NO301548B1 - Fremgangsmåte for mikrobiell bioomdannelse av en utvalgt fenylforbindelse, samt mikroorganismevertsceller, rekombinante plasmider og DNA-segment - Google Patents
Fremgangsmåte for mikrobiell bioomdannelse av en utvalgt fenylforbindelse, samt mikroorganismevertsceller, rekombinante plasmider og DNA-segment Download PDFInfo
- Publication number
- NO301548B1 NO301548B1 NO894845A NO894845A NO301548B1 NO 301548 B1 NO301548 B1 NO 301548B1 NO 894845 A NO894845 A NO 894845A NO 894845 A NO894845 A NO 894845A NO 301548 B1 NO301548 B1 NO 301548B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- recombinant plasmid
- microorganism host
- host cell
- toluene
- fragment
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 104
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- -1 Phenyl Compound Chemical class 0.000 title claims description 8
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims description 8
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 303
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 claims description 61
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 44
- XQXPVVBIMDBYFF-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XQXPVVBIMDBYFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N p-cresol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1 IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- YPGCWEMNNLXISK-UHFFFAOYSA-N hydratropic acid Chemical compound OC(=O)C(C)C1=CC=CC=C1 YPGCWEMNNLXISK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 11
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 claims description 10
- 241000589755 Pseudomonas mendocina Species 0.000 claims description 10
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 claims description 10
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 10
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 9
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- YNQLUTRBYVCPMQ-UHFFFAOYSA-N Ethylbenzene Chemical compound CCC1=CC=CC=C1 YNQLUTRBYVCPMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N N-phenylacetamide Chemical compound CC(=O)NC1=CC=CC=C1 FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 claims description 3
- OFJWFSNDPCAWDK-UHFFFAOYSA-N 2-phenylbutyric acid Chemical compound CCC(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 OFJWFSNDPCAWDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001413 acetanilide Drugs 0.000 claims description 2
- PYLWMHQQBFSUBP-UHFFFAOYSA-N monofluorobenzene Chemical compound FC1=CC=CC=C1 PYLWMHQQBFSUBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 91
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 22
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- BVJSUAQZOZWCKN-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=C(O)C=C1 BVJSUAQZOZWCKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- RGHHSNMVTDWUBI-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC=C(C=O)C=C1 RGHHSNMVTDWUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 8
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 8
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 6
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 6
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 101150057066 nahG gene Proteins 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- FWZBPBKAANKOJQ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(hydroxymethyl)phenyl]acetic acid Chemical group OCC1=CC=C(CC(O)=O)C=C1 FWZBPBKAANKOJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGSWEKYNAOWQDF-UHFFFAOYSA-N 3-methylcatechol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1O PGSWEKYNAOWQDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybenzoate Chemical compound OC1=CC=C(C([O-])=O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010007733 Catabolic state Diseases 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 2
- 101100186375 Pseudomonas putida nahR gene Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003169 complementation method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 101150027505 nahR gene Proteins 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- YCCILVSKPBXVIP-UHFFFAOYSA-N 2-(4-hydroxyphenyl)ethanol Chemical compound OCCC1=CC=C(O)C=C1 YCCILVSKPBXVIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000001055 blue pigment Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000005817 monooxygenase reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000003385 ring cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
- C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
- C12P7/12—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing sulfite waste liquor or citrus waste
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Oppfinnelsens bakgrunn
Den foreliggende oppfinnelse retter seg mot bruken
av rekombinant DNA-teknikker for å overføre til mikroorganismevertceller egenskapen for utvalgte bioomdannelser. Oppfinnelsen er mer spesifikt rettet mot kloningen av toluenmonooxygenasegener fra en nylig isolert ogkarakterisertPseudomonas-art, Pseudomonas mendocina KR-1. Den foreliggende oppfinnelse gir således genetisk modifiserte mikroorganismer som overproduserer toluenmonooxygenase-enzymer og -proteiner og gir derfor mer effektive hjelpemidler for å utføre bioomdannelser som er avhengige av dette enzymsystem.
Nylig ble en bakterie identifisert som Pseudomonas mendocina KR-1 (PmKRl), isolert av Richardson og Gibson fra en algeprøve tatt fra en ferskvannsjø. Whited, Ph.D. disputas, universitetet i Texas, Austin, bibliotekreferanse nr. W586 (1986). PmKRl benytter toluen som en eneste carbon-og energikilde. Andre arter av Pseudomonas er tidligere blitt isolert og beskrevet som metaboliserer eller degraderer toluen, inkludert Pseudomonas putida mt-2 (Pp mt-2). Williams og Murry, J. Bacteriol. 120:416-423 (1974) og Pseudomonas putida PpFl (PpFl) (Gibson et al., Biochemistry £:1626-1630
(1970)). Imidlertid er genene, enzymene og reaksjonsveiene for toluenmetabolismen i disse ulike Pseudomonas-arter forskjellige og ikke overlappende.
Den katabolske reaksjonsvei for degraderingen av toluen ved Pp mt-2 er blitt betegnet TOL. Genene for TOL-reaksjonsveien er innkodet på isofunksjonelle katabolske plasmider som finnes i visse arter av Pseudomonas. Referanse-plasmidet for TOL-degraderingsreaksjonsveien er pWWO som opprinnelig ble isolert fra Pp mt-2. Genetikken og biokjemien til TOL-reaksjonsveien er godt beskrevet. Kunz og Chapman, J. Bacteriol. 146:179-191 (1981); Williams og Murry, J. Bacteriol. 120:416-423 (1974); Williams og Worsey, J. Bacteriol. 125:818-828 (1976); Worsey og Williams, J. Bacteriol. 124:7-13 (1975); Murry, et al., Eur. J. Biochem. 28:301-310
(1972). En kort oppsummering av TOL-reaksjonsveien er som følger: initialt angrep av toluen skjer på methylgruppen som undergår trinnvise oxydasjoner til å danne benzosyre som videre blir oxydert ved dannelse av en cis-carboxylsyrediol, som blir oxydert til catechol, som så blir degradert av enzymer i en meta-spaltningsreaksjonsvei til acetaldehyd og pyruvat.
En annen katabolsk reaksjonsvei for degraderingen av toluen ved PpFl er blitt etablert og - betegnet TOD. I mot-setning til TOL-reaksjonsveien er genene for TOD-reaksjonsveien lokalisert på bakteriekromosomet og er ikke kodet for av plasmid. Finette, et al., J. Bacteriol. 160:1003-1009
(1984); Finette, Ph.D. disputas, universitetet i Texas,
Austin, bibliotekreferanse nr. F494 (1984). Genetikken og biokjemien til TOD-reaksjonsveien er blitt studert av Finette, et al. (supra); Finette (supra); Gibson, et al., Biochemistry 2:1626-1630 (1970); Kobal, et al., J. Am. Chem. Soc. 9J5:4420-4421 (1973); Ziffer, et al., J. Am. Chem. Soc. 95:4048-4049 (1973); Dagley, et al., Nature 202:775-778
(1964); Gibson, et al., Biochemistry 7:2653-2662 (1968). En
kort oppsummering av TOD-reaksjonsveien er som følger: det initiale angrep på toluen skjer ved et dioxygenaseenzymsystem å danne (+)-cis-1(S),2(R)-dihydroxy-3-methylcyclohexa-3,5-dien(cis-toluendihydrodiol) som blir oxydert i 3-methyl-catechol som videre blir degradert av enzymer i en meta-spaltningsreaks j onsvei.
En tredje katabolsk reaksjonsvei for degraderingen av toluen er nylig blitt identifisert i PmKRl. Det er blitt funnet at PmKRl kataboliserer toluen ved en ny reaksjonsvei som er fullstendig forskjellig fra begge de to reaksjons-veier som er beskrevet ovenfor. Richardson og Gibson, Abst. Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol. K54:156 (1984). Den katabolske reaksjonsvei for degraderingen av toluen ved PmKRl er blitt betegnet TMO fordi det første trinnet i reaksjonsveien blir katalysert av et unikt enzymkompleks, toluenmonooxygenase. Biokjemien til enzymene og proteinene i denne reaksjonsvei er nylig blitt studert i detalj av Whited, Ph.D. doktoravhand- ling, universitetet i Texas, Austin, bibliotekreferanse nr. W586 (1986).
En kort oppsummering av TMO-reaksjonsveien i PmKRl
er som følger: i det første trinn blir toluen oxydert til p-cresol, etterfulgt av methylgruppeoxydering slik at p-hydroxybenzoat blandes, fulgt av hydroxylering til 3,4-dihydroxy-benzosyre og deretter orthoringspaltning. Trinnene i TMO-reaksj onsveien som beskrevet av Whited (supra), er vist i diagram i fig. 1. I det første trinn av TMO-reaksjonsveien blir toluen overført ved toluenmonooxygenase til p-cresol. PmKRl arbeider med et unikt multikomponentenzymsystem som katalyserer dette første monooxygenasereaksjonstrinn. Ifølge Whited, (supra), er minst tre proteinkomponenter involvert: oxygenase (minst 2 subenheter av 50.000d. og 32.000d.), ferredoxin (23.000d.) og NADH oxidoreduktase (molekylvekt ukjent).
Fagkunnskapen er i dag, til tross for de betydelige fremskritt i forståelsen av biokjemien til enzymene og proteinene i TMO-reaksjonsveien og begynnende genetiske studier (Yen et al., Abstract, universitetet i Geneve EMBO Workshop, 31. august - 4. september, 1986), ikke blitt forsynt med informasjon vedrørende genene som koder for enzymene og proteinene i toluenmonooxygenasesystemet i PmKRl eller anvend-barheten av slike gener og genprodukter i visse mikrobielle bioomdannelser. Fagkunnskapen er heller ikke blitt forsynt med mikroorganismevertceller som inneholder nye rekombinante plasmider som inneholder PmKRl toluenmonooxygenasegener der visse av disse mikroorganismevertcellene uttrykker toluen-monooxygenaseenzymaktivitet på nivåer som overskrider aktivi-teten til villtype PmKRl-celler.
Oppsummering av o<p>pfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et rekombinant plasmid som omfatter en plasmid-vektor i hvilken et DNA-segment er blitt innsatt, kjennetegnet ved at DNA-segmentet koder for toluenmonooxygenasegener isolert fra Pseudomonas mendocina KR-1, og at det rekombinante plasmid er biologisk funksjonelt og har den identifiserbare egenskap å være i stand til å transformere og overføre egenskapen å omdanne toluen til p-cresol til en mikroorganismevertscelle som mangler slik egenskap.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en mikroorganismevertscelle som er kjennetegnet ved at den er transformert med det rekombinante plasmid ifølge krav 1.
I tillegg tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse et DNA-segment som er kjennetegnet ved at det omfatter det 20,5 kb Sac I-fragment som har restriksjonskartet vist i fig. 3, eller et subfragment av dette, idet DNA-segmentet koder for toluenmonooxygenasegener isolert fra Pseudomonas mendocina KR-1.
Den foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for mikrobiell bioomdannelse av en utvalgt fenylforbindelse til en utvalgt fenolforbindelse ved hydroxylering, kjennetegnet ved at fenylforbindelsen omsettes med en mikroorganismevertscelle, idet mikroorganismevertscellen er blitt transformert med et rekombinant plasmid ifølge krav 1, og som er blitt behandlet med et induserende middel for toluenmonooxygenasegener .
Den foreliggende oppfinnelse omfatter også en mikrobiell enzymatisk fremgangsmåte for fremstilling av p-hydroxyfenyleddiksyre fra methylfenyleddiksyre, kjennetegnet ved at(a) methylfenyleddiksyre omsettes med mikroorganismevertsceller ifølge krav 9, idet mikroorganismevertscellene er blitt behandlet med et induserende middel for toluenmonooxygenasegener, og (b) det hydrolyseres med syre i en tilstrekkelig tid inntil methylfenyleddiksyren omdannes kvantitativt til p-hydroxyfenyleddiksyre.
Den foreliggende oppfinnelse omfatter videre en mikrobiell enzymatisk fremgangsmåte for fremstilling av indigo fra indol, kjennetegnet ved at indol omsettes med en mikroorganismevertscelle, idet mikroorganismevertscellen er blitt transformert med et rekombinant plasmid ifølge krav 1, og som er blitt behandlet med et induksjonsmiddel for toluenmonooxygenasegener .
Kort beskrivelse av figurene
Fig. 1 illustrerer trinnene i PmKRl-toluenmonooxygenase (TMO)-reaksjonsveien.
Fig. 2 viser et kart av pKY235-plasmidvektoren.
Fig. 3 illustrerer en oppsummering av rekombinante plasmider, plasmidvektorer og restriksjonskart til PmKRl DNA-segmentene som inneholder toluenmonooxygenasegener.
Detaljert beskrivelse
Fremgangsmåtene og materialene som gir en illustra-sjon av utøvelsen av oppfinnelsen, og som omfatter de nåværende foretrukne utførelsesformer, er spesielt relatert til plasmid-bårne DNA-gensegmenter av PmKRl-opprinnelse som koder for genene til PmKRl-toluenmonooxygenaseenzymsystemet. Ved konjugering eller transformasjon kan disse plasmid-bårne DNA-gensegmenter bli introdusert og uttrykt i visse mikroorganismevertceller. Mikroorganismevertcellene som inneholder PmKRl-toluenmonooxygenasegener, er anvendbare i en fremgangsmåte for visse bioomdannelser.
Oppfinnelsen blir nå illustrert ved de følgende eks-empler med referanse til de ledsagende illustrasjoner. Eks-emplene inkluderer ikke detaljerte beskrivelser for konvensjonelle metoder som benyttes i isoleringen av DNA, klyvingen av DNA med restriksjonsenzymer, konstruksjonen av vektorer, innsettingen av DNA-gensegmenter som koder for polypeptider av interesse, inn i slike vektorer (f.eks. plasmider) eller overføringen av de resulterende rekombinante plasmider inn i mikroorganismevertceller. Slike metoder er velkjente for fagfolk innen genetisk ingeniørkunst og er beskrevet i tall-rike publikasjoner som inkluderer de følgende: Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co. (1986); Current Protocols in Molecular Biology, utgitt av Ausubel et al., Greene Publishing Associates og Wiley Interscience
(1987).
Eksempel 1
Vekst av PmKRl- celler
Pseudomonas mendocina KR-1 ble dyrket over natten ved 30°C i PAS-medium eller på en PAS-agarplate (Chakrabarty, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 70:1137-1140 (1973)) med toluen (tilført som damp) for vekst og for induksjon av toluenmonooxygenasegenene.
Eksempel 2
Konstruksjon av PmKRl Bgl II- bibliotek i E. coli HB101
A. Fremstilling av PmKRl- DNA
Total DNA ble isolert fra PmKRl ved konvensjonelle metoder. I korte trekk ble PmKRl inokulert i PAS-medium som inneholdt toluen ifølge eksempel 1 og inkubert ved risting ved 30°C over natten (13-17 timer). Etter inkubasjon ble PmKRl-celler i den stasjonære vekstfase oppsamlet ved sentrifugering. Cellene ble lysert, og total PmKRl-DNA ble så ekstrahert og renset som beskrevet av Dhaese et al., Nucleic Acid Res. 7:1837-1849 (1979).
B. Fremstilling av plasmid- DNA
E. coli HB101 som inneholdt pRK290-plasmidet (Ditta, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 11_'. 13A1- 1151 (1980)), ble inokulert i L-medium og inkubert under omristing ved 37°C over natten. Bakteriecellene ble oppsamlet ved sentrifugering, lysert, og mesteparten av kromosomal DNA og cellulære elementer ble fjernet ved sentrifugering. pKR290-plasmid-DNA ble så renset ved konvensjonelle teknikker ved bruk av cesiumklorid/ethidiumbromid-tetthetsgradienter.
C. Fremstilling av rekombinant plasmid
Total PmKRl-DNA isolert i del A ovenfor og pRK290-plasmid-DNA isolert i del B ovenfor, ble behandlet separat med restriksjonsendonuclease Bgl II, under betingelser for fullstendig fordøyelse. Bgl II-fordøyd PmKRl-DNA ble blandet
med Bgl II-fordøyd pRK290-plasmid-DNA og blandingen deretter i inkubert med DNA-ligase.
D. Transformasjon med rekombinant plasmid
Det ligerte DNA som ble oppnådd i del C ovenfor, ble brukt for å transformere E. coli HB101, og de transformerte cellene ble utplatet på seleksjonsskåler med L-agar som inneholdt 10/ug/ml tetracyklin. Bare de cellene som ble vellykket transformert og de som inneholdt pRK290-plasmidet eller et rekombinant pRK290-plasmid med PmKRl-DNA, kan vokse på seleksjonsskålene. Kolonier som vokste på seleksjonsskålene, ble testet for tilstedeværelsen av rekombinante plasmider som inneholdt PmKRl-toluenmonooxygenasegener ved konjugerings- og komplementerings-screeningsmetoden i eksempel 3.
Eksempel 3
Konjugerings- og komplementerings- screeningsmetode
En komplementeringsmetode som involverer plasmidover-føring via bakteriell konjugering, ble benyttet for å screene PmKRl- Bgl II-biblioteket som var laget ifølge eksempel 2 og PmKRl- Sac I-biblioteket som var laget ifølge eksempel 8 for å oppdage rekombinante plasmider som inneholdt PmKRl-toluenmonooxygenasegener. Følgelig ble plasmidene overført mellom bakterielle stammer ved konjugerings- ("mating") fremgangsmåten beskrevet av Yen og Gunsalus, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 7_9_:874-878 (1982) hvis fremgangsmåte er summert i korthet som følger.
Kolonier ble fjernet fra seleksjonsskålene i eksempel 2 eller eksempel 8 ved mild skraping med L-medium. Den resulterende bakterielle cellesuspensjon ble vasket for å fjerne alt tetracyklin og suspendert i L-medium for "mating". Suspensjoner av donorceller, hjelpeceller (hvis nødvendig) og mottagerceller i logaritmisk vekstfase ble blandet i like volumer. Små prøver av blandingen ble satt ut på L-agarskåler for således å tillate alle celletyper å vokse. Etter inkubering over natten ved 30°C ble cellene sådd om på en PAS-agar-seleksjonsskål som inneholdt 50 /ug/ml tetracyklin. Toluen ble tilsatt som eneste carbonkilde for vekst. Toluendamp ble forsynt til seleksjonsskålen ved å tape et bomulls- tilstoppet toluenholdig rør til lokket på skålen. Denne seleksjonsskål tillater bare de ønskede transkonjugater å vokse. I alle utførte eksperimenter var donorcellene fra et E. coli HBlOl-bibliotek (enten Bgl II-biblioteket i eksempel 3 eller Sac I-biblioteket i eksempel 8) som inneholdt et rekombinant plasmid (pRK290 eller pKY235 inneholdende PmKRl-gensegmenter) som skulle overføres i "mating"-prosessen. Hjelpecellene som ble benyttet, var E. coli HBlOl-celler som inneholdt hjelpeplasmidet pRK2013 som ga overføringsfunk-sjonene for de overføringsplasmider som ikke inneholdt tra-genene. Alternativt ble hjelpeplasmid pRK2013 introdusert direkte i donorcellene for å gi dets overføringsfunksjon. Mottagerstammen var én av flere muterte stammer av Pseudomonas mendocina KR-1 (Pm Y4001, Pm Y4002, Pm Y4007) behandlet som beskrevet i eksempel 4. Hver av de muterte stammene har et defekt toluenmonooxygenasegen og er ikke i stand til å omdanne toluen til p-cresol. Når et rekombinant plasmid som inneholder det spesifikke PmKRl-toluenmonooxygenasegen som er defekt i mottagerstammen, er blitt vellykket transformert under konjugeringen, vil det resulterende transkonjugat være i stand til å vokse som en koloni på seleksjonsskålene som inneholder toluen som den eneste carbonkilde for vekst.
Koloniene som vokste på seleksjonsskålene, ble renset ved å så ut hver koloni en eller to ganger på seleksjonsskåler. Disse transkonjugatene er videre blitt manipulert ifølge eksempel 5.
Eksempel 4
Fremstilling av Pseudomonas mendocina KR- l- muterte stammer
PmKRl-celler ble mutert, og de toluenmonooxygenase-defekte mutanter ble isolert ifølge den følgende fremgangsmåte. Cellene ble dyrket i 5 ml av L-medium til O.D.g<g>Q på omtrent 0,7 og resuspendert i 2 ml av 50 mM citratbuffer pH 6,0 inneholdende N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
i (nitrosoguanidin) i en konsentrasjon på 0,2 mg pr. ml. Etter inkubasjon ved romtemperatur i 20 minutter ble cellene vasket
to ganger med 2 ml av 1 M fosfatbuffer pH 7,0 og resuspendert i 50 ml av L-medium. Etter dyrkning over natten ble cellene utsådd på L-agarskåler som enkeltkolonier. De individuelle koloniene ble plukket og streket ut på PAS-skåler som inneholdt toluen eller p-cresol som eneste carbonkilde. De toluenmonooxygenase-defekte mutanter, PmY4001, PmY4002 og PmY4007, ble isolert som stammer som vokste på p-cresol, men ikke på toluen. Toluenmonooxygenasemetoden som beskrevet i eksempel 11, bekreftet videre at disse mutanter har et defekt toluenmonooxygenaseenzymsystem.
Lignende mutageniseringsteknikker kan bli benyttet for å oppnå mutanter som er defekte i enzymet p-hydroxybenzaldehyd-dehydrogenase i TMO-reaksjonsveien. Etter nitroso-guanidinbehandling av PmKRl-celler som beskrevet ovenfor, er p-hydroxybenzaldehyd-dehydrogenase-defekte mutanter isolert som stammer som vokser på p-hydroxybenzoat, men ikke vokser på toluen, p-cresol, p-hydroxybenzylalkohol eller p-hydroxybenzaldehyd.
Eksempel 5
Isolering av 9, 4 kb Bgl II- fragment
Et antall (12) av de transkonjugerte kolonier av PmY4001 som inneholdt PmKRl-toluenmonooxygenasegener isolert ifølge eksempel 3, ble viderekarakterisertsom følger. Hver koloni ble dyrket, og plasmid-DNA ble isolert ved konvensjonelle metoder. Plasmid-DNA fra hvert isolat ble benyttet for å transformere E. coli HBlOl-celler. Plasmidet i hver transformant ble overført til PmY4001 ved konjugering ifølge eksempel 3 unntatt at seleksjonsskålene inneholdt tetracyklin og glucose (2 mg/ml). Hvert transkonjugat ble testet for vekst på toluen ved å så ut cellene på PAS-agar supplert med 50/ug/ml tetracyklin og toluendamp. Etter at toluenmono-oxygenasekomplementerende aktivitet til plasmidet var bekreftet i transkonjugatene, ble hver HBlOl-transformant dyrket og plasmid-DNA isolert ved konvensjonelle metoder. DNA ble fordøyd med Bgl II, og et 9,4 kb fragment ble isolert fra hver transkonjugatkoloni som komplementerte hver PmKRl-mutantstamme i eksempel 4 for toluenutnyttelse. Dette resultatet indikerer at 9,4 kb Bgl II-fragmentet fra PmKRl inneholdt ett eller flere toluenmonooxygenasegener. To Sac I- seter ble kartlagt å ligge nær en av endene til 9,4 kb Bgl
II- fragmentet.
Eksempel 6
Konstruksjon av pKY235- plasmidvektor
Startmaterialet for konstruksjonen av pKY235-plasmidet var pKY217-plasmidet beskrevet av Yen og Gunsalus, J. Bacteriol. 162:1008-13 (1985). pKY235-plasmidet ble konstruert i henhold til den følgende serie av trinn. I det første trinn ble et 5,1 kb Hind III-fragment fra pKY217 inneholdende nahR- og nahG-genene, klonet i Hind III-setet til pKT240-plasmidet beskrevet av Bagdasarian et al., Gene 26:273-82
(1983). Det resulterende plasmid fra dette trinn ble betegnet pKY219. I det annet trinn ble et omtrent 7 kb Bam HI - Sac I-fragment fra pKY219 inneholdende nahR- og nahG-genene, klonet inn i Bam HI- og Sac I-setene til pKT231-plasmidet beskrevet av Bagdasarian et al., Gene 16:237-47
(1981). Det resulterende plasmid ble betegnet pKY223. I det neste trinn ble et 6 kb Pst I-fragment fra pKY223 inneholdende nahR-genet, 200 basepar av nahG-genet og genet som overførte kanamycinresistens, klonet i Pst I-setet til pUC19-plasmidet beskrevet av Yanisch-Perron et al., Gene 3_3:103-119 (1985). Det resulterende plasmid ble betegnet pKY256. Orienteringen til 6 kb Pst I-fragmentet i pKY256 plasserte multikloningssetet av pUC19 fra Sal I- til Eco RI-setet like nedstrøms for Pst I-setet i nahG-genet. I det endelige trinn ble et 5,4 kb BstE II - Eco RI-fragment fra pKY256 inneholdende genet som overfører kanamycinresistens, nahR-genet, 200 basepar av nahG-genet og et multippelt kloningssete, ende-utfylt ved hjelp av det store fragment av E. coli DNA-polymerase I og innsatt i pRK290-plasmidet beskrevet av Ditta et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A.
77:7347-7351 (1980) for å erstatte det omtrent 1 kb Sma I-fragment i pRK290. Det resulterende plasmid ble betegnet pKY235, og et kart av pKY235 er vist i figur 2.
Eksempel 7
Konstruksjon av pCFMll46- plasmidvektor
Startmaterialet for konstruksjonen av pCFMH46-plasmidet var pCFM836-plasmidet. En detaljert beskrivelse av konstruksjonen av ekspresjonsvektorer, inkludert pCFM836, er beskrevet i US patent 4.710.473, som herved er inkorporert ved referanse i sin helhet. pCFM836-plasmidet inneholder en varmeinduserbar promoter, en restriksjonssetebank (klonings-område), plasmidorigo for replikasjon, en transkripsjons-terminator, gener som regulerer plasmidkopitall og et gen som overfører kanamycinresistens, men intet syntetisk ribosom-bindingssete like foran kloningsområdet. pCFM1146-plasmidet ble utviklet fra pCFM836 ved å erstatte den lille DNA-sekvensen mellom de unike Cia I- og Xba I-restriksjonssetene med det følgende oligonucleotid
og ved å ødelegge de to endogene Nde I-restriksjonsseter ved spaltning med Nde I og deretter utfylling med T^-polymerase-enzym etterfulgt av like-ende-ligering.
Eksempel 8
Konstruksjon av PmKRl- Sac. I- bibliotek i E. coli HB101
pKY235-plasmidvektoren utviklet ifølge eksempel 6, ble benyttet til å konstruere et Sac I-bibliotek i E. coli
i HB101 ifølge konvensjonelle teknikker for å konstruere genomiske biblioteker. Total DNA fra PmKRl ble isolert som beskrevet i eksempel 2, del A. Den isolerte PmKRl-DNA ble behandlet med restriksjonsendonuclease Sac I under betingelser for partiell fordøyelse. For å produsere en populasjon i av DNA-fragmenter anriket med hensyn til de fragmenter som inneholder noen eller alle av PmKRl-toluenmonooxygenasegenene
for bruk i konstruksjon av dette Sac I-bibliotek, ble den partielt fordøyde PmKRl-DNA fraksjonert etter størrelse ved bruk av 10-40% sucrose-tetthetsgradient ifølge konvensjonelle fremgangsmåter. Etter sentrifugering i 24 timer ved 26.000 rpm i et SW-28-sentrifuge-rør og -rotor ble DNA-fraksjonene samlet og testet ved hjelp av hybridisering. Det 9,4 kb Bgl II-fragment isolert fra Bgl II-biblioteket konstruert ifølge eksempel 3, og som var i stand til å komplementere hver PmKRl-mutantstamme med hensyn til toluenutnyttelse ifølge eksempel 5 og således sannsynligvis inneholdt minst ett av PmKRl-toluenmonooxygenasegenene, ble radioaktivt merket og benyttet som probe (markør) for å selektere hybridiserende fraksjoner fra sucrosegradienten. De hybridiserende fraksjoner ble samlet for å gi en populasjon av DNA-fragmenter anriket i PmKRl-toluenmonooxygenaseholdige fragmenter. Denne anrikede populasjon av DNA-fragmenter ble benyttet for å konstruere Sac I-biblioteket.
Den anrikede Sac I-fordøyde PmKRl-DNA ble blandet med Sac I-fordøyd pKY235-plasmid-DNA og inkubert med DNA-ligase. Den ligerte DNA ble benyttet for å transformere E. coliHB101, og de transformerte cellene ble utsådd på seleksjonsskåler av L-agar inneholdende 10/ug/ml tetracyklin. Bare de cellene som ble transformert på en vellykket måte og inneholdt pKY235-plasmidet eller et rekombinant pKY235-plasmid med PmKRl-DNA, kan vokse på seleksjonsskålene. Transformerte kolonier ble testet for PmKRl-toluenmonooxygenasegener ved konjugasjons- og komplementerings-metoden i eksempel 3.
Eksempel 9
Isolering av 20, 5 kb Sac I- fragment
Et antall (10) av transkonjugatene som utnyttet toluen som eneste carbonkilde, ble viderekarakterisert vedå isolere plasmid-DNA, transformere E. coli HB101, og å kon-jugere inn i PmY4001 for å teste vekst på toluen ifølge eksempel 5. En E. coli HBlOl-transformant som inneholdt et rekombinant pKY235-plasmid (betegnet pKY266) inneholdende tolu enmonooxygenasegener, ble dyrket og plasmid-DNA isolert ved konvensjonelle metoder. Restriksjonsenzymanalyse av innskudd i pKY266-plasmid indikerte at det inneholdt to Sac I-fragmenter på hhv. 10,2 kb og 10,3 kb. 10,2 kb Sac I-fragmentet inneholder 8 kb av det 9,4 kb Bgl II-fragment beskrevet i eksempel 5.
Eksempel 10
Konstruksjon av rekombinante plasmider for å kartlegge
i toluenmonooxygenasegenene
Det 10,2 kb Sac I-fragment til pKY266 ble videre subklonet inn i den høye kopitall E. coli-ekspresjonsvektor pUC19 beskrevet av Yanisch-Perron et al., Gene 33:103-119
(1985), og det resulterende rekombinante plasmid ble be-
I tegnet pKY277. pKY277-plasmidet ble benyttet for å transformere E. coli JMl09-celler. Denne nye E. coli-stamme betegnet JMl09/pKY277, syntetiserte et blått pigment med egenskaper som forventet av indigo i L-medium. Toluenmonooxygenaseaktivitet ble også oppdaget i denne stammen. Videre kartlegging av toluenmonooxygenasegenene viste korrelasjon mellom den indigoproduserende egenskap og nærværet av toluenmonooxygenaseaktivitet. (Se tabell I).
Det 10,2 kb Sac I-fragment av pKY277 ble fordøyd med en rekke restriksjonsenzymer, og et partielt restriksjons-5kart ble utviklet som vist i figur 3. På bakgrunn av dette restriksjonskart ble en rekke DNA-fragmenter deletert fra en ende av det 10,2 kb Sac I-fragment i pKY277 for å danne plasmidene pKY280, pKY281, pKY282 og pKY283 som vist i figur
3. Et 4,6 kb Xho I-fragment i pKY282 ble subklonet i Sal
3I-setet til pUC19 for å danne plasmid pMY401. Et 4,6 kb Bam HI - Sph I-fragment av pMY401 som inneholdt 4,6 kb Xho I-fragmentet, ble innsatt i E. coli-ekspresjonsvektoren pUC18 beskrevet av Yanisch-Perron et al., Gene 3_3:103-119 (1985)
for å danne plasmidet pMY404. pUCl8-plasmidet er identisk
5med pUC19 bortsett fra at polykloningssetet er i motsatt orientering med hensyn til lac-promoteren. Som et resultat av dette, ble 4,6 Xho I-fragmentet innsatt i pUC18-plasmidet i en motsatt orientering til den i pUC19-plasmidet med hensyn til lac-promoteren. 4,6 kb Xho I-fragmentet av pKY277 ble også klonet inn i den bredspektrede vertplasmidvektoren pMMB66EH beskrevet av Furste et al., Gene 48:119-131 (1986) for å konstruere plasmidet pMY402. I tillegg som vist i figur 3, ble et 2,2 kb Sac I - Bgl II-fragment deletert fra den venstre ende av det 5,9 kb Sac I - Xma I-fragment av pKY282 ved å fordøye pKY282-DNA med Sac I og Bg_l II, og fylle ut endene med det store fragmentet av E. coli DNA-polymerase I og ligere endene. Det resulterende plasmid ble betegnet pMY400.
Som vist i tabell I (ifølge målemetoden i eksempel 11), responderte pMY402-holdige celler overfor IPTG med induksjon av toluenmonooxygenasegenene. Dette resultat lokaliserte toluenmonooxygenasegenene i 4,6 kb Xho I-fragmentet og viste transkripsjonsretningen til toluenmonooxygenasegenene å være fra venstre til høyre vist i figur 3. Forskjellen i orienteringen til 4,6 kb Xho I-fragmentet i pMY401 og pMY404 såvel som forskjellen i toluenmonooxygenaseaktivitet i pMY401- og pMY404-holdige celler (tabell I), er også i overensstemmelse med denne transkripsjonsretning til toluenmonooxygenasegenene. For å uttrykke toluenmonooxygenasegenene på et høyt nivå ble 4,6 kb Xho I-fragmentet av pKY282 også klonet inn i Xho I-setet til E. coli-eks-presj onsvektoren pCFMH46 (som beskrevet i eksempel 7) for å konstruere pKY287.
Eksempel 11
Toluenmonooxygenase- målemetode
Celler ble dyrket i PAS-medium som inneholdt 0,4% glutamat eller i L-medium til metning. De ble resuspendert i et passende volum i det samme medium til en O.D.ggQpå 3,0. En prøve av cellene ble benyttet for å bestemme protein-konsentrasjonen ved hjelp av metoden til Bradford, Anal. Biochem. 7_2:248 (1976) ved bruk av Bio-Rad-protein- målemetoden. En prøve på 0,5 ml av celler ble blandet med 4/umol av p-cresol i 10/ul og 15 nmol radioaktivt toluen (toluen-ring-^C, Sigma Chemical Co., 56,3 mCi/mmol) i 5/ul, og reaksjonsblandingen ble inkubert ved romtemperatur med periodevis vortexblanding i 20 minutter. Etter inkubasjon ble 20/ul av blandingen applisert på en liten bit av en tynnsjiktskromatografiplate, og platen ble lufttørret i 20 minutter. Den ikke-fordampbare radioaktivitet forble på filteret og ble bestemt i en væskescintillasjonsteller og ble brukt for å beregne mengden av toluen-degraderingsprodukt på platen og den spesifikke aktivitet til toluenmonooxygenase. Resultatene er presentert i tabell I.
Eksempel 12
Omdannelse av visse fenylforbindelser til visse fenolforbindelser
A. Overføring av PmKRl- celler
Mange fenylforbindelser, inklusive toluen, methylfenyleddiksyre, ethylfenyleddiksyre, 2-fenylethanol, acetanilid, fluorbenzen og ethylbenzen, kan tjene som substrater og således bli omdannet til fenolforbindelser via para-hydroxylering ved hjelp av toluenmonooxygenasesystemet til PmKRl. De følgende skjemaer illustrerer flere mulige omdannelser :
I er toluen II er p-cresol
der:
III er methylfenyleddiksyre
IV er p-hydroxymethylfenyleddiksyre
V er 2-fenylethanol
VI er p-hydroxy-2-fenylethanol
For hver omdannelse ble et fenylforbindelsesubstrat (f.eks. formlene I, III eller V) blandet med PmKRl-celler, inkubert i en periode tilstrekkelig for å utføre bioomdannelsen og så målt med hensyn til tilstedeværelsen av fenolforbindelser som følger.
Pseudomonas mendocina KRl-celler ble dyrket ved 25-30°C i 50 ml PAS-medium supplert med 0,4% glutamat til stasjonær fase (12-16 timer) i tilstedeværelse (indusert) eller fravær (ikke indusert) av toluendamp tilført fra 2,5 ml toluen. En prøve på 5-50 ml celler ble resuspendert i det samme volumet av det samme medium eller konsentrert 2,5 ganger i det samme medium. En gitt mengde av substratet som svarte til å danne en 15-30 mM løsning, ble blandet med cellene, og blandingen ble inkubert ved 25-30°C under kraftig rysting i 1-24 timer. Typisk ble blandingen inkubert i 5-6 timer. Produksjon av fenolforbindelser ble bestemt ifølge målemetoden til Gupta et al., Clin. Biochem. 16_ ( 4):220-221
(1983). Måleresultatene når det gjelder omdannelse av flere
fenylsubstrater til fenolforbindelser til forskjellige tider og temperaturer under inkubasjonen er vist i tabell II.
i
B. O mdannelse ved mikroorganismevertceller som inneholder rekombinante plasmider kodende for PmKRl-toluenmonooxygenaseqener
De samme omdannelser ifølge del A kan bli utført ved å bruke mikroorganismevertceller som inneholder de rekombinante plasmider beskrevet i eksempel 10. Ethvert av de rekombinante plasmider (unntatt pKY283 eller pMY400) som koder for funksjonelle PmKRl-toluenmonooxygenasegener, kan bli benyttet for å transformere en passende mikroorganismevertcelle som beskrevet i eksempel 10. En foretrukket fremgangsmåte ér å bruke pMY402 som det rekombinante plasmid, E. coli HB101, som vertcellen og IPTG som den induserende for-bindelse, som beskrevet i eksempel 11. Den resulterende stamme ble betegnet HB101/pMY402. En annen foretrukket fremgangsmåte er å bruke pKY287 som det rekombinante plasmid, E. coli FM5, som mikroorganismevertcellen og temperatur (42°C i 1-3 timer) som det induserende middel. Den resulterende stamme ble betegnet FM5/pKY287.
For hver omdannelse er en fenylforbindelse (f.eks. formlene I, III eller V) blandet med HB101/pMY402- ellerFM5/pKY287-celler. Blandingen inkuberes i en periode tilstrekkelig for å effektuere bioomdannelsen og så måles som beskrevet i del A med hensyn til nærværet av fenolforbindelser. For hver bioomdannelse med HB101/pMY402-celler må cellene dyrkes og måles i nærvær av IPTG for å indusere PmKRl-toluenmonooxygenaseaktivitet som følger. Celler dyrkes i PAS-medium som inneholder 0,4% glutamat og 1 mM IPTG eller dyrkes i L-medium med 1 mM IPTG til metning. Cellene resuspenderes i et passende volum i det samme medium til en O.D.ggQpå 3,0 og inkuberes med substrat og måles som beskrevet i del A. For hver bioomdannelse med FM5/pKY287-celler må cellene dyrkes under de følgende temperaturbeting-elser for å indusere PmKRl-toluenmonooxygenaseaktivitet.FM5/pKY287-celler dyrkes i L-medium til en O.D.ggQpå 0,4.Kulturene inkuberes under omristing ved 42°C i 3 timer og så forandres til 30°C for inkubering i ytterligere 2 timer. Celler resuspenderes i friskt L-medium til en O.D.g<g>Q på 3,0 og inkuberes med substrat og måles som beskrevet i del A.
Eksempel 13
Omdannelse av toluen til p- hydroxyfenyleddiksyre
A. Omdannelse ved PmKRl- celler
For omdannelsen av toluensubstrat til p-hydroxyfenyleddiksyre blandes toluen med en PmKRl-mutant som inneholder defekt p-hydroxybenzaldehyd-dehydrogenase som beskrevet i eksempel 4, og inkuberes i en periode tilstrekkelig for å effektuere omdannelsen av toluen til p-hydroxybenzylalkohol. I det andre trinn blir celleblandingen som inneholder p-hydroxybenzylalkohol-mellomprodukt, reagert med nikkel (Ni) og carbonmonoxyd (CO) i slike konsentrasjoner og ved slike temperaturer som er tilstrekkelige til å omdanne p-hydroxy- benzylalkoholen til p-hydroxyfenyleddiksyre ifølge fremgangsmåtene beskrevet i US patenter 4.482.497, 4.659.518, 4.631.348 som herved er inkorporert ved referanse. Omdann-elsesskjemaet er illustrert som følger:
B. Omdannelse ved mikroorganismevertceller som inneholder rekombinante plasmider kodende for PmKRl-toluenmonooxygenasegener
Den samme omdannelse som i del A kan oppnås ved å benytte mikroorganismevertceller som inneholder p-cresol-hydroxylasegenet og de rekombinante plasmider i eksempel 10. p-cresol-hydroxylasegenet kan klones ved konvensjonelle gen-teknologiske metoder fra en rekke mikroorganismer som inneholder dette genet, inkludert f.eks. fra PmKRl eller fra plasmid pND50 (Hewetson et al., Genet. Res. Camb. 32:249-255, 1978). Ethvert av de rekombinante plasmider (unntatt pKY283 eller pMY400) som koder for funksjonelle PmKRl-toluenmonooxygenasegener, kan benyttes for å transformere en passende mikroorganismevertcelle beskrevet i eksempel 10. En foretrukket fremgangsmåte er å benytte HBl01/pMY402-celler. En annen foretrukket fremgangsmåte er å benytte FM5/pKY287-celler.
For omdannelsen som illustrert i del A, blandes toluen med HBl01/pMY402-celler dyrket og indusert med IPTG eller FM5/pKY287-celler dyrket og indusert med temperatur som beskrevet i eksempel 12. Blandingen inkuberes i en periode tilstrekkelig til å effektuere omdannelsen av toluen til p-hydroxybenzylalkohol og omsettes deretter med Ni og CO ifølge del A for å effektuere omdannelsen til p-hydroxyfenyleddiksyre.
Eksempel 14
Omdannelse av methylfenyleddiksyre til
p- hydroxyfenyleddiksyre
A. Omdannelse ved PmKRl- celler
For omdannelsen av methylfenyleddiksyresubstrat til p-hydroxyfenyleddiksyre blandes med PmKRl dyrket som beskrevet i eksempel 12 og inkuberes i en periode tilstrekkelig til å effektuere omdannelsen av methylfenyleddiksyre til p-hydroxymethylfenyleddiksyre. I det annet trinn underkastes celleblandingen som inneholder p-hydroxyfenyleddiksyre-mellomprodukt, syrehydrolyse ved syrekonsentrasjoner og temperaturer tilstrekkelige til å omdanne p-hydroxymethyl-fenyleddiksyren til p-hydroxyfenyleddiksyre. Omdannelses-skjemaet er illustrert som følger:
B. Omdannelse ved mikroorganismevertceller som inneholder rekombinante plasmider kodende for PmKRl-toluenmonooxygenaseqener
Den samme omdannelse som i del A kan oppnås ved å bruke mikroorganismevertceller som inneholder de rekombinante plasmider i eksempel 10. Ethvert av de rekombinante plasmider (unntatt pKY283 eller pMY400) som koder for funksjonelle PmKRl-toluenmonooxygenasegener, kan benyttes for å transformere en passende mikroorganismevertcelle beskrevet i eksempel 10. En foretrukket fremgangsmåte er å benytte HB101/pMY402-celler. En annen foretrukket fremgangsmåte er å benytte FM5/pKY287-celler.
For overføringen som illustrert i del A, blandes methylfenyleddiksyre med HBl01/pMY402-celler dyrket og indusert med IPTG eller FM5/pKY287-celler dyrket og indusert med temperatur som beskrevet i eksempel 12. Blandingen inkuberes i en periode tilstrekkelig til å effektuere bioomdannelsen av p-hydroxymethyleddiksyre, og så behandles blandingen med sur hydrolyse ved syrekonsentrasjoner og temperaturer som er tilstrekkelige til å gi p-hydroxyfenyleddiksyre.
Eksempel 15
Omdannelse av indol til indigo
A. Omdannelse ved PmKRl- celler
For omdannelsen av indolsubstrat til indigo ble 50/ug/ml indol blandet med PmKRl-celler dyrket som beskrevet i eksempel 12 og inkubert i en periode tilstrekkelig til å effektuere omdannelsen av indol til indigo, vanligvis 48 timer. Indigoen kan isoleres fra celleblandingen ved fremgangsmåten beskrevet av Ensley i eksempel 5 i US patent nr. 4.520.103.
B. Omdannelse ved mikroorganismevertceller som inneholder rekombinante plasmider kodende for PmKRl-toluenmonooxygenasegener
Den samme omdannelse ifølge del A kan oppnås ved å benytte mikroorganismevertceller som inneholder de rekombinante plasmidene i eksempel 10. Ethvert av de rekombinante plasmider (unntatt pKY283 eller pMY400) som koder for funksjonelle PmKRl-toluenmonooxygenasegener, kan benyttes for å transformere en passende mikroorganismevertcelle beskrevet i eksempel 10. En foretrukket fremgangsmåte er å benytte HBl01/pMY402-celler. En annen foretrukket fremgangsmåte er å benytte FM5/pKY287-celler.
For omdannelsen som illustrert i del A, blandes indol med HBl01/pMY402-celler dyrket og indusert med IPTG eller FM5/pKY287-celler dyrket og indusert med temperatur som beskrevet i eksempel 12. Blandingen inkuberes i en periode tilstrekkelig til å effektuere bioomdannelsen av indol til indigo. Indigoen kan isoleres fra celleblandingen ifølge fremgangsmåten i del A.
Claims (21)
1. Rekombinant plasmid som omfatter en plasmid-vektor i
hvilken et DNA-segment er blitt innsatt,karakterisert vedat DNA-segmentet koder for toluenmonooxygenasegener isolert fra Pseudomonas mendocina KR-1, og at det rekombinante plasmid er biologisk funksjonelt og har den identifiserbare egenskap å være i stand til å transformere og overføre egenskapen å omdanne toluen til p-cresol til en mikroorganismevertscelle som mangler slik egenskap .
2. Rekombinant plasmid ifølge krav 1,
karakterisert vedat plasmidvektoren er pUC18, pUC19, pKY235, pMMB66EH, pMB66HE eller pCFM1146.
3. Rekombinant plasmid ifølge krav 1,karakterisert vedat DNA-segmentet er et 20,5 kb Sac I-fragment som har restriksjonskartet vist i fig. 3 eller har et aktivt subfragment av dette.
4. Rekombinant plasmid ifølge krav 1,karakterisert vedat DNA-segmentet er et 10,2 kb Sac I-fragment som har restriksjonskartet vist i fig. 3.
5. Rekombinant plasmid ifølge krav 1,karakterisert vedat DNA-segmentet er et 7,7 kb Sac I- Bam I-fragment som har restriksjonskartet vist i fig. 3.
6. Rekombinant plasmid ifølge krav 1,karakterisert vedat DNA-segmentet er et 6,2 kb Sac I- Sph I-fragment som har restriksjonskartet vist i fig. 3.
7. Rekombinant plasmid ifølge krav 1,karakterisert vedat DNA-segmentet er et 5,9 kb Sac I- Xma I-fragment som har restriksjonskartet vist i fig. 3.
8. Rekombinant plasmid ifølge krav 1,karakterisert vedat DNA-segmentet er et 4,6 kb Xho I-fragment som har restriksjonskartet vist i fig. 3.
9. Mikroorganismevertscelle,karakterisert vedat den er transformert med det rekombinante plasmid ifølge krav 1.
10. Mikroorganismevertscelle ifølge krav 9,karakterisert vedat mikroorganismevertscellen er E. coli JM109, JM83, HB101 eller FM5.
11. Mikroorganismevertscelle ifølge krav 9,karakterisert vedat den er transformert med det rekombinante plasmid ifølge krav 3.
12. Mikroorganismevertscelle ifølge krav 9,karakterisert vedat den er transformert med det rekombinante plasmid ifølge krav 4.
13. Mikroorganismevertscelle ifølge krav 9,karakterisert vedat den er transformert med det rekombinante plasmid ifølge krav 5.
14. Mikroorganismevertscelle ifølge krav 9,karakterisert vedat den er transformert med det rekombinante plasmid ifølge krav 6.
15. Mikroorganismevertscelle ifølge krav 9,karakterisert vedat den er transformert med det rekombinante plasmid ifølge krav 7.
16. Mikroorganismevertscelle ifølge krav 9,karakterisert vedat den er transformert med det rekombinante plasmid ifølge krav 8.
17. DNA-segment,karakterisert vedat det omfatter det 20,5 kb Sac I-fragment som har restriksjonskartet vist i fig. 3, eller et subfragment av dette, idet DNA-segmentet koder for toluenmonooxygenasegener isolert fra Pseudomonas mendocina KR-1.
18. Fremgangsmåte for mikrobiell bioomdannelse av en utvalgt fenylforbindelse til en utvalgt fenolforbindelse ved hydroxylering,karakterisert vedat fenylforbindelsen omsettes med en mikroorganismevertscelle, idet mikroorganismevertscellen er blitt transformert med et rekombinant plasmid ifølge krav 1, og som er blitt behandlet med et induserende middel for toluenmonooxygenasegener.
19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat den utvalgte fenylforbindelse omfatter toluen, methylfenyleddiksyre, ethylfenyleddiksyre, 2-fenylethanol, acetanilid, fluorbenzen eller ethylbenzen.
20. Mikrobiell enzymatisk fremgangsmåte for fremstilling av p-hydroxyfenyleddiksyre fra methylfenyleddiksyre,karakterisert vedat (a) methylfenyleddiksyre omsettes med mikroorganismevertsceller ifølge krav 9, idet mikroorganismevertscellene er blitt behandlet med et induserende middel for toluenmonooxygenasegener, og (b) det hydrolyseres med syre i en tilstrekkelig tid inntil methylfenyleddiksyren omdannes kvantitativt til p-hydroxyfenyleddiksyre.
21.Mikrobiell enzymatisk fremgangsmåte for fremstilling av indigo fra indol,karakterisert vedat indol omsettes med en mikroorganismevertscelle, idet mikroorganismevertscellen er blitt transformert med et rekombinant plasmid ifølge krav 1, og som er blitt behandlet med et induksjonsmiddel for toluenmonooxygenasegener .
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/177,631 US5017495A (en) | 1988-04-05 | 1988-04-05 | Plasmid encoding the Pseudomonas mendocina toluene monooxygenase gene |
| PCT/US1989/001445 WO1989009828A1 (en) | 1988-04-05 | 1989-04-04 | Method and materials for the microbial bioconversion of toluene and other phenyl compounds |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO894845D0 NO894845D0 (no) | 1989-12-04 |
| NO894845L NO894845L (no) | 1990-02-02 |
| NO301548B1 true NO301548B1 (no) | 1997-11-10 |
Family
ID=22649341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO894845A NO301548B1 (no) | 1988-04-05 | 1989-12-04 | Fremgangsmåte for mikrobiell bioomdannelse av en utvalgt fenylforbindelse, samt mikroorganismevertsceller, rekombinante plasmider og DNA-segment |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5017495A (no) |
| EP (1) | EP0336719A3 (no) |
| JP (1) | JP2862301B2 (no) |
| KR (1) | KR0157301B1 (no) |
| AU (1) | AU625220B2 (no) |
| CA (1) | CA1337977C (no) |
| DK (1) | DK175789B1 (no) |
| FI (1) | FI104379B (no) |
| IL (1) | IL89845A (no) |
| NO (1) | NO301548B1 (no) |
| WO (1) | WO1989009828A1 (no) |
| ZA (1) | ZA892503B (no) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5171684A (en) * | 1988-04-05 | 1992-12-15 | Amgen Inc. | Bioconversions catalyzed by the toluene monooxygenase of Pseudomanas mendocina KR-1 |
| WO1992006186A1 (en) * | 1990-09-28 | 1992-04-16 | Amgen Inc. | Cloning cartridges and expression vectors in gram-negative bacteria |
| US6190892B1 (en) * | 1995-11-20 | 2001-02-20 | Genencor International, Inc. | Microbial production of indigo |
| US6642031B2 (en) | 1995-11-20 | 2003-11-04 | Genencor International, Inc. | Microorganisms with ability to degrade indole and enzymes therefrom |
| US5958757A (en) * | 1996-09-13 | 1999-09-28 | Envirogen, Inc. | Biological conversion of organic compounds |
| DK0932662T3 (da) * | 1996-09-25 | 2008-03-03 | Genencor Int | Mikroorganismer med evnen til at nedbryde indol og ekstrakter deraf med indoloxidase-aktivitet |
| US6395539B1 (en) | 1997-05-05 | 2002-05-28 | Ohio University | Composition and methods for bioremediation |
| US6551814B1 (en) | 1997-05-05 | 2003-04-22 | Ohio University | Methods for bioremediation by degrading toluene |
| US6830899B1 (en) | 1997-06-13 | 2004-12-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the production of para-hydroxybenzoate in Pseudomonas mendocina |
| WO1999023224A1 (en) * | 1997-10-31 | 1999-05-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | A GENE ENCODING A PUTATIVE EFFLUX PROTEIN FOR SOLVENTS/ANTIBIOTICS IN $i(PSEUDOMONAS MENDOCINA) |
| AU1133900A (en) | 1998-10-26 | 2000-07-12 | University Of Iowa Research Foundation, The | Novel naphthalene dioxygenase and methods for their use |
| US6586229B1 (en) | 2000-06-01 | 2003-07-01 | North Carolina State University | Method for the production of ρ-Hydroxybenzoate in species of pseudomonas and agrobacterium |
| EP1303614A2 (en) * | 2000-07-18 | 2003-04-23 | National Research Council Of Canada | Cloning, sequencing and expression of a comamonas cyclopentanone 1,2-monooxygenase-encoding gene in escherichia coli |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1436573A (en) * | 1972-06-07 | 1976-05-19 | Gen Electric | Microorganisms |
| US4477570A (en) * | 1981-09-24 | 1984-10-16 | Occidental Chemical Corporation | Microbial degradation of obnoxious organic wastes into innocucous materials |
| WO1984001154A1 (en) * | 1982-09-20 | 1984-03-29 | Amgen | Method and materials for the microbiological oxidation of aromatic hydrocarbons |
| US4520103A (en) * | 1982-10-27 | 1985-05-28 | Amgen | Microbial production of indigo |
| US4959315A (en) * | 1987-04-30 | 1990-09-25 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The Environmental Protection Agency | Biodegradation of chloroethylene compounds |
-
1988
- 1988-04-05 US US07/177,631 patent/US5017495A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-04-03 CA CA000595484A patent/CA1337977C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-04 JP JP1504385A patent/JP2862301B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-04 AU AU34104/89A patent/AU625220B2/en not_active Expired
- 1989-04-04 EP EP89303329A patent/EP0336719A3/en not_active Withdrawn
- 1989-04-04 IL IL8984589A patent/IL89845A/en unknown
- 1989-04-04 KR KR1019890702299A patent/KR0157301B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-04-04 WO PCT/US1989/001445 patent/WO1989009828A1/en active IP Right Grant
- 1989-04-05 ZA ZA892503A patent/ZA892503B/xx unknown
- 1989-12-04 DK DK198906090A patent/DK175789B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-12-04 FI FI895788A patent/FI104379B/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-12-04 NO NO894845A patent/NO301548B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK609089D0 (da) | 1989-12-04 |
| KR900700612A (ko) | 1990-08-16 |
| NO894845L (no) | 1990-02-02 |
| AU3410489A (en) | 1989-11-03 |
| FI895788A0 (fi) | 1989-12-04 |
| FI104379B (fi) | 2000-01-14 |
| ZA892503B (en) | 1991-12-24 |
| DK609089A (da) | 1990-01-24 |
| EP0336719A3 (en) | 1989-11-15 |
| JPH03500126A (ja) | 1991-01-17 |
| IL89845A (en) | 1994-11-28 |
| DK175789B1 (da) | 2005-02-21 |
| AU625220B2 (en) | 1992-07-02 |
| WO1989009828A1 (en) | 1989-10-19 |
| IL89845A0 (en) | 1989-12-15 |
| EP0336719A2 (en) | 1989-10-11 |
| KR0157301B1 (ko) | 1998-10-15 |
| JP2862301B2 (ja) | 1999-03-03 |
| US5017495A (en) | 1991-05-21 |
| NO894845D0 (no) | 1989-12-04 |
| CA1337977C (en) | 1996-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chaudhry et al. | Isolation and characterization of a new plasmid from a Flavobacterium sp. which carries the genes for degradation of 2, 4-dichlorophenoxyacetate | |
| Jeon et al. | The naphthalene catabolic (nag) genes of Polaromonas naphthalenivorans CJ2: evolutionary implications for two gene clusters and novel regulatory control | |
| Egland et al. | Benzoate-coenzyme A ligase, encoded by badA, is one of three ligases able to catalyze benzoyl-coenzyme A formation during anaerobic growth of Rhodopseudomonas palustris on benzoate | |
| Zylstra et al. | Toluene degradation by Pseudomonas putida F1: genetic organization of the tod operon | |
| Carreno-Lopez et al. | Physiological evidence for differently regulated tryptophan-dependent pathways for indole-3-acetic acid synthesis in Azospirillum brasilense | |
| US7105296B2 (en) | Genes encoding Baeyer-Villiger monooxygenases | |
| Gescher et al. | Genes coding for a new pathway of aerobic benzoate metabolism in Azoarcus evansii | |
| NO301548B1 (no) | Fremgangsmåte for mikrobiell bioomdannelse av en utvalgt fenylforbindelse, samt mikroorganismevertsceller, rekombinante plasmider og DNA-segment | |
| Charles et al. | Megaplasmid and chromosomal loci for the PHB degradation pathway in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti | |
| Jones et al. | sal genes determining the catabolism of salicylate esters are part of a supraoperonic cluster of catabolic genes in Acinetobacter sp. strain ADP1 | |
| Benson et al. | Plasmid-determined alcohol dehydrogenase activity in alkane-utilizing strains of Pseudomonas putida | |
| Park et al. | Characterization of glk, a gene coding for glucose kinase of Corynebacterium glutamicum | |
| Kivisaar et al. | Degradation of phenol and m-toluate in Pseudomonas sp. strain EST1001 and its Pseudomonas putida transconjugants is determined by a multiplasmid system | |
| EP0504349B1 (en) | BIOCONVERSIONS CATALYZED BY THE TOLUENE MONOOXYGENASE OF $i(PSEUDOMONAS MENDOCINA) KR-1 | |
| Winstanley et al. | pWW174: A large plasmid from Acinetobacter calcoaceticus encoding benzene catabolism by the β‐ketoadipate pathway | |
| IE83308B1 (en) | Bioconversions catalyzed by the toluene monooxygenase of pseudomonas mendocina KR-1 | |
| Parke et al. | Toxicity caused by hydroxycinnamoyl-coenzyme A thioester accumulation in mutants of Acinetobacter sp. strain ADP1 | |
| Banh et al. | Establishment of Tn 5096-based transposon mutagenesis in Gordonia polyisoprenivorans | |
| Grabau et al. | A Salmonella typhimurium cobalamin-deficient mutant blocked in 1-amino-2-propanol synthesis | |
| Stephens et al. | Cloning and expression in Escherichia coli of the toluene dioxygenase gene from Pseudomonas putida NCIB11767 | |
| Altenschmidt et al. | Evidence that enzymes of a novel aerobic 2‐amino‐benzoate metabolism in denitrifying Pseudomonas are coded on a small plasmid | |
| US5605823A (en) | Bioconversions catalysed by the toluene monooxygenase of Pseudomonas mendocinaKR-1 | |
| Maseda et al. | Development of expression vectors for Thermus thermophilus | |
| Thipayathasana | Isolation and properties of Escherichia coli ATPase mutants with altered divalent metal specificity for ATP hydrolysis | |
| Dutton et al. | Comamonas acidovorans UCC61 catabolizes o-phthalate via a 4, 5-oxygenation pathway that is encoded on a 70 kbp section of plasmid pOPH1 bounded by directly repeated sequences |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |