JPH03500888A - 中性子捕獲療法剤およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 中性子捕獲腫瘍療法用リポソーム封入化合物のための組成物および使用法 ［１，発明の分野］ この発明は、広義には腫瘍処置のだめの組成物および方法に関するものであり、 具体的には、中性子捕獲療法においてリポソーム封入化合物を用いて腫瘍を処置 するための組成物および方法に関するものである。

［２１発明の背景コ 中性子捕獲療法はがんの治療、特に悪性腫瘍の処置において注目を集めている方 法である。一般的方法としては、大きな中性子捕獲断面積をもった適当な原子核 により熱化中性子（通常、特別な減速剤およびボートを備えた原子炉による）を 捕獲することを含む。引続いて起る崩壊によりエネルギー粒子（アルファ粒子） が放出され、これは近傍の腫瘍細胞を殺すことができる。例えば、はう素１ｏは この種の適当な原子核をもち、そのためこの図式において特に有利な性質を有す る。このほう素１０の熱化中性子捕獲反応は下記の通りである（星印はほう素原 子核の不安定な中間状態を示す）。

”Ｂ　＋　Ｉｎ−−−＋［目Ｂ］＊　−−−’Ｌ　ｉ（０、８７Ｍｅｖ）＋　’ Ｈｅ（１、５２Ｍｅｖ） この療法を有効にするためには、必要とする粒子密度を得るに充分な”Ｂが局在 化されなければならない。この濃度は、約１Ｏ−５０μｇ”Ｂ／腫腫瘍クラム間 で種々の推定がなされている。さらに、正常組織および血液中の゛°Ｂ濃度は制 限すべきであり、健康な細胞および血管の傷害を減らすために腫瘍中の濃度より 低いことが好ましい。ハタナカ（１９８６年）、ボロン・ニュートロン・キャプ チュア・セラピー・フォー・テユマー、ニジムラ・カンパニー・リミテイッド、 １−１６頁参照。

多数のほう素含有化合物が、上記の要件を満足する能力について試験されてき１ こ。少数の例外を除いて、これらはすべて、充分な量のほう素が腫瘍に局在化さ れず、血液濃度が効果的な中性子捕獲療法には高すぎる点で、不満足であった。

日本でなされたＮ　ａ　！　Ｂ　＋　２ＨＩ＋ＳＨによるひと臨床実験で若干の 裏付けを得たが、脳腫瘍の限られたグループに対してでしかなかった。（グリオ ーマ）前掲１６−２６頁。

高濃度でＩＯＢを腫瘍に送達する一般的方法が得られるならば、中性子捕獲療法 の有用性は大きく拡大されると思われる。さらに、”Ｂが血液中よりも腫瘍に多 く集まるならば、有用性が増すと思われる。最近、特定の組成と構造をもつリポ ソームを用いて薬剤または他の化合物を選択的に腫瘍に送達することが可能にな った。例えば、係属中の「ひとの腫瘍を標的にする方法」と題するベスター、イ ンコーポレイティッドの特許出願第６７４２０１号（これヲ引用して本明細書に 包含させる。これは、中性子捕獲療法の成功に必要な量に較べて１０万倍少ない 低濃度で放射性薬剤をとり込むことを記載している）参照。効果的な中性子捕獲 療法に必要な、リポソームの外側より高浸透圧の内側への化合物取込みは、従来 達成されたことがなく、過剰の浸透圧によりリポソームが破壊され、および／ま たは内容物が漏出すると思われるため不安定な状態だと考えられていた。リポソ ームを用いる中性子捕獲療法の成功は、その後にリポソームの有利な生体内分布 特性を実質的に損なうことなく出来る限り高濃度の”Ｂをとり込ませることの成 否にかかつている。これは、実用可能な最高数のほう素原子を有する化合物を用 い、また安定で腫瘍を標的にできるリポソームに調和する最高限の濃度でリポソ ームにほう素をとり込ませることによって、達成可能となる。この発明により、 動物における生体内分布行動を良好な状態に保ったまま高浸透圧溶液を安定に封 入できることが見出だされた。すなわち、腫瘍組織１グラム当り少なくともＩＯ μｇの”Ｂをもつ目的物が得られた（９０％以上の１０Ｂ強化物質を使用すると 仮定）。したがって、この発明は、特別な剤形のリポソームであって、予期せざ る高濃度のほう素含有化合物を封入し、静脈注射または腫瘍に血液を供給する動 脈への直接注入後に腫瘍組織に集まるリポソームを使用する方法を提供するもの である。はう素含有化合物が腫瘍組織に充分蓄積できる時間後、患者に中性子捕 獲療法に有効な中性子をもつ放出する発生源を作用させることができる。

［発明の概要］ この発明の目的は、中性子捕獲腫瘍療法に使用するための、腫瘍にほう素含有化 合物を治療上有用なま度で送達する方法を提供するこの発明の別の目的は、顕著 な破壊を伴なわずにリポソーム内にほう素化合物濃度を保持する性質を有する、 はう素含有化合物封入リポソーム製剤を提供することである。

この発明の他の目的は、血液濃度は低下させ、動物およびひとの腫瘍に対しては 腫瘍組織当り少なくともｌＯマイクログラムのＩｏＢを送達する手段として、リ ポソーム封入はう素含有化合物を用いるがん治療法を提供することである。

［発明の詳細な記載コ リポソームは、一部りん脂質を含む顕微鏡的構造の物体である。

このようなリポソームを作る方法は、現在までに当技術で周知であり、これらの 任意の方法をこの発明で用いることができる。りん脂質は、グリセリンと縮合し た２個の脂肪酸鎖からなり、グリセリンハリん酸エステルの頭頂基からなる別の 置換基をもっている。この発明者は、ある種のりん脂質分子をとり込ませること により、インビボで安定なリポソームが得られることを見出した。相転移点が炭 化水素鎖の長さの関数であることは知られている（Ｃ・ランボード・ザ°″イド ロホービック・エフェクト２版、１９８０年）。アル種のりん脂質分子は比較的 高温（３７℃超）で相転移を示すが・この発明者は、ここに記載の組成物にこの ようなりん脂質を用いるとインビボの安定性が改善されたリポソームをもたらす ことを見出だした。

水和したとき、りん脂質は２層構造を形成し、その脂肪酸の炭化水素尾部を内側 に向け、極性頭頂基を外側に向ける。水和したりん脂質のけんたく液を撹拌する と、小さな玉ねぎ様のマルチラメラ小胞（ＭＬＶ）を形成し、多数の２層を水が 隔てる。ＭＬＶのけんだく液に超音波作用のようなせん断力を適用すると、平均 直径が一般に３３０−２００ｎの寸法範囲にある単一２層小胞（ＳＴｊＶ）を生 ずる。別の脂質をりん脂質に組合わせると、特定の性質をもったリポソームを生 ずることができる。具体例をあげると、コレステロールのようなステロール類は 、血しょう中での漏洩および破壊に対して２層構造を安定化させるのに役立つ。

安定なリポソームは、りん脂質の重量の５−５０％のコレステロールをリポソー ムに含ませることによって作ることができる。荷電した脂質または特定のリガン ド機能をもつ脂質も含ませることができる。

ジステアロイルホスファチジルコリン（Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ｃ）およびコレステロール を含むＳＵＶは、放射性化合物を腫瘍に送達するのに特に有利である。

この発明に適当な、熱化中性子に対する大きな捕獲断面積を示すほう素以外の非 放射性同位体が存在する。すなわち、３Ｈｅ、１４１１３ｍ、２３５Ｕ、　”Ｌ ｉ、Ｉ　１３　ｃ　ｄ、１５５．１５７Ｇｄである。しかし、リチウムとウラニ ウムを除き、上記リストの他の元素は熱化中性子吸収後にガンマ線を生ずる。生 成するガンマ線は標的細胞内に閉じ込められないので、この発明に使用すること は確かに可能ではあるが望ましいものではない。

使用するほう素化合物は、１分子当り２個以上のほう素をもっことがてきるが、 １分子当り少なくとも１０個のほう素原子を含むのが好ましい。はう素の同位体 含量は、天然存在量の”８　１９．７８％から高富化化合物の１０Ｂ９５％以上 にわたることができる。天然存在量の物質は、カプセル封入、生体内分布、安定 性等の研究に有用である。高富化物質は、実用できる最高限の１０Ｂが要求され る治療用に有用である。

好ましいほう素含有化合物は、水溶性が高く、生理学的ｐＨでほとんどまたは全 く荷電がなく、リポソームのりん脂質２層に比較的透過性がなく、治療対象に非 毒性または低毒性のものである。例としては、ｐＪａ２Ｂ１ｏＨ＋ｏ、ＮａｔＢ ＋ｔＨ＋ｔｓ　ＮａｚＢ＋ｙＨ＋＋ＳＨおよびＮａｔＢ＋ｏＨ＋ｌｌがある。１ 分子当り少なくとも１０個のほう素原子をもつほう素化合物の場合、リポソーム の内側で少なくとも２５０ｍＭの濃度が必要である。勿論、１分子当りのほう素 原子がより少量ならば、より高濃度が必要となる。

１つの好ましい態様において、リポソームはＤＳＰＣとコレステロール（モル比 ｌ：１）の混合物から作られる。乾燥した脂質膜を、ＮａｔＢ＋。Ｈ３゜の水溶 液で水和させる。超音波または適当なホモジナイズ技術により溶液にせん断力を 適用して、平均径が２Ｏ０ｎｍ未満で好ましくは３３０−１Ｏ０ｎの小さな単ラ メラ小胞を生成させる。

封入されなかったＮａｔＢ　１ｏＨ＋ｏを、りん酸緩衝食塩水または乳糖（浸透 圧が生理学的な値にほぼ等しいもの）で平衡化したセファデックスＧ−２５−８ ０カラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィーによりリポソームから分離する。

生成するリポソーム溶液は、３．５か月の期間にほう素含有物質の１０５未満が 漏出する程度であり、内側の物質の漏出に関して安定である（第２および第３表 参照）。

内側に放射性トレーサーとして２５０ｍＭのＮａｔＢ　＋ｏＨ＋。および”’Ｉ ｎ−ＥＤＴＡを含むコレステロールＤＳＰＣリポソームを、Ｂａ１ｂ／ｃマウス の尾静脈に注入する。動物には、予じめ右脇腹にＥＭＴ６踵瘍細胞を皮下に移植 しておく。種々の時点で動物を殺し、血液、腫瘍、肝臓および膵臓を、ガンマ線 レベルの測定によりＩ　Ｉ　１１　ｎ化合物浸度について試験する。Ｉｎ−ＥＤ ＴＡ錯体がＢ　、ｏＨ、。′と同様に行動する場合、放射性トレーサーはほう素 化合物の生体内分布を示す・結果は、中性子捕獲療法で治療効果をもたらすに充 分なレヘルでほう素−１Ｏが腫瘍に送達され得ることを示す。

：、、）発明（よ、１分子当りのほう素原子数が少なくとも２個で好ましくは１ ０個以上の上記以外のほう素化合物、およびリポソーム内のほう素濃度を減少さ せるようなポリマー性はう素化合物にも拡張される。この発明は、はう素含有リ ポソームを投与し、その後患者を中性子放出源にさらすことによる、中性子捕獲 腫瘍療法の実施法をも包含する。このような放出源は、例えばラッセル・ジュニ ア等の米国特許第４５１６５３５号に記載されている。

水中でのＮａｔＢ＋。Ｈ３゜の製造 （普通の同位体存在率の場合） ＮａｔＢ　＋ｏＨＩＱは当業者に既知の方法によりＢ、。Ｈ３゜のビス−トリエ チルアンモニウム塩から製造された。

Ｂ、。Ｈ３゜のビス−トリエチルアンモニウム塩はＭ、Ｆ、ハードン、Ｒ，Ｌ、 ピリング、インオーガニック・シンセシス、９巻１６頁（１９６７年）（引用し て本明細書に包含させる）に述べられている製法により合成された。

リポソームに封入したＮａｚＢ＋。ＨＩＯの製造１５村ガラス試験管に、ＣＨＣ １３／メタノール５．Ｏｘｆ！中に入れたＤＳＰＣ（アバンティ・ポーラ−・リ ピッズ、バーミンガム、アラバマ月６６２９およびコレステロール（カルバイオ ケム、サン・ディエゴ、カリフォルニア）（モル比ｌ：１）を加えた。溶液を窒 素気流下で蒸発させ、管の内側にフィルムを形成させた。管は少なくとも１２時 間真空下においた。この管に２５０　ｍＭ　ＮａｔＢ　＋ｏＨ１０蒸留水溶　・ 液５．ＯｙＱを加えた。２５０　ｍＭ　ＮａｚＢ　＋ｏＨｒｏ溶液の浸透圧モル 濃度はオスモメーター（モデルＯＷ２、アドバンスト・インストルメンツ、ニー ドハム・ハイツ、マス）で別に測定し、７３０　ｍｏｓｍ／（！であると計測さ れた。水和脂質試料をミクロチップに対して出力を最大に設定したミクロチップ で「ソニック・アンド・マテリアルス・ビブラセル・プローブ・ソニケータ」を 使って音波処理をした。

溶液を６５℃、窒素気流下に保ち１５分音波処理をし几。その後試料を室温まで 放冷した。方法は第２試料で繰り返した。

生成したリポソーム試料を、５ｍＭりん酸塩ｐＨ７，５を含む０゜９％生理食塩 水（ＰＢＳ）または９０ｘｇ７／Ｑラクトース中で平衡化させたセファデックス Ｇ−２５−８０カラム（１０Ｘ］ｃｍ）に個別に通した。カラム中の両方の液は ２９５ｍＯＳｓ／１２浸透圧モル濃度であった。リポソームは真空下で溶出させ 、その方法により外側のＮ　ａ　２　Ｂ、。Ｈ３゜をＰＢＳまたはラクトースに 変換させた。リポソームを含む分画がカラムから集められた。

リポソームカプセル化したＮａｔＢ＋ｏＨ＋。の大きさの測定リポソームの大き さは、ニコンプ・モデル２７０レーザー光散乱ユニツトを使って動的光散乱によ り測定しｆ二。試料の２０μπ容量を測定用りん酸緩衝液（ＰＢＳ）７５０μｇ で希釈した。ガウス分布モードの結果を第１表に示す。

第１表 試料　平均直径（容＠） ＰＢＳ　６９．８ｎｍ ラクトース　７５．３ｎｍ ＮａｔＢ＋ｏＨ＋。のカプセル化した濃度Ｊ’ＪＢ、Ｂ、、Ｈ，ｏのカプセル化 した濃度は、各試料の比色法によって総デカヒドロデカボレート濃度を測定する ことにより評価され、その後限外濾過後の流出物について測定し、リポソームの 外側の物質に対して補正された。

比色法は、Ｍ、Ｆ、ハードン、Ｐ、Ｐ、オルセン、ジャーナル・オブ・アメリカ ン・ケミカル・ソテイエティー、８７巻２３６６頁（１９６５年）（引用して本 明細書に包含させる）に記載されている。

本比色法は、トリフルオロ酢酸の存在下アセトニトリル溶液中でＢ、。Ｈ＋ｏ’ −イオンの１位にペンゾニウムイオンがカップリングすることにより生成する強 い青色アゾ色素（λｍａｘ５２００Δε＝２ｘｌｏつの迅速および定量的形成に 依存している。本方法はｌＸｌ０−５Ｍという低濃度で８１゜Ｈ、。’−を定量 的に測定することができる。この結果を以下第２表に示す。

第２表 リポソーム　Ｎａ２Ｂ＋ｏＨ＋ｏ（ｍＭ）試料　総量　外側　内側 ＰＢＳ　４．．８　０．３５　４．４５ラクトース　３．５　０．１８　３．３ ２デカヒドロデカポレートは最初に外側のリポソームにごく微量しかない（５− ８％）。

カプセル化したＮ　ａ　ｔ　Ｂ　＋。ＨＩＯの濃度３．５箇月後 試料を室温で３．５箇月貯蔵し、その後再試験した。

第３表 リポソーム　Ｎａ２ＢＩｏＨ＋ｏ（ｍＭ）試料　総量　外側　内側 ＰＢＳ　４．８　０．６３　４．１７ ラクトース　３．５　０．＋１　３．３９３．５箇月後、ＰＢＳ中で貯蔵したリ ポソームは、内部から外ｌへ僅か約６％の余分のホウ素がもれ出すが、ラクトー ス中で貯蔵したものは測定の実験的誤差内でホウ素が欠失しない。すなわち、本 発明のリポソームは７３０　ｍｏｓ＋ｎ／６の内部デカヒドロデカボレート溶液 を何箇月も保つことができるが外部溶液は僅かに２９５＋ｎ０５ｍ／（！である 。

１１１１　ｎキレートリポソームラベルを使用したマウスのホウ酸封入リポソー ムの生物分布 リポソーム試料は、イオノファーＡ２３１８７がリン脂質の重量のｌｏ−３レベ ルで脂質中に含まれることを除けば上記に記載したように製造した。水和溶液（ ２，５ｘρ）は２５０　ｍＭＭＮａｔＢ　ＩｏＨ＋ｏおよび１ｍＭＥＤＴＡであ った。音波処理したリポソームの外側溶液は、前のようにセファデックスＧ−２ ５−８０から真空溶出によりＰＢＳと交換した。これらのリポソームは５７．９ ｎｍの平均直径であった。脂質分析は＋　４．３ｘ９／１ｆ２ＤｓＰｃおヨヒ７ 　、６７　Ｒｇ／ｘＱコレステロールを示した。交換したリポソームの試料は放 射性ｌｌｌＩｎＣ１ｓ５０μｇおよび５＋ｎＭクエン酸ナトリウムと８０℃３０ 分間インキュベートした。ｌ　ｌ　１１　ｎ　！“はＡ２３＋８７により本製造 法のリポソーム内部のＥＤＴＡに輸送される。

総試料および充填後の外部のＩｎ濃度の試験は９３％の充填率を示し、加えたＩ 　Ｉ　１１　ｎの９３％はＩｎ−ＥＤＴＡ複合体としてリポソームの内部にある 。限外濾過段階およびＪ’Ｊ　ａｔＢ　ＩｏＨ＋。の比色検定を使った類似製法 は、８０℃で３０分間インキュベートする間リポソームの外へもれ出すのはＮａ ｚＢ＋ｏＨ＋。１％未満であることを示した。

ＥＤＴＡでキレートしたｌｌｌＩｎを、この試験で放射性トレーサーとして使用 したが、その理由は動物組織のＢ　、、Ｈ、。１種の直接測定は既知方法では不 可能であることが証明されたからである。Ｉｎ−ＥＤＴＡ複合体（よ放射性イオ ンが体内で感知できる程度解離することができないためかなり安定である。複合 体は陰性の電荷をもち、Ｂ、。ＨＩＧ’−イオンと同様に水によく溶解する。す なわち、Ｉｎ−ＥＤＴＡおよびＢ　＋ｏＨ＋ｏ”−はマウスの生物分布研究にお いて大変類似した薬物動態掌性をもつことが期待される。それ故、ＩＩＩ　１１ ガンマ線放出の放射能から測定した組織ダラムあたりの注入薬剤パーセントはＢ 、。Ｈｏ。′−の分布にほぼ一致するはずである。　２５０ｍＭ　Ｎａ２ＢＩｏ Ｈ＋ｏ（内部濃度）を含む”’Ｉｎ−ＥＤＴＡ充填リポソームを、側面にＥＭＴ ６腫瘍を移植して８日後のＢａ１ｂ／ｃマウスの尾静脈に注入した。リポソーム 試料２００μＱ溶液を各マウスに注入した。

マウスを注入後２４．４８および７２時間に５匹のグループで殺した。組織を解 剖し、重量をはかり、ガンマ計数器で放射能を測定した。その結果は組織ダラム あたりのＩＩＩ　Ｈｎ注入量平均パーセント（％ＩＤ／ｇ）で表現され、以下に 示す。

第４表 注入後時間（時間） 組織　２４　４８　７２ 血液　７．８　０．５　０．０８ 腫瘍　１０．３　３，８　２．２ 肝臓　１１．４　３，８　２．３ 牌臓　１４．７　７．９　６．４ ２４時間後での腫瘍レベルは中性子捕獲療法に最適で、血液よりも多い。

第４表で述べたように、２４時間後の腫瘍Ｉｎ取り込みはダラムあたりの注入量 （ＩＤ／９）は１０００％である。それ故、２４時間レベルで腫瘍に送達可能な ”Ｂ量を同様にダラムあたりの注入量の１０００％と推定できる。注入した用量 は２１　、９７Ｍ９／　ＴｒＱ脂質濃度のリポソーム試料２００μｇであった。

ここで使用した種のリポソームは少なくとも脂質所あたり溶液１．０μａをカプ セル化する。

これは、使用した試料中の溶液のπνあたり２１．９７μａまたは２゜２％が捕 捉されることを意味する。１００μＱの注入用量では０゜２＋Ｑ×、０２２ｘ２ ５０マイクロモル／友ｆｆＢ、。Ｈ３゜２−または１．１０マイクロモルＢ、。

Ｈ３゜！−を含む。もし同位体濃縮が９０％ＩＯＢまたはそれ以上の場合、注入 量１０Ｂは１．ｌＯマイクロモル×９０μｇＩＯＢテある。１０００％ＩＤ／ｇ の腫瘍レベルでは腫瘍濃度は腫瘍ダラムあたり１０．２μ９１０　Ｂであり、中 性子捕獲療法の成功に必要と考えられる範囲内にある。

本発明を特定の用途について記載したが、含まれる原理は当業者に明らかである 他の用途にも適用可能である。したがって本発明は請求の範囲のみによって限定 されるものである。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 平成２年５月２日

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）大きな中性子捕獲断面積をもち、中性子が衝突したときアルファ粒子を放 出する同位元素を有する元素をもった封入化合物をもつリボソームを含む中性子 捕獲腫瘍療法剤。
2. （２）同位元素を約１０μｇ／腫瘍ｇ〜約５０μｇ／腫瘍ｇの濃度で集積させる に充分な濃度で化合物が封入されている、請求項１記載の腫瘍療洗剤。
3. （３）大きな中性子捕獲断面積をもつ元素および中性子が衝突したときアルファ 粒子を放出する同位元素を有する化合物を封入している、りん脂質を含むリボソ ームを与え、このようなリポソームを対象の血液流中に導入し、その後上記対象 を、中性子捕獲療法に有効な中性子を放出する放出源にさらすことからなる、中 性子捕獲腫瘍療法のための腫瘍標的法。
4. （４）化合物がほう素含有化合物である、請求項１記載の腫瘍療法。