DK175789B1

DK175789B1 - Biologisk funktionelt plasmid samt rekombinant plasmid indeholdende toluenmonooxygenase-gener, mikroorganismeværtsceller indeholdende eller transformeret med sådanne plasmider, DNA-segment kodende for toluenmonooxygenasegener samt fremgangsmåder.....

Info

Publication number: DK175789B1
Application number: DK198906090A
Authority: DK
Inventors: Kwang-Mu Yen; Lawrence M Blatt
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1988-04-05
Filing date: 1989-12-04
Publication date: 2005-02-21
Also published as: JPH03500126A; FI104379B; KR0157301B1; AU625220B2; EP0336719A2; NO301548B1; NO894845L; WO1989009828A1; EP0336719A3; DK609089A; CA1337977C; NO894845D0; IL89845A0; AU3410489A; JP2862301B2; KR900700612A; IL89845A; FI895788A0; DK609089D0; ZA892503B

Description

i DK 175789 B1

Opfindelsen angår et biologisk funktionelt plasmid fra Pseudomonas mendocina KR-1 indeholdende toluen-monooxygenase-gener og endvidere en mikroorganisme-værtscelle af slægten Pseudomonas. Opfindelsen angår 5 også et rekombinant plasmid og en mikroorganismeværtscelle samt et DNA-segment. Endelig angår opfindelsen en fremgangsmåde til mikrobiel bioomdannelse af en udvalgt phenylforbindelse til en udvalgt phenolisk forbindelse ved hydroxylering, en mikrobiel enzymatisk fremgangsmå-10 de til fremstilling af p-hydroxyphenyleddikesyre ud fra toluen, en mikrobiel enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af p-hydroxyphenyleddikesyre ud fra methylphe-nyleddikesyre og en mikrobiel enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af indigo ud fra indol.

15 For få år siden blev en bakterie, identificeret som Pseudomonas mendocina KR-1 (pMKRl), isoleret af Richardson og Gibson fra en algemåtte stammende fra en ferskvandssø, whited, Ph. D. Disputats, The University of Texas, Austin, biblioteksreference nr. W586 (1986).

20 pmKRl benytter toluen som eneste carbonkilde og energikilde. Man har tidligere isoleret og beskrevet andre stammer af Pseudomonas, der metaboliserer eller nedbryder toluen, deriblandt Pseudomonas putida mt-2 (Pb mt-2). Williams og Murry, J. Bacteriol. 120: 416-423 25 (1974) og Pseudomonas putida PpFl (PpFl) (Gibson et al., Biochemistry 9:1626-1630 (1970)). Imidlertid er generne, enzymerne og reaktionsvejene for toluenmetabolismen i disse forskellige Pseudomonas stammer adskilte og overlapper ikke.

30 Den kataboliske reaktionsvej for nedbrydningen af toluen af Pp mt-2 er blevet betegnet TOL. Generne for TOL reaktionsvejen er, kodet på isofunktionelle kataboliske plasmider fundet i visse stammer af Pseu- i

DK 175789 B1 I

domonas. Referenceplasmidet for TOL nedbrydningsreak- I

tionen er pwwo, oprindelig isoleret fra Pp mt-2. Gene- I

tikken og biokemien for TOL reaktionsvejen er vel be- I

skrevet. Kunz og Chapman, J. Bacteriol. 146:179-191 I

5 (1981); Williams og Murry, J. Bacteriol. 120:416-423 I

(1974) ; Williams og Worsey, J. Bacteriol. 125:818-828 I

(1976); Worsey og Williams, J. Bacteriol. 124:7-13 I

(1975) ; Murry et al., Eur. J. Biochem. 28:301-310 I

(1972). En kort opsummering af TOL reaktionsvejen er I

10 som følger: Det første angreb på toluen foregår ved I

methylgruppen, der undergår en række oxidationer til I

dannelse af benzoesyre, der yderligere oxideres under H

dannelse af en cis-carboxylsyrediol, der derefter oxi- I

deres til dannelse af catechol, som derefter nedbrydes I

15 af enzymer via en meta-reaktionsspaltning til acetalde- I

hyd og pyruvat.

Man har fastslået en anden katabolisk reaktions- H

vej for nedbrydningen af toluen af PpFl og betegnet I

denne TOD. I modsætning til TOL reaktionsvejen findes I

20 generne for TOD reaktionsvejen på bakteriekromosomet H

og kodes ikke af plasmider. Finette et al., J. Bacte- I

riol. 160:1003-1009 (1984); Finette, Ph. D. Disputats, I

The University of Texas, Austin, biblioteksreference I

nr. F494 (1984). Genetikken og biokemien for TOD reak- I

25 tionsvejen er studeret af Finette, et al. (se ovenfor); I

Finette (se ovenfor); Gibson et al., Biochemistry I

9:1626-1630 (1970); Kobal, et al., J. Am. Chem. Soc. I

95:4420-4421 (1973); Ziffer, et al., J. Am. Chem. Soc. I

30 95:4048-4049 (1973); Dagley, et all., Nature 202:775-

778 (1964); Gibson, et al.. Biochemistry 7:2653-2662 I

(1968). En kort oversigt over TOD reaktionsvejen er som I

følger: Det oprindelige angreb på toluen foregår ved I

hjælp af et dioxygenaseenzymsystem til dannelse af H

3 DK 175789 B1 (+)-cis-l(S), 2(R)-dihydroxy-3-methylcyclohexa-3,5-dien (cis-toluendihydrodiol), der oxideres til 3-me-thylcatechol, der yderligere nedbrydes af enzymer via en metaspaltnlngsreaktionsvej.

5 En tredje katabolisk reaktionsvej for nedbryd ningen af toluen er fornylig blevet identificeret i PmKRl. Man fandt, at PmKRl kataboliserer toluen via en ny reaktionsvej, der afviger fuldstændig fra begge de to ovenfor beskrevne reaktionsveje. Richardson og Gib-10 son, Abst. Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol. K54:156 (1984). Den kataboliske reaktionsvej for nedbrydningen af toluen af PmKRl er blevet betegnet TMO, idet det første trin i reaktionsvejen katalyseres af et unikt enzymkompleks, toluenmonooxygenase. Biokemien for en-*5 zymerne og proteinerne i denne reaktionsvej er fornylig blevet studeret detaljeret af whited, Pd. D. Dispu-' tats, The University of Texa, Austin, biblioteksrefe rence nr. W586 (1986).

Et kort resumé over TMO reaktionsvejen i PmKRl 20 er som følger: I begyndelsestr.innet oxideres toluen til p-cresol fulgt af methylgruppeoxidering til dannelse af p-hydroxybenzoat, fulgt af hydroxylering til protocatechuat og en følgende ortho-ringspaltning. Trinnene i TMO reaktionsvejen som beskrevet af Whited 25 (se ovenfor) ses diagrammatisk i fig. 1. I det første trin i TMO reaktionsvejen omdannes toluen af toluenmonooxygenase til p-cresol. PmKRl udvikler et unikt mangekomponentenzymsystem, der katalyserer denne mono-oxygenasereaktion i første trin. Ifølge Whited (se 30 ovenfor) er i det mindste tre proteinkomponenter involveret: Oxygenase (mindst to underenheder på 50.000 Dalton og 32.000 Dalton), ferredoxin (23.000 Dalton) og NADH oxidoreduktase (med ukendt molekylvægt).

I DK 175789 B1 I

I I

I Trods de betydelige fremskridt i forståelsen af I

biokemien for enzymerne og proteinerne i TMO reaktions- I

vejen og begyndende genetiske studier (Yen et al., I

I Abstract, Universiry of Geneva EMBO Workshop, 31. au- I

5 gust-4. september 1986) er der endnu ikke information I

I tilgængelig vedrørende de gener, der koder for enzymer I

og proteiner i toluenmonooxygenasesystemet i PmKRl el- I

ler vedrørende nytten af sådanne gener og genprodukter I

I i visse mikrobebioomdannelser. Der kendes heller ikke I

I 10 mikroorganismeværtsceller indeholdende nye rekombinante I

plasmider med Indhold af PmKRl toluenmonooxygenasege- I

ner, hvori visse af disse mikroorganismeværtsceller I

I eksprimerer toluenmonooxygenaseenzymaktivitet med ni- I

I veauer, der overskrider aktiviteten af vild type PmKRl I

15 celler. I

I Opfindelsen tilvejebringer hidtil ukendte gen- I

I segmenter, biologisk funktionelle plasmider og rekom- I

binante plasmider og mikroorganismeværtsceller, der I

I alle indeholder PmKRl toluenmonooxygenasegenerne. Op- I

20 findelsen tilvejebringer yderligere en mikroorganisme- I

værtscelle med indhold af et nyt rekomblnant plasmid I

indeholdende PmKRl toluenmonooxygenasegener, hvori I

værtscellen eksprimerer toluenmonooxygenaseenzymaktivi- I

tet på niveauer, der overskrider aktiviteten af vild I

I ! 25 type PmKRl celler. Derudover tilvejebringer opfindelsen I

en fremgangsmåde til anvendelse af transformerede mi- I

kroorganismeværtsceller med indhold af PmKRl toluenmo- I

nooxygenasegener ved mikrobielle bioomdannelser. Såle- I

H des tilvejebringer opfindelsen mikroorganismer, der er I

30 genetisk tilrettelagt til at overproducere toluenmono- I

H oxygenaseenzymer og proteiner og derfor tilvejebringer I

H i I

mere effektive midler til at udføre bioomdannelser, der

afhænger af dette enzymsystem. I

5 DK 175789 B1 I overensstemmelse med det ovenfor anførte er det ovenfor definerede isolerede biologisk funktionelle plasmid ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at generne findes i et DNA-fragment med det på figur 3 angivne 5 restriktionskort, og at det biologisk funktionelle plasmid har det identificerende karakteristikum at indeholde toluenmonooxydasegener og derved er i stand til at overføre evnen til at omdanne toluen til p-cresol til en mikroorganismeværtscelle, der mangler en sådan 10 evne. Endvidere er mikroorganismeværtscellen af slægten Pseudomonas ejendommelig ved, at det biologisk funktionelle plasmid ifølge opfindelsen er blevet overført til denne ved konjugering.

I en særlig foretrukket udførelsesform af opfin-15 delsen er mikroorganismeværtscellen til plasmidet Pseudomonas putlda 72101.

Opfindelsen omfatter endvidere de toluenoxygena-; segener, der er blevet isoleret og klonet som forskel lige DNA gensegmenter fra PmKRl i en passende autonomt 20 replicerende plasmidvektor resulterende i en række re-kombinante plasmider, der hver indeholder et toluenmo-nooxygenasegensegment. Ethvert sådant rekombinant plasmid er biologisk fungerende og kan benyttes til at transformere en mikroorganismeværtscelle, idet det til 25 mikroorganismeværtscellen overfører evnen til at omdanne toluen til p-cresol.

Mere detaljeret er det ovenfor definerede rekom-binante plasmid ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at det omfatter en plasmidvektor, hvori et DNA-segment 30 med det på figur 3 angivne restriktionskort og kodende for toluenmonooxygenasegener isoleret fra Pseudomonas mendocina KR-1 er blevet indsat, og den dertil hørende mikroorganismeværtscelle ifølge opfindelsen er ejendom- Η

I DK 175789 B1 I

I 6 I

I melig ved at være transformeret med det rekombinante I

I plasmid ifølge opfindelsen. DNA-segmentet ifølge opfin- I

I delsen er ejendommeligt ved, at det omfatter 20,5 kb I

I Sac 1 fragmentet med restriktionskortet vist på figur I

53, idet DNA-segmentet koder for toluenmonooxygenasege- I

ner isoleret fra Pseudomonas mendocina KR-1. I

I Mikroorganismeværtscellen er f.eks. E. coli HB101, det I

I rekombinante plasmid er pMY402, og det inducerende mid- I

I del er isopropylthiogalactosid (IPTG). Det rekombinante I

I 10 plasmid pMY402 er plasmidet pMMB66EH, hvori et 4,6 kb I

I Xho I fragment, der koder for PmKRl toluenmonooxygena- I

I segener, er blevet indsat. Mikroorganismeværtscellen I

I kan også være coll FM5, det rekombinante plasmid er I

I pKY287, og der benyttes varme (42°C) til inducering. I

I i 15 Det rekombinante plasmid pKY287 er plasmidet pCFM1146, I

: hvori et 4,6 kb I fragment, der koder for PmKRl toluen- I

I monooxygenasegener, er blevet indsat. Disse resulteren- I de rekombinante værtsceller eksprimerer toluenmonooxy-

I genaseenzymaktivitet i niveauer, der overskrider akti- I

I 20 viteten af de vild type PmKRl celler, fra hvilke man I

I isolerede toluenmonooxygenasegenerne. I

I Opfindelsen er rettet på en fremgangsmåde til I

I visse mikrobielle bioomdannelser under anvendelse af I

I PmKRl eller de transformerede mikroorganismeværtscel- I

25 ler, der indeholder PmKRl toluenmonooxygenasegenerne. I

I Herved er fremgangsmåden ifølge opfindelsen til

I mikrobiel bioomdannelse af en udvalgt phenylforbindelse I

I til en udvalgt phenolisk forbindelse ved hydroxylering I

I ejendommelig ved, at man lader phenylforbindelsen rea- I

I 30 gere med Pseudomonas mendocina celler eller med mikro- I

organismeværtsceller ifølge opfindelsen, idet cellerne

I først er behandlet med et inducerende middel for tolu- I

I enmonooxygenasegener. I

7 DK 175789 B1

Den mikrobielle enzymatiske fremgangsmåde ifølge opfindelsen til fremstilling af p- hydroxyphenyleddikesyre ud fra toluen er ejendommelig ved, at man lader toluen reagere med en mutant stamme 5 af Pseudomonas mendocina KR-1 indeholdende defekt p-hydroxybenzaldehyd-dehydrogenase eller med mikroorganismeværtsceller ifølge opfindelsen; og behandler så laenge med Ni og carbomonoxid, at toluen i det væsentli-J ge er omdannet til p-hydroxyphenyleddikesyre.

10 Den mikrobielle enzymatiske fremgangsmåden iføl ge opfindelsen til fremstilling af p-hydroxyphenyleddikesyre ud fra methylphenyleddikesyre er ejendommelig ved, at man lader methylphenyleddikesyre reagere med Pseudomonas mendocina KR-1 celler eller med mikroorga-15 nismeværtsceller ifølge opfindelsen, idet cellerne først er behandlet med et inducerende middel for tolu-enmonooxygenasegener; og hydrolyserer så længe med syre, at methylphenyleddikesyre i det væsentlige er omdannet til p-hydroxyphenyleddikesyre.

! 20 Endelig er den mikrobielle enzymatiske frem gangsmåde ifølge pofindelsen til fremstilling af indigo ud fra indol ejendommelig ved, at man lader indigo reagere med Pseudomonas mendocina KR-1 celler eller med mikroorganismeværtsceller ifølge opfindelsen, idet cel-^ lerne først er behandlet med et inducerende middel for toluenmonooxygenasegener.

Yderligere aspekter og fordele ved opfindelsen vil kunne ses af fagmanden fra den følgende detaljerede beskrivelse.

30 På tegninger viser fig. 1 trinnene i PmKRl toluenmonooxygenase j (TMO) reaktionsvejen; fig. 2 et kort over pKY235 plasmidvektoren; og

I DK 175789 B1 I

I I

I fig. 3 en oversigt over rekombinante plasmider, B I plasmidvektorer og restriktionskort over PmKRl DNA seg- B I menter med indhold af toluenmonooxygenasegener. B B De fremgangsmåder og materialer, der illustrerer B

5 udøvelsen af opfindelsen og som omfatter de for tiden B B foretrukne udførelsesformer, angår specifikt plasmid- B B bårne DNA gensegmenter stammende fra PmKRl og som koder B B for generne for PmKRl toluenmonooxygenaseenzymsystemet. B

Ved konjugering eller transformering kan disse plasmid- fl B 10 bårne DNA gensegmenter indføres og eksprimeres i visse I B mikroorganismeværtsceller. Mikroorganismeværtsceller B B med indhold af PmKRl toluenmonooxygenasegener er nytti- B

ge i en fremgangsmåde til visse bioomdannelser. B B Opfindelsen illustreres af følgende eksempler B I 15 under reference til tegningen. Eksemplerne indeholder B B ikke detaljerede beskrivelser af konventionelle meto- I B der, der benyttes ved isolering af DNA, spaltning af B B DNA med restriktionsenzymer, konstruktion af vektorer, B B indsætning af DNA gensegmenter, der koder for inter- B

20 essante polypeptider i sådanne vektorer (f.eks. plas- I B mider) eller indførelse af de opnåede rekombinante B B plasmider i mikroorganismeværtsceller. Sådanne metoder fl B er velkendte af fagmanden indenfor genteknik og beskri- B B ves i mange publikationer, deriblandt: Maniatis et al., B B 25 Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring B B Harbor Laboratory (1982); Davis et al., Basic Methods B B in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co. B B (1986); Current Protocols in Molecular Biology, udgivet B B af Ausubel et al., Greene Publishing, og Wiley Inter- B B 30 science (1987). B

9 DK 175789 B1

Eksempel 1 vækst af pMKRl celler 5 Man dyrkede Pseudomonas mendocina KR1 natten over ved 30 °C i PAS medium eller på en PAS agarplade (Chakrabarty, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70:1137-1140 (1973)) med toluen tilført som damp til vækst og til induktion af toluenmonooxygenasegenerne.

10

Eksempel 2

Konstruktion af PmKRl Bgl II bibliotek i coll HB101

15 A. Præparering af PmKRl DNA

Man isolerede totalt DNA fra PmKRl ved konventionelle metoder. Kort fortalt inokulerede man PmKRl i PAS medium med indhold af toluen ifølge eksempel l og 20 inkuberede under omrystning ved 30 C natten over (13-17 timer). Efter inkubering samlede man PmKRl celler i stationær vækstfase ved centrifugering. Man lyserede cellerne og ekstraherede derefter totalt PmKRl DNA og rensede som beskrevet af Dhaese et al., Nucleic Acid 25 Res. 7:1837-1849 (1979).

B. Præparering af plasmid DNA

Man inokulerede coll HB101 med indhold af 30 plasmidet pRK290 (Ditta, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 77:7347-7351 (1980)) i L-urt og inkuberede under omrystning ved 37*C natten over. Bakteriecellerne blev fracentrifugeret, lyseret og man fjernede hovedparten

I DK 175789 B1 I

I io 1

I af kromosomalt DNA og celleaffald ved centrifugering. I

I Derefter oprensede man pKR290 plasmid DNA ved kendt I

I teknik under anvendelse af cæsiumchlorid/ethidiumbro- I

I mid densitetsgradienter. I

I I

I C. Fremstilling af rekombinant plasmid

I Man behandlede adskilt totalt PmKRl DNA opnået i I

I del A ovenfor og pRK290 plasmid DNA opnået i del B I

10 ovenfor med restriktionsendonucleasen Bgl II under be- I

I tingelser til fuldstændig fordøjelse. Man blandede det I

I Bgl II fordøjede PmKRl med det Bgl II fordøjede pRK290 I

I plasmid DNA og inkuberede derefter blandingen med DNA

I ligase. I

I 15 I

I D. Transformation med rekombinant plasmid I

I Man benyttede det ligerede DNA opnået i del C I

I ovenfor til at transformere coli HB101, og man ud- I

20 plattede de transformerede celler på udvælgelsesplader I

I af L-agar med indhold af 10 yg/ml tetracyclin. Kun så- I

danne celler, der med held transformeres og som inde- I

I holder pRK290 plasmidet eller et rekombinant pRK290 I

I plasmid med PmKRl, kan vokse på udvælgelsespladerne. I

I 25 j^an afprøvede de kolonier, der voksede på udvælgelses- I

I pladerne, for tilstedeværelse af rekombinante plasmider I

I med indhold af PmKRl toluenmonooxygenasegener ved kon- H

I jugerings- og komplementeringsgennemsøgningsassay som

I beskrevet i eksempel 3. I

11

Eksempel 3 DK 175789 B1

Konjugerings- og komplementeringsgennemsøgningsassay

Man benyttede komplementeringsassay involveren-5 de plasmidoverførsel via bakteriel konjugering til at gennemsøge PmKRl Bgl II biblioteket fremstillet ifølge eksempel 2 og PmKRl Sac I biblioteket fremstillet ifølge eksempel 8 til opnåelse af påvisning af rekombinante plasmider med indhold af PmKRl toluenmonooxygenasege-10 ner. Dertil overførte man plasmider mellem bakteriestammer ved konjugerings("mating")fremgangsmåden beskrevet af Yen og Gunsalus, Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A., 79 874-878 (1982), hvilken fremgangsmåde opregnes kort i det følgende.

15 Man fjernede kolonier fra udvælgelsespladerne i eksempel 2 eller eksempel 8 ved forsigtig afskrabning med L-urt. Den opnåede bakteriecellesuspension blev vasket til fjernelse af spor af tetracyclin og suspenderet i L-urt til matingen. Man blandede suspensioner 20 af donorceller, hjælperceller (hvis de var nødvendige) og modtagerceller i logaritmisk fase i lige store rumfang. Små portioner af denne blanding blev anbragt på L-agar plader, så man tillod alle celletyper at vokse.

Efter inkubering natten over ved 30#C omplattede man 25 cellerne på en PAS udvælgelsesplade med indhold af 50 yg/ml tetracyclin. Den eneste carbonkilde til vækst var toluen. Man førte toluendamp til udvælgelsespladen ved at fastklæbe et rør, indeholdende toluen og lukket med vatpropper, til låget af pladen. Denne udvælgelsespla-30 de tillader kun vækst af de ønskede transkonjugater.

I alle de udførte eksperimenter var donorcellerne fra et coli HB101 bibliotek (enten Bgl II biblioteket

I DK 175789 B1 I

I I

I j fra eksempel 3 eller Sac I biblioteket fra eksempel 8) I

I bærende et rekombinant plasmid (pRK290 eller pKY235 I

I med indhold af pMKRl gensegmenter), der skulle overfø- I

I , res ved matingen. De anvendte hjælperceller var coli I

I 5 HB101 celler, der bar hjælperplasmidet pRK2013, idet I

I dette plasmid tilvejebragte overføringsfunktionerne I

I for de overføringsplasmider, der ikke bærer tra gener- H

I ne. Alternativt indførte man hjælperplasmidlet pRK2013 I direkte i donorcellerne til opnåelse af dets overføren-

I 10 de funktioner. Modtagerstammen var en af mange mutant- I

I stammer af Pseudomonas mendoclna KR-1 (Pm Y4001, Pm I

I Y4002, Pm Y4007) fremstillet som beskrevet i eksempel I

I 4. Hver af disse mutantstammer har et defekt toluen- H

I monooxygenasegen og er ude af stand til at omdanne to- H

15 luen til p-cresol. I tilfælde af, at et rekombinant H

I plasmid, der indeholder det specifikke PmKRl toluen- I

I monooxygenasegen, der er defekt i modtagerstammen, med H

I held er blevet overført under konjugeringen, vil det I

I opnåede transkonjugat være i stand til at vokse som en I

I 20 koloni på udvælgelsesplader, der indeholder toluen som I

I eneste carbonkilde for vækst. I

I De kolonier, der voksede på udvælgelsespladerne, I

I blev oprenset, idet man udstrøg hver koloni en eller to I

I gange på en. udvslgelsesplade. Disse transkonjugater I

I 25 manipuleres yderligere som beskrevet i eksempel 5. I

13

Eksempel 4 DK 175789 B1

Fremstilling af Pseudomonas mendoclna KR-1 mutantstam-mer.

5

Man mutageniserede PmKRl celler og isolerede to-luenmonooxygenasedefekte mutanter ved følgende fremgangsmåde. Celler blev dyrket i 5 ml L-urt til en O.D.ggo P* ca· °9 i<jen suspenderet i 2 ml 50 mM ci-tratpuffer, pH 6,0, med indhold af N-methyl-Ν'-nitro-N-nitrosoguanidin (nitrosoguanidin) med en koncentration på 0,2 mg/ml. Efter inkubering ved stuetemperatur i 20 minutter vaskede man cellerne to gange med 2 ml 1M phosphatpuffer, pH 7,0, og suspenderede dem igen i 15 so ml L-urt. Efter vækst natten over udstrøg man cellerne på L-agarplader til enkeltkolonier. De enkelte kolonier blev udprikket og udstrøget på PAS plader med indhold af toluen eller p-cresol som eneste carbonkil-de. De toluenmonooxygenasedefekte mutanter PmY4001,

PmY4002 og PmY4007 blev isoleret som stammer, der voksede på p-cresol, men ikke på toluen. Det toluenmono-oxygenaseassay, der beskrives i eksempel 11, bekræftede yderligere, at disse mutanter har et defekt toluenmono-oxygenaseenzymsystem.

25 Man kan benytte lignende mutageneseteknikker til at opnå mutanter, der er defekte i enzymet p-hydroxy-benzaldehyddehydrogenase i TMO reaktionsvejen. Efter nitrosoguanidinbehandling af PmKRl celler som ovenfor beskrevet kan man isolere p-hydroxybenzaldehyddehydro-50 genasedefekte mutanter som stammer, der vokser på p-hy-droxybenzoat, men ikke vokser på toluen, p-cresol, p-hydroxybenzylalkohol eller p-hydroxybenzaldehyd.

I DK 175789 B1 I

I

I Eksempel 5 I

I Isolering af 9,4 kb Bgl II fragment I

5 Et antal (12) af de transkonjugatkolonier af I

PmY4401, der indeholder PmKRl toluenmonooxygenasegener I

og var isoleret ifølge eksempel 3, blev yderligere ka- I

I rakteriseret på følgende måde. Man dyrkede hver koloni I

I og isolerede plasmid DNA ifølge kendt teknik. Man be- I

I 10 nyttede plasmid DNA fra hver isolat til at transformere I

^ coli HB101 celler. Plasmidet i hver transformant I

I , blev overført til PmY4001 ved konjugering ifølge eksem- I

I pel 3, idet dog udvælgelsespladerne indeholdt tetra- I

I cyclin og glucose (2 mg/ml). Alle transkonjugaterne I

I 15 blev afprøvet for vækst på toluen, idet man udplattede I

cellerne på PAS agar supplementeret med 50 pg/ml tetra- I

I cyclin og toluendamp. Efter bekræftelse af den toluen- H

I monooxygenasekomplementerede aktivitet af plasmidet i

I transkonjugaterne dyrkede man hver sådan HB101 trans- H

I 20 formant og isolerede plasmid DNA ved kendt teknik.

I Man fordøjede DNA med Bgl II og isolerede et 9,4 I

kb fragment fra hver transkonjugatkoloni, der komple- I

menterede hver PmKRl mutantstamme fra eksempel 4 for I

I toluenudnyttelse. Dette resultat er et tegn på, at 9,4 I

I 25 kb Bgl II fragmentet fra PmKRl indeholder en eller fle- H

I re toluenmonooxygenasegener. Man kortlagde to Sac I I

I steder tæt ved den ene ende af det 9,4 kb lange Bgl II I

I fragment. I

15

Eksempel 6 DK 175789 B1 i Konstruktion af plasmidvektor pKY235 5 Udgangsmaterialet til konstruktion af plasmidet pKY235 var plasmidet pKY2l7 beskrevet af Yen og Gunsa-les, J. Bacteriol. 162:1008-13 (1985). Man konstruerede plasmidet pKY235 ved følgende række af trin. I første trin klonede man et 1,5 kb Hind III fragment fra pKY217 10 med indhold af nahR og nahG gener i Hind III stedet på plasmidet pKT240 beskrevet af Bagdasarian et al., Gene 26^:273-82 (1983). Det plasmid, der blev frembragt i første trin, blev betegnet pKY219. I andet trin klonede man et omtrent 7 kb langt Bam HI - Sac I fragment fra 15 pKY219 med indhold af nahR og nahG generne i Bam HI og Sac I stederne på plasmidet pKY231 beskrevet af Bagdasarian et al. Gene 16:237-47 (1981). Det opnåede plasmid blev betegnet pKY223. I næste trin klonede , man et 6 kb Pst I fragment fra pKY 223 med indhold af nahR 20 genet, 200 basepar af nahG genet og genet, der giver kanamycinresistens, i Pst I stedet på plasmidet pUC19 beskrevet af Yanish-Perron et al.. Gene 33:103-119 (1985). Det opnåede plasmid blev betegnet pKY256.

Orienteringen af det 6 kb lange Pst I fragment i pKY256 25 anbragte multikloningsstedet fra pUC19 fra Sal I stedet til Eco Ri stedet umiddelbart nedstrøms for Pst I stedet i nahG genet. I sluttrinnet fyldte man enderne på et 5,4 kb langt BstE II - Sco RI fragment fra pKY256 med indhold af genet, der overfører kanamycinresistens, 30 nahR genet, 200 basepar af nahG genet og et multipelt kloningssted, med det store fragment fra E. coli DNA polymerase I og indsatte det i plasmidet pRK290 beskrevet af Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

I DK 175789 B1 I

I 16 I

I 21:7347-7351 (1980) til at erstatte det omtrent 1 kb I

lange Sma I fragment fra pRK290. Det opnåede plasmid I

I blev betegnet pKY235, og et kort over pKY235 ses i fig. I

I 2. I

I 5 I

I Eksempel 7

I Konstruktion af pCFMH46 I

10 Udgangsmaterialet til konstruktion af plasmidet

I PCFM1146 var plasmidet pCFM836. En detaljeret beskri- I

I velse af konstruktionen af ekspressionsvektorer, deri- I

I blandt pCFM836, ses i beskrivelsen til US patentskrift I

I nr. 4,710,473. Plasmidet pCFM836 indeholder en varmein- I

I 15 ducerbar promotor, en tæt gruppe restriktionssteder I

I (klonende sammenhobning), et plasmidreplikationsorigin, I

I en transkriptionsterminator, gener der regulerer kopi- I

I tallet for plasmider, og et gen der overfører kanamy-

cinresistens, men ingen syntetiske ribosombindingssteer I

I 20 umiddelbart før kloningssammenhobningen. Plasmidet I

I PCFM1146 blev afledt af pCFM836, idet man substituerede I

den lille DNA sekvens mellem de unikke Cla I og Xba I I

I restriktionssteder med følgende oligonucleotid I

I 5' CCATTTGATT 3' I

I 25 3* TAAACTAACATC 5' I

og idet man ødelagde de to endogene Nde I restriktions- I

I steder ved spaltning med Nde I og påfølgende opfyldning I

med T4 polymeraseenzym fulgt af stumpendeligering.

17

Eksempel 8 DK 175789 B1

Konstruktion af PmKRl Sac I bibliotek i coll HB101 5 Man benyttede plasmidvektoren pKY235 fremstillet ifølge eksempel l til at konstruere et Sac I bibliotek i E^ coll HB101 ifølge kendt teknik til fremstilling af genomiske biblioteker. Man isolerede totalt DNA fra PmKRl som beskrevet i eksempel 2, del A. Det isolerede 10 PmKRl DNA blev behandlet med restriktionsendonucleasen Sac I under betingelser for delvis fordøjelse. Til opnåelse af en population af DNA fragmenter beriget i sådanne fragmenter, der indeholder visse eller alle PmKRl toluenmonooxygenasegenerne til anvendelse ved konstruk-15 tion af dette Sac I bibliotek, fraktionerede man det delvis fordøjede PmKRl DNA efter størrelse under anvendelse af en 10-40% saccharosedensitetsgradient ved kendt teknik. Efter centrifugering i 24 timer med 26.000 o/m i et SW-28 centrifugerør og rotor samlede 20 man DNA fraktionerne og afprøvede dem ved hybridise-ring. Man radiomærkede det 9,4 kb lange Bgl II fragment isoleret fra Bgl II biblioteket konstrueret ifølge eksempel 3, og som man ved komplementerer alle de PmKRl stammerne ifølge eksempel 5 for toluenudnyttelse, hvor-25 for det sandsynligvis indeholder i det mindste et af PmKRl toluenmonooxygenasegenerne, og benyttede det som en sonde til udvælgelse af hybridiserende fraktioner til opnåelse af en population af DNA fragmenter beriget i PmKRl toluenmonooxygenaseholdige fragmenter. Denne 30 berigede population af DNA fragmenter blev benyttet til at konstruere Sac I biblioteket.

Man blandede den berigede Sac I fordøjede PmKRl DNA med Sac I fordøjet pKY235 plasmid DNA og inkuberede ——------ - _

I DK 175789 B1 I

I i

I med DNA ligase. Det ligerede DNA blev benyttet til at I

I transformere EL coll HB101, og man udplattede de trans- I

I formede celler på udvælgelsesplader af L-agar med ind- I

I hold af 10 yg/ml tetracyclin. Kun sådanne celler, der I

I 5 med held blev transformeret og indeholdt pKY235 plas- I

' midet eller et rekombinant pKY235 plasmid med PmKRl I

I DNA, kan vokse på udvælgelsespladerne. Man afprøvede I

I transformerede kolonier for PmKRl toluenmonooxygenase- I

I i gener ved konjugering og komplementeringsassay ifølge I

10 eksempel 3. I

I Eksempel 9 I

I Isolering af 20,5 kb Sac I fragment I

I I

I Man karakteriserede et antal (10) af de trans- I

I konjugater, der kunne benytte toluen som eneste carbon- I

I kilde, yderligere ved isolering af plasmid DNA, trans- I

I I formation af coli HB101 og konjugering i PmY4001 til I

1 20 afprøvning af vækst på toluen ifølge eksempel 5. Man I

I dyrkede en coli HB101 transformant med indhold af et I

I rekombinant pKY235 plasmid (betegnet pKY236) bærende I

toluenmonooxygenasegener og isolerede plasmid DNA ved I

kendt teknik. Restriktionsenzymanalyse af indsætnings- I

25 stykket i pKY266 plasmidet tydede på, at det bar to Sac I

I I fragmenter på henholdsvis 10,2 kb og 10,3 kb. Det I

10,2 kb lange Sac I fragment indeholdt 8 kb af det 9,4 I

kb lange Bgl II fragment beskrevet i eksempel 5. I

19

Eksempel 10 DK 175789 B1

Konstruktion af rekombinante plasmider til kortlægning af toluenmonooxygenasegener 5

Man underklonede yderligere det 10,2 kb lange Sac I fragment fra pKY266 i højkopital E^ coli ekspressionsvektoren pUC19 beskrevet af Yanish-Perron et al., Gene 32:103-119 (1985) og betegnede det opnåede 10 rekombinante plasmid pKY277. Plasmidet pKY277 blev benyttet til at transformere E^ coll JM109 celler. Denne nye coli stamme betegnet JM109/pKY277 syntetiserede et blåt pigment i L-urt, med de egenskaber man venter af indogo. Man kunne også påvise toluenmonooxygenaseak-15 tivitet i denne stamme. En yderligere kortlægning af toluenmonooxygenasegenerne korrelerede den indogoprodu-cerende egenskab med tilstedeværelsen af toluenmonooxy-genasseaktivitet (se tabel I).

Det 10,2 kb lange Sac I fragment fra pKY277 blev 20 fordøjet med en række restriktionsenzymer til opnåelse af en delvis restriktionskortlægning som vist i fig. 3.

Baseret på dette restriktionskort slettede man en række DNA fragmenter fra den ene ende af det 10,2 kb lange Sac I fragment i pKY277 til opnåelse af plasmiderne 25 pKY280, pKY281, pKY282 og pKY283 vist i fig. 3. Et 4,6 kb Xho I fragment fra pKY282 blev underklonet i Sal I stedet på pUC19 til opnåelse af plasmid pMY401. Et 4,6 kb Bam HI - Sph I fragment fra pMY401 med indhold af 4,6 kb Xho i fragmentet blev indsat i E^ coli ekspres-30 sionsvektoren pUC18 beskrevet af Yanish-Perron et al.,

Gene 21:103-H9 (1985) til opnåelse af plasmidet pMY404. Plasmidet pUC18 er identisk med pUC19, idet dog polykloningsstedet står i modsat orientering i for- /

I DK 175789 B1 I

I 20 I

I hold til lac promotoren. Som et resultat heraf blev det I

I 4,6 kb lange Xho I fragment indsat i plasmid pUC18 i I

I modsat orientering til i pUC19 plasmidet, hvad angår I

I lac promotoren. Det 4,6 kb lange Xho I fragment fra I

I 5 pKY277 blev også klonet i plasmidvektor pMMB66EH med I

I bred anvendelse, beskrevet af Purste et al., Gene 48: I

119-131 (1986), til konstruktion af plasmidet pMY402. I

I Derudover slettede man, som vist i fig. 3, et 2,2 kb I

I Sac I - Bgl II fragment fra den venstre ende af det 5,9 I

fl 10 kb lange Sac I - Sma I fragment fra pKY282 ved at for- I

døje pKY282 DNA med Sac I og Bgl II, fylde enderne med I

I det store fragment fra E_^ coli DNA polymerase I og li- I

I gere enderne. Det opnåede plasmid blev betegnet pMY400. I

Som vist i tabel I (ifølge assayet fra eksempel I

I 15 il) gav celler med indhold af pMY402 respons til IPTG, I

hvad angår inducering af toluenmonooxygenasegenerne. I

Dette resultat placerede toluenmonooxygenasegenerne i I

det 4,6 kb lange Xho i fragment og viste, at tran- I

skriptionsretningen af toluenmonooxygenasegenerne er I

20 fra venstre til højre vist i fig. 3. Forskellen i ori- I

I enteringen af det 4,6 kb lange Xho I fragment i pMY401 I

I og pMY404 så vel som forskellen i toluenmonooxygenase- I

I aktivitet i celler med indhold af pMY40l og pMY404 I

I (tabel I) svarer også til denne transkriptionsretning I

I 25 af toluenmonooxygenasegenerne. Til opnåelse af eks- I

I primering på højt niveau af toluenmonooxygenasegenerne I

klonede man endvidere det 4,6 kb lange Xho I fragment I

fra pKY282 i Xho I stedet på coli ekspressionsvek- I

toren pCFMH46 (som beskrevet i eksempel 7) til kon- I

I 30 struktion af pKY287. I

21

Eksempel 11 DK 175789 B1

Toluenmonooxygenaseassay 5 Man dyrkede celler i PAS medium med indhold af 0,4% glutamat eller i L-urt til mætning, hvorefter man suspenderede dem i et passende rumfang af det samme medium til en værdi af O.D.ggg på 3,0. Man benyttede en portion af cellerne til bestemmelse af proteinkoncen-10 tration ved fremgangsmåden ifølge Bradford, Anal. Bio-chem. 72:248 (1976) under anvendelse af Bio-Rad Protein Assay. Man blandede 0,5 ml celler med 4 ymol p-cresol i 10 μΐ og 15 nmol radioaktiv toluen (toluenring-14C,

Sigma Chemical Co., 56,3 mCi/mmol) i 5 yl og inkuberede blandingen ved stuetemperatur i 20 minutter under forskydningspåvirkning i ny og næ. Efter inkuberingen satte man 20 yl af denne blanding som en plet på et lille stykke tyndtlagschromatografiplade og tørrede pladen i luften i 20 minutter. Man bestemte den ikke-flygtige 20 tilbageblevne radioaktivitet på filteret i en væske-scintillationstæller og benyttede den til at beregne mængden af toluennedbrydningsprodukter på pladen og den specifikke aktivitet af toluenmonooxygenase. Resultaterne ses i tabel I.

/

I DK 175789 B1 I

I I

I Tabel I

I Eksprimering af toluenmonooxygenase (TMO) gener i I

I EL coil og P_;_ mendocIna I

I 5 plasmid Inducerende Værtscelle Specifik Indi- I

I middel aktivitet go I

I TMO (nmol dan- H

I _min-1 mg-1) nelse I

I 10 pAUTl Toluen £· wendoclna KR1 0,130 + I

pAUTl ingen *· BfinfrCilH KR1 0,010 + pKY266 Ingen £· Blålitifl KT2440 0,020 +

pKY277 Ingen £· soli JM109 0,010 + I

I pKY405 Ingen £· coll HB101 0,005 I

I pKY405 IPTG £· £gli HB101 0,015 + I

pKY280 Ingen £. £fiii JM109 0,010 + 13 pKY281 Ingen £· JM109 0 010 +

pKY282 Ingen £. epII JM109 0,010 + H

I pKY283 Ingen £. coll JM109 0,005 I

I pHY400 Ingen £· «>11 JM83 0,005

pMY401 Ingen £· JM83 0,035 + I

I pMY404 Ingen £· ££li JH83 0,010 + I

I pKY402 Ingen £. coll HB101 0’005 I

I 20 pKY402 IPTG £ tfili HB101 0,200 + I

pMY287 Varme £· tali FM5 0,500 + I

I pUC19 Ingen £· coll JM109 0,005 I

pMMB66EH IPTG £· ££ll HB101 0,005 I

I pFCH1146 Varme £· SSli Ώ15 0.005 I

I

DK 175789 B1 i i ; 23

Eksempel 12

Omdannelse af visse phenylforbindelser til visse phe-noliske forbindelser 5 A. Omdannelse ved hjælp af PmKRl celler

Mange phenylforbindelser, deriblandt toluen, methylphenyleddikesyre, ethylphenyleddikesyre, 2-phe-10 nylethanol, acetanilid, fluorbenzen og ethylbenzen kan benyttes som substrater og således omdannes til phé-noliske forbindelser via parahydroxylering ved hjælp af toluenmonooxygenasesystemet i pMKRl. Det følgende skema illustrerer adskillige mulige omdannelser:

15 skema A

CH3 ch3 „ ό — Φ

CH

i II

hvori I er toluen 25 ii er p-cresol

DK 175789 B1 I

24 I

Skema B I

CH2COOCH3 CH2COOCH3 I

! 6-^ 6

lf) III IV I

10 hvori: I

III er methylphenyleddikesyre I

IV er p-hydroxymethylphenyleddikesyre I

Skema C I

15 ch2ch2oh ch2ch2oh I

. é - Φ

CH I

V VI I

hvori: I

V er 2-phenylethanol I

25 vi er p-hydroxy-2-phenylethanol I

For hver omdannelse blandede man et substrat af I

en phenylforbindelse (f. eks. sådanne med formlerne I, I

III eller V) med PmKRl celler, inkuberede i en til- '· I

30 strækkelig lang periode til at opnå bioomdannelse og

foretog derefter analyse for tilstedeværelse af pheno- I

liske forbindelser på følgende måde. H

Man dyrkede Pseudomonas mendoclna KR1 celler ved i I

25-30 C i 50 ml PAS medium supplementeret med 0,4% glu- DK 175789 B1 i i i 25 j tamat til opnåelse af stationær fase (12-16 timer) under tilstedeværelse (induceret) eller fravær (ikke induceret) af toluendamp stammende fra 2,5 ml toluen.

Man suspenderede en portion på 5-50 ml celler i samme 5 rumfang af det samme medium eller opkoncentreret 2,5 gange i samme medium. Man blandede en given mængde af substratet, der svarede til dannelse af en 15-30 mM opløsning, med cellerne og Inkuberede blandingen ved , 25-30°C under kraftig omrystning i 1-24 timer. Typisk 10 blev blandingen inkuberet i 5-6 timer. Dannelsen af phenoliske forbindelser blev påvist ved assayfremgangs-måden ifølge Gupta et al., Clin. Biochem. 1S_ (4):220^-221 (1983). Assayresultater for omdannelse af adskillige phenylsubstrater til phenoliske forbindelser ved 15 forskellige inkubationstider og temperaturer ses i tabel II.

Tabel II

Syntese af phenoliske forbindelser ved hjælp af toluen-20 monooxygenase fra Pseudomonas mendocina KR1

Substrat (inkubationstid og Aflæsning af O.D.660 _temperatur)_ 25 acetanilid (6 timer, 25°C) 1,07 fluorbenzen (24 timer, 25°C) 0,73 0 methylphenylacetat (6 timer, 30 C) 0,23 o ethylphenylacetat (6 timer, 30 C) 0,13 ethylbenzen (6 timer, 30°C) 0,37 i 30 2-phenylethanol (5 timer, 30°C) 0,16 substrat i ikke induceret kultur 0,03

DK 175789 B1 I

| 26 I

] B. Omdannelse ved hjælp af mikroorganismeværtsceller I

med indhold af rekombinante plasmider, der koder for I

PmKRl toluenmonooxygenasegener I

5 Man kan foretage samme omdannelser som i del Λ I

ved at benytte mikroorganismeværtsceller, der indehol- I

der de rekombinante plasmider, fra eksempel 10. Man kan I

benytte et hvilket som helst af de rekombinante plasmi- I

der (undtaget pKY283 eller pMY400), der koder for funk- I

10 tionelle PmKRl toluenmonooxygenasegener, til at trans-

formere en passende mikroorganismeværtscelle som be- I

skrevet i eksempel 10. En foretrukken fremgangsmåde er I

at benytte pMY402 som det rekombinante plasmid, co- li HB101 som mikroorganismeværtscelle og IPTG som indu-

15 cerende middel som beskrevet i eksempel 11. Den opnåede I

• stamme blev betegnet HB101/pMY402. En anden foretrukken I

fremgangsmåde er at benytte pKY287 som det rekombinante I

plasmid, E^ coli FM5 som mikroorganismeværtscelle og I

varme (42#C i 1-3 timer) til induktionen. Den opnåede I

20 stamme blev betegnet FM5/pKY287. I

For hver omdannelse blander man en phenylforbin- I

delse (f.eks. med formlerne I, III eller V) med HB101/ I

ΡΜΥ402 eller FM/pKY287 celler. Blandingen inkuberes i I

en tilstrækkelig lang periode til opnåelse af bioomdan-

25 nelse og analyseres derefter som beskrevet i del A for I

tilstedeværelse af phenoliske forbindelser. For hver I

bioomdannelse med HBi01/pMY402 celler må cellerne dyr- I

kes og analysen foretages under tilstedeværelse af IPTG I

for at inducere PmKRl toluenmonooxygenaseaktivitet på I

30 følgende måde. Man dyrker celler i PAS medium med ind- I

hold af 0,4% glutamat og 1 mM IPTG eller dyrker i L-urt I

med 1 mM IPTG til mætning. Cellerne suspenderes igen I

i et passende rumfang af samme medium til en O.D.ggg på 27 DK 175789 B1 3,0 og inkuberes med substrat og analyseres som beskrevet i del A. For hver bioomdannelse med FM5/pKY287 celler må cellerne dyrkes under følgende temperaturbetingelser for at inducere PmKRl toluenmonooxygenaseaktivi-5 tet. FM/pKY287 celler dyrkes i L-urt til en O.D.66q på o 0r4. Kulturen inkuberes under omrystning ved 42 C i o 3 timer, hvorefter man ændrer temperaturen til 30 C og inkuberer i yderligere 2 timer. Cellerne suspenderes på ny i frisk L-urt til en O.D.gg0 på 3,0 og inkuberes 10 med substrat og analyseres som beskrevet i del A.

Eksempel 13

Omdannelse af toluen til p-hydroxyphenyleddikesyre 15 A. Omdannelse ved hjælp af PmKRl celler

Til omdannelsen af toluensubstrat til p-hydroxyphenyleddikesyre blander man toluen med en PmKRl mutant 20 indeholdende defekt p-hydroxybenzaldehyddehydrogenase som beskrevet i eksempel 4 og inkuberer i en tilstrækkelig lang periode til opnåelse af omdannelsen af toluen til p-hydroxybenzylalkohol. I andet trin lader man celleblandingen, der indeholder p-hydroxybenzylalkohol-25 mellemproduktet, reagere med nikkel (Ni) og carbonmono-xid (CO) i sådanne koncentrationer og ved sådanne temperaturer, at man får omdannet p-hydroxybenzylalkohol til p-hydroxyphenyleddikesyre ifølge fremgangsmåderne i OS patentskrifterne nr. 4.482.497, 4.659.518 og 30 4.631.348 til hvis indhold vi herved refererer. Skemaet for omdannelsen kan illustreres på følgende måde:

I DK 175789 B1 I

I 28 I

I CH, ch, ch,oh ch.cooh I

I i l l i I

I Γ Jj oxygenaser Γ Jjhvdroxvlaspf Jj_:-„f Jj I

I OH OH OH I

I toluen p-cresol ρ-hydroxybenzyl- p-hydroxy- I

alkohol phenyleddike- syre

I B. Omdannelse ved hjælp af mikroorganismeværtsceller I

10 med indhold af rekombinante plasmider, der koder for I

PmKRl toluenmonooxygenasegener I

I Man kan opnå samme omdannelse som i del A ved at I

benytte mikroorganismeværtsceller med indhold af p-cre- I

I *5 solhydrolasegenet og de rekombinante plasmider fra eks- I

empel 10. p-Cresolhydroxylasegenet kan klones ved kon- I

I ventionelle genteknologiske fremgangsmåder fra en række I

mikroorganismer, der indeholder dette gen, deriblandt I

f.eks. PmKRl eller plasmid pND50 (Hewetson et al., I

I ; 20 Genet. Res. Camb. 32:249-255, 1978). Man kan benytte et I

H hvilket som helst af de rekombinante plasmider (und- I

I tagen pKY283 eller pMY400), der koder for funktionelle I

I PmKRl toluenmonooxygenasegener, til at transformere en I

passende mikroorganismeværtscelle som beskrevet i eks- I

25 empel 10. En foretrukken fremgangsmåden er at benytte I

HB10l/pMY402 celler, og en anden foretrukken fremgangs- I

måde er at benytte FM/pKY287 celler. I

I Til omdannelsen som illustreret i del A blander I

man toluen med HB101/pMY402 celler dyrket og induceret I

30 med IPTG eller med FM5/pKY287 celler dyrket og varme- I

induceret som beskrevet i eksempel 12. Blandingen in- I

kuberes i en tilstrækkelig lang periode til at opnå om- I

dannelse af toluen til p-hydroxybenzylalkohol, hvor- I

29 DK 175789 B1 efter den bringes til reaktion med Ni og CO som i del A til opnåelse af omdannelse til p-hydroxyphenyleddike-syre.

I 5 Eksempel 14

Omdannelse af methylphenyleddikesyre til p-hydroxy-phenyleddikesyre 10 a. Omdannelse ved hjælp af PmKRl celler

Til omdannelsen af methylphenyleddikesyresub-strat til p-hydroxyphenyleddikesyre blander man methylphenyleddikesyre med PmKRl dyrket som beskrevet i eks-15 empel 12 og inkuberer i en tilstrækkelig lang periode til opnåelse af omdannelse af methylphenyleddikesyre til p-hydroxymethylphenyleddikesyre. I andet trin lader man celleblandingen, der indeholder p-hydroxyphenyled-dikesyremellemproduktet, undergå sur hydrolyse ved en 20 tilstrækkelig koncentration af syre og en passende temperatur til at omdanne p-hydroxymethylphenyleddikesyre til p-hydroxyphenyleddikesyre. Omdannelsesskemaet illu- i streres nedenfor: 25

CH,COOCH, CHjCOOCHj CHjCOOM

0 toluenmono- JL sur. JL

' oxygenase κπ hydrolyse r t\ T 1

30 OH OH

methylphenyl- p-hydroxymethyl- p-hydroxyphenyl- eddikesyre phenyleddikesyre eddikesyre

I DK 175789 B1 I

I 30 I

B. Omdannelse ved hjælp af mikroorganismeværtsceller

indeholdende rekombinante plasmider, der koder for H

I PmKRl toluenmonooxygenasegener I 5 Man kan opnå samme omdannelse som i del A ved at I benytte mikroorganismeværtsceller, der indeholder de I rekombinante plasmider fra eksempel 10. Man kan benytte I et hvilket som helst af de rekombinante plasmider (und- I tagen pKY283 eller pMY400), der koder for funktionelle I 10 PmKRl toluenmonooxygenasegener, til at transformere en passende mikroorganismeværtscelle beskrevet i eksempel I 10. En foretrukken fremgangsmåde er at benytte HB101/ I pMY402 celler, og en anden foretrukken fremgangsmåde er at benytte FM5/pKY287 celler.

15 Til omdannelsen som illustreret i del A blander

; man methylphenyleddikesyre med HBl01/pMY402 celler I

I dyrket og induceret med IPTG, eller FM5/pKY287 celler I dyrket og varmeinduceret som beskrevet i eksempel 12.

Blandingen inkuberes i en tilstrækkelig periode til I

20 at opnå bioomdannelse af p-hydroxymethyleddikesyre, I

I hvorefter man lader blandingen undergå sur hydrolyse I

I med syrekoncentrationer og temperaturer, der er til- I

I ! strækkelige til opnåelse af p-hydroxyphenyleddikesyre. I

I 25 Eksempel 15 I

I Omdannelse af indol til indigo I

A. Omdannelse ved hjælp af PmKRl celler I

30

Til omdannelse af indolsubstrat til indigo bian- I

dede man 50 yg/ml indol med PmKRl celler dyrket som be- I

skrevet i eksempel 12 og inkuberer i en tilstrækkelig I

31 DK 175789 B1 lang periode til at opnå omdannelse af indol til indigo, almindeligvis 48 timer. Man kan isolere indigo fra celleblandingen ved fremgangsmåden beskrevet af Ensley i eksempel 5 i US patentskrift nr. 4,520,103.

5 B. Omdannelse ved hjælp af mikroorganismeværtsceller indeholdende rekombinante plasmider, der koder for PmKRl toluenmonooxygenasegener 10 Man kan opnå samme omdannelse som i del A ved at benytte mikroorganismeværtsceller indeholdende de rekombinante plasmider, fra eksempel 10. Man kan benytte et hvilket som helst af de rekombinante plasmider (undtagen pKY283 eller pMY400), der koder for funktionelle 15 PmKRl toluenmonooxygenasegener, til at transformere en passende mikroorganismeværtscelle beskrevet i eksempel 10. En foretrukken fremgangsmåde er at benytte HB101/ pMY402 celler, og en anden foretrukken fremgangsmåde er at benytte FM5/pKY287 celler.

20 Til omdannelsen som illustreret i del A blander man indol med HBl01/pMY402 celler dyrket og induceret med IPTG, eller med FM5/pKY287 celler dyrket og varme-induceret som beskrevet i eksempel 12. Man inkuberer blandingen tilstrækkelig længde til opnåelse af bio-25 omdannelse af indol til indigo, og man kan derefter isolere indigo fra celleblandingen som angivet i del A.

Claims

1. Biologisk funktionelt plasmid fra Pseudomo- I I nas mendocina KR-1 indeholdende toluenmonooxygenase- I I gener, kendetegnet ved, at generne findes I I 5 i et DNA-fragment med det på figur 3 angivne restrik- I I tionskort, og at det biologisk funktionelle plasmid I I har det identificerende karakteristikum at indehol- I I dende toluenmonooxygenasegener og derved er i stand I I til at overføre evnen til at omdanne toluen til p- I I 10 cresol til en mikroorganismeværtscelle, der mangler j I I en sådan evne. |

2. Mikroorganismeværtscelle af slægten Pseudo- I I monas, kendetegnet ved, at det biologisk I funktionelle plasmid ifølge krav 1 er blevet overført H I 15 til denne ved konjugation. I

3. Mikroorganismeværtscelle ifølge krav 2, H I kendetegnet ved, at cellen af slægten H I Pseudomonas er Pseudomonas putida Y2101. I

4. Rekombinant plasmid, kendetegnet H I 20 ved, at det omfatter en plasmidvektor, hvori et DNA- H I segment med det på figur 3 angivne restriktionskort I I og kodende for toluenmonooxygenasegener isoleret fra H I Pseudomonas mendocina KR-1 er indsat. H

5. Rekombinant plasmid ifølge krav 4, der er I I 25 biologisk funktionelt, kendetegnet ved, at H I det har det identificerende karakteristikum at være i H I stand til at transformere og overføre evnen til at H I omdanne toluen til m-cresol til en mikroorganisme- H I værtscelle, der mangler en sådan evne. H 1 30 DK 175789 B1

6. Rekombinant plastnid ifølge krav 4, ken detegnet ved, at det er udvalgt blandt pUC18, pUC19, pKY235, som er deponeret i coli stammen ATCC 67671, pMMB66EH, pMB66HE og pCFM1146, som er de- 5 poneret i E^ coli stammen ATCC 67672, fortrinsvis blandt pKY235 og pCFM1146 deponeret som ovenfor anført.

7. Rekombinant plasmid ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det er udvalgt blandt et så- 10 dant, hvori DNA-segmentet er et 20,5 kb Sac I fragment med restriktionskortet vist i Fig. 3 eller et aktivt underfragment deraf; et sådant, hvori DNA-segmentet er et 10,2 kb

15 Sac I fragment med restriktionskortet vist i Fig. 3; et sådant, hvori DNA-segmentet er et 7,7 kb Sac I - Bam I fragment med restriktionskortet vist i Fig. 3; • et sådant, hvori DNA-segmentet er et 6,2 kb Sac

20 I - Sph I fragment med restriktionskortet vist i Fig. 3; et sådant, hvori DNA-segmentet er et 5,9 kb Sac I - Xma I fragment med restriktionskortet vist i Fig. 3; og 25 et sådant, hvor DNA-segmentet er et 4,6 kb Xho I fragment med restriktionskortet vist i Fig. 3.

8. Mikroorganismeværtscelle, kendetegnet ved, at den er transformeret med det rekombi-nante plasmid ifølge krav 4.

9. Mikroorganismeværtscelle ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den er E_^ coli JM109, JM83, HB101 eller FM5. ^^fl ^fl I DK 175789 B1 I i I

10. Mikroorganismeværtscelle, kendeteg- I net ved, at den er transformeret med et hvilket I fl som helst plasmid ifølge krav 7. fl

11. DNA-segment, kendetegnet ved, at fl 5 det omfatter 20,5 kb Sac I fragmentet med restrikti- I onskortet vist på Fig. 3 eller er under fragment der- fl H af, idet DANN-segmentet koder for toluenmonooxygena- I H segener isoleret fra Pseudomonas mendocina KR-1. I

12. Fremgangsmåde til mikrobiel bioomdannelse fl 10 af en udvalgt phenylforbindelse til en udvalgt pheno- H lisk forbindelse ved hydroxylering, kendeteg- I fl net ved, at man lader phenylforbindelsen reagere fl fl med Pseudomonas mendocina celler eller med mikroorga- I B nismeværtsceller ifølge krav 8, idet cellerne først fl fl 15 er behandlet med et inducerende middel for toluenmo- fl fl nooxygenasegener. fl fl

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12,kende- fl B tegnet ved, at phenylforbindelsen er udvalgt B I blandt toluen, methylphenyleddikesyre, ethylphenyled- fl I 20 dikesyre, 2-phenylethanol, acetanilid, fluorbenzen B B eller ethylbenzen. B fl

14. Mikrobiel enzymatisk fremgangsmåde til B B fremstillnig af p-hydroxyphenyleddikesyre ud fra to- B B luen, kendetegnet ved, at man fl B 25 a) lader toluen reagere med en mutant stamme af B B Pseudomonas mendocina KR-1 indeholdende defekt p- B B hydroxybenzaldehyd-dehydrogenase eller med mikroorga- B B nismeværtsceller ifølge krav 8,- og B fl , b) behandler så længe med Ni og carbonmonoxid, B B 30 at toluen i det væsentlige er omdannet til p-hydroxy- B B phenyleddikesyre. fl DK 175789 B1

15. Mikrobiel enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af p-hydroxyphenyleddikesyre ud fra phe-nyleddikesyre, kendetegnet ved, at man a) lader methylphenyleddikesyre reagere med 5 Pseudomonas mendocina KR-1 celller eller med mikroor- ganismevaertsceller ifølge krav 8, idet cellerne først er behandlet med et inducerende middel for toluenmo-nooxygenasegener; og b) hydroxylyerer så længe med syre, at 10 methylphenyleddikesyre i det væsentlige er omdannet til p-hydroxyphenyleddikesyre.

16. Mikrobiel enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af indigo ud fra indol, kendetegnet ved, at man lader indol reagere med

15 Pseudomonas mendocina KR-1 eller med mikroorganisme-værtsceller ifølge krav 8, idet cellerne først er behandlet med et inducerende middel for toluenmonooxy-genasegener. i j