KR0157301B1 - 톨루엔 및 페닐화합물의 미생물적 생물 전환 방법 및 물질 - Google Patents

톨루엔 및 페닐화합물의 미생물적 생물 전환 방법 및 물질

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KR0157301B1 KR1019890702299A KR890702299A KR0157301B1 KR 0157301 B1 KR0157301 B1 KR 0157301B1 KR 1019890702299 A KR1019890702299 A KR 1019890702299A KR 890702299 A KR890702299 A KR 890702299A KR 0157301 B1 KR0157301 B1 KR 0157301B1
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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
톨루엔 및 페닐 화합물의 미생물적 생물전환 방법 및 물질
[본 발명의 배경]
본 발명은 선택된 생물전환 능력을 미생물 숙주 세포에 부여하기 위해 DNA 재조합 기술을 이용하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 새롭게 분리하여 특정화된 슈도모나스 (Pserdomonas)종인 슈도모나스 멘도시나 (Pesudomonas mendocina) KR-1 으로부터 수득한 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자의 클로닝에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 톨루엔 모노옥시게나아제 효소 및 단백질을 생산하는 유전 공학 처리한 미생물 및 이 효소 체계에 의존적인 보다 효과적인 생물전환 방법을 제공한다.
최근에 Richardson 과 Gibsonol 가 맑은 물을 가진 호수로부터 취득한 조류 - 매트로부터 슈도모나스 멘도시나 KR - 1 (PmKRl)으로 확인된 박테리아를 분리하였다(오스틴에 소재하는 텍사스 유니버시티의 도서관 참고번호 제 W586 호(1986)인 Whited, Ph. D. 논문 참조). PmKRl 은 탄소원 및 에너지원으로 톨루엔을 이용한다. 슈도모나스 푸티다 mt - 2 (Ppmt - 2)를 포함하여 톨루엔을 대사하거나 분해하는 슈도모나스의 다른 종을 이미 분리하여 기술하였다[Williams 및 Murry, J. Bacteriol. 120 : 416 - 423(1974), 슈도모나스 푸티다 PpFl (PpFl) Gibson 등의, Biochemistry 9 : 1626 - 1630(1970) 참조]. 그러나 이러한 다양한 슈도모나스 종 내에서의 톨루엔 대사를 위한 유전자, 효소 및 경로는 분명하고 중복되지 않는다.
Ppmt-2 에 의한 톨루엔 분해의 이화작용 경로는 TOL 로 지정하였다.
TOL 경로용 유전자는 슈도모나스의 특정종에서 발견되는 기능이 같은 이화작용 플라스미드상에서 암호화된다. TOL 분해 경로용 관련 플라스미드는 Ppmt-2 에서 최초로 분리한 pWWO 이다. TOL 경로에 대한 유전학 및 생화학은 잘 기술되어 있다[Kumz 및 Chapman, J. Bacteriol. 146 : 179 - 191(1981) ; Williams 및 Murry, J. Bacteriol. 120 : 416 - 423 (1974) ; Williams 및 Worsey, J. Bacteriol. 125 : 818 - 828(1976) ; Worsey 및 Williams, J. Bacteriol. 124 : 7 - 13(1975) ; Murry 등의, Eur. J. Biochem. 28 : 301 - 310(1972) 참조]. TOL 경로의 간략한 요약은 하기와 같다: 즉, 톨루엔의 초기 공격은 벤조산을 형성하기 위해 계속 산화되는 메틸기에서 일어나는데, 이 톨루엔은 산화되어 시스-카르복실산디올을 형성하고, 또 산화되어 카테콜을 형성한 다음 메타 절단경로의 효소에 의해 분해되어 아세트알데히드 및 피르부산으로 된다.
PpFl 에 의한 톨류엔 분해를 위한 두 번째 이화작용 경로는 확정되어 있고 TOD 로 지정하였다. TOL 경로와는 반대로 TOD 경로용 유전자는 박테리아의 염색체상에 위치하고 플라스미드에 암호화되어 있지 않다[Finette 등의, J. Bacteriol. 160 : 1003-1009(1984) ; 오스틴에 소재하는 텍사스 유니버시티의 도서관 참고 번호 제 F494호 (1984)인 Finette, Ph.D. 논문 참조]. TOD 경로에 관한 유전학 및 생화학은 Finette 등의 상기 문헌에 기술되어 있다 ; Finette(상기 문헌 참조) ; Gibson 등의, Biochemistry 9 : 1626-1630(1970) ; Kobal 등의 J. Am. Chem.Soc. 95 ; 4420-4421(1973) ; Dagley 등의, Nature 202 : 775-778(1964) ; Gibson 등의, Biochemistry 7 : 2653-2662(1968) 참조. TOD 경로를 간단히 요약하면 다음과 같다 : 톨루엔의 초기 공격은 디옥시게나아제 효소 체계에 의해, 산화되어 3 - 메틸카데콜이 되고, 메타 절단 경로의 효소에 의해 더 분해되는 (+) - 시스 -1(S), 2(R) -디히드록시 - 3 - 메틸씨클로헥사- 3, 5 - 디엔(시스-톨루엔 디히드로디올)을 형성한다.
톨루엔 분해를 위한 세 번째 이화작용 경로는 최근에 PmKRl에서 확인되었다. PmKPl 은 상기 기술한 두 경로와는 완전히 다른 새로운 경로에 의해 톨루에을 분해한다는 것이 발견되었다[Richardson 및 Gibson, Abst. Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol. K54 : 156(1984) 참조]. 경로의 첫단계가 독특한 효소복합체인 톨루엔 모노옥시게나아제에 이화되기 때문에 PmKRl 에 의한 톨루엔 분해를 위한 이화작용 경로를 TMO 로 지정하였다. 본 경로의 효소 및 단백질에 대한 생화학은 최근에 오스틴에 소재하는 텍사스 유니버시티의 도서관 참고 번호 제W586 호(1986)인 Whited PH D. 논문에서 연구되었다.
PmKRl 에서의 TMO 경로에 대한 간단한 요약은 다음과 같다 : 첫 번째 단계에서 톨루엔은 산화되어 p - 크레졸이 되고, 메틸기가 산화되어 P-히드록시벤조에이트로 되고, 또 히드록시화 반응으로 프로토카테큐에이트로 되고 계속해서 오르토 고리가 절단된다. Whited(상기 문헌 참조)에 의해 요약된 TMO 경로의 단계는 제1도에 도시되어 있다. TMO 경로의 첫 번째 단계에서 톨루엔은 톨루엔 모노옥시게나아제에 의해 P-크레졸로 바뀐다. PmKRl은 첫 번째 단계의 모노옥시게나아제 반응을 촉매하는 독특한 다성분의 효소 체계를 생산해 낸다. Whited(상기 문헌 참조)에 따르면 적어도 세가지의 단백질 성분, 옥시게나아제( 50,000 d. 및 32,000 d. 의 적어도 두 개의 소단위체), 페러독신(23,000 d.) 및 NADH 산화환원요소(분자량 모름)가 포함된다.
현재 TMO 경로의 효소 및 단백질에 대한 생화학을 이해하고 유전적 연구(Yen 등의, Abstract, University of Geneva EMBO Workshop 1986년 8월 31일 - 9월 4일 참조)를 시작하는데 있어서의 실질적인 진보에도 불구하고, 본 기술은 PmKRl 에서의 톨루엔 모노옥시케나아제 체계의 효소 및 단백질을 암호화하는 유전자나, 특정한 미생물적 생물전환반응에서의 이러한 유전자와 유전자 산물의 유용성에 관한 정보를 제공하지 못했다. 또한 본 기술은 PmKRl 톨루엔 모노옥시 게나아제 유전자를 포함하는 새로운 재조합 플라스미드를 포함하는 미생물 숙주세포를 제공하지 못했는데, 이러한 특정 미생물 숙주세포는 야생형 PmKRl 세포의 활성도를 능가하는 수준으로 톨루엔 모노옥시게나아제 효소 활성도를 발현한다.
[본 발명의 요약]
본 발명은 새로운 유전자 단편, 생물학적으로 기능적인 플라스미드와 재조합 플라스미드 및 미생물 숙주세포를 제공하는데, 이들 모두는 PmKRl 톨루엔 모노옥시케나아제 유전자를 포함한다. 또한 본 발명은 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함하는 새로우 재조합 플라스미를 포함하는 미생물 숙주세포를 제공하는데, 이 숙주세포는 야생형 PmKRl 세포의 활성도를 능가하는 수준으로 톨루엔 모노옥시게나아제 효소 활성도를 발현한다. 또한 본 발명은 미생물적 생물전환 반응에 이용되는 PmKRl톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물 숙주세포를 이용하는 방법도 제공한다. 따라서 본 발명은 톨루엔 모노옥시게나아제 효소 및 단백직을 과잉생산하도록 유전공학 처리한 미생물을 제공하며, 이 효소 체계에 의존적인 생물전환 반응을 이행하는 데 더욱 효과적인 방법을 제공한다.
본 발명은 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함하는 PmKRl 으로부터 유도된 생물학적으로 기능적인 플라스미드를 제공한다. pAUTl으로 명명된 이 플라스미드는 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자 체계가 결여되어 톨루엔을 P-크레졸로 전환시킬 수 없는 미생물 숙주세포내로 접합에 의해 전이될 수 있다. 특히 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, pAUTl 플라스미드용 미생물 숙주 세포는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)Y2101 이다.
또한 본 발명은 PmKRl 으로부터 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 분리한 후 적합한 자가복제 플라스미드 벡터내로 다양한 DNA 유전자 단편을 클로닝하여, 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자 단편을 포함하는 일련의 재조합 플라스미드를 만드는 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함한다. 각각의 재조합 플라스미드 생물학적 기능을 가지며 미생물 숙주 세포가 톨루엔을 P-크레졸로 전환할 수 있도록 미생물 숙주세포를 형질전환시키는 데 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 이러한 일련의 형질전환된 미생물 숙주세포를 포함한다. 특히 본 발명의 바람직한 실시형태에서의 미생물 숙주 세포는 E. coli HB101 이고, 재조합 플라스미드는 pMY402 이며 유도물질은 이소프로필-티오갈락토시드(IPTG)이다. pMY402 재조합 플라스미드는 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 암호하는 4.6 kb 의 Xho I 단편을 pMMB66EH 플라스미드[Furste 등의 Gene 48 : 119 - 131(1986)에 삽입한 것이다. 특히 본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 미생물 숙주세포는 E.coli FM5 이고 재조합 플라스미드는 pKY287 이며 유도물질은 열(42℃)이다. pKY287 재조합 플라스미드는 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 암호화하는 4.6 Kb 의 Xho I 단편을 pCFM1146 플라스미드(하기의 실시예 7 에서 제조)에 삽입한 것이다. 결과 산물인 재조합 숙주세포는 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 분리해낸 야생형 PmKRl 세포의 활성도를 능가하는 수준에서 톨루엔 모노옥시게나아제 효소 활성도를 발현한다.
본 발명은 PmKRl 또는 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물 숙주세포를 사용하는 특정한 미생물적 생물전환 반응 방법, 특히 선택된 페닐화합물을 선택된 페놀화합물로 전환시키는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 바람직한 실시형태에 있어서, PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물 숙주세포를 사용하여 P-히드록시페닐아세트산을 생물전환시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 PmKRl 세포나 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물 숙주세포를 사용하여 인돌로부터 인디고를 미생물적 생성하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명의 양상 및 장점은 하기의 상세한 설명을 고려하면 본 분야의 숙련자들에게는 명백해질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제(TMO) 경로의 단계를 도시한 도면이다.
제2도는 pKY235 플라스미드 벡터의 지도를 도시한 것이다.
제3도는 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드, 플라스미드 벡터 및 PmKRl DNA 부분의 제한지도를 요약해서 도시한 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 방법 및 물질은 본 발명의 실시예에서 설명하고 있는데, 현재로서 가장 바람직한 실시형태는 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 효소체계를 위한 유전자를 암호화하는 PmKRl 기원의 플라스미드에서 유래한 DNA 유전자 부분에 관한 것을 포함한다. 접합이나 형질전환으로, 이들 플라스미드에서 유래한 DNA 유전자 부분을 특정한 미생물 숙주세포내로 삽입하여 발현시킬 수 있다. PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함하는 미생물 숙주세포는 특정한 생물전환 방법에 유용하다.
본 발명은 첨부한 도면을 참고로하여 하기 실시예로 설명된다.
실시예에는 DNA 의 분리, 제한 효소로 DNA 절단, 벡터구성, 플라스미드와 같은 벡터내로 흥이밌는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 유전자 부분의 삽입 또는 결과적으로 생성된 재조합 플라스미드를 미생물 숙주세포로 삽입하는데 이용된 일반적인 방법에 대한 자세한 설명은 포함되어 있지 않다. 그러한 방법은 유전공학 분야의 숙련자 들에게 잘 알려져있고, Maniatis 등의, Moilecular Cloing - ALaboratory Maunl, Cold Spring Harbor Laboratory(1982) ; Davis 등의, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co.(1986) ; Currint Protocal, in Molecular Biology Ausubel 등의, 편집, Greene Publishing Associates 및 Wiley Intersciente
(1987) 와 같은 수많은 출판물에 기술되어 있다.
[실시예 1]
PmKRl 세포의 성장
톨루엔 모노옥시게나아제 유전자의 성장 및 유도를 위해 슈도모나스 멘도시나 KR-1을 톨루엔(증기형태로 공급)과 함께 PAS 배지 또는 PAS 한천 플레이트 (Chakrabarty 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 70 : 1137 - 1140, 1973 참조)에서 30℃로 밤새 성장시켰다.
[실시예 2]
E. coli HB101 내에서의 PmKRl Bgl II 라이브러리 구성
A. PmKRl DNA 의 제조
통상적인 방법으로 전체 DNA를 PmKRl에서 분리하였다. 간단하게, 실시예 1 의 톨루엔 포함하는 PAS 배지내로 PmKRl을 접종하고 30℃ 에서 흔들면서 밤새(13-17시간) 항온시켰다. 항온 시킨후, 원심분리하여 정지 성장기에 있는 PmKRl 세포를 수집하였다. 세포를 용해한 다음 Dhaese 등의, Nucleic Acid Res. 7 : 1837 - 1849 (1973) 에 기술된대로 전체 PmKRl DNA를 추출하여 정제하였다.
B. 플라스미드 DNA 의 제조
pRK290 플라스미드를 포함하는 E.coli HB101[Ditta 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77 : 7347 - 7351 (1980) 참조]을 L 육즙에 접종한 뒤 35℃에서 밤새 진탕배양하였다. 박테리아 세포를 원심분리기로 수집하여 용해한 뒤, 원심분리하여 대량의 염색체 DNA 와 세포 잔여물을 제거하였다. 다음 pRK290 플라스미드 DNA를 세슘 클로라이드/에티디움 브로마이드 밀도 기울기를 사용하는 통상적인 기술을 사용하여 정제하였다.
C. 재조합 플라스미드의 제조
상기 A 부분에서 수득한 전체 PmRKl DNA 와 상기 B 부분에서 수득한 pRK290 플라스미드 DNA를 완전히 분해되는 조건하에서 제한 엔도 뉴클레아제 Bgl II로 각각 처리하였다. Bgl II 로 절단한 PmKl DNA를 Bal II 로 절단한 pRK290 과 혼합한 다음 이 혼합물을 DNA 리가아제와 항온시켰다.
D. 재조합 플라스미드로 형질전환
상기 C 부분에서 수득한 결합 DNA를 E.coli HB101을 형질전환시키는데 사용하였고, 형질전환된 세포를 10 ㎍/ml 의 테트라싸이클린을 포함하는 L - 한천 선택 플레이트에 도말하였다. 성공적으로 형질전환되고 pRK290 플라스미드나 PmKRl DNA를 포함하는 재조합 pRK290 플라스미드를 포함하는 세포만이 선택 플레이트에서 성장할 수 있다. 실시예 3 의 접합 및 상보 선별 검정에 의해 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드의 존재를 알아내기 위해 선택 플레이트에서 자란 콜로니를 실험하였다.
[실시예 3]
접합 및 상보 선별 검정
박테리아 접합을 통한 플라스미드 전이와 관련된 상보 검정은 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 검출 하기 위하여 실시예 2 에 의해 제조된 PmKRl Bgl II 라이브러리와 실시예 8 에 의해 제조된 PmKRl Sac I 라이브러리를 선별하는데 사용되었다. 따라서, 하기에 그 방법이 간략히 요약되어 있는 Yen 및 Gunsalus 의 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79 ; 874 - 878(1982)에 기술된 접합(교배) 방법에 의해 박테리아 균주 사이로 플라스미드를 전이시켰다.
L - 육즙을 살짝 긁어 실시예 2 또는 실시예 8 의 선택 플레이토로부터 콜로니를 제거하였다. 결과적으로 생성된 박테리아 세포 현탁액을 세척하여 테트라싸이클린을 제거한 후 접합시키기 위하여 L - 육즙내에 현탁시켰다. 대수기에 있는 기증세포, 헬퍼(helper)세포 (만약 필요하다면) 및 수용세포를 동부피로 혼합하였다. 모든 유형의 세포가 성장하도록 혼합물의 소량의 분취량을 L - 한천 플레이트에 도말하였다. 30℃에서 밤새 항온시킨 후 50 ㎍/ml 테트라사이클린을 포함하는 PAS 한천 선택 플레이트에 세포를 다시 도말하였다. 성장을 위한 유일한 탄소원으로서 톨루엔을 제공하였다. 톨루엔 증기를 면으로 막은 톨루엔을 포함하는 관을 플레이트의 뚜껑에 테이프를 붙여 선택 플레이트에 공급하였다. 이선택 플레이트는 성장을 위해 바람직한 접합완표체만을 허용한다.
실시한 모든 실험에서, 기증 세포는 접합시 전이될 재조합 플라스미드(PmKRl 유전자 단편을 포함하는 pRK290 또는 pKY235)를 운반하는 E. coli HB101 라이브러리(실시예 3 의 Bgl II 라이브러리 또는 실시예 8의 Sac I 라이브러리)에서 수득하였다. 사용한 헬퍼 세포는 tra 유전자를 수반하지 않는 이들 전이 플라스미드에 전이 기능을 제공하는 플라스미드인 헬퍼 플라스미드 pRK2013을 수반하는 E. coli HB101 세포이다. 택일적으로, 전이 기능을 제공하기 위해 헬퍼 플라스미드 pRK2013 기증세포 안으로 직접 삽입하였다. 수용 균주는 실시예 4 에 기술된 대로 제조한 슈도모나스 멘도시나 KR - 1 의 여러 변이 균주(Pm Y4001, Pm Y4002, Pm Y4007)중의 하나였다. 각각의 변이 균주는 불완저한 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 가지며 톨루엔을 P - 크레졸로 전환시킬 수 없다. 수용균주내 불완전한 특이 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드가 접합하는 동안 성공적으로 전이되면, 생성된 접합완료체는 성장을 위한 유일한 탄소원으로 톨루엔을 포함하는 선택 플레이트에서 콜로니를 성장시킬 수 있을 것이다.
선택 플레이트에서 성장한 콜로니는 선택 플레이트에서 각각의 콜로니를 한 번 또는 두 번 재도말하여 정제했다. 이들 접합완료체를 실시예 5 에 따라 더 조작하였다.
[실시예 4]
슈도모나스 멘도시나 KR-1 변이 균주의 제조
PmKRl 세포를 변이시킨 후, 다음 프로토콜에 따라 톨루엔 모노옥시게나아제 결핍 변이균주를 분리하였다. 그 후 5 ml 의 L - 육즙에서 O.D.660이 약 0.7 로 될 때가지 세포를 배양하고, 0.2 mg/ml의 농도로 N - 메틸 - N' - 니트로 - N - 니트로소구아니딘(니트로소구아니딘)을 포함하는 pH 6.0 의 50mM 시트르산 완충액 2 ml에 재현탁하였다. 실온에서 20 분간 향온시킨 후, pH 7.0 의 1 M 인산 완충액 2ml 로 2 회 세척하고 50 ml 의 L - 육즙에 재현탁하였다. 밤새 배양한 후 단일 콜로니를 이루도록 L - 한천 플레이트 상에 상기 세포를 스트리킹하였다. 개개의 콜로니를 따로 거둔 후 유일한 탄소원으로 톨루엔 또는 P - 크레졸을 포함하는 PAS 플레이트 상에 스트리킹 하였다. 톨루엔 모노옥시게나아제 결핍 변이체인 PmY4001, PmY4002 및 PmY4007은 P - 크레졸에서는 성장하나 톨루엔에서는 성장하지 않는 균주로서 분리하였다. 실시예 11에 기술한 톨루엔 모노옥시게나아제 분석은 이들 변이체가 톨루엔 모노옥시게나아제 결핍효소 체계임을 입증해주었다.
이와 유사한 돌연변이유발 기술은 TMO 경로의 효소인 P - 히드록시 벤즈알데히드 탈수효소가 결핍된 변이체를 수득하는 데 사용할 수 있다. 상기와 같이 PmKRl 세포에 니트로소구아니딘을 처리한 후,P-히드록시벤즈알데히드 탈수효소가 결핍된 변이체는 P-히드록시벤조에이트에서는 성장하나 톨루엔, P-크레졸, P - 히드록시벤질알콜 또는 P - 히드록시벤즈알데히드에서는 성장하지 않는 균주로 분리하였다.
[실시예 5]
9.4 kb Bgl II 단편의 분리
실시예 3 의 방법에 따라 분리한 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함하는 12 개의 PmY4001 접합완료체 콜로니를 다음과 같이 특정화하였다. 각 콜로니를 배양하고 플라스미드 DNA를 통상적인 방법으로 분리하였다. 각 분리물로부터의 플라스미드 DNA를 E. coli HB101 세포를 형질전환시키는 데 사용하였다. 선택 플레이트가 테트라싸이클린 및 글루코스(2 mg/ml)를 포함하는 것을 제외하고는 실시예 3 의 방법으로 접합하여 각 형질전환체내의 플라스미드를 PmY4001로 전이시켰다. 50㎍/ml 의 테트라싸이클린과 톨루엔 증기가 보충된 PAS 한천 위에 세포를 도말하여 톨루엔 상에서 각 접합완료체의 성장을 실험하였다. 톨루엔 모노옥시게나아제로 보충된 플라스미드의 활성도를 접합완료내에서 확인한 후, 각 HB101 형질전환체를 배양하고 통상적인 방법으로 플라스미드 DNA를 분리하였다.
DNA를 Bgl II로 절단한 후, 톨루엔을 이용하기는 하지만 실시예 4의 각 PmKRl 변이 균주에 상보적인 각 접합완료체 콜로니로부터 9.4 kb 의 단편을 분리하였다. 이러한 결과는 PmKRI으로부터의 9.4kb의 Bgl II 단편이 하나 또는 그 이상이 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 포함함을 의미한다. 두 Sac I 부위를 9.4kb 의 Bgl II 단편의 한쪽 말단에 가깝게 위치시켰다.
[실시예 6]
pKY235 플라스미드 벡터의 구성
pKY235 플라스미드의 제조를 위한 출발 물질로 Yen 및 Gun - salus, J. Bacteriol. 162 : 1008 - 13 (1985) 에 기술된 pKY217 플라스미드를 사용하였다. pKY235 플라스미드는 다음과 같은 일련의 단계로 제조하였다. 첫째 단계에서는, nahR 과 nahG 유전자를 포함하는 pKY217 로 부터의 5.1 kb Hind III 단편을 Bagdasarian 등의 Gene 26 : 273 - 82 (1983) 에 기술된 pKT240 플라스미드의 Hind III부위에 클로닝시켰다. 이 첫단계에서 수득한 플라스미드를 pKY219 로 명명하였다. 둘째 단계에서는 nahR 과 nahG 유전자를 포함하는 pKY219 로부터의 약 7 Kb Bam H I - Sac I 단편을 Bagdasarian등의, Gene 16 : 236 - 47(1981)에 기술된 pKT231 플라스미드의 Bam HI 및 Sca I 부위에 클로닝시켰다. 그 결과 생성된 플라스미드를 pKY223 으로 명명하였다. 그 다음단계 에서는 nahR 유전자, 200 염기쌍의 nahG 유전자 및 카나마이신 저항성을 부여하는 유전자를 포함하는 pKY223 으로부터의 6 Kb Pst I 단편을 Yanisch - Perron 등의 Gene 33 : 103 - 119(1985)에 기술된 pUC19 플라스미드의 Pst I 부위에 클로닝 시켰다. 그 결과 생성된 플라스미드를 pKY256 으로 명명하였다. pKY256 내의 6 Kb Pst I 단편의 배열은 nahG 유전자 내의 Pst I 부위에 하류쪽에 위치한 Sal I 으로부터 EcoR I 부위까지는 pUC 19 의 다중클로닝 부위내로 위치시킨다. 마지막 단계에서, 카나마이신 저항성을 부여하는 유전자, nagR 유전자, 200 염기쌍의 nahG 유전자 및 다중클로닝 부위를 포함하는 pKY256 으로부터의 5.4kb BstE II - Eco R I 단편 말단을 E.coli DNA 폴리머라아제 I 의 큰 단편으로 충진시키고, pRK290 의 약 1 kb Sma I 단편을 치환하기 위해 Ditta 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77 : 7347 - 7351 (1980)에 기술된 pRK290 플라스미드내로 삽입한다. 그 결과 생성되는 플라스미드들 pKY235로 명명하고, pKY235의 지도는 제 2 도에 나타냈다.
[실시예 7]
pCFM1146 플라스미드 벡터의 구성
pCFM1146 플라스미드 제조시 출발 물질로 pCFM836 플라스미드를 사용하였다. pCFM386을 포함하는 발현벡터의 구조에 대한 상세한 설명은 본 발명에 참고로 인용한 미국 특허 제 4,710,473 호에 기술되어 있다. pCFM836 플라스미드는 열 유도성 촉진제, 제한 부위 뱅크(클로닝 집락), 복제의 플라스미드 기원, 전사 종결자, 유전자 조절 플라스미드 복제수, 및 카나마이신 저항성을 부여하는 유전자를 포함하나 클로닝 집락 바로 앞의 합성 리보좀 결합 부위는 포함하지 않는다. pCFM1146 플라스미드는 Cla I 과 Xba I 제한 부위 사이의 작은 DNA 서열을 다음 올리고뉴클레오티드로 치환하고 두 내재성 Nde I 제한 부위를 Nde I 으로 절단시킨 다음 T4 폴리머라이제 효소로 충진시킨 후 블런트 말단 결합시킴으로써 pCFM836 으로부터 유도하였다 :
5' CGATTTGATT 3'
3' TAAACTAAGATC 5'
[실시예 8]
E. coli HB101 내의 PmKRl Sac I 라이브러리의 구성
통상적인 게놈 라이브러리 제조 기술에 따라 E. coli HB 101 내의 Sac I 라이브러리를 제조하기 위해 실시예 6 에 의해 제조한 pKY235 플라스미드 벡터를 사용하였다. PmKRl 으로 부터의 총 DNA를 실시예 2 의 A 부분에 기술한 방법으로 분리하였다. 분리한 PmKRl DNA를 부분분해 조건하에서 제한 엔도뉴클레아제 Sac I 으로 처리하였다. Sac I 라이브러리 제조에 사용하기 위한 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자의 일부 또는 전부를 포함하는 단편내에 풍부한 DNA 단편을 생산하기 위하여, 부분적으로 분해된 PmKRl DNA를 통상적인 방법으로 10% - 40% 밀도의 수크로오스 기울기법을 사용하여 크기별로 분획화하였다. SW - 28 원심분리관 및 회전기에서 26,000 rpm 으로 24 시간동안 원심분리 한 후 DNA 분획을 모으고 혼성화로 시험하였다. 톨루엔을 이용하기는 하지만 실시예 5 에 의한 각 PmKRl 변이균주에 상보적 이어서 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 적어도 하나 포함할 것으로 알려진, 실시예 3 에 의해 구성된 Bgl II 라이브러리로부터 분리한 9.4 kb 의 Bgl II 단편을 방사성표지하여 수크로오스 기울기법으로부터 혼성화 분획을 분리하기 위한 프로브로서 사용하였다. PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 함유 단편에 풍부한 일군의 DNA 단편을 제공하기 위하여 혼성화 분획을 모았다. 이 풍부한 DNA 단편을 Sac I 라이브러리 구성에 사용하였다.
풍부한 Sac I 으로 절단된 PmKRl DNA를 Sac I 으로 절단된 pKY235 플라스미드 DNA 와 혼합한 후 리가아제와 함께 향온시켰다. 결합된 DNA 는 E. coli HB101을 형질전환시키는데 사용하고 형질전환된 세포는 10㎍/ml 테트라싸이클린을 포함하는 L - 한천 선택 플레이트 상에 도말하였다. 효과적으로 형질전환되고 pKY235 플라스미드 또는 PmKRl DNA를 갖는 재조합 pKY235 플라스미드를 포함하는 세포는 상기 선택 플레이트 상에서 성장할 수 있다. 실시예 3 의 접합 및 상보 분석으로 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자에 대하여 형질전환된 콜로니를 검사하였다.
[실시예 9]
20.5 kb Sac I 단편의 분리
플라스미드 DNA를 분리하고 E. coli HB101을 형질전환한 후 실시예 5 에 따라 톨루엔 상의 성장을 시험하기 위하여 PmY4001 내로 접합함으로써 탄소원으로 톨루엔을 이용한 10 개의 접합완료체를 보다 특정화하였다. 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 수반하는 재조합 pKY235 플라스미드(pKY266 으로 명명)를 포함하는 E.coli HB101 형질전환체(1988년 4월 5일자로 기탁한 A.T.C.C. 제 67671 호)를 배양하고 통상적인 방법으로 플라스미드 DNA를 분리하였다. pKY266 플라스미드 내의 삽입물의 제한 효소 분석 결과 각각 두 개 10.2 kb 및 10.3 kb 의 Sac I 단편을 수반함을 시사한다. 10.2 kb 의 Sac I 단편은 실시예 5 에 기술한 9.4 kb Bgl II 단편의 8 kb를 포함한다.
[실시예 10]
톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 지도화하는 재조합 플라스미드의 구성
pKY266 의 10.2 kb Sac I 단편을 Yanisch - Perron 등의 Gene 33 : 103 - 119 (1985)에 기술된 높은 복제수의 E. coli 발현 벡터 pUC19로 서브클로닝한 후 그 결과 생성되는 재조합 플라스미드를 pKY277로 명명하였다. 이 pKY277 플라스미드는 E. coli JM109세포를 형질전환하는데 사용하였다. JM109/pKY 277로 명명한 새로운 E.coli 균주는 L - 육즙내의 인디고 특성을 가지는 푸른 색소를 합성하였다. 또한 이 균주내에서 톨루엔 모노옥시게나아제 활성도를 검출하였다. 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자 지도는 톨루엔 모노옥시게나아제 활성도의 존재와 함께 상관관계를 나타냈다(표1 참조).
pKY277 의 10.2 kb Sac I 단편을 일련의 제한 효소로 절단하여 생성된 부분 제한 지도는 제3도와 같다. 이 제한 지도를 기본으로 제3도에 나타난 플라스미드 pKY280, pKY281, pKY282 및 pKY283을 생성하도록 pKY277 내에 있는 10.2 kb Sac I 단편의 한쪽 말단으로부터 일련의 DNA 단편을 제거하였다. pKY 282의 4.6 kb Xho I 단편은 pUC19 의 Sal I 부위에 서브클로닝시켜 플라스미드 pMY 401을 제조하였다. 4.6 kb Xho I 단편을 포함하는 pMY 401을 제조하였다. 4.6 kb Xho I 단편을 포함하는 pMY 401 의 4.6 kb Bam HI - Sph I 단편을 Yanisch-perron등의 Gene 33 : 103 - 119 (1985)에 기술된 바와 같은 E. coli 발현벡터 pUC 18 에 삽입하여 플라스미드 pMY 404를 제조하였다. 다클로닝 부위가 lac 촉진자에 대하여 반대 방향인 것을 제외하고는 pUC 18 플라스미드는 pUC 19 와 동일하다. 그 결과 lac 촉진자에 대한 pUC 19 플라스미드의 방향과는 반대 방향으로 4.6 Xho I 단편을 pUC 18 플라스미드에 삽입하였다. pKY 277 의 4.6 kb Xho I 단편을 Furste 등의 Gene 48 : 119 - 131(1986)에 기술된 광범위한 숙주 범위를 갖는 플라스미드 벡터 pMMB66EH에 클로닝시켜 플라스미드 pMY 402를 제조하였다. 또한 제3도에서와 같이 Sac I 및 Bgl II 로 pKY 282 DNA를 절단시키고 E. coli DNA 폴리머라아제 I 의 큰 단편으로 말단을 채운 후 말단끼리 결합시킴으로써 2.2 kb Sac I - Bgl II 단편을 pKY282 의 5.9 kb Sac I - Xma I 단편의 왼쪽 말단으로부터 제거하였다. 그 결과 생성된 플라스미드를 pMY 400 으로 명명하였다.
표 1 (실시예 11 의 분석에 따른)에 기술된 바와 같이, 세포를 포함하는 pMY 402 는 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 유도하는 IPTG 에 반응한다. 이 결과는 4.6 kb 의 Xho I 단편내의 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 일정 장소에 위치시키며, 제3도에 나타났듯이 왼쪽에서 오른쪽으로 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자의 전사 방향을 밝혔다. 세포를 포함하는 pMY 401 과 pMY 404 내의 톨루엔 모노옥시게나아제 활성도 차이 뿐만아니라 pMY 401 과 pMY 404 내의 4.6 kb Xho I 단편의 방향의 차이 (표 1)는 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자의 전사방향과 일치한다. 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 높은 수준으로 발현시키기 위하여 pKY 282 의 4.6 kb Xho I 단편을 E. coli 발현벡터 pCFM 1146 (실시예 7 에 기술)의 Xho I 부위에 클로닝시켜 pKY 287을 제조하였다.
[실시예 11]
톨루엔 모노옥시게나아제 검정
0.4%의 글루타민산염을 포함하는 PAS 배양액 또는 L - 육즙내에서 포화되도록 세포를 배양하였다. 이들을 O.D.660이 3.0이 될 때까지 적합한 부피의 동일 배양액에 재현탁시켰다. 바이오-래드 단백질 검정을 사용하는 Bradford, Anal. Biochem. 72 : 248 (1976)의 방법으로 단백질 농도를 측정하는 데 분취량의 세포를 사용하였다. 세포 0.5 ml를 4μmoles 의 P - 크레졸 10μl 및 15 nmole 의 방사성 톨루엔(톨루엔 - 고리 -14C, 시그마 케미컬 캄파니에서 구입, 56.3 mCi/mmole) 5μl 와 혼합한 후, 가끔식 교반시키면서 실온에서 20 분간 혼합물을 항온시켰다. 항온한 후, 20μl 의 혼합물을 작은 박층 크로마토그래피 플레이트에 점점이 떨어뜨리고 이 플레이트를 20 분간 공기 건조시켰다. 필터에 남은 비휘발성인 방사성은 액체 섬광 계수기로 측정하고 플레이트 상의 톨루엔 분해 생성물의 양과 톨루엔 모노옥시게나아제 비활성도를 측정하는데 사용하였다.
그 결과는 표 1 에 나타나 있다.
Figure kpo00001
[실시예 12]
특정한 페닐 화합물의 페놀 화합물로의 전환
A. PmKRl 세포에 의한 전환
톨루엔, 메틸페닐아세트산, 에틸페닐아세트산, 2 - 페닐에탄올, 아세트아닐리드, 플류오로벤젠 및 에틸벤젠을 포함하는 다수의 페닐 화합물이 가질로 작용하면 PmKRl 의 톨루엔 모노옥시게나아제 체계의 의한 파라 - 히드록시화를 통하여 페놀 화합물로 전환될 수 있다. 다음은 가능한 몇가지의 전환 경로를 나타낸 것이다 :
경로 A
Figure kpo00002
이 식에서
I 은 톨루엔이고
II 는 P-크레졸이다
경로 B
Figure kpo00003
이 식에서
III은 메틸페닐아세트산이고
IV는 P - 히드록시메틸페닐아세트산이다
경로 C
Figure kpo00004
이식에서
V 는 2 - 페닐에탄올이고
VI은 P - 히드록시 - 2- 페닐에탄올이다.
각 전환에 있어서, 페닐 화합물 기질(예를들면 식 I,III 또는 V)을 PmKRl 세포와 혼합하고 생물전환에 효과적으로 되도록 충분한 시간동안 항온시킨 후 다음과 같이 페놀 화합물이 존재하는지를 분석하였다.
슈도모나스 멘도시나 KRl 세포를 0.4 % 의 글루타민산염을 보충한 50 ml PAS 배양액에서 2.5 ml 의 톨루엔으로 공급한 톨루엔 증기하에(유도) 또는 증기의 부재하에서(비유도) 25℃ - 30℃ 로 정지기(12 - 16 시간)까지 배양한다. 5-50ml의 세포 분취량을 상기와 동일한 부피의 동일 배양액으로 재현탁하여 같은 배양액으로 2.5배 농축시킨다. 15 - 30 mM 의 용액을 형성하도록 주어진 량의 기질 당량을 세포와 혼합하고, 혼합물은 1 내지 24 시간동안 격렬히 흔들면서 25 ℃ 내지 30 ℃에서 항온시켰다. 이 혼합물을 5 내지 6 시간 동안 항온하여 Gupta 등의 Clin. Biochem. 16 (4) : 220 - 221 (1983) 에 기술된 검정 방법으로 페놀 화합물의 형성을 결정하였다. 다양한 항온 온도 및 시간에 따른 몇몇 페닐 기질의 페놀 화합물로의 전환에 대한 검정 결과를 표 2 에 나타냈다.
Figure kpo00005
B. PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 암호하는 재조합 플라스 미드를 포함하는 미생물 숙주 세포에 의한 전환
A 부분에 따른 동일한 전환은 실시예 10 의 재조합 플라스미드를 포함하는 미생물 숙주 세포를 사용하여 완성할 수 있다. 기능적인 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 암호화하는 재조합 플라스미드(pKY 283 또는 pMY 400 제외)는 실시예 10 에 기술한 적합한 미생물 숙주 세포를 형질전환하는데 사용할 수 있다. 실시예 11 에 기술한 바와 같이, 재조합 플라스미드로 pMY 402를 사용하고, 미생물 숙주 세포로 E. coli HB 101, 유도물질로 IPTG를 사용하는 것이 바람직하다. 그 결과 생성되는 균주는 HB 101/pMY 402로 명명하였다. 그 밖의 바람직한 방법으로는 재조합 플라스미드로 pKY 287을, 미생물 숙주 세포로 E. coli FM5를, 유도물질로 열(42℃에서 1 내지 3 시간)을 사용하는 것이 있다. 그 결과 생성되는 균주는 FM5/pKY 287 로 명명하였다.
각 전환에 있어서, 페닐 화합물(예를들면 식 I, III 또는 V를 가지는 화합물)을 HB 101/pMY 402 또는 FM5/pKY287 세포와 혼합한다.
각 혼합물을 충분한 시간동안 항온시켜 생물전환한 후, 페놀 화합물의 존재여부를 부분 A 에 기술된 바와 같이 검정하였다. HB 101/pMY 402 세포로 인한 각 생물전환에 있어서, 이 세포는 다음과 같이 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 활성도를 유도하도록 IPTG 의 존재하에 배양하여 분석하여야 한다. 세포를 0.4 % 의 글루타민산염 및 1 mM 의 IPTG를 포함하는 PAS 배양액 또는 1 mM 의 IPTG를 포함하는 L - 육즙내에서 포화되도록 배양한다. 이 세포를 적당한 부피의 동일 배양액으로 O.D.이 3.0 으로 될 때까지 재현탁한 후 기질과 함께 항온하고 부분 A 에 기술된 바와 같이 검정한다. FM5/pKY 287 세포로 인한 각 생물전환에 있어서, PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 활성도를 유도하도록 세포를 다음 온도에서 배양하여야 한다. O.D.이 0.4 가 되도록 FM5/pKY 287 세포를 육즙내에서 배양한다. 이 배양액을 3 시간 동안 42℃에서 진탕배양한 후 30℃로 이동시켜 2 시간동안 더 배양한다. O.D.이 3.0 이 되도록 세포를 신선한 L - 육즙내에서 재현탁한 후 기질과 함께 항온시키고 부분 A 에 기술된 방법으로 검정한다.
[실시예 13]
톨루엔에서 p - 히드록시페닐아세트산으로의 전환
A. PmKRl 세포에 의한 전환
톨루엔 기질을 p - 히드록시페닐아세트산으로 전환시키기 위하여, 실시예 4 에 기술한 바와같은 불완전한 p - 히드록시벤즈알데히드 탈수소효소를 포함하는 PmKRl 변이체와 톨루엔 혼합한 후, 톨루엔이 p - 히드록시벤질알콜로 전환되기에 충분한 시간동안 항온시킨다. 둘째 단계에서는, 본 발명에 참고문헌으로 인용한 미국 특허 제 4,482,497 호 ; 제 4,659,518 호 ; 제 4,631,348 호의 방법에 따라 p - 히드록시벤질알콜이 p - 히드록시페닐아세트산으로 전환되기에 충분한 농도 및 온도하에서 p - 히드록시벤질알콜 중간체를 포함하는 세포 혼합물을 니켈(Ni) 및 일산화탄소(CO) 와 반응시킨다. 그 전환 경로는 다음과 같다 :
Figure kpo00006
B. PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 암호하는 재조합 플라스미드를 포함하는 미생물 숙주 세포에 의한 전환
A부분에 따른 동일한 전환은 p-크레졸 수산화효소 유전자 및 실시예 10의 재조합 플라스미드를 포함하는 미생물 축주 세포를 사용하여 실시할 수 있다. p - 크레졸 수산화효소 유전자는 이러한 유전자를 포함하는 다양한 미생물 (PmKRl 또는 플라스미드 pND 50)로부터 통상적인 유전공학 기술을 사용하여 클로닝할 수 있다(Hewetson 등의, Genet. Res. Camb. 32 : 249 - 255, 1978 참조). 기능적인 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 암호하는 재조합 플라스미드(pKY 283 또는 pMY 400 은 제외)는 실시예 10 에 기술한 적합한 미생물 숙주 세포를 형질 전환하는데 사용할 수 있다. 바람직한 방법은 HB 101/pMY 402 세포를 사용하는 것이다. 그 밖의 바람직한 FM5/pKY 287 세포를 사용한다.
A 부분에 기술한 바와 같이 전환시키기 위하여 실시예 12 에 기술한 바와같이, 성장시켜 IPTG 로 유도한 HB 101/pMY 402 세포 또는 성장시켜 열로 유도한 FM5/pKY 287 세포를 톨루엔과 혼합한다. 이 혼합물을 톨루엔이 p - 히드록시벤질알콜로 전환되기에 충분한 시간동안 항온시킨 후 A 부분에 따라 Ni 및 CO 와 반응시켜 p - 히드록시페닐아세트산으로의 전환을 완결시킨다.
[실시예 14]
메틸페닐아세트산의 p - 히드록시페닐아세트산으로의 전환 A. PmKRl 세포에 의한 전환
메틸페닐아세트산 기질을 p - 히드록시페닐아세트산으로 전환시키기 위하여, 실시예 12 에 기술한 바와같이 배양한 PmKRl 과 메틸페닐아세트산을 혼합하고 메틸페닐아세트산이 p - 히도록시메틸페닐아세트산으로 전환되기에 충분한 시간동안 항온한다. 둘째 단계에서는, p - 히드록시페닐아세트산 중간체를 포함하는 세포 혼합물을 p - 히드록시메틸페닐아세트산이 p - 히드록시페틸아세트산으로 전환되기에 충분한 농도 및 온도에서 산 가수분해한다. 그 전환 경로는 다음과 같다 :
Figure kpo00007
B. PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 암호하는 재조합 플라스미드를 포함하는 미생물 숙주 세포에 의한 전환
A 부분에 따른 동일한 전환을 실시예 10 의 재조합 플라스미드를 포함하는 미생물 숙주 세포를 사용하여 실시할 수 있다. 기능적인 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 암호하는 재조합 플라스미드 (pKY283 또는 pMY 400 제외)는 실시예 10 에 기술한 적합한 미생물 숙주 세포를 형질전환하는데 사용할 수 있다. 바람직한 방법은 HB 101/pMY 402 세포를 사용하는 것이다. 그 밖의 바람직한 방법은 FM5/pMY 287 세포를 사용하는 것이다.
A 부분에 기술한 바와 같이 전환시키기 위하여 실시예 12 에 기술한 바와 같이, 성장시켜 IPTG 로 유도한 HB 101/pMY 402 세포 또는 성장시켜 열로 유도한 FM5/pKY 287 세포를 메틸페닐아세트산과 혼합한다. 이 혼합물을 P - 히드록시메틸아세트산의 생물전환을 위해 충분한 시간 동안 항온한 후 P - 히드록시페닐아세트산을 수득하기에 충분한 산 농도 및 온도에서 이 혼합물을 산 가수분해한다.
[실시예 15]
인돌(Indole)에서 인디고(Inidgo)로의 전환
A. PmKRl 세포에 의한 전환 인돌 기질을 인디고로 전환시키기 위하여, 50 ㎍/ml 의 인돌을 실시예 12 에 기술한 바와같이 배양한 PmKRl 세포와 혼합한 후, 인돌이 인디고로 전환되기에 충분한 시간, 일반적으로 48 시간 동안 항온시켰다.
Ensley 의 미국 특허 제 4,520,103 호의 실시예 5 에 기술된 바와같은 방법을 사용하여 세포 혼합물로부터 인디고를 분리해낼 수 있다.
B. PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 암호하는 재조합 플라스미드를 포함화는 미생물 숙주 세포에 의한 전환
A 부분에 따른 동일한 전환은 실시예 10 의 재조합 플라스미드를 포함하는 미생물 숙주 세포를 사용하여 실시할 수 있다. 기능적인 PmKRl 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 암호하는 재조합 플라스미드(pKY 283 또는 pMY 400 제외)는 실시예 10 에 기술한 적합한 미생물 숙주 세포를 형질전환하는데 사용할 수 있다. 바람직한 방법은 HB 101/pMY 402 세포를 사용하는 것이다. 다른 바람직한 방법은 FM5/pKY 287 세포를 사용하는 것이다.
A 부분에 기술한 바와같은 전환을 위하여, 실시예 12 에 기술한 바와같이 성장시켜 IPTG 로 유도한 HB 101/pMY 402 세포 또는 성장시켜 열로 유도한 FM5/pKY 287 세포를 인돌과 혼합한다. 이 혼합물을 인돌이 인디고로 생물전환되기에 충분한 시간동안 항온시킨다.
A 부분의 방법에 따라 세포 혼합물로부터 인디고를 분리할 수 있다.

Claims (9)

  1. 슈도모나스 멘도시나 KR-1 으로 부터 분리한 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 암호하는, 제3도에 도시한 제한 지도를 갖는 20.5 Kb Sac I 단편 또는 그의 아단편을 포함하는 DNA 부분.
  2. pKY235를 포함하는 플라스미드 벡터.
  3. pCFM1146을 포함하는 플라스미드 벡터.
  4. 슈도모나스 멘도시나 KR-1으로부터 분리한 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자를 암호하는 제3도에 도시한 제한 지도를 갖는 20.5 kb 의 Sac I 단편 또는 그의 활성 아단편인 DNA 부분이 삽입된, 제2도에 도시한 지도를 가지며 실시예 6 에 기술된 바와같이 제조한 25 kb 의 pKY235 플라스미드 벡터를 포함하는, 생물학적으로 기능적이며 톨루엔을 p - 크레졸로 전환시킬 수 있는 능력이 없는 미생물 숙주 세포를 형질전환시켜 그러한 능력을 부여하는 재조합 플라스미드.
  5. 제4항의 재조합 플라스미드로 형질전환시킨 E. coli HB101을 포함하는 미생물 숙주 세포.
  6. 히드록시화 반응에 의해 페닐 화합물을 페놀 화합물로 미생물적 생물전환시키기 위한 방법에 있어서, 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자의 유도물질로 처리한 제5항의 미생물 숙주 세포와 페닐 화합물을 반응시킴을 특징으로 하는 미생물적 생물전환 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 페닐 화합물이 톨루엔, 메틸페닐아세트산, 에틸페닐아세트산, 2-페닐에탄올, 아세트아닐리드, 플루오로벤젠 또는 에틸벤젠을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  8. (a) 제5항의 미생물 숙주 세포와 톨루엔을 반응시키고, (b) 톨루엔이 p - 히드록시페닐아세트산으로 전환되기에 충북한 시간동안 Ni 및 일산화탄소로 처리함을 포함하는, 톨루엔의 p - 히드록시페닐아세트산으로의 미생물적 생물전환 방법.
  9. 톨루엔 모노옥시게나아제 유전자의 유도물질로 처리한 제5항의 미생물 숙주세포와 메틸페닐아세트산을 반응시키고, (b)메틸페니아세트산이 p - 히드록시페닐아세트산으로 전환되기에 충분한 시간동안 산으로 가수분해시킴을 포함하는, 메틸페닐아세트산의 p - 히드록시페닐아세트산으로의 미생물적 생물전환 방법.
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