JPH03501083A - エアーリフト昆虫細胞培養 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エアーリフト昆虫細胞培養 本発明は発酵及び昆虫細胞培養の分野に関する。本発明は特に噴射昆虫培養、そ してさらに詳しくはエアーリフト昆虫細胞培養に関する。さらに、本発明は、ウ ィルス産物又は組換え産物の製造のための宿主である昆虫細胞の大規模生体外増 殖を提供する。さらに、本発明は、それぞれ組換えバキュロウィルス（ｂａｃｕ ｌｏｖｉｒｕｓ）又は野性型ウィルスにより感受された前記エアーリフト培養に おいて増殖した昆虫細胞による組換え産物又はウィルス産物の発現に関する。

エアーリフト培養は、発酵工程における細胞培養液への酸素含有ガスの表面／体 積比を増加せしめる手段を提供する。

エアーリフト発酵の原理は幾つかの総説、例えばＱｎｋｅｎら、ｒＡｉｒｌｉｆ ｔ　Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒｓ：Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ、Ｂｅｈａｖｉｏｒ、ａ ｎｄ　Ｕｓｅｓｊ　。

Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓ ｅｓ、１：６７−９５（１９８３）；並びにＳｍａｒｔ、　ｒＧａｓｌｉｆｔ　 Ｆｅｒ＋＋＋ｅｎｔｅｒｓ：Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、、１　 。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　（１９８４年７月）に記載されてい る。

細胞培養の文献はエアーリフト培養による微生物細胞及び哺乳類細胞の培養に関 する言及を含むが、エアーリフト培養法による昆虫細胞の好結果の培養の報告は 存在しない。例えばＴｒａｍｐｅｒら、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈ ｎｏ！、、８　：　３３−３６　（１９８６年１月）は、その３３頁において、 ［昆虫細胞系のスケールアップにおいて遭遇する主たる問題は、細胞のサイズ（ ２〇一台）特表千３−５０１０８３（２） 及び細胞壁の欠如によるそれらの細胞の剪断力感受性である。

剪断力感受性が従来法における（例えば、噴射による）十分な酸素の供給を妨げ るであろう。」と述べている。Ｔｒａｍｐｅｒらはさらに、３５〜３６頁におい て次のように述べている。培養における昆虫細胞の機械的強度は小さい・・・こ れは昆虫細胞培養のスケールアップにとって明確な結果をもたらす。昆虫細胞培 養の体積が大きくなるに従って、液体表面を空気／酸素でフラッシュすることに より達成され得るのよりも効率的な酸素移動が必要となる。しかしながら、十分 な酸素を供給するために細胞懸濁液に空気を噴射しそして撹拌することによりガ スを分散させれば、細胞の増殖速度より大きな崩壊が起こるであろう。

Ｔｒａｍｐｅｒらが報告するところによれば、エアーリフト反応器中のｌＯ％ウ シ胎児血清及び０．０２％消泡剤を含有する培地中とが彼らにはできなかった。

「おそらく、気泡の上昇及び破裂並びに非流体速度が、その様なバイオリアクタ ー中で細胞が増殖できるのよりも速い速度で細胞を破壊するのであろう。」Ｔｒ ａｍｐｅｒら、３５頁。

［昆虫細胞の大容量培養のための懸濁系の十分な利用を２つ（それぞれ強調が付 され、省略記号により引用の省略が示さくＡｃａｄｃ＋＋＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　 １９７６）　ｏ本発明はこれらの問題点を解決する。

文献が「昆虫細胞のもろさ」を認めているため、従来昆虫細胞の培養にはあまり 通気しない条件が用いられ、スケールアップが制限されてきた。昆虫細胞は従来 から容器、例えば回転フラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ　ｆｌａｓｋ）又はゆっくり撹 拌される容器中で培養されており、これらは培地の空気供給のための表面上ガス 供給のみに頼っていた。このような従来から使用されてきた容器においては、容 器の体積が増加するに従って液体表面積と体積との比率が増加する。従って、昆 虫細胞培養の全酸素要求は培養物の体積の増加に比例して増加するが、表面上通 気からの酸素移動の容量は液体表面積に比例する。そして昆虫細胞の酸素飢餓が 従来の昆虫細胞培養容器のサイズを制限する。本発明はこのような酸素移動の制 限、そしてその結果としての昆虫細胞培養の寸法制限を克服するものである。

昆虫細胞の最適な大規模培養のためにはよく通気された条件が必要である。エア ーリフト培養はこの様な大規模増殖のために必要な酸素移動を提供するための手 段である。

さらに、前記のように、細胞を損傷することなくエアーリフト培養において昆虫 細胞を増殖せしめる必要が当業界においてなお存在する。本発明は、噴射培養（ ｓｐｅｒｇｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ）、特にエアーリフト発酵槽において昆虫細胞 を大規模に高細胞密度まで高い生存性をもって増殖せしめる方法を提供すること により前記の要求を満たずものである。

昆虫細胞は組換えバキュロウィルスを複製せしめそれによって担持された外来遺 伝子の発現を促進するために好結果に使用されて来た。Ｓｍ１ｔｈら、ハＡＳ　 （ＵＳＡ）、　８２　：　８４０４−８４０８（１９８５）　；ヨーロッパ出願 公開Ｎｕ　１２７．８３９　（１９８４年１２月１２日公開）；及びＪｅａｎｇ ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６１　（３）　：　７０９−７１３　（１９８７年３月） 。

昆虫細胞はまた、生物学的殺虫剤として使用される昆虫ライ−５（１９７８）。

これらのウィルスには、例えば、バキュロウィルス及び非バキュロウィルス、例 えば感染性フラケリアウイルス［１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｆｌａｃｈｅｒｉａｅ 　ｖｉｒｕｓ　（ＩＦＶ）　］及び細胞質多形体病ウィルス（ｃｙｔｏｐｌａｓ ｍｉｃ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　（ＣＰＶ））が含まれる。例 えば、ある種のバキュロウィルス、例えば核多形体病ウィルス（ｎｕｃｌｅｏｐ ｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓｅｓ　（ＮＰＶ））及びグラヌロリスウイ ルス（ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　（ＧＶ）　）が挙げられ、これらは 害虫に対して非常に毒性であり、最も有望なものの幾つかは農業的に重要な昆虫 に対して病原性の生物学的殺虫剤として商業的に開発されている。Ｂｕｒｇｅｓ 　（編集）、ＩＩ　：　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｌ　Ａｄｖ、Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌ、Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、３　：　２９１＜１９８４）　；生物学的殺虫剤 としてのこの様なＮＰＶ及びＧＶ生生物物検討のため、５ｈｉｅｈら、ｒＰｒｏ ｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｓ　ｉｎ　Ｐｅｒｔ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｒｎｓ」　、Ｇｒ ａｎａｄｏｓら（編集）　、Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉ ｒｕｓｅｓ　：　Ｖｏｌ、　ｕ　Ｐｒａｃ−ｔｉｃａｌ　八ｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎｓ　ｆｏｒ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、１８１−２０２頁（１９８６） を参照のこと。

伝統的に、バキュロウィルスの生産は昆虫のサナギを用いて達成されたが、しか しながら、この様な手段による大規模生産はあまり魅力的ではない。昆虫細胞培 養はさらに非常に実際的である。Ｖａｕｇｈｎ、　Ａｄｖ、　Ｃｅ１１．Ｃｕ１ ｔ、　１　：　２８１−２９５（１９８１）　；５ｔｏｃｋｔｏｎら、Ｂｕｒｇ ｅｓ　（編集）前掲、３１３−３２８頁。アウトグラフ７”カリホルニ力　（Ａ ｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多形体病ウィルスの複製を許 容するスボドブテラ・フルギベルダ５０６頁（１，９８２）。

本発明は、昆虫細胞を大規模に高細胞密度に高い生存性を伴って増殖せしめるの みならず、該細胞が組換バキュロウィルスにより感染された場合には組換え産物 の生産を支持し、又は該細胞が野性型ウィルスにより感染された場合には他のウ ィルス産物の生産を支持する手段を提供する。

本発明は噴射培養において、特にエアーリフ）　（ａｉｒｌｉｆｔ）発酵槽にお いて昆虫細胞を増殖せしめる手段を提供する。この様な噴射培養又はエアーリフ ト培養は、従来の昆虫培養容器、すなわち培地の空気供給のために表面上通気に 頼る回転フラスコ又はゆっくり撹拌される容器において起こる酸素制限を克服す る。本発明は、噴射により、そしてそれによって培養物への酸素移動のための表 面上通気に内在する表面／体積率制限を克服することによって昆虫培養物に好結 果に通気する新規な手段を提供することにより従来の昆虫細胞培養の寸法制限を 克服する。本発明は、昆虫細胞が高密度に高生存性をもって大規模に増殖するこ とを可能にする。

本発明は、エアーリフト式昆虫細胞培養のために適当な操作パラメーター、最も 顕著に噴射する速度及び気泡直径を開示する。最適噴射速度は好ましくは、培養 体積当り分当り約０．０１〜約０．０８全ガス流容量（ｖｖｍ）　、さらに好ま しくは約０．０２〜約０．０６ｖｖｍである。最適気泡直径は好ましくは０．２ 〜約２．０ｃｍ、そしてさらに好ましくは約０６３〜約１．５　ｃｍである。

本発明はさらにエアーリフト昆虫細胞培養物が増殖するための培地を提供し、こ の培地は、噴射からの、すなわち撹拌／酸素供給系を駆動するために用いられる 気泡からの細胞の損傷及び細胞死を最少にする非毒性保護剤を含んで成る。本発 明の好ましい非毒性保護剤は非毒性水溶性ポリマーであり、さらに好ましくは非 毒性非イオン性洗剤であり、そして一層好ましくはプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎ ｉｃ）ポリオール、例えばプルロニックＦ６８又はプルロニックＦ８８である。

この様な保護剤は、特に細胞が血清含有培地中に維持される場合に、発泡を減少 させ、そしてそれによって遊離懸濁液から泡層への細胞のロス及び液体表面より 上の容器壁への細胞の付着を防止する点で効果的である。

さらに、本発明は、昆虫細胞を大規模に増殖せしめそして該細胞が組換えバキュ ロウィルスにより感染されている場合には組換え産物の生産を及び該細胞が野性 型ウィルスにより感染されている場合にはウィルス産物の生産を支持するための 方法及び培地を提供する。

ここで、大規模培養は約５１〜約２５．０００βの容量の培養を意味するものと 定義される。

ここで、噴射培養は、加圧された空気又は酸素含有ガスが、ち該加圧された空気 又はガスが発酵過程でそれを通して押し出される穿孔又はノズルを通して導入さ れるような培養として定義される。

ここで、エアーリフト培養は、細胞をそれらが沈降しがちである栄養溶液中に導 入する段階、及び該溶液に酸素含有゛ガスを導入することによって細胞を懸濁状 態に維持してそれらの沈降を防止する段階を含む細胞培養法として定義される。

エアーリフト培養を行うための装置は、栄養溶液用容器、及び該容器に酸素含有 ガスを導入しそして該栄養溶液が該酸素含有ガスの駆動力によって、該容器内を 循環するように該栄養溶液を案内するために機能する装置を含む。この案内装置 は管状部材として、実質的に平らな隔壁として、又は円筒状に完全なチューブ状 容器の内壁として構成することができる。

このチューブ状部材はドラフトチューブ（ｄｒａｕｇｈｔ　ｔｕｂｅ）であるこ とができ、その基部を通して酸素含有ガスが導入され、これによって培養流体が ドラフトチューブを通って上方に循環しく上行液流）そして次に該ドラフトチュ ーブと容器壁との間を通って下方に循環する（下行液流）。酸素含有ガスの気泡 を含む上行流は下行流よりも低密度であり、これにより置換が行われ、こうして 緩慢な循環流が導入される。溶存酸素圧及びｐＨは噴射されるガスの組成を変え ることにより調節することができる。

前記のように、噴射は「気泡の上昇及び破裂による」細胞の損傷及び死を生じさ せることが文献（Ｔｒａｍｐｅｒら前掲）中に注目され、これは従来技術が認め る「昆虫細胞のもろさ」（Ｗｅｉｓｓら、前掲）及び「培養における昆虫細胞の 小さい機械的強度Ｊ　（Ｔｒａｍｐｅｒら、前掲）と関連する。本発明のエアー リフト培養法は昆虫細胞を、よく噴射培養の通気された条件下での損傷及び死か ら保護する。

本発明の１つの観点は昆虫培養のための噴射速度の記述である。噴射速度は、良 好な細胞懸濁及び適当な酸素供給を維持するのに適当であるが細胞の損傷を惹起 する程には高くないように選択される。噴射速度の選択におけるさらなる基準は 、気泡対気泡の相互作用を最小にして気泡の合体を最少にし、合体による気泡サ イズの増加と関係なくスパージャ−のオリフィスのサイズの選択により気泡サイ ズを調節することができるように、培養流体中の気泡密度を十分低くすることで ある。

噴射速度は本発明の方法によれば好ましくは培養体積当り分当り約０．０１〜約 ０．０８全ガス流体積（ｖｖｍ）であり、そしてさらに好ましくは約０．０２〜 約０．０６ｖｖｍである。噴射されるガスは適当な細胞密度を維持することが可 能な空気であることができる。しかしながら細胞密度制限を回避するために、噴 射されるガスには純酸素を補充するのが好ましい。従って、噴射されるガスは酸 素と非毒性稀釈ガスとの混合物から成ることができる。培地の溶存酸素濃度（Ｄ ｏ）は、昆虫細胞系のために適当な特定の要件及び選択されたパラメーターに依 存して、当業者に知られている方法によって約１％〜約１５０％の空気飽和の濃 度に維持することができる。一般に、酸素は高濃度においては細胞にとって毒性 であり得るため、ＤＯは好ましくは１００％未満の空気飽和に維持され、そして さらに好ましくは約２０％又はそれより低い空気飽和に維持される。

しかしながら、このような記載は単に一般的ガイドラインであり、そして使用さ れる特定の細胞系及びパラメーターについてのＤＯはそのための最適レベルに維 持されるべきである。

本発明の方法によれば、噴射により導入される気泡から生ずる昆虫細胞に対する 損傷を減少甘めしるため、気泡のサイズは好ましくは中間範囲に維持される。好 ましくは、噴射される気泡は直径約０．２〜約２．０　ｃｍの範囲であり、そし てさらに好ましくは約０．３〜約１．５ｃｍの範囲である。気泡のサイズは、ス パージャ−のオリフィスの寸法を調節することにＪ：り制御することができる。

本発明の方法の第一の観点は１又は複数種の保護剤を含有する培地の使用である 。１又は複数の保護剤は噴射条件下で増殖した昆虫細胞の崩壊／塊形成現象を回 避するために機能し、そしてさらに容器壁へのそれらの付着を防止する。さらに 、保護剤は培養物中の細胞破片の量を減少せしめ、これは保護剤の存在によって 細胞溶解が減少することを意味している。使用される培地中のある種の要素、例 えばその中の血清蛋白質に対する噴射されたガスの効果によりエアーリフト培養 中に発泡が起こる可能性があるため、好ましくは、保護剤はさらに、遊離懸濁液 から泡層への細胞のロスを防止する消泡剤としても機能し、そして気泡表面張力 低下剤として、及び／又は細胞表面安定化剤として及び／又は気泡の損傷を減少 せしめ又は防止するための増粘剤として機能する。懸濁系ではなくマイクロキャ リヤー系が使用される場合、マイクロキャリヤーは泡層に集まる傾向がある点に おいて、発泡はエアーリフト昆虫細胞培養においてかなりの問題である。

ここで、保護剤は、よく通気された培養条件下で損傷及び死から昆虫細胞を保護 するために機能的に作用する非毒性水溶性化合物として定義される。本発明の保 護剤は好ましくは非毒性水溶性ポリマーである。保護剤候補は、まずそれが昆虫 細胞培養の分野の当業者に知られている方法により培養される昆虫細胞に対して 非毒性であることを確認することにより、例えばそれを培養のために選択された 昆虫細胞の懸濁液又は単層に添加し１、そしてその培養物の増殖を対照と比較す ることにより選択することができる。次に、非毒性保護剤候補を選択された昆虫 細胞の速く撹拌され又は噴射された小規模培養物に添加し、適当な時間の後に生 存を観察し、そしてこの培養物の細胞の生存を対照培養物中の細胞の生存と比較 することにより候補剤を保護能力について試験することができる。

撹拌培養及び噴射培養の両者における保護剤の有効性の間の一般的相関は、本発 明のエアーリフト昆虫培養培地及び方法のために適当な非毒性保護剤の選択を単 純化する上で助けとなる。エアーリフト培養は５１未満の培養容積においては一 般的でないと考えられるので小振とうフラスコ培養（対照培養及び試験培養）が 候補保護剤の保護能力を決定するための良好なモデルである。この様な決定のさ らなる単純化は保護能力についての標準的規準としての崩壊／塊形成現象の使用 である。細胞の崩壊及び塊形成が対照フラスコ中で生じしかし候補剤を含有する フラスコ中で生じなければ１．その剤は保護効果を有すると考えられる。実施例 （後記）は本発明の保護剤の選択のためのこのような方法のモデル系を提供する 。

本発明の培地中の保護剤は好ましくは細胞表面安定化剤及び／又は増粘剤及び／ 又は気泡表面張力低下剤である。好ましい保護剤の例はヒドロキシエチル澱粉、 メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（例えば、ナトリウムカルボキ シメチルセルロース）、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリドン、フィコール （ｆｉｃｏｌｌ）、アルギン酸、ポリプロピレングリコール、及び非毒性高分子 洗剤である。

非毒性高分子洗剤が本発明の方法における保護剤として好ましい。非イオン性で ある非毒性高分子洗剤がさらに好ましい。ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ　Ｅｍｕｌ ｓｉｆｉｅｒｓ　＆　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓの複数の版（ＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉ ｎｇ　Ｃｏ、１７５　Ｒｏｃｋ　Ｒｏａｄ、　Ｇｌｅｎｎ　Ｒｏｃｋ、　Ｎ、Ｊ 、米国のＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎにより発行）が、前記のよう にして非毒性及び保護能力について試験することができる本発明の培地のための 保護剤の非毒性非イオン性高分子洗剤候補を見出す源の例である。好ましい非毒 性非イオン性高分子洗剤はプロピルオキサイドとエチレンオキサイドとのブロッ クコポリマー（ポリオキシプロピレンポリオキシエチレン縮合体）、好ましくは プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、例えばプルロニックＦ６８．　 Ｆ７７、　Ｆ１ａ及びＦ２Ｏ３、好ましくはＦ１ａ及びＦ１ａ、さらに好ましく はＦ１ａである。これらのプルロニックポリオール類はまた、それらの消泡能力 のために好ましい。

プルロニックポリオールはＢＡＳＦ　Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ　Ｃｏｒｐ、　（１０ １Ｃｈｅｒｒｙｔｌｉｌｌ　Ｒｏａｄ、　Ｐ、０．ＢＯＸ　１８１．　Ｐａｒｓ ｉｐｐａｎｙ、　Ｎｕ、　０７０５４．米国）から商業的に入手可能である。

保護剤は好ましくは、本発明の培地中に、損傷から昆虫細胞を保護するためには 最も効果的であるがしかし細胞の増殖及び再生のために阻害的でない濃度で存在 する。プルロニックポリオール高分子保護剤は本発明の培地中に好ましくは約０ ．０１％〜約１％、さらに好ましくは約０．０５％〜約０．５％、そしてなお一 層好ましくは約０．１％の濃度（重量−容量）で存在する。

エアーリフト培養において生ずる場合がある発泡により惹起される損傷から昆虫 細胞を保護するだめの本発明の方法のさらに他の観点は、ドラフトチューブの上 方の液の高さを調整して、培地流が破泡器（ｆｏａｍ　ｂｒｅａｋｅｒ）として 使用され得る場合の最適レベルを見出すことである。泡の高さはドラフトチュー ブから上の液の高さの関数であることが見出された。

高濃度の蛋白質を含有する培地中で、例えば９％の血清が補充された培地中で、 ドラフトチューブの上方の円筒状部分（すなわち、直径がドラフトチューブに相 当しそしてドラフトチューブの頂部から発酵槽中の液体の表面に伸びる円筒状部 分）の周囲面積が下行環の水平断面積の、好ましくは約１．５〜約２．５培、さ らに好ましくは２倍になるように液の高さが調整される場合に泡の高さが最小に される。前記周囲面積はπｄｈとして計算され、ここでＩ−ｄ　Ｊはドラフトチ ューブの直径であり、モしてｒｌＩＪはドラフトチューブから上の液の高さ、す なわぢ液体の表面とドラフトチューブの頂部との差である。

下記の無血清低蛋白質又は無蛋白質培地においては、トラットチューブから上の 円筒状部分の周囲面積が下行環の水平断面積の好ましくは約２．５〜約５．５倍 、ぞし°Ｃさらに好ましくは約４．５倍であるように液の高さを調整することに より泡の高さが最小にされる。

本発明の方法によれば、を行部分のくすなわち、ドラフトチューブそれ自体の） 水平断面積が下行環の水平断面積の約１〜約１．５倍であるのがさらに好ましい 。

工”７−　ＩＪソフト養の期間を通して比較的安定な酸素濃度を維持するため、 本明細書中に定義した好ましい噴射速度における容器の寸法は、容器の高さ対そ の直径の比は約３７１〜約１２７１、そしてさらに好ましくは約６７１〜約７７ １の範囲である。

このような寸法において細胞の生存性及び密度を最大にする環境が形成され、こ の場合、酸素濃度は下行環内で消耗されず、そして好ましい噴射速度における適 切な撹拌及び酸素移動が容器全体に維持される。

昆虫細胞は、本発明のエアーリフト培養法により、良好な栄養環境を与えそして 前記の非毒性保護剤を含んで成る任意の培地中で増殖することができる。本明細 書において「基礎培地」とは、無機塩、糖、アミノ酸、場合によってはさらにビ タミン、有機酸及び／又は緩衝剤を含有する栄養混合物として定義される。基礎 培地は補充物質と共に細胞の生命、増殖及び再生産（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ　１ｏ ｎ）を支持するのに必要な栄養を与える。基礎培地には血清及び蛋白質、例えば アルブミンを補充することができ又は補充しない。

培地に血清及び蛋白質が補充されない場合、この様な培地は無血清と称され、そ して蛋白質を含有しないか又はほとんど含有せず、そして好ましくは（１）基礎 培地、（２）脂質／乳化剤成分、（３）ペプトン成分、及び好ましくは、（４） よく通気された条件下での保護剤、例えば前記のもの、を含んで成る。

ペプトン成分は、すべての残留プロテアーゼ、高分子量成分、又はエキソトキシ ンを除去するために限外濾過される。

この様な無血清培地のペプトン成分は広範囲の種類の加水分解された蛋白質生成 の単独又は組合わせから選択することができ、しかし好ましくは酵母エキス、さ らに好ましくはイーストレート（Ｙｅａｓｔｌａｔｅ）　（ディフコ、米国）単 独又はラクトアルブミン加水分解物（ＬＨ）との組合わせであり、約１ｇ、／ｌ 〜約１約１２矛／βまし７くは約１■／ｌ〜約８　ｇ　／　ｊ２、そし。

てさらに好ましくは３ｇ／Ａ〜約５ｇ／１２の濃度である。ペプトン成分が約４ 　ｇ　／　ｌの濃度のイーストレート（Ｙｅａｓｔｌａｔｅンのみ、又は各線２ ｇ／ｌの濃度のイーストレートとＬ　Ｈ（！−の組合わせが一層好ましい。

脂質／乳化剤成分は好ましくは、ミクロエマルジョンの形で培地に供給される。

脂質／乳化剤成分は好ましくは昆虫細胞の増殖のために必須な脂質を含んで成り 、そして好ましくは多価不飽和脂肪酸エステル、好ましくはメチルエステルの混 合物から成る群から選択され、そしてさらに好ましくはタラ肝油であり、好まし くは、約１■／ｌ〜約５０ｍｇ／ｊ２の濃度の脂溶性ビタミン、好ましくはα− トコフェロール（好ましくは約０．５■／’１〜約４■／Ｉｔの濃度）、及びス テロイド類、好ましくはステロール類、そしてさらに好ましくはコレステロール （好ましくは約１■／ｌ〜約７ｍｇ／ｆｆの濃度における）である。脂質／′乳 化剤成分中に存在する１又は複数の乳化剤には好ましくはリン脂質、さらに好ま しくはレシチン、及び非毒性非イオン性高分子洗剤（好ましくは、約５■／ｌ〜 約７５ｆｆＩｇ／ｊ’の濃度における）、さらに好ましくはポリソルベート化合 物、そし、てさらに好ましくはポリソルベート８０が含まれる。

本発明の培地においで使用することができる、高範囲の種類の商業的に入手可能 な基礎培地が存在する。この様な商業的に入手可能な基礎培地には、例えば、Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｓｓｏｃ　１ａｔｅｓから商業的に入手可能の トリプトン不含有ＴＣＩＯブロス［Ｇａｒｄ　１ｎｅｒら、Ｊ、　Ｉｎｖｅｒｔ 、Ｐａｔｈｏｌ、、　２５　：　３６３　（１９７５）、ブレース・アンセラー （Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ａｎｔｈｅｒａｅａ）培地〔νａｕｇｈｎら、ゲートウィン ＩＰＬ−２メデイウム（Ｇｏｏｄｗｉｎ’ｓ　ＩＰＬ−２Ｍｅｄｉｕｍ）。

ハンセンのメディウムＳ　−３０１（Ｍｅｄｉｕｍ　Ｓ−３０１ｏｆ　Ｈａｎｓ ｅｎ）−４１が好ましい基礎培地である。

前記のごとく、ＩＰＬ−４１が本発明の培地の調製のだめの基礎培地である。Ｊ ＰＬ−４１基礎培地は多くの業者から市販されており、そしてＷｅｉｓｓら、Ｉ ｎν１ｔｒｏ、　１７　（６）　：　４９５−５０２（Ｊｕｎｅの成分を挙げそ してそれらの比率を■／ｌで示している。これらの表を引用によりこの明細書に 組み入れる。Ｗｅｉｓｓらｉｎ　Ｖｉｔｒｏの４９７頁には完全培地ＩＰＬ−４ １の調製が記載されており、この場合、トリプトースホスフェートブロス（ＴＰ Ｂ）　及びウシ胎児血清（ＰＢＳ）が添加される。本発明の培地の調製に使用さ れるＩＰＬ−４１基礎培地は好ましくはトリプトースホスフェートブロス（ＴＰ Ｂ）を含有せず、そしてさらに好ましくはその代替成分として酵母エキス、好ま しくはイーストレート（ディフコ）、又は対応する濃度のイーストレート及びラ クトアルブミン加水分解物を含有する。

本発明のエアーリフト培養のための培地には、あらゆる種類の培養法及び条件に おいて維持された昆虫細胞を接種することができるが、しかし好ましくは、指数 増殖期にある細胞、。

すなわち非酸素制限条件及び非栄養制限条件下で維持された細胞が接種される。

本発明の方法において用いられる培地は好ましくは、細胞増殖及び生存性を増強 し、そしてそれぞれ野性型ウィルス又は組換ウィルスにより感染された昆虫細胞 からのウィルス産物又は組換え産物の生産を支持するものである。

本発明のエアーリフト培養法に従って増殖した昆虫細胞は、選択された特定の細 胞系のために適当な条件下及び温度範囲内で培養される。例えば、Ｓｆ９細胞で あるスポドブテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ ａ）細胞は約り５℃〜約３２℃、好ましくは約り７℃〜約２８℃の温度範囲にお いて培養され、そして培地のｐｉ＋は好ましくは約６〜約７．０、さらに好まし くは約６．２〜約６．４の範囲に維持される。

本発明のエアーリフト培養法により好結果に増殖することができる昆虫細胞は、 撹拌培養、例えば振とうフラスコ中で好結果に増殖するものであり、ここで培地 は１又は複数種の保護剤を含有する。従って、特定の昆虫細胞系が本発明のエア ーリフト培養法により好結果に増殖し得るか否かを決定するために簡単な試験を 計画することができ、この場合、培地が前記の非毒性保護剤を含有している小振 とうフラスコ培養において適切な増殖及び生存性規準について候補昆虫細胞を試 験する。

同様に、好結果に増殖することができ、そしてそれぞれ野性型ウィルス又は組換 ウィルスによる感染後にウィルス産物又は組換蛋白質を生産することができる昆 虫細胞は、培地が非毒性保護剤を含有している撹拌培養において増殖し、再生産 しそして組換産物又はウィルス産物を発現することが示されているものである。

ウィルス産物又は組換産物の生産のために増殖する候補昆虫細胞を前記と同様に して試験することができる。

本発明のエアーリフト培養法に従って増殖することができる候補昆虫細胞は、昆 虫網のいかなる目からのものであってもよく、好ましくはバキュロウィルス発現 系又は他の野性型ウィルスの宿主であり得るものである。好ましくは、昆虫細胞 はジブテラ（Ｄｉｐｔｅｒａ）目又はレビドブテラ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ） 目から選択される。約３００の昆虫種が核多角体病ウィルス（ＮＰＶ）疾患を有 することが知られおり、その多く　（２４３）がレピドブテラ（１，ｅｐｉｄｏ ｐｔｅｒａ）から単離された。Ｗｅｉｓｓら、ｒｃｅｌ、ｌＣｕ１ｔｕｒｅ　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｌａｒｇｅ−３ｃａｌｅ　Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　Ｂａｃｕｌｏ−ｖｉｒｕｓｅｓ　Ｊ　、　Ｇｒａｎａｄｏｓら　（編集）　 Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｂａｃｕｌｏｖｉ−ｒｕｓｅｓ　：　Ｖｏｌ、 　ＩＩ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｉｎ５ｅｃｔ 　Ｃｏｒ＋ｔｒｏｌ。

６３−８７．６４頁（１９８６）。次の昆虫に由来する昆虫細胞系が例ｐｌｕｓ ｉａ　ｎｉ）　（好ましくは細胞系ＴＮ−３６８）、アウトグラフ７”ｍｅｌｌ ｏｎｅｌｌａ）　、スボドブテラ・リットラリス　（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｌｉ ｔｔｏｌａｒｉｓ）、ジブテラ・ケルマニ力　（Ｂｌａｔｅｌｌａ　ｇｅｒｍａ ｎｉｃａ）、ヘリオチス・ゼア（ｌｌｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｚｅａ）　、スポドプ テラ・エキｐｌｕｓｉａ　ｏｕ）　、プロシア・インテルブンクテラ　（ｐｌｏ ｄｉａｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ）　、アムサエタ“モオレイ　（八ｍ５ａ ｅｔａ　ｍｏｏｒｅｉ）、ゲツム（Ａｇｒｏｔｉｓ　ｓｅｇｅｔｕｍ）　、ボン ビックス・モリ　（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒ＋）　Ｎヒボノメウタ・マリネルス　（ Ｈｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ　ｍａｌｉｎｅ−１１ｕｓ）　、コリアス−ユーり七メ 　（Ｃｏｌｉａｓ　ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ）　、アンパル（Ｐｏｒｔｈｅｔｒｉａ 　ｄｉｓｐａｒ）　ｏ好ましい昆虫細胞系はスポドブテラ・フルギペルダ由来の ものであり、そしてセルラインＳｆ９が特に好ましい。この明細書の実施例にお いて使用されるＳｆ９細胞系はＭａｘ口、Ｓｕ＋ｎ＋ｎｅｒｓ　（Ｔｅｘａｓ　 Ａ＆　Ｍ　ＩＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。

ＣｏＣｏ１１ｅ　５ｔａｔｉｏｎ、　ＴＸ　７７８４３米国）から得られた。他 のＳ。

フルギペルダ（Ｓ、ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株、例えばＩＰＬ−Ｓｆ−２１ ＡＥ　ＩＩＩがＶａｕｇｈｎら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　１３　：　２１３−２１ ７　（１９７７）に記載されている。

本発明の昆虫細胞系は好ましくは、多くの昆虫病原性ウィルス、例えばパルポリ ウィルス（ｐａｒｖｏｖ　１ｒｕｓ）、ポックスウィルス（ｐｏｘ　ｖｉｒｕｓ ）　、バキュロウィルス、ラブドウィルス（ｒｈａｈｄｏｖ　１ｒｕｓ）の再生 産のために適当であり、この内、バキュロウィルス群からの核多角体病ウィルス （ＮＰＶ）及び顆粒病（ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ）ウィルス（ＧＶ）が好ましい。

アウトグラファｓｐｐ、　（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｓｐｐ、）　、スボドブテ ラ８１１ｐ、（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｓｐｐ、）　、）リコプルシアｓｐｐ、　 （Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｓｐｐ、）、ラチブルシアｓｐｐ、　（Ｒａｃｈ ｉｐｌｕｓｉａ　ｓｐｐ、）、ガレリアｓｐｐ、（Ｇａｌｌｅｒｉａｓｐｐ、　 ）及びリマントリアｓｐｐ、　（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ　３ｐｐ、　）からのウィ ルスのごときＮＰＶウィルスも好ましい。バキュロウィルス株アウトグラファ・ カリホルニカＮＰν（ＡｃＮＰＶ）、ラチブルシア・オウ　（Ｒａｃｈｉｐｌｕ ｓｉａ　ｏｕ）ＮＰＶ、ガレリア・モルうＮＰＶ及びＡｃＮＰＶの任意のプラー ク精製された株、例えばＥ２．Ｒ９゜けられそして記載されでいる。

ヨーロッパ特許出願Ｎα１２７．８３９　（１９８４年１２月１２日公開）及び 米国特許Ｎ（１４，７４５，０５１（Ｓｍｉｔｈら）は、選択された遺伝子を宿 主昆虫細胞中で発現することができる組換バキュロウィルス発現ベクターの製造 方法を記載している。この組換えバキュロウィルス発現ベクターは野性型バキュ ロウィルスＤＮＡと共に宿主昆虫細胞に同時形質転換され、ここで組換えが起こ る。次に、ＥＰ　１２７．８３９及びＳｕｍｍｅｒｓらｒＡ　Ｍａ、ｎｕａ、ｌ 　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　 ａｎｄ　１ｎｓｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅ−ｄｕｒｅｓ　 Ｊ　（１９８６年１月１７日）に記載されている方法に従って組換バキュロウィ ルスが検出されそして単離される。次に、生ずる組換バキュロウィルスを用いて 培養昆虫細胞に感染せしめ、そして選択され導入された遺伝子からの蛋白質生成 物が該昆虫細胞により発現されそして培地中に分泌される。そのゲノムに適切な 遺伝子が導入されている組換ＡｃＮＰＶ発現ベクターにより感染されたＳ、フラ ギベルダの細胞の培養を介しての組換えβ−インターフェロン、インターロイキ ン−２及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の生産 をこの明細書において例示する。この様な組換バキュロウイノｉｐス発現系及び 組換蛋白質の発現におけるその使用に関する更なる情報はＳｕｍｍｅｒｓら、前 掲、に見ることができる。

ヨ・−ロッパ特許出願Ｎα１２７．８３９　、米国特許Ｎα４．７４５．０５１ 、及びＬｕｃｋｏｗ、　Ｖ、Ａ、（１９８８）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、６　： ４７−５５は組換バキュロウィルストランスファーベクター及び組換バキュロウ ィルスの製造方法並びに宿主昆虫細胞中で組換蛋白質を発現せしめるための組換 バキュロウィルス発現系の使用方法を可能にしている。このヨーロッパ特許出願 、米国特許及び刊行物の記載を引用によりこの明細書に組み入れる。

本発明のエアーリフト培養法により製造することができる組換え産物の特定の例 は、ＡｃＭ４又はＡｃＭ６のごとき組換えバキュロウィルスにより感染されそし て本発明の方法に従って培養された宿主昆虫細胞により生産され得る組換えＣ３ Ｆ−１である。しかしながら、この開示及び引用により組込まれた前記の公表の 恩恵を受ける当業者は本発明に従って組換えバキュロウィルスにより感染された 昆虫細胞により他の多くの組換え蛋白質を製造することができることを認識する であろう。

ＢＥＶＳを介して昆虫細胞中で発現されている他の異種蛋白質は３ｕｍｍｅｒｓ ら、　ｒＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｏｍ ｅ　ｏｆ　ｔｈｅ％　ｃｕｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅ ｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　Ｊ　。

Ｖｏｌ、８．２７７−２９８；Ｓｅｔｔｏｗ及びｌｌｏｌｌａｅｎｄｅｒ編集、 Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。

ニューヨークに記載されている。組換え蛋白質の例には、制限的ではなく、コロ ニー刺激因子１、例えば長い形又は短い形のＣ３Ｐ−１（下記）　、Ｇ−Ｃ３Ｐ 　、特許ＧＭ−Ｃ３Ｆ　、　イン９−フヱロン（α、β及びγ、並びにこれらの バイブリド、インターロイキン類、腫瘍壊死因子、エリスロボイエチン、ヒト成 長ホルモン、さらにブタ、ウシ及び他の成長ホルモン、上皮成長因子、インシュ リン、修飾されたプロウロキナーゼ又はウロキナーゼ、ティシュプラスミノーゲ ン活性化因子（ＴＰＡ）、ＴＰＡ−ウロキナーゼバイブリド、肝炎Ｂワクチン、 スーパーオキシドディスムターゼ、ファクター■、心房ナトリウム利尿因子、ネ コ白血病ウィルスワクチン、例えばｇｐ７０ポリペプチド、毒性蛋白質、例えば 全体リシントキシン、リシンＡ鎮、リシンＡ含有生成物、他のレクチン類、例え ばリシン・リア毒素、ゲロニン、シュードモナス・アエルギノーサ蛋白質（ＰＡ ＰＩ　、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−３）　、ハシｙｔｔｘ−ｆニーＩＪンジェンシ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｒ＋ｇｉｅｎｓｉｓ）からの殺虫性蛋白質、 多くの酵素、例えばＣＡＴ、ならびに無数の他のバイブリド蛋白質が含まれる。

［コロニー刺激因子（Ｃ３Ｐ−１）　ＪはＣ３Ｆ−１について当業界において理 解されている活性のスペクトルを示す蛋白質を意味する。すなわち、Ｍｅｔｃａ ｌｆ、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　ｒ’ｈｙｓｉｏ１．７６：　８９（１９７０）の標準的 なコロニー刺激アッセイに適用した場合に、このものは−次的マクロファージコ ロニーの形成をもたらす。

生来のＣ３Ｐ〜１はグリコジル化された二量体であり、活性のために二量体化が 必要である。本明細書においてＣ５Ｆ−１なる用語は二量体形及び単量体形の両 者を意味する。

ネズミＣ５Ｆ−１はヒトの細胞に対して活性を示さないが、ヒ）Ｃ３Ｆ−１はヒ ト及びネズミの両者の骨髄細胞に対して機能する。従って、ヒトＣ５Ｆ−１はＤ ａｓら、Ｂｌｏｏｄ、　５８　：　６３０（１９８１）の特異的ネズミラジオリ セブターアッセイにおいて陽性のはずである。この蛋白質の生物学的活性はまた ヒト尿Ｃ３Ｆ−１に対する中和抗血清により阻害される（Ｄａｓら、前掲）。

Ｃ５Ｆ−１は成熟マクロファージからの一連のＥプロスタグランジン、インター ロイキン−１及びインターフェロンの分泌を刺激する。Ｍｏｏｒｅら、５ｃｉｅ ｎｃｅ、　２２３：　１７８　（１９８４）。しかしながら、骨髄細胞を用いる 単球／マクロファージコロニーの形成を刺激する蛋白質の能力及び精製ヒト尿Ｃ ５Ｆ−１に対する中和抗血清による阻害に対する感受性並びにラジオリセブター アッセイ（ＲＲＡ）又は常用のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に対する陽性応 答を用いて、組換えバキュロウィルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を介して昆虫 細胞により生産されたＣ５Ｆ−１を同定することができる。

１９８８年５月５日に公開されたＰＣＴ公開ＮｏＷＤ８８／　０３１７３に記載 されているように、生物学的に活性なＣ５Ｆ−１の生産はグリコジル化及び二量 体化を含む高度の翻訳後プロセシングにより複雑化される。Ｌｕｃｋｏｉｕ、　 Ｖ、Ａ。ら（前掲）に示されているように、コロニー刺激因子が培地中に分泌さ れることが明らかである。生産されたＣ３Ｆ蛋白質の分子量はシグナルペプチド が開裂されていることを示している。この生成物はまたグリコジル化されるらし い。

短い形及び長い形を含む種々の形のＣ５Ｆ−１が記載されてＭｅｔｃａｌｆ、前 掲、を参照のこと。組換えＣ３Ｆ−１及びｃＤＮＡにコードされた形に対応する ミューティンが、１９８６年８月１４日に公開されたＰＣＴ公開ＮｎＷＤ８６１ ０４６０７．１９８８年５月５８に公開されたＷＯ３８１０３１７３、及び１９ ８７年１１月１９日に公開されたＩｔ、’０８７１０６９５４に開示され、特許 請求されている。

Ｃ３Ｆ−１遺伝子を含有するバキュロウィルストランスファーベクターｐＡｃＭ ４及びｐＡｃＭ６を用いて、バキュロウィルスＤＮＡとのＳｆ９細胞への同時ト ランスフェクションにより、組換バキュロウィルスＡｃＭ４及びＡｃＭ６を調製 した。大腸菌に入れたこの組換バキュロウィルストランスファーベクターｐ　Ａ 　ｃ　ＩＡ　４及びｐＡｃＭ６はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　（ＡＴＣＣ）。

１２３０１バークラウンドライブ、ロックビル、　ＭＯ２０８５２（米国）にそ れぞれＡＴＣＣＮα６７４２８及びＮα６７４２９とし７で１９８７年６月１２ 日付で寄託された。これらのベクターはまた、Ｃｅｔｕｓ　ＭａｓｔｅｒＣｕｌ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＣＭＣＣ）にそれぞれＣ１，！［：ＣＮｎ ３００２及びＣＭ　ＣＣＮα２９９６として寄託されそして維持されている。

組換バキュロウィルスＡ　ｃ　Ｍ　４はｒＣＳＦ　−１の１５０アミノ酸形をコ ードするヌクレオチド配列を担持し、他方、組換バキュロウィルスＡ　ｃ　ｌ、 （６はｒＣＳＦ　−１の５２２アミノ酸形をコードするヌク１／オチド配列を担 持する。

ｐＡｃＭ４は、変異したＣ３Ｆ−１，ｃＤＮＡ断片をｐＡｃｃｌにクローニング することにより作製されたインアレーン、（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）翻訳可能な融合 ベクターである。ｐＡｃｌＯはｐＡｃ４０１　（Ｌｕｃｋｏｗ、　Ｖ、Δ。

ら、前掲により記載されている）に類似しているが、ＥｃｏＲＩエンドヌクレア ーゼの認識部位が除去されている。これを達工の不存在について候補をスクリー ニングした。　ｃｓｐ・−１ｃＤＮＡ断片の起源はＰＣＴ公開ＮαＷＯ３６１０ ４６０７に記載されているｐｃｓＦ　−ｇｌｙ１５０であり、このものは１５１ 位のヒスチジンコドンの代りにＴ　Ｇ　Ａ終止コドンを含有する。さらにＳｍａ 　Ｉ認識部位が部位特定変異誘発により、Ｃ５Ｆ−ｇｌｙ１５０コード配列のＡ 　’ｒ　Ｇ翻訳開始コドンの３ｂｐ後に導入された。

従って目的の構成物ｐＡｃＭ４は無傷のポリヘトリン遺伝子プロモーター及びＣ ３Ｆ−１シグナルペプチド中の３個の変化したコドン以外の５′−非翻訳リーダ ーを含有する。Ｍｅｔ　−Ｔｈｒ−Ａｌａ　−Ｐｒｏ−Ｇａｙ・・・ではなく、 この構成物の配列はＭｅｔ　−Ａｒｇ−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｙ　−をコー ドする。　Ｃ３Ｆ−１５’　−非翻訳リーダー配列が除去され、Ａ、　Ｔ　Ｇ翻 訳開始部から５′側の配列のすべてがＡｃＮＰＶポリヘトリン遺伝子に由来する 。

ｐＡｃＭ４（セクションＢ、３に記載）から２５０ｂｐ　Ｓｔｕ　Ｉ断片（ｐｃ ＣＳＦ−１，７配列中の位置５１１−８２１ｂｐ）を切除し、これをｐｃＤＢｈ ｕＣ３Ｆ−４からのＳｔｕ　Ｉ断片（Ｃ３Ｆ−４配列上の位置３４３−１４．８ ４ｂｐ）で置き換えることによりｐへｃＭ６を作製した。

ｐｃＤＢｈｕＣ３Ｆ　−５からの１．１４１ｂｐ　Ｓｔｕ断片は短いｐｃＣＳＦ −１７Ｃ３Ｆ配列のアミノ酸１０１内からアミノ酸１８４内までの配列を含有し 、さらにアミノ酸１４９の後に挿入された２９８アミノ酸のための追加のコード 配列を有する。別の言い方をすれば、生ずる構成物ｐＡｃＭ６はｐＡｃＭ４中に 存在するのと同じ５′及び３′配列を有し、さらにＣ３Ｆ−１コ一ド配列内に挿 入されたｐｃＤＢｈｕ［：ＳＦ　−４からの追加のコード配列の追加の８９４ｂ Ｐを有する。

組換バキュロウィルスによる昆虫細胞の感染の時期の効果が比生産性の増強のた めに重要であることが示された。組換蛋白質の比生産性は非酸素制限条件下での 細胞増殖の指数期を通して一定であることが見出された。非指数増殖条件下での 遅い感染は低い比生産性及び低い最終力価をもたらす。組換蛋白質産物の最高の 全生産性を達成するためには、指数増殖期を可能な最高細胞密度になるまで延長 するのが好ましい。

増殖を制限する条件下、例えば細胞増殖の定常期、にあける宿主昆虫細胞の感染 は組換え蛋白質産物の比生産性の低下をもたらす。

培養物が指数増殖期にある限り、組換え蛋白質の比生産性は感染時の細胞密度か らは比較的独立である。例えば、スボドプテラ・フルギベルダ細胞が宿主昆虫細 胞である場合、組換バキュロウィルスによる感染のためには約１．０〜約４．０ ×１０″細胞／ｒｒＬ１．が好ましく、約２．５〜約３．５Ｘ１０’細胞／献が さらに好ましい。

組換蛋白質産物の収得の時期は、ウィルス蛋白質及び細胞溶解蛋白質による組換 蛋白質の汚染を回避しそしてそれによって組換産物の下流精製を簡単にするため に重要である。産物の安定性を考慮して、有意な細胞溶解が起こる前に組換産物 を採取するのが好ましいであろう。さらに、本発明の方法及び培地に従って生産 されるべき組換蛋白質又はウィルス産物は発酵の過程にわたって安定性及び分解 についてチェックされるべきである。最適収得時期の決定においてこれらの考慮 がなされるべきである。

次の実施例は、本発明の工’７　！Ｊソフト養法をさらに説明する。これらの例 は本発明を限定することをなんら意味するものではない。

実施例１゜ この実施例は、本発明のエアー、　ＩＪラフト養培地及び方法のための適当な保 護剤の選択のためのモデル的な小規模振とうフラスコ培養法を提供する。この実 施例において記載される特定のパラメーターはずべての昆虫細胞系のためには適 当でないかもしれない。特定の昆虫細胞系について、保護剤を用いない対照培養 において崩壊／環形成現象が１又は２日以内に起こるのに撹拌が十分であるよう な条件を見出すべきである。

１、Ｘ］、０５細胞／ｒｎｌテ接種されたｓｆ９ノ１ｏｏＷＬｅノ培養物２本を 、１００〜１５０ｒｐｍ　（２分の１インチの回転半径を有する）にて撹拌され た２　５０ｒｄの振とうフラスコ中で約２７℃にて増殖せしめた。１つの培養物 、すなわち対照培養物は９．１％ウシ胎児血清及び４ｇ／！ｉイーストレート（ ディフコ）を補充したＩＰｌ、−４１基礎培地中に維持し、他方試験培養物は対 照に相当するがしかし保護剤プルロニックＦ６ｇを０．１％（重量−容量）濃度 で含む培地中に維持した。

次にこれら２つの培養物を増殖及び生存性について観察し７た。約３６時間の後 、対照培養物は崩壊／塊形成現象を示し、細胞は増殖せず、トリトンブルー排除 により決定する場合死んでいた。保護剤を含む試験培養物は９９％より高い生存 性をもってよく増殖し、そして５日目までに約５Ｘ１．０６細胞／ｍｌの細胞密 度に達し、た。

衷施毀ζ この例は、スボドブテラ・フルギベルダ細胞（ＳＦ３）が２５１のエアーリフト 発酵槽において９Ｘ１０’細胞／７７Ｉｊ２から５×１０６細胞／ｒｎＩ！、に 好結果に増殖することを示す。これに対して、２．４１回転フラスコはわずか１ ．５　Ｘ　１０’細胞／蔵の細胞密度に達した。Ｓｆ９エアーリフト培養物は２ ３〜２９時間の倍化時間及び９７％を超える生存性をもって増殖した。

Ｓｆ９細胞の静置培養物を、トリプトースホスフェートブロス　（２，６ｇ／β ）及び９．２％熱不活性化ウつ胎児血清を含むＩＰＬ−４１完全培地であって０ ．１％プルロニツタボリオール（プルロニックＦ６８）を添加したものに移行し そしてその中に維持した。この培地を、この例において記録されるすべての実験 のために使用した。懸濁培養物を６Ｏｒｐｍ　、室温（２６℃〜３２℃）にて回 転フラスコ中に維持した。コールタ−・カウンターにより増殖をモニターした。

細胞の生存性をトロパンブルーバイタル染色及び顕微鏡計測により決定した。は とんどの場合に生存性は９９％であった。この明細書において言及される細胞密 度は生存細胞カウントである。

表面／体積比が０．２５ｃＩＩｆ　／　ｒｒｄｌの１００一回転フラスコ〔ベル コ・カタログ（Ｂｅ１．］ｃｏ　Ｃａｔａｌｏｇ）＃１９６５００１００　）に １ｘｉｏ５細胞／献で、６日間の静置培養から再懸濁されたＳｆ９細胞を接種し た。９６時間の増殖の後（１，４Ｘ］、０’細胞／　ｍｈ　、培養体積は１００ 蔵から５０ｍＪｌ！に減少し、これにより表面／体積比は倍化した。

２．４１の培養物を３１の回転フラスコ（ベルコ・カタログ＃　１９６５０３０ ００）中で約０．０８４ｃＩＩｌ／ｒｒｄ！、の表面積／体積比で増殖せしめた 。最初の細胞密度は指数増殖期の最中の５００ｍ１．回転フラスコから接種され た１、、、　４　Ｘ　１０５細胞／ｄであった。

２５βのケマプ（Ｃｈｅｍａｐ）工”Ｔ−リフト発酵槽（カタログＮａ９１００ １６７４−０６＞に、３β回転フラスコ中で指数増殖後期（９，３×１０５細胞 ／蔵）に増殖したＳｆ９細胞を９Ｘ１０’細胞／　ｍｅで接種した。最初の培養 体積は２２１であった。発酵槽を２８℃にて運転した。窒素及び酸素を培養体積 当り分当り０．０２全ガス流体積（およぞ、１分間当り０．４ｊ２＞で噴射する ことにより撹拌を維持した。噴射ガス中の酸素濃度を調節することにより溶存酸 素を約２０％の空気飽和で維持した。

１．００ｄ回転培養の増殖曲線は、細胞密度が５Ｘ１０’細胞／蔵を超えて平ら になり生存率が９７〜９９％であることを示した。

この小回転培養は、低い体積対表面積比のために比較的良好な酸素移動性を提供 すると予想された。細胞増殖は２．７　Ｘ　１．０’細胞／ｄまでおよそ指数的 であった。倍化時間（Ｔｄ）は１９〜２５時間であった。５．３　Ｘ　１０’細 胞／ｒｒＬ１．において、栄養の枯渇に基く細胞増殖の停止が生じた。

２．４１回転培養の増殖曲線が示すところによれば、増殖は５Ｘ１０’細胞／ｄ までおよそ指数的であり、倍化時間は２４〜２８時間であった。細胞増殖は８Ｘ １０’細胞／ｍｌの上で線状となった。培養物が１．５　Ｘ　１．０’全細胞／ ｍｌに達する前に培養物の生存性が有意に低下し、そして生存細胞密度のピーク はほとんど１．２　Ｘ　１０’細胞／　ｍｌに達した。直線的（指数的に対して ）な細胞密度の増加は酸素制限を示すものである。体積の増加に伴う少い酸素移 動が、１．００ｍ１回転培養に比べての２．４β回転培養の低い性能の理由であ ると考えられた。

２５Ｉｌケマ７’　（Ｃｈｅｍａｐ）エアーリフト発酵槽での増殖曲線が示すと ころによれば、細胞の増殖は１００ｒｄ回転培養において見出されるそれに類似 していた。細胞密度は約５Ｘ１０’細胞／−においてピークとなり、生存性は９ ７％であった。ｌＸｌ０’細胞／Ｔｎｌまでの指数増殖期は２４時間のＴｄを有 し、その後３、６　Ｘ　１．０’細胞／ｒｒＬ１．までＴｄは２９時間であった 。細胞密度は、小規模１００ｍｆ回転培養において見られるのと近似のレベルま で増加した。

前記のごとく、小回転培養（１００ｍｆ）及びエアーリフト発酵槽培養の両者は 、９７〜９９％を生存性で約５Ｘ１０’細胞／ｍ１．のピーク細胞密度を有して いた。他方、２．４１回転培養は、わずかに１．２　Ｘ　１０６細胞／ｍｊ２の 生存細胞密度を達成した。

結論 要約すれば、本発明のエアーリフト培養法及び培地は、昆虫細胞が噴射培養にお いて、特にエアーリフト発酵槽において、高い生存性をもって大規模に高細胞密 度に増殖することを可能にする。さらに、本発明の方法は、細胞が野性型ウィル ス又は組換ウィルスにより感染された場合に培養物からウィルス産物又は組換え 産物を好結果に生産するように昆虫細胞培養をスケールアップする手段を提供す る。

寄託 前記のごとく、大腸菌／ＭＭ２９４中の組換バキュロウィルストランスファーベ クターｐＡｃＭ４及びｐＡｃＭ６は１９８７年６月１２日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ 　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）、　１２３ ０１パークラウンドライブ、ロックビル、Ｍ０２０８５２　（米国）にそれぞれ ＡＴＣＣＮｏｓ、６７４２９及び６７４２８標示のもとに寄託された。

上記寄託はＡＴＣＣと本特許出願の承継人シタス・コーポレイションとの間の契 約により行われた。ＡＴＣＣとのこの契約は、該寄託を記載しそして特定するこ の出願に関する米国特許の発行の後、又は米国特許出願もしくは外国特許出願の 公衆への公告又は公開の後、いずれか早く到来した後に前記株又はその子孫の永 久的入手可能性を公衆に与え、そして３５　ＵＳＣ。

１２２及びそれに基く長官規則（８８６０Ｇ　６３ｇへの特定の言及を伴う３７ 　ＣＦＲ，１，１４を含む）に従って米国特許商標庁長官により決定された者に 前記株及びその子孫の入手可能性を与える。

本出願の承継人は、適切な条件下で培養された場合において寄託中の株が死滅し 又は失われもしくは破壊された場合に、通知の後にそれが同じ株の生存培養物に よりすみやかに置き換えられるであろうことを認めた。

ブダペスト条約のもとての寄託は、寄託された微生物のサンプルの分譲の最新の 要求がＡＴＣＣにより受理された後に少なくとも５年間汚染されない生存状態で 前記寄託された培養物が維持され、そしていかなる場合も、寄託の日から少なく とも３０年間維持されることを保証する。

寄託された株の入手可能性は、いずれかの政府の権威のもとにその特許法に従っ て認められた権利に反して発明を実施する承諾であると解してはならない。

さらに、寄託されたベクターは本発明の特定の観点の常なる例示であると意図さ れるから、本発明の範囲が寄託された組換えトランスファーベクターにより制限 されると考えるべきではない。組換え蛋白質産物を生産するために宿主昆虫細胞 に感染するように機能することができる組換バキュロウィルスを調製するために 使用され得るあらゆる組換えバキュロウィルストランスファーベクターが本発明 の範囲内にあると考えられる。さらに、前記の記載から当業者に明らかなように 記載されそして示されているものに加えて本発明の種々の変更が添付された請求 の範囲に属すると考えられる。

手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２４４４ ２、発明の名称 エアーリフト昆虫細胞培養 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　シタス　コーポレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話５０４ −０７２１５、補正命令の日付 平成２年１１月６日（発送日） ６、補正の対象 明細書及び請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） ８、添附書類の目録 明細書及び請求の範囲の翻訳文　各　１　通国際調査報告 １″＋ｅ″＋−１幻ｅｌｃｕｌ−Ｎａ、　、、、、ヒｓεεｒ’０２”Ｌ〜国際 調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．昆虫細胞を高生存性をもって高細胞密度に培養する方法であって、酸素が噴 射により培養物に供給される方法。
2. ２．高生存性をもって高細胞密度に昆虫細胞を培養するためのエアーリフト培養 法。
3. ３．培地が１又は複数の非毒性保護剤を含有する、請求項２に記載のエアーリフ ト培養法。
4. ４．前記保護剤が、よく通気された条件下で増殖した昆虫細胞の崩壊／塊形成現 象を回避するために作用する、請求項３に記載のエアーリフト培養法。
5. ５．前記保護剤が、よく通気された培養条件下で損傷及び死滅から昆虫細胞を保 護するために機能的に作用する非毒性の可溶性化合物である、請求項４に記載の エアーリフト培養法。
6. ６．噴射される気泡の直径が約０．２ｃｍ〜約２．０ｃｍである請求項１に記載 の方法。
7. ７．噴射速度が約０．０１〜約０．０８ｖｖｍである請求項１に記載の方法。
8. ８．使用されるエアーリフト容器の高さとその直径との比が約３／１〜約２／１ の範囲にある、請求項３に記載のエアーリフト培養法。
9. ９．昆虫細胞の増殖及び再生産、並びに該細胞が野性型ウイルス又は組換バキュ ロウイルスにより感染された場合にはウイルス産物又は組換え産物の生産を支持 する、請求項３に記載のエアーリフト培養法。
10. １０．１又は複数の保護剤を含んで成る、昆虫細胞のエアーリフト培養のための 培地。
11. １１．血清が補充されているか又は補充されていない基礎培地をさらに含んで成 る請求項１０に記載の培地。
12. １２．血清が補充されておらず、そして脂質成分及びペプトン成分を含んで成る 請求項１１に記載の培地。