎ　ｓ　ｃＦ３、内径２５ｃｍ×４１Ｒｘ）をＱ、（ ５ｍｌ　７分で夏用１−た。溶媒Ａは０．３Ｍ硫酸アンモニウムであり、溶媒Ｂ は６５％アセトニトリル中０−３ＭＮ酸アンモニウムであった。この２つの溶媒 は、濃硫酸を注意深＜　７１０えて−を２（ガラス電極）に調整した６Ｍ硫酸ア ンモニウムを使用して調製した。

２５４　ｎｍで検出した。

画分な手で集め、水で希釈した後０１８セゾパツク（Ｓｅｐ　Ｐａｋ　）　（ウ ーメーズ（Ｗａｔｅｒｓ　））を用いて製造業者の指示に従い蛋白を回収した（ メタノールで洗浄、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ　）で平衡化、等量の水 で希釈した試料を添７１１］、０．１％ＴＦＡ　／　２０％アセトニトリルで洗 浄、０．１％ＴＦＡ　／　４０％アセトニトリルで溶出ン。真空遠心分離機中で ヒーターのスイッチはきった状四で溶媒を除去した（スぎ一ドパツクコンセント レーター（５ｐｅｓｄＶａｃ　ｃｏｎｃｅｎｔ’ｒａｔｏｒ　）　、サバント（ ５ａｖａｎｔ　）　）。

１０％酢酸中ｐＨ８で酢酸セルロース電気泳動でこの生成物は純粋であることが 証明されＴ二。アルミラリアメレア（Ａｒｍ１ｌｌａｒｉａ　、５ｅｌｌｅａ　 ）のプロテアーゼ（ローズら（ＦｔＯｓｅＳｔ　ａｍ、　）、「ペプチド、Ｊ、 １９８４年、ラグナーソｙ　（Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ、　Ｕ、　）　ｍ、２３５ −２３８頁、アルムクビストアンドゥイクセルインターナショナル（ＡｌｍｑＶ ｉｓｔ　ａｎｄ　Ｗｉｋｃｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　）、ストック ホルム、１９８４年を参照）を用いて消化すると、デス（Ｌ７Ｂ””Ａ１ａＢ３ ０　）インスリンが遊離された（　ｐＨ８での酢酸セルロース電気泳動とＨｐＬ ｃで同定〕。

上記のデータ及び合成方法を考慮すると、この生成物は、Ｌ７８Ｂ２９のアルフ ァーカルボキシル基にジアミノプロパノール基が結合している構造ＤＡエニー１ （（：Ｈ２（Ｈ（ＯＨ，）（、Ｈ２ＮＨ２であると判定さｎた。

中間体２ Ｄ訂−ＮＨｃＨ２（Ｊ（０Ｈ）ｃＨ２Ｎ町の酸化ＤＡニーＮＨＣＨ２ＣＪＯＨ） ＣＨ２ＮＨ２（中間体１と同様に調製し、精製した；１％重炭酸アンモニウム溶 液中１゜１彎／ｍｌ。

声８．３）の溶液１．３ｍｌに、完全Ｖ−混合しながら５．８μｍのエチレング リコール（フル力（Ｆユｕ′ｋａ）　）　’を加えた。完全に混合しながら２０ ０μｍの過ヨー累酸溶液（１，９６彎／　ｍ１水溶液）を加えた（最終濃度、Ｄ Ａエニー１（ＯＨ２Ｃ阻０Ｈ）ＯＨ２’ＮＨ２，０，１９ｚＭ；グリコール、５ ７．６　ｍＭ　；過ヨー累酸、０．９６　ｍＭ　）　Ｏ暗所中で２２００で３０ 分間インキュベートした後、混合液をＨＰＬＣシステム１で分析した。ＤＡエニ ーＨＯＨ２０Ｈ（ＯＨ）ｆｌＨ２ＮＨ２はほとんど定量的に、溶出の遅い物質に 変換されており、陽性荷電を失ったことに一致している。この生成物をシステム １の調製ＨＰＬＣで単離し、セプパツク（Ｓ６＋ｐＰａｋ　）と真空遠心分離で 回収しり（実施例１に記載）。調製ＨＰＬＣｉ上での性質（ＤＡエニーＨＣＨ２ （Ｈ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＦ（２よりも疎水性）、１０％酢酸中酢酸セルロース電気 泳動での性質（インスリンに近い位置に移動し１、ＤＡＩ−ＮＨＣＨ２０Ｈ（Ｏ Ｈ）（Ｈ２ＮＨ２よりもかなり遅い請求アルデヒド性試薬との反応性から、この 生成物は、予想され１こＤＡエニー）ＩＣＨ２（ＪＱと同定されＴ二。

亜鉛を含１ないブタインスリン（対照）とＤＡエニーＨＣＨ２ＣＨＯを１００μ Ｍの濃度で、５００μＭのアミノオキシアセチルフェリオキサミン（ヨーロッパ 特許明細書第２４３９２９号に記載の方法で調製））の存在下で及び存在ｌ−な いところで、ＰＨ４，６のＱ、Ｉ　Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液中で２２℃で、イ ンキュベートした。間隔をあげて１０μｍをＨＰＬＣで分析した。その結果は、 インスリンはアミノオキシ化合物と反応せず、ＤＡエニーＨＣ：Ｈ２ＣＨＯはア ミノオキシ化合物の存在しないところで安定であり、アミノオキシ化合物は安定 であり、５ＤＡニーＮＨｃＨ２（ＪＩＯは明らかに反応してより疎水性の単一の 複合体を産生じていることを明瞭に示してい１こ。この生成物はだいだい色で、 ｐ）１２−８で安定であり（これより広い範囲は調べていない）、ＤＡエニーＨ ＣＨ２ＣＨＯの予想されたオキシムでアル。

手続補正書（自発） 平成　２　年　（月Ｓ／日

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．式（１）の化合物及びそれらの塩：Ａ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１）ＣＨ２−Ｚ１−Ｒ ２（１）（式中、Ａ−ＣＯ−は蛋白又はペプチドＡ−ＣＯ２Ｈの残基であり；Ｒ １水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基であり；Ｚ１は存在す るか又は欠如しており、スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）基であり；Ｒ２は−Ｃ（Ｏ Ｈ）（Ｒ３）ＣＨ２ＮＨＲ４（ここでＲ３とＲ４は同じか又は異なっており、そ れぞれ水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基である）、又は− Ｃ（Ｒ３）Ｏであり；Ａ−ＣＯがインスリンの残基である場合、Ｒ１は水素原子 以外のものである）。
2. ２．式（１ａ）の化合物及びそれらの塩：Ａ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１）ＣＨ２−Ｒ２（ １ａ）〔式中、Ａ−ＣＯは蛋白又はペプチドＡ−ＣＯ２Ｈの残基であり；Ｒ１水 素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基であり；Ｚ１は存在するか 又は欠如しており、スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）基であり；Ｒ２は−Ｃ（ＯＨ） （Ｒ３）ＣＨ２ＮＨＲ４（ここでＲ３とＲ４は同じか又は異なっており、それぞ れ水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基である）、又は−Ｃ（ Ｒ３）Ｏであり；Ａ−ＣＯがインスリンの残基である場合、Ｒ１は水素原子以外 のものである）。
3. ３．Ａ−ＣＯは蛋白又はペプチドＡ−ＣＯ２Ｈ（ここで−ＣＯ２Ｈは該蛋白又は ペプチドのＣ末端カルボキシル基である）の残基である、請求の範囲第１項又は 第２項に記載の化合物。
4. ４．Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４はそれぞれ水素原子である、前記請求の範囲のうちいずれ か１項に記載の化合物。
5. ５．Ａ−ＣＯは免疫グロブリン又はその断片の残基である、前記請求の範囲のう ちいずれか１項に記載の化合物。
6. ６．式（２）： Ａ−ＣＯ２Ｈ（２） の化合物又はその活性化誘導体を、式（３）：Ｒ１ＮＨＮ（Ｒ２）−Ｚ１０（Ｏ Ｈ）（Ｒ３）ＣＨ２ＮＨＲ４（３）の化合物と縮合することよりなる、 式（１）の化合物及びその塩の調製方法：Ａ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１）ＣＨ２−Ｚ１− Ｒ２（１）〔式中、Ａ−ＣＯ−は蛋白又はペプチドＡ−ＣＯ２Ｈの残基であり； Ｒ１水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基であり；Ｚ１は存在 するか又は欠如しており、スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）基であり；Ｒ２は−Ｃ（ ＯＨ）（Ｒ３）ＣＨ２ＮＨＲ４（ここでＲ３とＲ４は同じか又は異なっており、 それぞれ水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基である）、又は −Ｃ（Ｒ３）Ｏであり；Ａ−ＣＯがインスリンの残基である場合、Ｒ１は水素原 子以外のものである）。
7. ７．式（１）（式中、Ａ−ＣＯは蛋白又はペプチドＡ−ＣＯ２Ｈの残基であり、 −ＣＯ２Ｈは該蛋白又はペプチドのＣ末端カルボキシル基である）の化合物の調 製のための請求の範囲第７項に記載の方法において、ペプチド結合の形成を触媒 することができる酵素の存在下で、式（２）の化合物を式（３）の化合物と縮合 させることよりなる、上記方法。
8. ８．蛋白は他の蛋白又はペプチド、又はエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）又は レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）分子に結合している蛋白複合体において、結合 は−Ｎ（Ｒ１）ＣＨ２−Ｚ１−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ３）ＣＨ２Ｎ＝又ま−Ｎ（Ｒ１） ＣＨ２Ｚ１−ＣＨ＝基（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４は同じか又は異なっており、そ れぞれ水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基であり、Ｚ１は存 在するか又は欠如しており、スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）基である）よりなる上 記蛋白複合体。 ９式（４）の化合物： Ａ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１）ＣＨ２−Ｚ１−Ｙ−Ｒ（４）（式中、Ａ−ＣＯ−は蛋白又 はペプチドＡ−ＣＯ２Ｈの残基であり；Ｒ１は水素原子、又はアルキル、アリー ル、又はアラルキル基であり；Ｚ１存在するか又は欠如しており、スペーサー（ ｓｐａｃｅｒ）基であり；Ｒは蛋白又はペプチド又はエフェクター又はレポータ ー基であり；１は、−ＮＨＲ４又は−Ｃ（Ｒ３）Ｏ基（ここでＲ３とＲ４はそれ ぞれ水素原子又はアルキル、アリール、又はアラルキル基である）をＲ基中の反 応性の基と結合させることにより生成される結合基である）。