JPH03500126A - トルエン及び他のフェニル化合物の微生物でのバイオ変換のための方法及び物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３゜シュードモナス（Ｐｓｅｕｃｌｏｍｏｎａｓ）がシュードモナスプチダ（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　匹■ｂ）　Ｙ２１０１である請求項２に記載の微生物宿 主細胞。

４、シュードモナスメンドシナ（ＰｓｅｕｄｏＩａｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎ ａ）にＲ−１から単離されたトルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子をコードするＤ ＮＡ断片が挿入されたプラスミドベクターを含む組換えプラスミド。

５゜前記組換えプラスミドが、トルエンをｐ−クレゾールに変換する能力をこの 能力が欠如している微生物宿主細胞に形質転換及び付与できる同定特性を有し、 生物学的に機能的である請求項４に記載の組換えプラスミド。

６、前記プラスミドベクターがｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９、ｐＫＹ２３５、ｐＭＭ Ｂ６６ＥＨ，ｐＭＢ６６ＨＥまたはｐｃＦＭ１１４６である請求項４に記載の組 換えプラスミド。

７、前記ＤＮＡ断片が第３図に示した制限マツプを有する２０．５ｋｂ　Ｓａｃ 　ｌフラグメントまたはその活性サブフラグメントである請求項４に記載の組換 えプラスミド。

８、前記ＤＮＡ断片が第３図に示した制限マツプを有する１０．２ｋｂ　Ｓａｃ 　ｌフラグメントである請求項４に記載の組換えプラスミド。

９、前記ＤＮＡ断片が第３図に示した制限マツプを有するフ、フｋｂ　Ｓａｃ　 Ｉ　−Ｂａａ　ｌフラグメントである請求項４に記載の組換えプラスミド。

１０、前記ＤＮＡ断片が第３図に示した制限マツプを有する６、２ｋｂ　Ｓａｃ 　Ｉ　−鏑１フラグメントである請求項４に記載の組換えプラスミド。

１１、前記ＤＮＡ断片が第３図に示した制限マツプを有する５、９ｋｂ　Ｓａｅ 　ｌ　−Ｘｍａ　ｌフラグメントである請求項４に記載の組換えプラスミド。

１２、前記ＤＮＡ断片が第３図に示した制限マツプを有する４、６ｋｂＸｈｏｌ フラグメントである請求項４に記載の組換えプラスミド。

１３、請求項４に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主細 胞。

１４、前記微生物宿主細胞がＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、ＪＭ８３、ＦＩＢＩＯ ＩまたはＦＭ５である請求項１３に記載の微生物宿主細胞。

１５、請求項７に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主細 胞。

１６、請求項８に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主細 胞。

１７、　請求項９に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主 細胞。

１８、請求項１０に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主 細胞。

１９、請求項１１に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主 細胞。

２０゜請求項１２に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主 細胞。

２１、シュードモナスメンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｗ＋ｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉ ｎａ）にＲ−１から単離されたトルエンモノオキシゲナーゼをコードし、第３図 に示した制限マツプを有する２０．５ｋｂ　Ｓａｅ　Ｉフラグメントまたはその サブフラグメントを含むＤＮＡ断片。

２２、フェニル化合物を、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘導物質で処理 したシュードモナスメンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｅｉｎａ ）　ＫＲ−１細胞と反応させることを含むしドロキシル化により、選択されたフ ェニル化合物を選択されたフェノール化合物に微生物バイオ変換する方法。

２３゜前記選択されたフェニル化合物が、トルエン、メチルフェニル酢酸、エチ ルフェニル酢酸、２−フェニルエタノール、アセトアニリド、フルオロベンゼン またはエチルベンゼンである請求項２２に記載の方法。

２４゜フェニル化合物を、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘導物質で処理 された請求項１３に記載の微生物宿主細胞と反応させることを含むしドロキシル 化により、フェニル化合物をフェノール化合物に微生物バイオ変換する方法。

２５、前記フェニル化合物が、トルエン、メチルフェニル酢酸、エチルフェニル 酢酸、２−フェニルエタノール、アセトアニリド、フルオロベンゼンまたはエチ ルベンゼンである請求項２４に記載の方法。

２６、　（ａ））ルエンを、欠陥ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドデヒドロゲナ ーゼを含有するシュードモナスメンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏａｏｎｉｓ　ｍｅｎｄ ｏｃｉｎａ）　ＫＲ−１の突然変異株と反応させ、（ｂ）Ｎｉ及び−酸化炭素を 用いて、トルエンがｐ−ヒドロキフェニル酢酸に実質的に変換するのに充分な時 間処理することを含む、トルエンからｐ−ヒドロキシフェニル酢酸を製造する微 生物酵素的方法。

２７、　（ａ）メチルフェニル酢酸を、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘 導物質で処理したシュードモナスメンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏ＠ｏｎａｓ　ｍｅｎ ｄｏｃｉｎａ）　ＫＲ−１細胞と反応させ、（ｂ）酸を用いて、メチルフェニル 酢酸がｐ−ヒドロキフェニル酢酸に実質的に変換されるのに充分な時間加水分解 することを含む、メチルフェニル酢酸からｐ−しドロキシフェニル酢酸を製造す る微生物酵素的方法。

２８、　（ａ））ルエンを請求項１３に記載の微生物宿主細胞と反応させ、（ｂ ）Ｎｉ及び−酸化炭素を用いて、トルエンがｐ−ヒドロキフェニル酢酸に実質的 に変換されるのに充分な時間処理することを含む、トルエンからｐ−しドロキシ フェニル酢酸を製造する微生物酵素的方法。

２９、　（ａ）メチルフェニル酢酸を、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘 導物質で処理した請求項１３に記載の微生物宿主細胞と反応させ、（ｂ）酸を用 いて、メチルフェニル酢酸がｐ−ヒドロキフェニル酢酸に実質的に変換されるの に充分な時間加水分解することを含む、メチルフェニル酢酸がらｐ−ヒドロキシ フェニル酢酸を製造する微生物酵素的方法。

３０、インドールを、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘導物質で処理した シュードモナスメンドシナ（Ｐｓｅｕｌｏｍｏｎａｓ　＋５ｅｎｄｏｃｉｎａ） 　ＫＲＩ細胞と反応させることを含むインドールからインジゴを製造する微生物 酵素的方法。

３１、インドールを、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘導物質で処理した 請求項１３に記載の微生物宿主細胞と反応させることを含むインドールからイン ジゴを製造する微生物酵素的方法。

３２、　ｐＫＹ２３５を含むプラスミドベクター。

３３、　ｐｃＦＭ１１４Ｂを含むプラスミドベクター。

明細書 トルエン及び他のフェニル化合物の微生物でのバイオ変換のための方法及び物質 発明の背景 本発明は、微生物宿主細胞に選択したバイオ変換能力を付与するための組換えＤ ＮＡ技術の使用に係わる１本発明は特に、新たに単離し、キャラクタライズした シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ）株であるシュードモナス・メンドシ ナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）　ＫＲ−１から得たトルエ ンモノオキシゲナーゼ遺伝子をクローニングすることに係わる。即ち本発明は、 トルエンモノオキシゲナーゼ酵素及びタンパク質を過剰生産する、遺伝子工学的 に製造された微生物を提供し、従って上記酵素系によってバイオ変換を行なう、 より有効な手段を提供する。

最近、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｅｉｎａ　ＫＲ−１（ＰｍＫＲｌ） として同定された細菌をＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＧｉｂｓｏｎが、淡水湖から 採取した藻塊から単離した［Ｗｈｉｔｅｄ、　Ｐｈ、Ｄ、　Ｄｉｓｓｅｒｔａｔ ｉｏｎ、　ＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｘａｓ　ａｔ　Ａｕ５ｔｉ ｎ、　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｎｏ。

１５８６　（１９８６）］、　Ｐ＋ａＫＲ１はトルエンを単独の炭素及びエネル ギー源として用いる。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ−ｎａｓ　ｐ ｕｔｉｄａ）　ｍｔ−２（Ｐｐ　５ｉｔ−２）　［Ｗｉｌｌｉａｓ＋ｓ　ａｎｄ 　Ｍｕｒｒｙ、　Ｊ、−Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２０：　４１６−４２３　（ １９７４）］及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　７−ｄａ　Ｆｌ　（ＰｐＦｌ）　［ Ｇｉｂｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　９：　１６２６−１ ６３０　（１９７０）］を含めた、トルエンを代謝もしくは分解する他のＰｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ株が以前に単離され、かつ文献に記載されている。しかし、こ れらの様々なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株でのトルエン代謝のための遺伝子、酵素 及び経路は互いに異なり、重複しない。

Ｐｐ　＋５ｔ−２によるトルエン分解の異化経路はＴＯＬと呼称され株に見いだ されるイソファンクショナルな異化プラスミドにおいてコードされる。　ＴＯＬ 分解経路のための基準プラスミドは、最初Ｐｐ　ｍＬ−２から単離されたｐＷＷ Ｏである。　ＴＯＬ経路の遺伝学及び生化学は十分に説明されている［Ｋｕｎｚ 　ａｎｄＣｈａｐｍａｎ、　Ｊ、　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、　１４６：　１７９− １９１　（１９８１）；　ｌｌｉｌｌｉａｍｓａｎｄ　Ｍｕｒｒｙ、　Ｊ、　Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２０：　４１６−４２３　（１９７４）；　ＮｉＮ１１ ｌｉ−ａ　ａｎｄ　Ｗｏｒｓｅｙ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２５：　 ８１８−８２８　（１９７６）；Ｈｏｒｓｅｙ　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　 Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２４：　７−１３　（１９７５）；Ｍｕｒｒｙ 　ｅｔ　ｍｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２８：　３０１−３１ ０　（１９７２）］。

ＴＯＬ経路の概要は次のとおりである。トルエンはまずメチル基がアタックされ 、このメチル基は連続的に酸化されて安息香酸となり、安息香酸が更に酸化され てシス−カルボン酸ジオールを生成し、シス−カルボン酸ジオールは酸化されて カテコールとなり、このカテコールがメタ切断経路の酵素によって分解されてア セトアルデヒド及びピルベートとなる。

ＰｐＦｌによる第二のトルエン分解異化経路が確定されており、この経路はＴＯ Ｄと呼称されている。Ｔ叶経路の場合に異なり、ＴＯＤ経路のための遺伝子は細 菌の染色体に配置され、プラスミドでコードされるのではない［Ｆｉｎｅｔｔｅ 　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１εＯ：　１００３−１００９　（１９８４）Ｈ Ｆｉｎｅｔｔｅ、　Ｐｈ、Ｄ。

Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、　Ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｘａ ｓ　ａｔ　Ａｕ５ｔｉｎ。

Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｎｏ、　Ｆ４９４　（１９８４）コ、　 ＴＯＤ経路の遺伝学及び生化学は、Ｆｉｎｅｔｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、上記；　Ｆ ｉｎｅｔｔｅ、上記；Ｇｉｂｓｏｒ＋　ｅＬ　ｍｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅ＋１ｉｓ ｔｒ　９：　１６２６−１６３０　＜１９７’Ｏ）：Ｋｏｂａｌ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｊ、＾ｍ、Ｃｈｅｗ、Ｓｏｃ、９５：　４４２０−４４２１　（１９７３）； Ｚｉｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、八ｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　９５：　 ４０４８−４０４９　（１９７３）；Ｄａｇｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ ｒｅ　２０２：　７７５−７７８　（１９６４）；　Ｇｉｂｓｏｎ　ｅｔａｌ、 、　Ｂｉｏｃｈｅｅ＋１ｓｔｒ　７：　２６５３−２６６２　（１９６８）によ って研究されている。ＴＯＤ経路の概要は次のとおりである。トルエンのアタッ クがジオキシゲナーゼ酵素系によって開始され、それによって生成した（＋）− シス−１（Ｓ＞、２（Ｒ）−ジヒドロキシ−３−メチルシクロベキサ−３，５− ジエン（シス−トルエンジヒドロジオール）は酸化されて３−メチルカテコール となり、この３−メチルカテコールはメタ切断経路の酵素によって更に分解され る。

最近、第三のトルエン分解異化経路がＰｍＫＲｌにおいて同定された。　ＰｍＫ Ｒｌはトルエンを、上述の２経路のいずれとも全く異なる新規な経路で異化する ことが判明した［Ｒｉｃｈａｒｄ−ｓｏｎ　ａｎｄ　Ｇｉｂｓｏｎ、＾ｂｓｔ、 ＾ｎｎ、　Ｍｅｅｔ、＾ｍ、　Ｓｏｃ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

阻、　１５６　（１９８４）コ、Ｐ＋ｅＫＲ１によるトルエン分解の異化経路は 、経路の第一の段階が独自の酵素複合体であるトルエンモノオキシゲナーゼによ って触媒されるのでＴＭＯと呼称されている。この経路の酵素及びタンパク質の 生化学は最近、Ｗｈｉｔｅｄ、　Ｐｈ、Ｄ、　Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、　Ｔ ｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｘａｓａｔ　Ａｕ５ｔｉｎ、　Ｌｉｂ ｒａｒｙ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｎｏ、　Ｗ２Ｂ５　（１９８６）によって詳細 に研究されている。

ＰｍＫＲｌでのＴＭＯ経路の概要は次のとおりである。最初の段階でトルエンは 酸化されてｐ−クレゾールとなり、次にメチル基の酸化によってｐ−ヒドロキシ ベンゾエートが生成し、その後ヒドロキシル化によってプロトカテケーＩ・とな ってからオルト環切断が行なわれる。〆ｈｉｔｅｄ（上記）が概説しているＴＭ Ｏ経路の諸段階を第１図に示す、　ＴＭＯ経路の第一段階ゼによって変換される 。　ＰｍＫＲｌは独自の多成分酵素系を創出し、この酵素系が第一の段階である モノオキシゲナーゼ反応を触媒する。　Ｗｈｉｔｅｄ（上記）によれば、少なく とも３種のタンパク質成分、即ちオキシゲナーゼ（少なくとも５０，０ＯＯｄ。

及び３２，０ＯＯｄ、の二つのサブユニット）、フェレドキシン（２３，０ＯＯ ｄ、）及びＮＡＤＦＩ酸化還元酵素（分子量未知）が関与する。

現在、ＴＭＯ経路の酵素及びタンパク質の生化学について理解が相当に進み、遺 伝傘的研究も始まっている（Ｙｅｎ　ｅｔａｌ、、Ａｂｓｔｒａｃｔ、Ｕｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙ　ｏｒ　Ｇｅｎｅｖａ　ＥＭＢＯＷｏｒｋｓｈｏｐ。

＾ｕｇｕｓｔ　３１−Ｓ３１−５ｅｐｔｅ　４．１９８６）にもかかわらず、Ｐ ＋ＫＲ１のトルエンモノオキシゲナーゼ系の酵素及びタンパク質をコードする遺 伝子について、またはそのような遺伝子及び遺伝子製品の、微生物バイオ変換（ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｂｉｏｅｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）での有用性については当分 野で知られていない、当分野では、ＰｍＫＲｌ　）ルエンモノオキシゲナーゼ遺 伝子を含む新規な組換えプラスミドを有する微生物宿主細胞も知られていない、 このような微生物宿主細胞の成るものは、野生型ＰｍＫＲ１細胞の活性レベルよ り高いレベルでトルエンモノオキシゲナーゼ酵素活性を示す。

１１へ１１ 本発明は、いずれもＰｍＫＲｌ　）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を具えた新 規な遺伝子断片、生物学的に機能するプラスミド及び組換えプラスミド、並びに 微生物宿主細胞を提供する１本発明はまた、ＰｍＫＲｌ　）ルエンモノオキシゲ ナーゼ遺伝子を含む新規な組換えプラスミドを有する微生物宿主細胞を提供し、 この宿主細胞は野生型ＰｍＫＲ１細胞の活性より高レベルのトルエンモノオキシ ゲナーゼ酵素活性を示す、更に本発明は、微生物バイオ変換に用いるＰｍＫＲｌ 　）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を有する形質転換微生物宿主細胞の使用方 法も提供する。即ち本発明は、トルエンモノオキシゲナーゼ酵素及びタンパク質 を過剰生産する、遺伝子工学的に製造された微生物を提供し、従って上記酵素系 によってバイオ変換を行なう、より有効な手段を提供する。

本発明は、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を有するＰｍＫＲｌに由来する、 生物学的に機能するプラスミドを包含する。このプラスミド（ｐＡＵＴｌと呼称 ）は、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子系を欠く、即ちトルエンをｐ−クレゾ ールに変換し得ない微生物宿主細胞に接合によってトランスファーされ得る０本 発明の特に好ましい例では、ｐＡＵＴ１プラスミドのための微生物宿主細胞はＰ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　創ｄａＹ２１０１である。

本発明は、ＰｍＫＲｌから様々なりＮＡ遺伝子断片として単離し、かつクローニ ングして適当な自律複製プラスミドベクターとしたトルエンモノオキシゲナーゼ 遺伝子も包含し、この遺伝子によって各々トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子断 片を含む一連の組換えプラスミドが得られる。そのような組換えプラスミドはい ずれも生物学的に機能し、微生物宿主細胞を形質転換して該細胞にトルエンをｐ −クレゾールに変換する能力を付与するのに用い得る。

本発明は更に、上記のように形質転換した一連の微生物宿主細胞も包含する１本 発明の特に好ましい例において、微生物宿主細胞はＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ であり、組換えプラスミドはｐＨＹ４０２であり、インデューサー（誘導物質） はイソプロピル−チオガラクトシド（ＩＰＴに）である、　ｐＭＹ４０２組換え プラスミドは、ｐＭＮＢ６６ＥＨプラスミドにＰｓ＋ＫＲ１）ルエンモノオキシ ゲナーゼ遺伝子をコードする４、６ｋｂ　Ｘｈｏｌフラグメントを挿入したもの である６本発明の別の特に好ましい例では、微生物宿主細胞はＥ、　ｃｏｌｉ　 ＦＭ５であり、組換えプラスミドはｐＫＹ２８７であり、インデューサーは熱（ ４２℃）である、　ｐＫＹ２８７組換えプラスミドは、ｐｃＦ８１１４６プラス ミドにＰｍＫＲｌ　）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子をコードする４、６ｋｂ 　Ｘｈｏ　Ｉフラグメントを挿入したものである。これらの得られた組換え宿主 細胞は、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を単離した野生型ＰｍＫＲ１細胞の 活性より高レベルのトルエンモノオキシゲナーゼ酵素活性を示す。

本発明は、ＰｍＫＲｌ、またはＰｓＫＲｌ　）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子 を有する形質転換微生物宿主細胞を用いる微生物バイオ変換方法、特に選択した フェニル化合物を選択したフェノール化合物に変換する方法に係わる１本発明の 特に好ましい例は、ＰｍＫＲｌ　）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を有する形 質転換微生物宿主細胞を用いるｐ−ヒドロキシフェニル酢酸の製造方法を提供す る。

本発明は、Ｐ＋ａＫＲ１！ＩＩＩ胞、またはｐｍＫＲｌ　）ルエンモノオキシゲ ナーゼ遺伝子を有する形質転換微生物宿主細胞を用いてインドールからインジゴ を微生物的に製造する方法にも係わる。

本発明のその他の特徴及び利点は、当業者には以下の詳細な説明から明らかとな ろう。

図面の簡単な説明 第１図はＰ＋ＫＲ１）ルエンモノオキシゲナーゼ（ＴＭＯ）経路の諸段階の説明 図である。

第２図はｐＫＹ２３５プラスミドベクターのマツプを示す。

第３図は組換えプラスミド、プラスミドベクター、及びトルエンモノオキシゲナ ーゼ遺伝子を含むＰｍＫＲＩ　ＤＮＡ断片の制限マツプの概略的説明図である。

毘１４１弧 本発明の詳細な説明する方法及び物質で、現在好ましい態様をなすものは、Ｐｍ ＫＲｌ　）ルエンモノオキシゲナーゼ酵素系のための遺伝子をコードするＰ＋ｎ ＫＲ１由来の、プラスミドに含まれたＤＮＡ遺伝子断片に特に関連する。このプ ラスミド含有ＤＮＡ遺伝子断片は、接合または形質転換によって一定の微生物宿 主細胞に導入し、発現させることができる。

ＰｍＫＲｌ　）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を有する微生物宿主細胞は、一 定のバイオ変換を実現する方法に有用である。

本発明を、添付図面を参照しつつ以下の実施例によって説明する。実施例は、Ｄ ＮＡの単離、制限酵素でのＤＮＡ切断、ベクター形成、関連ポリペプチドをコー ドするＤＮＡ遺伝子断片の、上記ベクター（例えばプラスミド）への挿入、また は得られた組換えプラスミドの微生物宿主細胞への導入に用いる通常の方法に関 しては詳細な説明を含まない、そのような諸方法は遺伝子工学分野の当業者に公 知であり、Ｎａｎ１ａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏｔｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ ｉｎ−＾ＬＴＬｂＯｒａｔｒ。

Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｒ ｙ　（１９８２）；　Ｄａｖｉｓｅｔ　ａｌ、、　Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、　ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃ ｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、　（１９８６）；　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏ ｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｂ±ｅｃｑｌａｒ　Ｂ土ｄ互■−、ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ａ ｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏ ｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｅｉｅｎｃｅ　（１９８７） を含めた多くの刊行物に開示されている。

実」１伊口、：Ｐ鞘ＫＲＩ細胞の増殖 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎａドＲ−１を、増殖及びトルエンモ ノオキシゲナーゼ遺伝子誘導のためにトルエン（蒸気として供給）を加えたＰＡ Ｓ培地中またはＰＡＳ寒天プレート上で温度３０℃で一晩増殖させた［Ｃｈａｋ ｒａｂａｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、Ｓｃ；、Ｕ、Ｓ、＾、７０：　１１３７−１１４０　（１９７３）］ 。

Ｋ益１２：Ｅ、吐８８１０１でのＰ如ＫＲＩ　ｊ４土■ライブラリー形八Ａ　、 　ＰｍＫＲＩ　ＤＮＡの製造 ＰｍＫＲ１から全ＤＮＡを通常方法で単離した。即ち、ＰｍＫＲｌを実施例１に 記載のトルエン含有ＰＡＳ培地に接種し、３０℃で一晩（１３〜１７時間）Ｓ盪 させつつインキュベートした。インキュベーション後、定常増殖期のＰｍＫＲ１ 細胞を遠心分離によって収集した。　Ｄｈａｅｓｅ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、７：　１８３７−１８４９　（１９７９）に開示し であるように、細胞を溶解させて全ＰｍＫＲＩ　ＤＮＡを抽出及び精製した。

Ｂ、プラスミドＤＮＡの製造 ｐＲＫ２９０プラスミドを有するＥ、　ｃｏｌｉ　［１Ｂ１０１　［Ｄｉｔｔａ 　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪ、Ｓ、＾＝７７：　７３４ ７−７３５１　（１９８０）］をＬブイヨンに接種し、３７℃で一晩振盪させつ つインキュベートした。組直細胞を遠心分離で収集し、溶解させ、染色体ＤＮＡ 塊と細胞の破片とを遠心分離で除去した。その後、塩化セシウム／臭化エチジウ ム密度勾配を用いる通常技術でｐＲＫ２９０プラスミドＤＮＡを精製した。

Ｃ３組換えプラスミドの製造 上記パートＡで得た全ＰｍＫＲＩ　ＤＮＡと上記パートＢで得たｐＲＫ２９０プ ラスミド［１８＾とを、完全消化（ｄｉｇｅｓｔ　１ｏｎ）条件下に制限エンド ヌクレアーゼＬＬＬＩＩで別個に処理した−　ＬｔＬｉｒに消化されたＰ＋＊Ｋ ＲＩ　ＤＮＡをｈ↓■に消化されたｐＲＫ２９０プラスミドＤＮＡと混合し、混 合物を、ＤＮＡリガーゼを加えてインキュベートした。

０９組換えプラスミドでの形質転換 上記パートＣで得な連結ＤＮ＾を用いてＥ、　ｅｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換 し、形質転換細胞をテトラサイクリン１１０Ａｔ／＊Ｉ含有のＬ寒天の選択プレ ート上に接種した１選択プレート上では、形質転換が成功し、ｐＲＫ２９０プラ スミドが才たはＰ＋ＫＲＩＤＮ＾を伴ったＭｌ換えｐＲＫ２９０プラスミドを有 する細胞のみが増殖し得る１選択プレート上で増殖したコロニーを、ｈＫＲ１ト ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドが存在するがどうかに ついて実施例３の接合及び相補性スクリーニングアッセイで試験した。

叉」Ｅ凹」−：接合及び相補性スクリーニングアッセイＰｍＫＲ１）ルエンモノ オキシゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを検出するべく、実施例２によっ て製造したＰａＫＲＩ　Ｂ）１土■ライブラリー及び実施例８によって製造した ＰｍＫＲＩ　Ｓａｅ　Ｉライブラリーをスクリーニングするのに、細菌接合を介 してのプラスミドトランスファーを含む相補性アッセイを用いた。従ってプラス ミドは、Ｙｅｎ　ａｎｄ　にｕｎｓａ−１ｕｓ、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｃ ａｄ、　Ｓｅｉ、υ、Ｓ、＾＝７９：　８７４−８７８　（１９８２）の開示す る、以下に要約する接合（“交配″）操作によって細菌株間でトランスファーさ れた。

実施例２または実施例８の選択プレートからコロニーを、Ｌブイヨンを用いた穏 やかな掻き取りによって除去した。

得られた細菌細胞懸濁液を、洗浄してテトラサイクリンを完全に除去してから交 配のためしブイヨンに懸濁させた。

対数増殖期のドナー細胞、ヘルパー細胞〈必要であれば）及びレセプター細胞の 懸濁液を等量ずつ混合した。混合物の小アリコートをＬ寒天プレート上に置き、 このようにして全タイプの細胞の増殖を可能にした。３０℃で一晩インキユベー トした後、細胞をテトラサイクリン５０μｇ／ｍ！含有のＰＡＳ寒天選択プレー ト上に再接種した。単独の増殖用炭素源としてトルエンを用いた。トルエン蒸気 の選択プレートへの供給は、トルエンを入れて綿で栓をした管をプレートの蓋に テープで留め付けることによって実現した。この選択プレートでは所望のトラン ス接合体の増殖のみが可能である０行なった全実験でドナー細胞は、交配でトラ ンスファーされるべき組換えプラスミド（Ｐｄ８１遺伝子断片を含むｐＲＫ２９ ０まなはｐＫＹ２３５）を有すルＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１ライブラリー（実 施例２のｈ土■ライブラリーかまたは実施例８のガ±■ライブラリー）から得た 。用いたヘルパー細胞は、匹遺伝子を有しない伝達プラスミドに伝達機能をもた らすヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を有するＬｃ　ｏ　Ｉ　ｉ　Ｈ８１０１ ｍ胞であった。

ある−いは他の場合には、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３をドナー細胞に直 接導入してその伝達機能を実現した。受容株は、実施例４に述べるようにして製 造したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｅｎｄｏｃｉｎａ　ＫＲ−１の複数の突然変異 株（Ｐａ　Ｙ４００１、Ｐａ　Ｙ４００２、Ｐａ　Ｙ４００７）のうちの−っで あった、突然変異株はいずれも欠陥（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）　）ルエンモノオキ シゲナーゼ遺伝子を有し、トルエンをｐ−クレゾールに変換できない、受容株で は欠損性である特定のＰＩＩＫＲＩ　）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を含む 組換えプラスミドが接合の際に首尾よくトランスファーされれば、得られるトラ ンス接合体は、単独の増殖用炭素源としてトルエンを含有する選択プレート上で コロニーとして増殖し得る。

選択プレート上で増殖したコロニーを、各コロニーを選択プレート上で１度また は２度ストリークすることにより精製した。トランス接合体を、更に実施例５に 従って操作した。

７：　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎａ　ＫＲ−１突然変異株の製 造ＰｍＫＲ１１１胞を変異原物質処理しくｍｕｔａｇｅｎｉｚｅ）、トルエンモ ノオキシゲナーゼ欠損突然変異株を次のプロトコールに従って単離した。細胞を ５輸１のしブイヨン中でＯ，Ｄ、ｇａ。が約０．７となるまで増殖させ、Ｎ−メ チル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジンにトロソグアニジン）を含有する ｐＨ６，０の５０ａＭシトレート緩衝液２鋤１に濃度０．２＋ａｇ／ｌで再懸濁 させた。室温で２０分間インキュベートした後、細胞を１）Ｆ１７．Ｏの１Ｍホ スフェート１１衝液２−１で２回洗浄して、５０−！のしブイヨンに再懸濁させ た。−晩増殖させた後、細胞を、個別コロニーを得るべくＬ寒天プレート上でス トリークした０個々のコロニーをつつき取り、単独炭素源としてトルエンまたは ｐ−クレゾールを含有するＰＡＳプレート上でストリークした。ｐ−クレゾール 上で増殖するがトルエン上では増殖しない株としてトルエンモノオキシゲナーゼ 欠損突然変異株ＰｍＹ４００１、ＰｍＹ４００２及びＰｍＹ４００７を単離した 。実施例１１に述べたトルエンモノオキシゲナーゼアッセイによって、これらの 突然変異株が欠陥トルエンモノオキシゲナーゼ酵素系を有することを更に確認し た。

同様の変異原物質処理を、ＴＭＯ経路の酵素ｐ−しドロキシベンズアルデヒドデ ヒドロゲナーゼにおいて欠損性である突然変異株を得るのにも用い得る。　Ｐｍ ＫＲ１細胞を上述のようにニトロソグアニジン処理した後、ｐ−ヒドロキシベン ズアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損突然変異株を、ｐ−ヒドロキシベンゾエート 上では増殖するがトルエン、ｐ−クレゾール、ｐ−ヒドロキシベンジルアルコー ルまたはｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド上では増殖しない株として単離する。

火」１例５：　９．４ｋｂ　ｉ上■フラグメントの単離実施例３によって単離し たＰ＋ａＫＲ１）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を有するＰｍＹ４００１のト ランス接合体コロニーの幾つか（１２）を更に次のようにキャラクタライズした 。各コロニーを増殖させ、プラスミドＤＮＡを通常方法で単離した。

各単離で得たプラスミドＤＮＡをＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ細胞の形質転換に 用いた。各形質転換細胞中のプラスミドはＰｍＹ４００１に、選択プレートがテ トラサイクリン及びグルコース（２−ｇ／醜１）を含有する以外は実施例３と同 様に実現される接合によってトランスファーされた。各トランス接合体を、５０ μｇ／ｍｌテトラサイクリン及びトルエン蒸気を補給したＰＡＳ寒天上に細胞を 接種することによりトルエン上での増殖について試験した。トランス接合体にお いてプラスミドのトルエンモノオキシゲナーゼ相補活性を確認した後、上記のよ うな）ＩＢＩＯＩ形質転換細胞を各々増殖させ、プラスミドＤＮＡを通常方法で 単離した。

ＤＮＡをｈ土■で消化し、トルエン資化に関して実施例４の各ＰｍＫＲ１突然変 異株と相補的である各トランス接合体コロニーから９．４ｋｂフラグメントを単 離した。この結果は、　ＰｍＫＲｌから得た９、４ｋｂ　Ｂｇ土■フラグメント が１種以上のトルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を含んでいたことを示す、　９ ．４ｋｂＩｎフラグメントの一端の近傍に二つの鉤±１部位をマツピングした。

火Ｊ１劉」−：　ｐＫＹ２３５プラスミドベクターの形成ｐＫＹ２３５プラスミ ド形成の出発物質は、Ｙｅｎ　ａｎｄ　Ｇｕｎｓａ−盲ｕｓ、　Ｊ、　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ、　１６２：　１００８−１０１３　（１９８５）に開示されたｐＫ Ｙ２１７ブラスミドであった６次の一連の段階に従ってｎａｈＧ遺伝子を含むｐ ＫＹ２１７がら得た５、１ｋｂ　ＦＩｉｎｄｌＩ［フラグメントをクローニング して、Ｂａｇｃ！ａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　２６：２７３− ２８２　（１９８３）４．：開示されｔ、；ｐＫＴ２４０’）”　ラスミド（７ ）Ｂｉｎｄｌｌｒ部位とした。この第一の段階で得られたプラスミドをｐＫＹ２ １９と呼称する。第二の段階では、岨及びｎａｈｃ遺伝子を含むｐＫＹ２１９か ち得た約７ｋｂのＢａｇ工！ｌｌ−５ａｃｌフラグメントをクローニングして、 Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｒｅｎｅ　１６：　２３７−２４ ７（１９８１）に開示されたｐＫＴ２３１プラスミドのＢａ５ａｌ　ｌ及びガ！ １部位とした。得られたプラスミドをｐＫＹ２２３と呼称する０次の段階で、ｎ ａｈＲ３１ｉ伝子と、２００塩基対のｎａｈＧ遺伝子と、カナマイシン耐性をも たらす遺伝子とを含むｐＫＹ２２３から得た６ｋｂ　Ｐｓｔ　ｌフラグメントを クローニングして、Ｙａｎｉｓｅｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ 　３３：　１０３−１１９　（１９８５）に開示されたｐＵｃ１９プラスミドの ｂ工■部位とした。得られたプラスミドをｐＫｙｚｓｓと呼称する。　ｐＫＹ２ ５６中の６ｋｂ　Ｐｓ工■フラグメントの方向性によって、ｉ１１部位からｎａ ｈＧ遺伝子のｂ１１部位の下流側に隣接するｈ且Ｒ１部位までにｐＵｃ１９の多 重クローニング部位を配置した。最終１１階において、カナマイシン耐性をもた らす遺伝子と、■且遺伝子と、２００塩基対の阻吠遺伝子と、多重クローニング 部位とを含むｐＫＹ２５６から得た５、４ｋｂ　ＢｓｔＥｆｆ　−ＥｃｏＲｌフ ラグメントを、その末端をＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮ＾ポリメラーゼＩの大型フラグ メントで満たした後Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、／１．７７：７３４７−７３５１　（１９８０）に 開示されたｐＲＫ２９０プラスミドに抽入して、ｐＲＫ２９０の約１ｋｂのＳｍ ａ　ｌフラグメントに１き換えた。得られたプラスミドをｐＫＹ２３５と呼称し 、ｐＫＹ２３５のマツプを第２図に示す。

火Ｊ１倒７：　ｐｃＦＭ１１４６プラスミドベクターの形成ｐｃＦ８１１４６ブ ラスミド形成の出発物質は、ｐＣＦＭ８３６ブラスミドであった。　ｐｃＦＭ８ ３６を含めた発現ベクターの形成は、その全体が本明細書に参考として含まれる 米国特許第４．７１０，４７３号に詳細に述べである。　ｐｃＦＭ８３６プラス ミドは、熱誘導可能なプロモーター、制限部位バンク（クローニングクラスター ）、プラスミド複製原型、転写ターミネータ−、プラスミドコピー数調整遺伝子 、及びカナマイシン耐性をもたらす遺伝子を含むが、クローニングクラスター直 前に位置する合成リポソーム結合部位は有しない、独自の阻見Ｉ及びＸｔ＋ａ　 Ｉ制限部位間の短いＤＮＡ配列を以下のオリゴヌクレオチド ５’　ＣＧＡＴＴＴＧＡＴＴ　３’ ３’　ＴＡ＾＾ＣＴ＾＾ＣＡＴＣ５’ で置き換えることによって、及び二つの内在Ｎｄｅ　Ｉ制限部位をＮｄｅ　ｌで の切断によって破壊してからＴ、ポリメラーゼ酵素で満たし１次いで平滑末端を 連結してｐｃＦＭ８３６からｐｃＦＭ１１４Ｂプラスミドを得た。

！ＵｕＬｉ：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢｌｏｌでのＰｍＫＲＩ　Ｓａｃ　Ｉライブ ラリーの形成 実施例６によって製造したρＫＹ２３５プラスミドベクターを、Ｅ、　ｃｏｌｉ 　ＨＢＩＯＩで襲±１ライブラリーを通常のゲノムライブラリー形成技術で形成 するのに用いた。　ＰｍＫＲｌから全ＤＮＡを実施例２のバートＡに述べたよう にして単離した。単離したＰｍＫＲＩ　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＳａｃ 　Ｉで部分消化条件下に処理した。このガ±■ライブラリーの形成に用いるＰｍ ＫＲｌ　）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の幾つかまたは総てを具えたフラグ メントの濃縮されたＤＮＡフラグメント集団を製造するために、部分的に消化さ れたＰｍＫＲＩ　ＤＮＡを通常の手順に従い１０〜４０％スクロース密度勾配を 用いてサイズにより分画した。　５Ｗ−２８遠心分離管及びロータで２６，００ ０ｒｐ＋ｍで２４時間遠心分離後、ＤＮＡフラクションを集め、ハイブリッド形 成によって試験した。実施例５によりトルエン資化に関して各ＰｍＫＲ１突然変 異株と相補的であることが知られている、即ち少なくとも１種のＰ−にＲ１）ル エンモノオキシ成したｈ土■ライブラリーから単離した９、４ｋｂ　ＬＬＬＩ［ フラグメントを放射性物質で標識し、スクロース勾配からハイブリッド形成フラ クションを選択するプローブとして用いた。

ハイブリッド形成フラクションを貯溜して、ＰｍＫＲｌ　）ルエンモノオキシゲ ナーゼ含有フラグメントが濃縮されたＤＮＡフラグメント集団を製造した。濃縮 されたこのＤＮＡフラグメント集団をＳａｗ　Ｉライブラリー形成に用いた。

シリエＩで消化した濃１ｉ１ＰＩＩＫＲＩ　ＤＮＡをむ±■で消化したｐＫＹ２ ３５プラスミドＤＮＡと混合し、ＤＮＡリガーゼを加えてインキュベートした。

連結したＤＮＡをＬｅｏｌｉ　ＢＢＩＯＩの形質転換に用い、形質転換細胞を、 １０μｇ／ｍｌのテトラサイタリンを含有したし寒天の選択プレート上に接種し た０選択プレート上では、形質転換が成功し、ｐＫＹ２３５プラスミドかまたは Ｐａ＋ＫＲ１ＤＮＡを伴った組換えｐＫＹ２３５プラスミドを有する細胞のみが 増殖し得る。形質転換細胞コロニーを、実施例３の接合及び相補性アッセイによ りＰａ＋ＫＲ１）ルエンモノオキシゲナーゼに関して試験した。

寒」１億９：　２０．５ｋｂむ±■ｌフラグメント単離単独炭素源としてトルエ ンを資化するトランス接合体の幾つか（１０）を、実施例５によりプラスミドＤ ＮＡを単離し、ルエン上での増殖について試験することによって更にキャラクタ ライズした。トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を含む組換えｐＫＹ２３５プラ スミド（消化されたｐＫＹ２６６）を有するＥ、　ｃｏｌｉ　’ＨＢＩＯＩ形質 転換細胞を増殖させ、プラスミドＤＮＡを通常方法で単離した。ｐＫＹ２６６ブ ラスミドへのインサートの制限酵素分析は、該プラスミドがそれぞれ１０．２ｋ ｂ及び１０．３ｋｂである二つのＳａｃ　ｌフラグメントを有することを示した 。

１０．２ｋｂ　わ」ｌフラグメントは、実施例５に述べた９、４ｋｂｈ土■フラ グメントの８ｋｂを含む。

叉１目１籾 トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子をマツプする組換えプラスミドの構築 ＧＩＫＹ２６６の１０．２ｋｂ　Ｓａｃ　ｌフラグメントを、Ｙａｎ　１ｓｅｈ −ＰｅｒｒｏｎらがＧｅｎｅ　３３：１０３〜１１９（１９８５）に記載した複 製能力の高いＥ、ｅｏｌｉ発現ベクターｐｊｌｃ１９にサブクローン化した。こ の得られた組換えプラスミドをｐＫＹ２７７と称する。このｐＫＹ２７７ブラス ミドを使用してＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９細胞を形質転換し、これをＪＮ１０９ ／ｐＫＹ２７フと称する。この新たなＥ、ｃｏｌｉ株はＬグロス中で、インジゴ に期待される特性を有する青色色素を合成した。更にこの株においてトルエンモ ノオキシゲナーゼ活性が検出された。更にトルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の マツピングは、インジゴ産生特性とトルエンモノオキシゲナーゼ活性の存在との 相関を示したく表■参照）。

ｐＫＹ２フ７のｉｏ、２ｋｂ　Ｓａｃ　ｌフラグメントを一連の制限酵素を用い て消化すると、第３図に示したような部分制限マ・ンプが生成された。この制限 マツプによれば、ｐＫＹ２７７における１０．２ｋｂ　Ｓａｃ　ｌフラグメント の一端から一連のＤＮＡフラグメントが削除され、第３図に示したプラスミドｐ ＫＹ２８０、ｐＫＹ２８１、ＰＫＹ２８２及びｐＫＹ２８３が生産された。ｐＫ Ｙ２８２の４．６ｋｂ珈１フラグメントをｐυＣ１９の５ｉ１１部位にサブクロ ーン化してプラスミドｐＭＹ４０１を生産した。　４．６ｋｂ　Ｘｈｏｌフラグ メントを含むｐＭＹ４０１の４．６ｋｂ　ＢＬ！旧−鋤■フラグメントを、Ｙｉ ｎｉｓｅｈ−ＰｅｒｒｏｎらがＧｅｎｅ　３３：１０：３−１１９＜１９８５） に記載したＥ、ｅｏｌｉ発現ヘク９−　ｐＵｃ１８Ｇｍ挿入Ｌ　テア　ラスミＦ 　ｐＭＹ４０４を生産した。ｐＵｃ１８プラスミドは、ポリクローニング（ｐｏ ｌｙｅｌｏｎｉｎｇ）部位が±プロモーターに関して反対向きであることを除き ｐｔｌｃ１９と同一である。結果として、４．６　Ｘｈ。

ｌフラグメントをｐＵｃ１８プラスミドに、膣プロモーターに関してｐＵｃ１９ プラスミドの向きとは反対向きで挿入した。

ｐＫＹ２７７の４．６ｋｂ　Ｘｈｏｌフラグメントを、ＦｕｒｓｔｅらがＧｅｎ ｅ　４８：１１９〜１３１（１９８６）に記載した広範囲の宿主のプラスミドベ ク９−　ｐＭＭＢ６６Ｅｌ１４：　クロー　ン化Ｌ、７”　ラスミドｐＭＹ４０ ２ヲｔＲ成した。更に第３図に示したように、ｐＫＹ２８２　ＯＮＡをＳｕｅ　 ｌ及び随■を用いて消化し、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮ＾ポリメラーゼ■の大フラグメ ントを端部に付加し、端部を連結することにより、ｐＫＹ２８２の５．９ｋｂ垣 １−Ｘ＋ｍａｒフラグメントの左端がら２．２ｋｂ　Ｓａｃ　Ｉ　ＢＩＬＬ　ｌ ｒｌフラグメント削除した。この得られたプラスミドをｐＭＹ４００と称する。

（実施例１１の分析法に従う）表１に示したように、ｐＭＹ４０２含有細胞は、 トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘導に対してＩＰＴＩＩ；に応答した。こ の結果、トルエンモノオキシゲが判り、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の転 写方向は第３図に示したように左から右であることが明らかとなった。　ｐＭＹ ４０１及びｐＭＹ４０４における４、６ｋｂ珈■フラグメントの方向性の相違と 、ｐＭＹ４０１及び９ＭＹ４０４含有細胞におけるトルエンモノオキシゲナーゼ 活性の差（表■）とは、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の転写方向とも一致 した。ト・ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を高レベルで発現するために、更に （実施例７に記載したように）ｐＫＹ２８２の４．６ｋｂ　Ｘｈ。

ｌフラグメントをＥ、ｃｏｌｉ発現ベクターｐｃＦＭ１１４６の山１部位にクロ ーン化してｐＫＹ２８７を構築した。

え１匠Ｕ トルエンモノオキシゲナーゼアッセイ ０．４％グルタメートを含有するＰＡＳ培地またはＬグロス中で細胞を飽和する まで成長させ、それらを適当な容積の同じ培地中に０．０．、、。３．０になる まで再度懸濁した。この細胞アリコートを、Ｂｒａｄｆｏｒｄが＾ｎｉｌ　、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、７２；２４８（１９７Ｂ）に記載したＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質 分析を使用する方法によってタンパク質濃度を測定するために使用した。細胞ア リコート０．５ｎ１をｐ−クレゾール４１ＩＭｏｌを含む溶液ｔｏｕｒ及び放射 性トルエン（トルエン環ＩＣ，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、５６． ３ｓＣｉ／ｍａ＋ｏｌｅ）１５ｎｍｏｌを含む溶液５．１と混合し、この混合物 を時々撹拌しながら室温で２０分間インキュベートした。インキュベート後、混 合物２０．１を薄層クロマトグラフィープレート小片上に滴下し、２０分間空気 乾燥した。フィルター上に残った非揮発性放射能を液体シンチレーションカウン ターにおいて測定し、これを使用してプレート上のトルエン分解生成物の量及び トルエンモノオキシゲナーゼの比活性を算出した。この結果を表Ｉに示す。

衣ユ Ｅ、ｅｏｌｉ及びＰ、ｍｅｎｄｏｅｉｎａにおけるトルエンモノオキシゲナーゼ （ＴＭＯ）遺伝子の発現 プラスミド　誘発物質　宿主細胞　ＴＭＯの比活性　インジゴ形成（ｎｍｏｌｅ ・分−１・、、−１） ｐＡＵＴｌ　）ルエン　Ｐ、ｅ＋ｅｎｄｏｃｉｎａ　ＫＲＩ　Ｏ，１３０＋ｐ＾ ■Ｔ１　無　Ｐ、ｍｅｎｄｏｃｉｎｉ　ＫＲＩ　Ｏ，０１０＋ｐＫＹ２６６　無 　Ｌ１リカバＫＴ２４４０　０．０２０　＋ｐＫＹ２フ７　無　Ｅ、ｅｏｌｉ　 ＪＭＬＯ９０，０１０＋ｐＭＹ４０５　無　Ｅ、ｃｏｌｉ　）ＩＢＩＯＩ　Ｏ， ００５−ｐＮＹ４０５　１ＰＴＧ　Ｅ、９且ＨＢＩＯＩ　０１０１５＋ｐＫｙｚ ｓｏ　無　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　０．０１０　＋ｐＫＹ２８１　無　Ｅ、 ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　０．０１０　＋ｐＫＹ２８２　無　Ｅ、ｅｏｌｉ　ＪＭ １０９　０．０１０　＋ｐＫＹ２８３　無　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　０．０ ０５　−ｐ）４Ｙ４００　葺Ｅ、ｅｏｌｉ　ＪＭ８３　０．００５　−ｐ１４Ｙ ４０１　無　Ｅ、ｅｏｌｉ　ＪＭ８３　０．０３５　＋ｐＭＹ４０４　ｍ　Ｅ、 ｅｏｌｉ　ＪＭ８３　０．０１０　＋ｐＭＹ４０２　無　Ｅ、ｅｏｌｉ　■Ｂｌ ｏＩ　Ｏ，００５−ｐＭＹ４０２　１ＰＴＧ　Ｅ、並置ＥＩＢＩＯＩ　Ｏ，２０ ０＋ｐＭＹ２８７　熱　Ｌｌすｉ　ＦＭ５　０．５００　＋ｐＵｃ１９　無　Ｅ 、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　０．００５　−ｐＭＮＢ６８ＥＦＩ　ＩＰＴＧ　Ｅ、 ９旦）ＩＢＩＯＩ　Ｏ，００５−ｐＦＣＮ１１４６　熱　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＦＭ５ 　０．００５　−人ｍ 所定のフェニル化合物の所定のフェノール化合物への変換Ａ、Ｐ輸ＫＲＩ！Ｉ胞 による変換 トルエン、メチルフェニル酢酸、エチルフェニル酢酸、２−フェニルエタノール 、アセトアニリド、フルオロベンゼン及びエチルベンゼンを含む多くのフェニル 化合物は基質となることができ、即ちＰｍＫＲｌのトルエンモノオキシゲナーゼ 系によるバラヒドロキシル化によってフェノール化合物に変換することができる 。以下の式は幾つかの可能な変［式中、■はトルエンであり、■はｐ−クレゾー ルである。］［式中、■はメチルフェニル酢酸であり、■はｐ−ヒドロキシメチ ルフェニル酢酸である。］ ［式中、■は２−フェニルエタノールであり、■はｐ−ヒドロキシ−２−フェニ ルエタノールである。］各変換において以下のように、フェニル化合物基質（例 えば、式１、ＩＩＩまたは■）をＰｍＫＲ１細胞と混合し、バイオ変換が行われ るのに充分な時間インキュベートし、次いでフェノール化合物の存在を分析した 。

Ｐｓｅｕｄｏｓ＋ｃｒ、ａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎａ　ＫＲＩを、０．４％グルタ メートを付与したＰＡＳ培地５０ｉ中で２５〜３０℃とし、トルエン２．５＋ａ １から供給されるトルエン蒸気の存在下（誘導）または不在下（非誘導）に定常 期まで（１２〜１６時間）成長させた。細胞アリコート５〜５０ｍ１を同じ容積 の同じ培地中に再度懸濁するか、または同じ培地において２．５倍に濃縮した０ 次いで、１５〜３０ｍＭ溶液を形成するのと等価の所与量の基質を細胞と混合し 、この混合物を激しく振盪しながら２５〜３０℃で１〜２４時間インキュベート した。典型的には混合物を５〜６時間インキュベートとし、ＧｕｐｔａらのＣｌ １ｎ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、　１８（４）：２２０〜２２１（１９８３）の分析方法 に従ってフェノール化合物の形成を測定した１種々のインキュベート時間及び温 度における幾つかのフェニル基質のフェノール化合物への変換の分析結果を表Ｈ に示す。

表１ の時間及び温度）　Ｏ，Ｄ、、、。読取り値アセトアニリド（６時間、２５℃） 　１．０７フルオロベンゼン（２４時間、２５℃＞　０．７３メチルフエニルア セテート（６時間、３０℃）　０．２３エチルフエニルアセテート（６時間、３ ０’Ｃ）　０．１３エチルベンゼン（６時間、３０℃）　０．３７２−フェニル エタノール（５時間、３０’Ｃ）　０．１６非誘導培養の基質　０．０３ Ｂ　、　ＰｍＫＲｌ　）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子をコードする組換えプ ラスミドを含有する微生物宿主細胞による変換実施例１０の組換えプラスミドを 含有する微生物宿主細胞を使用することにより、バートＡと同じ変換を行なうこ とができる。実施例１Ｏに記載した適当な微生物宿主細胞を形質転換するために は、機能的Ｐ論ＫＲ１）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子をコードする（ｐＫＹ ２８３またはｐＭＹ４００を除く）任意の組換えプラスミドを使用することがで きる。実施例１１に記載したように、好ましいのは、組換えプラスミドとしてｐ ＭＹ４０２を、微生物宿主細胞としてＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを及び誘導物質 としてＩＰＴにを使用する方法である。この得られた株をＩＩＢＩＯＩ／ｐＭＹ ４０２と称する。他の好ましい方法は、組換えプラスミドとしてｐＫＹ２８７を 、微生物宿主細胞としてＥ、ｃｏｌｉＦＭ５を、また誘導物質として熱く４２℃ で１〜３時間）を使用する方法である。この得られた株をｌＩＦ５／ｐＫＹ２８ ７と称する。

それぞれの変換において、フェニル化合物（例えば式Ｉ、■または■）をＨＢ１ ０１／ｐＭＹ４０２またはＦＭ５／ｐＫＹ２８７と混合し、この混合物をバイオ 変換が行われるのに充分な時間インキュベートし、バートＡに記載したようにフ ェノール化合物の存在を分析した。！（Ｂｌｏｔ／ｐＭＹ４０２細胞を用いたバ イオ変換の各々においてｈａＫＲｌ　トルエンモノオキシゲナーゼ活性を誘導す るためには、以下のようにＩＰＴＧの存在下に細胞を成長させ分析する必要があ った。即ち、細胞を、０．４％グルタメート及び１＋ｍＭ　ＩＰＴＧを含有する ＰＡＳ培地またはＩＩＩＭ　ＩＰＴにを含むＬブロス中で飽和するまで成長させ 、それらを適当な容積の同じ培地中にＯ，Ｄ、、、。３．０まで再度懸濁し、バ ートＡに記載したような基質を用いてインキュベートし、分析した。　ＦＭ５／ ｐＫＹ２８７Ｍ胞を用いたバイオ変換の各々においてＰａ＋ＫＲ１）ルエンモノ オキシゲナーゼ活性を誘導するためには、以下のような温度条件下に細胞を成長 させる必要があった。即ち、ＦＭ５／ｐＫＹ２８７細胞をＬブロス中でＯ，Ｄ、 ａ６゜０．４まで成長させ、培養液を振盪しながら４２℃で３時間インキュベー トし、次いで温度を３０℃に変えて更に２時間インキュベートし、細胞を新たな Ｌブロス中にＯ−Ｄ、ｓｅａ　３．０まで再度懸濁し、パートＡに記載したよう な基質を用いてインキュベートし、分析した。

Ｋ１匠旦 トルエンのｐ−ヒドロキシフェニル酢酸への変換Ａ　、　ＰｍＫＲ１細胞による 変換 トルエン基質をｐ−ヒドロキシフェニル酢酸に変換するために、実施例４に記載 したように、トルエンを欠陥ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ を含有するＰｍＫＲ１突然変異体と混合し、トルエンがｐ−ヒドロキシベンジル アルコールに変換されるのに充分な時間インキュベートした。第２のステップに おいては、ｐ−ヒドロキシベンジルアルコール中間体を含有する細胞混合物をニ ッケル（Ｎｉ）及び−酸化炭素＜Ｃａ＞と、米国特許第４，４８２，４９７号、 第４，６５９，５１８号、第４．６３１．３４８号に記載の方法に従ってｐ−ヒ ドロキシベンジルアルコールをｐ−ヒドロキシフェニル酢酸に変換するのに充分 な濃度及び温度で反応させた。前記特許は参照により本明細書に包含されるもの とする。変換スキームは以下の通りである： Ｂ　、　Ｐ＠ＫＲ１）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子をコードする組換えプラ スミドを含有する微生物宿主細胞による変換ｐ−クレゾールヒドロキシラーゼ道 遺伝及び実施例１０の組換えプラスミドを含有する微生物宿主細胞を使用し、パ ートＡと同じ変換を行なうことができる。ｐ−クレゾールヒドロオキシラーゼ遺 伝子は、この遺伝子を含有する種々の微生物、例えばＰｓＫＲｌまたはプラスミ ドｐＮ０５０から通常の遺伝子工学技術によってクローン化することができる（ Ｈｅｗｅｔｓｏｎら、Ｇｅｎｅｔ、Ｒｅｓ、Ｃａｍｂ、　３Ｚ：２４９〜２５５ ，１９）８）、実施例１０に記載した適当な微生物宿主細胞を形質転換するため には、機能的Ｐ＋ａＫＲ１）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子をコードする（ｐ ＫＹ２８３またはｐＭＹ４００を除く）任意の組換えプラスミドを使用すること ができる。好ましいのはＨＢＩＯＩ／ｐＭＹ４０２細胞を使用する方法であり、 他に好ましいのは、ＦＭ５／ｐＫＹ２８７細胞を使用する方法である。

パートＡに記載した変換を行なうためには、トルエンを、実施例１２に記載した ように、ＩＰＴにを用いて成長及び誘導したＨＢＩＯＩ／ｐＭＹ４０２細胞また は熱を用いて成長及び誘導したＦＭ５／ｐＫＹ２８７細胞と混合し、この混合物 を、トルエンがｐ−ヒドロキシンジルアルコールに変換されるのに充分な時間イ ンキュベートし、次いでパートＡのようにＮｉ及びＣＯと反応させ、ｐ−ヒドロ キシフェニル酢酸に変換した。

Ｋ１五Ｂ メチルフェニル酢酸のｐ−ヒドロキシフェニル酢酸への変換Ａ　、　ＰｍＫＲ１ 細胞による変換 メチルフェニル酢酸基質をｐ−ヒドロキシフェニル酢酸に変換するには、メチル フェニル酢酸を実施例１２に記載したように成長させたＰａ＋Ｒ１と混合し、メ チルフェニル酢酸をｐ−ヒドロキシメチルフェニル酢酸に変換するのに充分な時 間インキュベートした。第２のステップにおいては、ｐ−ヒドロキシフェニル酢 酸中間体を含有する細胞混合物を、ｐ−ヒドロキシメチルフェニル酢酸をｐ−ヒ ドロキシフェニル酢酸に変換するのに充分な酸濃度及び温度で酸加水分解した。

変換スキームは以下の通りである： メチルフェニル酢酸　ｐ−ヒドロキシメチル■　ｐ−ヒドロキシフェニルｌフエ ：＃ｌｌ Ｂ、Ｐ＋ＫＲ１）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミ ドを含有する微生物宿主細胞による変換実施例１０の組換えプラスミドを含有す る微生物宿主細胞を使用し、パートＡと同じ変換を行なうことができる。実施例 １０に記載の適当な微生物宿主細胞を形質転換するためには、機能的ＰｍＫＲ１ ）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子をコードする（ｐＫＹ２８３またはｐＭＹ４ ００を除く）任意の組換えプラスミドを使用することができる。好ましいのはＨ ＢＩＯＩ／ｐＭＹ４０２細胞を使用する方法であり、他に好ましいのは、ＦＭ５ ／ｐＫＹ２８７細胞を使用する方法である。

パートＡに記載の変換を行なうためには、メチルフェニル酢酸を、実施例１２に 記載したように、ＩＰＴＣを用いて成長及び誘導したＨＢＩＯＩ／ｐＭＹ４０２ 細胞または熱を用いて成長及び誘導したＦＭ５／ｐＫＹ２８７１１ｔｌ胞と混合 し、この混合物を、ｐ−ヒドロシキメチル酢酸のバイオ変換に充分な時間インキ ュベートし、次いで混合物を、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸を生成するのに充分 な濃度及び温度で酸加水分解した。

え１匠長 インドールのインジゴへの変化 Ａ、ＰｍＫＲ１細胞による変換 インドール基質をインジゴに変換するために、インドール５０１ｙ／ｍＮを実施 例１２に記載したように成長させたＰｍＫＲ１細胞と混合し、インドールがイン ジゴに変換されるのに充分な時間、一般的には４８時間インキュベートした。イ ンジゴは、Ｅｎｓｌｅｙが米国特許第４，５２０ＪＯ３号の実施例５に記載した 方法によって、この細胞混合物から単離することができた。

Ｂ　、　Ｐｓ＋ＫＲ１）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子をコードする組換えプ ラスミドを含有する微生物宿主細胞による変換実施例１０の組換えプラスミドを 含有する微生物宿主細胞を使用し、パートＡと同じ変換を行なうことができる。

実施例１０に記載した適当な微生物宿主細胞を形質転換するためには、機能的Ｐ ＋ａＫＲ１）ルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子をコードする（ｐＫＹ２８３また はｐＭＹ４００を除く）任意の組換えプラスミドを使用することができる。好ま しいのは１（ＢＬＯＩ／ｐＭＹ４０２細胞を使用する方法であり、他に好ましい のは、ＦＭ５／ｐＫＹ２８７細胞を使用する方法である。

パートＡに記載の変換を行なうためには、インドールを、実施例１２に記載した ように、ＴＰＴ［；を用いて成長及び誘導したＨＢＩＯＩ／ｐＭＹ４０２細胞ま たは熱を用いて成長及び誘導したＦＭ５／ｐＫＹ２８７細胞と混合し、この混合 物を、インドールがインジゴにバイオ変換されるのに充分な時間インキュベート し、次いでインジゴを、パートＡの方法に従って細胞混合物から単離することが できた。

浄書（内容に変更なし） ↓ ω 手続補正書坊式） ％式％ ２゜発明の名称　トルエン及び他のフェニル化合物の微生物でのバイオ変換のた めの方法及び物質 ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正命令の 日付　平成２年１０月９日６、補正の対象　図　面 ７、補正の内容 （１）適正な図面の翻訳文を別紙の通り補正する。（内容に変更なし）国際調査 報告　− ＩｍｗａａｂｏＴｖｌ＾”１ｃ”−””ＰＣ？／ｎ！；ＲＱｌｎｌａＡＣ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子を含有するシユードモナス　メンドシナ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）ＫＲ−１由来の生物学的機能 プラスミドであって、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の含有という同定特性 を有しており、それによってトルエンをｐ−クレゾールに変換する能力をこの能 力が欠如している微生物宿主細胞にトランスファーできる前記プラスミド。 ２．請求項１に記載の生物学的機能プラスミドが接合によってトランスファーさ れたシユードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物宿主細胞。 ３：シユードモナス（Ｐｓｏｕｄｏｍｏｎａｓ）がシユードモナス　プチダ（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）Ｙ２１０１である請求項２に記載の微生 物宿主細胞。 ４．シユードモナス　メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎ ａ）ＫＲ−１から単離されたトルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子をコードするＤ ＮＡ断片が挿入されたプラスミドベクターを含む組換えプラスミド。 ５．前記組換えプラスミドが、トルエンをｐ−クレゾールに変換する能力をこの 能力が欠如している微生物宿主細胞に形質転換及び付与できる同定特性を有し、 生物学的に機能的である請求項４に記載の組換えプラスミド。 ６．前記プラスミドベクターがｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＹ２３５、ｐＭＭ Ｂ６６ＥＨ、ｐＭＢ６６ＨＥまたはｐＣＦＭ１１４６である請求項４に記載の組 換えプラスミド。 ７．前記ＤＮＡ断片が第３図に示した制限マップを有する２０．５ｋｂ　Ｓａｃ Ｉフラグメントまたはその活性サブフラグメントである請求項４に記載の組換え プラスミド。 ８．前記ＤＮＡ断片が第３図に示した制限マップを有する１０２ｋｂ　ＳａｃＩ フラグメントである請求項４に記載の組換えプラスミド。 ９．前記ＤＭ断片が第３図に示した制限マップを有する７．７ｋｂ　ＳａｃＩ− ＢａｍＩフラグメントである請求項４に記載の組換えプラスミド。 １０．前記ＤＮＡ断片が第３図に示した制限マップを有する６．２ｋｂ　Ｓａｃ Ｉ−ＳｐｈＩフラグメントである請求項４に記載の組換えプラスミド。 １１．前記ＤＮＡ断片が第３図に示した制限マップを有する５．９ｋｂ　Ｓａｃ Ｉ−ＸｍａＩフラグメントである請求項４に記載の組換えプラスミド。 １２．前記ＤＮＡ断片が第３図に示した制限マップを有する４．６ｋｂ　ｘｙｏ Ｉフラグメントである請求項４に記載の組換えプラスミド。 １３．請求項４に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主細 胞。 １４．前記微生物宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、ＪＭ８３、ＨＢ１０１ またはＦＭ５である請求項１３に記載の微生物宿主細胞。 １５．請求項７に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主細 胞。 １６．請求項８に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主細 胞。 １７．請求項９に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主細 胞。 １８．請求項１０に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主 細胞。 １９．請求項１１に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主 細胞。 ２０．請求項１２に記載の組換えプラスミドを用いて形質転換された微生物宿主 細胞。 ２１．シユードモナス　メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉ ｎａ）ＫＲ−１から単離されたトルエンモノオキシゲナーゼをコードし、第３図 に示した制限マップを有する２０．５ｋｂ　ＳａｃＩフラグメントまたはそのサ ブフラグメントを含むＤＮＡ断片。 ２２．フェニル化合物を、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘導物質で処理 したシュードモナスメンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎａ ）ＫＲ−１細胞と反応させることを含むヒドロキシル化により、選択されたフェ ニル化合物を選択されたフェノール化合物に微生物バイオ変換する方法。 ２３．前記選択されたフェニル化合物が、トルエン、メチルフェニル酢酸、エチ ルフェニル酢酸、２−フェニルエタノール、アセトアニリド、フルオロベンゼン またはエチルベンゼンである請求項２２に記載の方法。 ２４．フェニル化合物を、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘導物質で処理 された請求項１３に記載の微生物宿主細胞と反応させることを含むヒドロキシル 化により、フェニル化合物をフェノール化合物に微生物バイオ変換する方法。 ２５．前記フェニル化合物が、トルエン、メチルフェニル酢酸、エチルフェニル 酢酸、２−フェニルエタノール、アセトアニリド、フルオロベンゼンまたはエチ ルベンゼンである請求項２４に記載の方法。 ２６．（ａ）トルエンを、欠陥ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドデヒドロゲナー ゼを含有するシュードモナスメンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏ ｃｉｎａ）ＫＲ−１の突然変異株と反応させ、（ｂ）Ｎｉ及び−酸化炭素を用い て、トルエンがｐ−ヒドロキフェニル酢酸に実質的に変換するのに充分な時間処 理することを含む、トルエンからｐ−ヒドロキシフェニル酢酸を製造する微生物 酵素的方法。 ２７．（ａ）メチルフェニル酢酸を、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘導 物質で処理したシュードモナス　メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎ ｄｏｃｉｎａ）ＫＲ−１細胞と反応させ、（ｂ）酸を用いて、メチルフェニル酢 酸がｐ−ヒドロキフェニル酢酸に実質的に変換されるのに充分な時間加水分解す ることを含む、メチルフェニル酢酸からｐ−ヒドロキシフェニル酢酸を製造する 微生物酵素的方法。 ２８．（ａ）トルエンを請求項１３に記載の微生物宿主細胞と反応させ、（ｂ） Ｎｉ及び−酸化炭素を用いて、トルエンがｐ−ヒドロキフェニル酢酸に実質的に 変換されるのに充分な時間処理することを含む、トルエンからｐ−ヒドロキシフ ェニル酢酸を製造する微生物酵素的方法。 ２９．（ａ）メチルフェニル酢酸を、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘導 物質で処理した請求項１３に記載の微生物宿主細胞と反応させ、（ｂ）酸を用い て、メチルフェニル酢酸がｐ−ヒドロキフェニル酢酸に実質的に変換されるのに 充分な時間加水分解することを含む、メチルフェニル酢酸からｐ−ヒドロキシフ ェニル酢酸を製造する微生物酵素的方法。 ３０．インドールを、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘導物質で処理した シュードモナス　メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎａ） ＫＲ１細胞と反応させることを含むインドールからインジゴを製造する微生物酵 素的方法。 ３１．インドールを、トルエンモノオキシゲナーゼ遺伝子の誘導物質で処理した 請求項１３に記載の微生物宿主細胞と反応させることを含むインドールからイン ジゴを製造する微生物酵素的方法。 ３２．ｐＫＹ２３５を含むプラスミドベクター。 ３３．ｐＣＦＭ１１４６を含むプラスミドベクター。