FI104379B - Menetelmä ja materiaaleja tolueenin ja muiden fenyyliyhdisteiden biokonvertoimiseksi - Google Patents
Menetelmä ja materiaaleja tolueenin ja muiden fenyyliyhdisteiden biokonvertoimiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI104379B FI104379B FI895788A FI895788A FI104379B FI 104379 B FI104379 B FI 104379B FI 895788 A FI895788 A FI 895788A FI 895788 A FI895788 A FI 895788A FI 104379 B FI104379 B FI 104379B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- toluene
- cells
- microorganism host
- plasmid
- recombinant plasmid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
- C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
- C12P7/12—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing sulfite waste liquor or citrus waste
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
1 104379
Menetelmä ja materiaaleja tolueenin ja muiden fenyyliyh-disteiden biokonvertoimiseksi
Keksinnön tausta 5 Kyseinen keksintö koskee yhdistelmä-DNA-tekniikoi den käyttämistä kyvyn valikoituihin biokonversioihin tuottamiseksi mikro-organlsmi-isäntäsoluille. Spesifisemmin keksintö koskee vasta eristetystä ja karakterisoidusta Pseudomonas-kannasta Pseudomonas mendocina KR-1 peräisin 10 olevien tolueenimono-oksygenaasigeenien kloonausta. Kyseinen keksintö tarjoaa täten geneettisesti manipuloituja mikro-organismeja, jotka tuottavat hyvin runsaasti to-lueenimono-oksygenaasientsyymejä ja -proteiineja, ja tarjoaa näin muodoin aiempaa tehokkaamman keinon tästä ent-15 syymijärjestelmästä riippuvaisten biokonversioiden suorittamiseksi .
Vast'ikään Richardson ja Gibson eristivät Pseudomonas mendocina KR-l:ksi (PmKRl:ksi) identifioidun bakteerin makeavesijärvestä otetusta levämatosta. Whited, Ph.D. -20 väitöskirja, The University of Texas, Austin, kirjastovii-te n:o W586 (1986). PmKRl käyttää tolueenia ainoana hiili-ja energialähteenä. Aiemmin on eristetty ja kuvattu muita Pseudomonas-kantoja, jotka metaboloivat tai hajottavat tolueenia, mukaanlukien Pseudomonas putida mt-2 (Pp mt-2). 25 Williams ja Murry, J.Bacteriol. 120 (1974) 416-423 ja t* | ’·· Pseudomonas putida PpFl (PpFl) (Gibson et.ai., Biochemlst- i ry 9 (1970) 1626-1630). Kuitenkin näissä eri Pseudomonas-
|ll · — 111 III
:*·*: kannoissa tolueenimetabolian geenit, entsyymit sekä reitit ovat erillisiä eivätkä päällekkäisiä.
• · 30 Tolueenihajoamiseen Pp mt-2;n toimesta liittyvä : kataboliareitti on nimetty T0L:ksi. TOL-reitin geenit ovat • · · I.. koodautuneet tietyissä Pseudomonas-kannoissa tavattuihin • · · ' ' ' *·', isofunktionaalisiin katabolisiin plasmideihin. TOL-hajoa- misreitin malliplasmidi on alunperin Pp mt-2;sta eristetty *:* * i 35 pWW0. TOL-reitin genetiikka ja biokemia on perusteellises- I · f I 0 · * • · M " ' • < 2 104379 ti kuvattu. Kunz ja Chapman, J.Bacteriol. 146 (1981) 179-191; Williams ja Murry, J.Bacteriol. 120 (1974) 416-423; Williams ja Worsey, J.Bacteriol. 125 (1976) 818-828;
Worsey ja Williams, J.Bacteriol. 124 (1975) 7-13; Murry 5 et.ai., Eur.J.Blochem. 28 (1972) 301-310. Seuraava on lyhyt yhteenveto TOL-reitistä: alustava hyökkäys kohdistuu tolueenin metyyliryhmään, joka hapettuu perättäisissä vaiheissa muodostaen bentsoehappoa, jonka edelleenhapettuessa muodostuu cis-karboksyylihappodiolia, joka hapettuu muo-10 dostaen katekolia, jonka sitten meta-pilkkomisreitin entsyymit hajottavat asetaldehydiksi ja pyruvaatiksi.
Tolueenin PpFl:n toimesta tapahtuvalle hajoamiselle on selvitetty toinen kataboliareitti, joka on nimetty TOD:ksi. Vastoin kuin TOL-reitissä TOD-reitin geenit si-15 jaitsevat bakteerikromosomissa eivätkä ole koodautuneet plasmidiin. Finette, et.ai., J.Bacteriol. 160 (1984) 1003-1009; Finette, Ph.D.-väitöskirja, The University of Texas, Austin, kirjastoviite n;o F494 (1984). TOD-reitin genetiikkaa ja biokemiaa ovat tutkineet Finette et.ai., 20 (supra); Finette (supra); Gibson et.ai., Biochemistry 9 (1970) 1626-1630; Kobal et.ai., J.Am.Chem.Soc. 95 (1973) 4420-4421; Ziffer et.ai., J.Am.Chem.Soc. 95 (1973) 4048-4049; Dagley et.ai., Nature 202 (1964) 775-778; Gibson V.: et.ai., Biochemistry 7 (1968) 2653-2662. Seuraava on lyhyt
4 I
V.1 25 yhteenveto TOD-reitistä: alustavan hyökkäyksen tolueenin : ·.. kimppuun suorittaa dioksygenaasientsyymijärjestelmä, jol- • loin muodostuu ( + )-cis-l(S),2(R)-dihydroksi-3-metyylisyk-« ·· · — loheksa-3,5-dieeniä (cls-tolueenidihydrodiolia), joka ha-.·.*. pettuu 3-metyylikatekoliksi, jonka hajottavat edelleen 30 meta-pilkkomisreitin entsyymit.
Vast'ikään PmKRlrssä on identifioitu tolueenihajoa-miselle kolmas kataboliareitti. On todettu, että PmKRl • · · '·' hajottaa tolueenia pitkin uutta reittiä, joka eroaa joka *: ” ‘: suhteessa kummastakin edellä kuvatusta reitistä.
•:·* 35 Richardson ja Gibson, Abst.Ann.Meet♦Am.Soc.Microbiol, K54 f • · • 4 ·
• I
I * 3 104379 (1984) 156. PmKRlrn toimesta tapahtuvan tolueenihajoamisen kataboliareitti on nimetty TMO:ksi, koska reitin ensimmäistä vaihetta katalysoi yksittäinen entsyymikompleksi, tolueenimono-oksygenaasi. Tämän reitin entsyymien ja pro-5 teiinien biokemiaa on vast'ikään tutkittu yksityiskohtaisesti Whitedin Ph.D.-väitöskirjassa, The University of Texas, Austin, kirjastoviite n:o W586 (1986).
Seuraava on lyhyt yhteenveto TMO-reitistä PmKRl:ssä: ensimmäisenä vaiheena tolueeni hapettuu p-kre-10 soliksi, mitä seuraa metyyliryhmän hapettuminen, jossa muodostuu p-hydroksibentsoaattia, minkä jälkeen tapahtuu hydroksylaatio protokatekuaatiksi ja sitä seuraava orto-rengaslohkeaminen. TMO-reitin vaiheet Whitedin (supra) hahmotteleman mukaisesti on esitetty kaaviollisesti KU-15 VIOSSA 1. TMO-reitin ensimmäisessä vaiheessa tolueenimono-oksygenaasi muuttaa tolueenin p-kresoliksi. PmKRl käsittää ainutlaatuisen monikomponenttientsyymijärjestelmän, joka katalysoi tätä ensivaiheen mono-oksygenaasireaktiota. Whitedin (supra) mukaan liittyviä proteiinirakenteita on 20 ainakin kolme: oksygenaasi (ainakin kaksi alayksikköä: 50 000 daltöniä ja 32 000 daltonia), ferredoksiini (23 000 d) ja NADH-oksidoreduktaasi (molekyylipainoa ei tunneta).
Tällä hetkellä huolimatta huomattavista edistys-askeleista TMO-reitin entsyymien ja proteiinien biokemian • · 25 ymmärtämisessä sekä geneettisten tutkimusten aloittamises- • ·
• ’·· ta (Yen et.al., tiivistelmä: University of Geneva EMBO
· Workshop, 31. elokuuta - 4. syyskuuta, 1986) alalla ei ole käytettävissä informaatiota koskien tolueenimono-oksyge- ·*·*. naasijärjestelmän PmKRl :ssä entsyymejä ja proteiineja • · 30 koodaavia geenejä tai tällaisten geenien ja geenituottei-den käyttökelpoisuutta tietyissä mikrobikonversioissa.
• · · 1.^ Alalla ei myöskään ole käytettävissä mikro-organismi-isän- w < » ' täsoluja, jotka sisältävät PmKRl-tolueenimono-oksygenaasi-geenejä sisältäviä uusia yhdistelmäplasmideja, joista « 35 mikro-organismi-isäntäsoluista tietyt ilmaisisivat toluee- t * • · • · • · • « , 104379 nimono-oksygenaaslentsyymiaktiivisuutta tasoilla, jotka ylittävät villityypin PmKRl-solujen aktiivisuuden. Keksinnön yhteenveto
Kyseinen keksintö tarjoaa uusia geenisegmenttejä, 5 biologisesti funktionaalisia plasmideja ja yhdistelmäplas-mideja sekä mikro-organismi-isäntäsoluja, jotka kaikki sisältävät PmKRl-tolueenimono-oksygenaasigeenejä. Kyseinen keksintö tarjoaa edelleen mikro-organismi-isäntäsolun, joka sisältää PmKRl-tolueenimono-oksygenaasigeenejä sisäl-10 tävän uuden yhdistelmäplasmidin, ja joka isäntäsolu ilmaisee tolueenimono-oksygenaasientsyymiaktiivisuutta tasoilla, jotka ylittävät villityypin PmKRl-solujen aktiivisuuden. Lisäksi kyseinen keksintö tarjoaa menetelmän mikrobi-aalisissa biokonversioissa käytettyjä PmKRl-tolueenimono-15 oksygenaasigeenejä sisältävien transformoitujen mikro- organismi-isäntäsolujen käyttämiseksi. Täten kyseinen keksintö tarjoaa mikro-organismeja, jotka on geneettisesti manipuloitu tuottamaan hyvin runsaasti tolueenimono-oksy-genaasientsyymejä ja -proteiineja, ja se tarjoaa siten 20 aiempaa tehokkaamman keinon tästä entsyymijärjestelmästä riippuvaisten biokonversioiden suorittamiseksi.
Kyseinen keksintö käsittää PmKRl:stä saadun ja tolueenimono-oksygenaasigeenejä sisältävän biologisesti funktionaalisen plasmidin. Tämä plasmidi (nimetään :.v 25 "pAUTl") voidaan siirtää konjugoimalla mikro-organismi- • * • *·· isäntäsoluun, josta puuttuu tolueenimono-oksygenaasigeeni- j#| : järjestelmä ja joka siten ei pysty muuttamaan tolueenia p- kresoliksi. Kyseisen keksinnön erityisen edullisessa suo-ritusmuodossa pAUTl-plasmidin mikro-organismi-isäntäsolu • · 30 on Psedomonas putida Y2101.
Kyseinen keksintö käsittää myös tolueenimono-oksy- • · · genaasigeenit, jotka on eristetty ja kloonattu PmKRl:stä erilaisina DNA-geenisegmentteinä sopivaan, itsenäisesti replikoituvaan plasmidivektoriin, jolloin on saatu sarja 35 yhdistelmäplasmideja, joista kukin sisältää tolueenimono- • · Φ I * • · <
·- I
‘m 5 104379 oksygenaaslgeenisegmentin. Kukin tällainen yhdistelmäplasmidi on biologisesti funktionaalinen ja sitä voidaan käyttää mikro-organismi-isäntäsolun transformoimiseksi, jolloin kyseinen mikro-organismi-isäntäsolu saa kyvyn muuttaa 5 tolueenia p-kresoliksi.
Kyseinen keksintö käsittää edelleen sarjan tällaisia transformoituja mikro-organismi-isäntäsoluja. Kyseisen keksinnön erityisen edullisessa suoritusmuodossa mikro-organismi-isäntäsolu on E^_ coli HB101, yhdistelmäplasmidi 10 on pMY402 ja indusori on isopropyylitiogalaktosidi (IPTG). pMY402-yhdistelmäplasmidi on pMMB66EH-plasmidi, johon on insertoitu 4,6 kb:n PmKRl-tolueenimono-oksygenaasigeenejä koodaava XhoI-fragmentti. Kyseisen keksinnön toisessa erityisen edullisessa suoritusmuodossa mikro-organismi-15 isäntäsolu on E_j_ coli FM5, yhdistelmäplasmidi on pKY287 ja indusorina on lämpö (42eC). pKY287-yhdistelmäplasmidi on pCFM1146-plasmidi, johon on insertoitu 4,6 kb:n PmKRl-tolueenimono-oksygenaasigeenejä koodaava XhoI-fragmentti. Nämä saadut yhdistelmäisäntäsolut ilmaisevat tolueenimono-20 oksygenaasientsyymiaktiivisuutta tasoilla, jotka ylittävät villityypin PmKRl-solujen aktiivisuuden, joista tolueeni-mono-oksygenaasigeenit eristettiin.
Kyseinen keksintö koskee menetelmää tiettyjen mikrobiaalisten biokonversioiden suorittamiseksi käyttäen f 25 PmKRl:tä tai PmKRl-tolueenimono-oksygenaasigeenejä sisäl- t · • '·· täviä transformoitu mikro-organismi -isäntäsoluja, erityi- sesti valitun fenyyliyhdisteen muuttamiseksi valituksi fenoliyhdisteeksi. Kyseisen keksinnön erityisen edullisena
V
suoritusmuotona tarjotaan menetelmä p-hydroksifenyylietik- • · 30 kahapon valmistamiseksi käyttäen PmKRl-tolueenimono-oksy- #...t genaasigeenejä sisältäviä transformoitu mikro-organismi - • · · 1..^ isäntäsoluja.
Kyseinen keksintö koskee myös menetelmää indigon '!" tuottamiseksi mikrobiaalisesti indolista käyttäen PmKRl- · • « « • * » 9 • « β 104379 soluja tai PmKRl-tolueenimono-oksygenaasigeenejä sisältäviä transformoitu mikro-organismi -isäntäsoluja.
Kyseisen keksinnön muita näkökohtia ja etuja tulee alan ammattilaisille ilmeiseksi heidän tutustuessaan seu-5 raavaan yksityiskohtaiseen kuvaukseen.
Suppea kuvaus piirroksista
Kuvio 1 havainnollistaa PmKRl:n tolueenimono-oksy-genaasi- (TMO-) reitin vaiheita.
Kuvio 2 esittää karttaa plasmidivektorista pKY235.
10 Kuvio 3 on yhteenveto yhdistelmäplasmideista ja plasmidivektoreista, jotka sisältävät tolueenimono-oksyge-naasigeenejä sisältäviä PmKRl-DNA-segmenttejä, sekä niihin liittyvistä restriktiokartoista.
Yksityiskohtainen kuvaus 15 Menetelmät ja materiaalit, jotka havainnollistavat keksinnön mukaista käytäntöä Ja jotka käsittävät tämänhetkiset edulliset suoritusmuodot, liittyvät spesifisesti PmKRl-alkuperää oleviin, plasmidin kantamiin DNA-geeniseg-mentteihin, jotka koodaavat PmKRl-tolueenimono-oksygenaa- 20 sientsyymijärjestelmän geenejä. Konjugoimalla tai transformoimalla näitä plasmidin kantamia DNA-geenisegmenttejä voidaan viedä tiettyihin mikro-organismi-isäntäsoluihin ja ilmaista näissä. PmKRl-tolueenimono-oksygenaasigeenejä sisältävät mikro-organismi-isäntäsolut ovat hyödyllisiä
< I
\v 25 menetelmässä tiettyjen biokonversioiden suorittamiseksi.
• · • *·· Keksintöä havainnollistetaan seuraavaksi seuraavil- : !*: la esimerkeillä oheisiin piirroksiin viitaten. Gsimerkkei- :*·*: hin ei sisälly yksityiskohtaisia kuvauksia tavanomaisista .*.’· menetelmistä, joita käytetään DNA:n eristämiseksi, DNA:n • · 30 pilkkomiseksi restriktioentsyymeillä, vektorien rakentami- #·;·. seksi, kiinnostavia polypeptidejä koodaavien DNA-geeniseg- • · · *... menttien insertoimiseksi tällaisiin vektoreihin (esim.
• · · plasmideihin) tai saatujen yhdistelmäplasmidien viemiseksi mikro-organismi-isäntäsoluihin. Tällaiset menetelmät ovat 35 geenimanipuloinnin alan ammattilaisten hyvin tuntemia ja « f I ( · • · » «
« I
« • · 104379 7 niitä kuvataan lukuisissa julkaisuissa mukaanlukien seu-raavat: Maniatis et.ai., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); Davis et.al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier 5 Science Publishing Co. (1986); Current Protocols in Molecular Biology, toim. Ausubel et.al.. Greene Publishing Associates ja Wiley Interscience (1987).
Esimerkki 1
PmKRl-solujen kasvatus 10 Pseudomonas mendocina KR-l:tä kasvatettiin yön yli 30°C:ssa PAS-kasvualustalla tai PAS-agar-maljalla (Chakrabarty et.al., Proc.Natl.Acad♦Sei♦ U.S.A. 70 (1973) 1137-1140) lisäten tolueenia (höyrynä) kasvua ja tolueeni-mono-oksygenaasigeenien indusointia silmälläpitäen.
15 Esimerkki 2
PmKRl Bglll -kirjaston rakentaminen E^ coli HB101:een A. PmKRl-DNA;n valmistus
Kokonais-DNA eristettiin PmKRl:stä tavanomaisilla 20 menetelmillä. Lyhyesti, PmKRl:tä siirrostettiin esimerkin 1 mukaiseen tolueenia sisältävään kasvualustaan ja inku-boitiin ravistellen 30°C;ssa yön yli (13-17 tuntia). Inku-boinnin päätyttyä stationäärisessä kasvuvaiheessa olevat PmKRl-solut otettiin sentrifugoimalla talteen. Soluissa 25 aikaansaatiin lyysi, minkä jälkeen kokonais-PmKRl-DNA
i * ; ’·· uutettiin ja puhdistettiin kuten kuvanneet Dhaese et.al., : Nucleic Acid Res. 7 (1979) 1837-1849.
··· · ^— — — __ ' ' B. Plasmidi-DNA:n valmistus m ·*;*; pRK290-plasmidin (Ditta et.al., Proc.Natl. Acad♦ Sei.
30 U.S.A. 77 (1980) 7347-7351) sisältävä E^ coli HB101 siir-rostettiin L-liemeen ja inkuboitiin ravistellen 37°C;ssa • · * yön yli. Bakteerisolut otettiin sentrifugoimalla talteen, • V « niissä aikaansaatiin lyysi ja valtaosa kromosomi-DNA:sta ja solujätteestä poistettiin sentrifugoimalla. pKR290-·:··: 35 plasmidi-DNA;ta puhdistettiin sitten tavanomaisten teknii- • « • * * • « s 104379 koiden mukaan käyttäen seesiumkloridi/etidiumbromidi-ti-heysgradienttej a.
C. Yhdistelmäplasmidin valmistus
Edellä osassa A saatua kokonais-PmKRl-DNA:ta ja 5 edellä osassa B saatua pRK290-plasmidi-DNA:ta käsiteltiin erikseen restriktioendonukleaasilla Bglll täydellisen pilkkomisen olosuhteissa. Bglllilla pilkottu PmKRl-DNA sekoitettiin BglII:lla pilkottuun pRK290-plasmidi-DNA:han ja seosta inkuboitiin DNA-ligaasilla.
10 D. Transformointi yhdistelmäplasmidilla
Edellä osassa C saadulla ligatoidulla DNA:11a transformoitiin E^ coli HBl01:tä ja transformoidut solut maljoitettiin L-agar-valikointimaljoihin, joissa kasvualusta sisälsi 10 mikrogrammaa/ml tetrasykliiniä. Vain ne 15 solut, jotka ovat menestyksekkäästi transformoituneet ja jotka sisältävät pRK290-plasmidin tai yhdistelmä-pRK290-plasmidin, joka sisältää PmKRl-DNA:ta, kykenevät kasvamaan valikointimaljapinnoilla. Valikointimaljapinnoille kasvaneet pesäkkeet testattiin PmKRl-tolueenimono-oksygenaasi- 20 geenejä sisältävien yhdistelmäplasmidien läsnäolon suhteen esimerkin 3 mukaisella konjugaatio- ja komplementaatioseu-lontamäärityksellä.
.. Esimerkki 3 « I — — -
Konjugaatio- ja komplementaatioseulontamääritys I « 25 Esimerkin 2 mukaan valmistetun PmKRl-Bglll-kirjas-
II
J *** ton ja esimerkin 8 mukaan valmistetun PmKRl-SacI-kirjaston • · ·,; ; seulomiseksi PmKRl-tolueenimono-oksygenaasigeenejä sisäl- :i : tävien yhdistelmäplasmidien toteamiseksi käytettiin komp- lementaatiomääritystä, joka käsittää plasmidin siirtämisen • · 30 bakteerikonjugaation välityksellä. Täten plasmideja siir- rettiin bakteerikantojen välillä konjugaatio- ("parinmuo-dostus-") menettelyllä, jota ovat kuvanneet Yen ja « · *
Gunsalus, Proc.Natl.Acad.Sei. U.S.A. 79 (1982) 874-878 ja i " *·"· josta menettelystä on alla esitetty lyhyt yhteenveto.
« • · • # 0 · · • · · • · * « ’ I I # · * i 9 - 104379
Esimerkin 2 tai esimerkin 8 mukaisilta valikointi-maljoilta irrotettiin pesäkkeitä kevyesti raaputtamalla ja L-lientä käyttäen. Saatu bakteerisoluliete pestiin mahdollisen tetrasykliinin poistamiseksi ja lietettiin L-liemeen 5 parinmuodostusta silmälläpitäen. Luovuttajasoluja, avusta-jasoluja (mikäli tarpeen) ja vastaanottajasoluja, jotka olivat logaritmisessa kasvuvaiheessa, sekoitettiin lietteinä samat tilavuudet. Pieniä seoseriä maljoitettiin L-agar-maljoihin, joissa siis kaikki solutyypit kykenivät 10 kasvamaan. Yön kestäneen inkuboinnin 30°C:ssa jälkeen solut maljoitettiin edelleen PAS-agar-valikointimaljoihin, joissa kasvualusta sisälsi 50 mikrogrammaa/ml tetrasykliiniä. Kasvun ainoaksi hiililähteeksi tarjottiin tolueenia. To-lueenihöyryä johdettiin valikointimaljaan kiinnittämällä 15 teipillä maljan kanteen tolueenia sisältävä putki, jonka pää oli tilkitty vanulla. Tässä valikointimaljassa kykenevät kasvamaan vain halutut transkonjugaatit. Kaikissa suoritetuissa kokeissa luovuttajasolut olivat coli HB101 -kirjastosta (joko esimerkin 2 mukainen Bglll-kir-20 jasto tai esimerkin 8 mukainen Sacl-kirjasto), joka käsittää parinmuodostuksessa siirrettävän yhdistelmäplasmidin (pRK290 tai pKY235, joka sisältää PmKRl-geenisegmenttejä). Käytetyt avustajasolut olivat E^_ coli HB101 -soluja, jotka 4 I ' sisälsivät avustajaplasmidin pRK2013, joka plasmidi varus-V,· 25 ti tra-geenejä ei-sisältävät siirtoplasmidit siirtofunk- • *·· tioilla. Vaihtoehtoisesti avustajaplasmidi pRK2013 vietiin J suoraan luovuttajasoluihin siirtofunktion tuottamiseksi tälle. Vastaanottajakanta oli jokin useista Pseudomonas • r' mendocina KR-1 -mutanttikannoista (PmY4001, PmY4002, • · 30 PmY4007), jotka valmistettiin kuten kuvattu esimerkissä 4.
#·;·. Kunkin mutanttikannan tolueenimono-oksygenaasigeeni on • · J..t puutteellinen eikä kanta kykene muuttamaan tolueenia p- kresoliksi. Sitten kun yhdistelmäplasmidi, joka sisältää i vastaanottajakannassa puutteellisen spesifisen PmKRl-to- *: * *: 35 lueenimono-oksygenaasigeenin, on menestyksekkäästi siir- • · • · · • * « · φ m 2„ 104379 retty konjugoimalla, saatu transkonjugaatti kykenee muodostamaan pesäkkeen tolueenia kasvun ainoana hiililähteenä sisältävään valikointimaljaan.
Valikointimaljapinnoille kasvaneita pesäkkeitä 5 puhdistettiin viivasiirrostamalla jokainen pesäke kerran tai kahdesti valikointimaljaan. Näitä transkonjugaatteja manipuloidaan edelleen esimerkin 5 mukaan.
Esimerkki 4
Pseudomonas mendocina KR-1 -mutanttikantojen valio mistus
PmKRl-soluja mutatoitiin ja tolueenimono-oksygenaa-sin osalta puutteelliset mutantit eristettiin seuraavan menettelyjärjestelyn mukaan. Soluja kasvatettiin 5 ml:ssa L-lientä optiseen tiheyteen 660 nm: n aallonpituudella 15 (0.D.£60) noin 0,7, minkä jälkeen ne uudelleenlietettiin 2 ml:aan 50 mM sitraattipuskuria, pH 6,0, joka sisälsi N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiinia(nitrosoguanidiinia) pitoisuuden 0,2 mg/ml. Soluja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 20 minuutin ajan, minkä jälkeen ne pestiin kahdesti 20 2 ml:11a 1 M fosfaattipuskuria, pH 7,0, ja uudelleenlie tettiin 50 ml:aan L-lientä. Soluja kasvatettiin yön yli, minkä jälkeen niitä viivasiirrostettiin L-agarmaljoihin
< I
yksittäispesäkkeiden saamiseksi. Yksittäiset pesäkkeet noukittiin talteen ja viivasiirrostettiin PAS-maljoihin,
I I I
. 25 joissa kasvualusta sisälsi tolueenia tai p-kresolia ai- • · · noana hiililähteenä. Tolueenimono-oksygenaasin osalta • · · puutteelliset mutantit, PmY4001, PmY4002 ja PmY4007 eris- • · · ·’·’ tettiin kantoina, jotka kasvoivat p-kresolilla mutta eivät tolueenilla. Esimerkissä 11 kuvatun mukaisella tolueeni- • · · V * 30 mono-oksygenaasimäärityksellä varmistettiin edelleen, että :T: näiden mutanttien tolueenimono-oksygenaasientsyymijärjes- telmä on puutteellinen.
• I
. Samankaltaisia mutatointitekniikoita käyttämällä ««««« « « . voidaan saada mutantteja, jotka on puutteellisia TMO-reit- • « 35 tientsyymin p-hydroksibentsaldehydidehydrogenaasi suhteen.
MM* • · il 104379
Kun PmKRl-soluja on käsitelty nitrosoguanidiinilla edellä kuvatun mukaisesti, p-hydroksibentsaldehydidehydrogenaasin osalta puutteelliset mutantit eristetään kantoina, jotka kasvavat p-hydroksibentsoaatilla, mutta eivät kasva to-5 lueenilla, p-kresolilla, p-hydroksibentsyylialkoholilla tai p-hydroksibentsaldehydillä.
Esimerkki 5 9,4 kb:n Bglll-fragmentin eristys
Useita (12) esimerkin 3 mukaaan eristettyjä, PmKRl-10 tolueenimono-oksygenaasigeenejä sisältäviä PmY4001-trans kon jugaattipesäkkeitä karakterisoitiin edelleen seuraavasti. Kukin pesäke kasvatettiin ja plasmidi-DNA eristettiin tavanomaisilla menetelmillä. Kustakin isolaatista saadulla plasmidi-DNA:11a transformoitiin coli HB101 -soluja. 15 Kunkin transformantin käsittämä plasmidi siirrettiin
PmY4001:een konjugoimalla esimerkin 3 mukaan lukuunottamatta, että valikointimaljat sisälsivät tetrasykliiniä ja glukoosia (2 mg/ml). Kunkin transkonjugaatin kasvua to-lueenilla testattiin maljoittamalla solut PAS-agarille, 20 jota oli täydennetty 50 mikrogrammalla/ml tetrasykliiniä sekä jota täydennettiin tolueenihöyryllä. Sitten kun oli varmistuttu plasmidin tolueenimono-oksygenaasia komplemen- • « toivasta aktiivisuudesta transkonjugaateissa, kutakin · « :·/ tällaista HBlOl-transformanttia kasvatettiin ja plasmidi- ! . 25 DNA eristettiin tavanomaisilla menetelmillä.
I · ·”.* DNA:ta pilkottiin Bglll:11a ja kustakin transkonju- • * · *·*/ gaattipesäkkeestä eristettiin 9,4 kb:n fragmentti, joka '·*·* komplementoi kutakin esimerkin 4 PmKRl-mutanttikantaa tolueenin käytön osalta. Tämä tulos osoitti, että : : : 30 PmKRl:stä peräisin oleva 9,4 kb:n Bglll-fragmentti sisälsi :T: yhden tai useamman tolueenimono-oksygenaasigeenin. Kaksi
Sacl -keskusta paikannettiin kartassa lähelle 9,4 kb:n < c . Bglll-fragmentin toista päätyä.
:\i 35 * “ 104379
Esimerkki 6 pKY235-plasmldlvektorln rakentaminen Lähtömateriaalina pKY235-plasmidin rakennuksessa oli plasmidi pKY217, jota ovat kuvanneet Yen ja Gunsalus, 5 J.Bacteriol. 162 (1985) 1008-1013. pKY235-plasmidi rakennettiin seuraavan vaihesarjan mukaan. Ensimmäisessä vaiheessa nahR- ja nahG-geenit sisältävä 5,1 kb:n Hindlll-fragmentti pKY217:stä kloonattiin pKT240-plasmidin
HindiII-keskukseen, jota plasmidia ovat kuvanneet 10 Bagdasarian et.ai., Gene 26 (1983) 273-282. Tästä ensimmäisestä vaiheesta saatu plasmidi nimettiin pKY219:ksi. Toisessa vaiheessa nahR- ja nahG-geenit sisältävä noin 7 kb:n BamHI-SacI-fragmentti pKY219:stä kloonattiin pKT231-plasmidin BamHI- ja Sacl-keskuksiin, jota plasmidia kuvaa-15 vat Bagdasarian et.ai., Gene 16 (1981) 237-247. Saatu plasmidi nimettiin pKY223:ksi. Seuraavassa vaiheessa nahR-geenin, 200 emäsparia nahG-geenistä sekä kanamysiiniresis-tenssin tuottavan geenin sisältävä 6 kb:n Pstl-fragmentti pKY223:sta kloonattiin pUC19-plasmidin Pstl-keskukseen, 20 jota plasmidia kuvaavat Yanisch-Perron et♦ai., Gene 33 (1985) 103-119. Saatu plasmidi nimettiin pKY256:ksi. 6 kb: n Pstl-fragmentin suuntautuminen pKY256:ssa osoitti « pUC19:n monikloonauskeskuksen Sali -keskuksesta EcoRI-kes-kukseen paikaksi välittömästi alavirtaan PstI-keskuksesta , 25 nahG-geenissä. Viimeisessä vaiheessa kanamysiiniresistens- < < < ” ·“.· sin tuottavan geenin, nahR-geenin, 200 emäsparia nahG- * · · '·* * geenistä sekä monikloonauskeskuksen sisältävän 5,4 kb:n *.*.· BstEI I -EcoRI - fragment in pKY256:sta pääty täytettiin E.
coll DNA-polymeraasi-I:n suurella fragmentilla, minkä V · 30 jälkeen ensinmainittu fragmentti insertoitiin Dittan et.ai., Proc.Natl.Acad.Sei. U.S.A. 77 (1980) 7347-7351, kuvaamaan pRK290-plasmidiin korvaamaan pRK290:n noin 1 i i , kb:n Smal-fragmentti. Saatu plasmidi nimettiin pKY235:ksi, I I I I f ja siitä on esitetty kartta kuviossa 2.
35 • · 4 I I « < • · i3 104379
Esimerkki 7 pCFMH46-plasmidivektorin rakentaminen Lähtömateriaalina pCFMH46-plasmidin rakennuksessa oli plasmidi pCFM836. Yksityiskohtainen kuvaus ilmaisuvek-5 torien, mukaanlukien pCFM836:n, rakentamisesta on esitetty US-patenttijulkaisussa 4,710,473, joka täten sisällytetään kokonaisuudessaan tähän viitteeksi. pCFM836-plasmidi sisältää lämpöindusoituvan promoottorin, restriktiokeskus-pankin (kloonausrykelmän), plasmidin replikaation alkukoh-10 dan, transkription päättäjän, plasmidin kopiolukua säätäviä geenejä sekä kanamysiiniresistenssin tuottavan geenin, mutta ei sisällä kloonausrykelmää välittömästi edeltävää synteettistä ribosomisitoutumiskeskusta. pCFM1146-plasmidi saatiin pCFM836:sta korvaamalla pieni yksittäisten Clal-15 ja Xbal-restriktiokeskuksien välinen DNA-sekvenssi seuraa-valla oligonukleotidilla: 5' CGATTTGATT 3' 3' TAAACTAAGATC 5' sekä tuhoamalla läsnäolevat kaksi endogeenista Ndel-rest-20 riktiokeskusta Ndelrllä pilkkomalla, täyttämällä sitten T4-polymeraasientsyymillä sekä lopuksi tylppäpääty-ligatoi-maila.
< «
Esimerkki 8
PmKRl-SacI-kirjaston rakentaminen E^ coli HB101:een 25 Esimerkin 6 mukaan valmistettua pKY235-plasmidivek- I · · *”.* toria käyttäen rakennettiin Sacl-kirjasto E. coli • · · "' *;*/ HB101:een tavanomaisten tekniikoiden genomikirjastojen • · ·
*·’·* rakentamiseksi mukaan. PmKRl:stä eristettiin kokonais-DNA
kuten kuvattu esimerkissä 2, osa A. Eristettyä PmKRl-V '· 30 DNA:ta käsiteltiin restriktioendonukleaasilla Sacl osit-
IM
ί taispilkkomisolosuhteissa. DNA-fragmenttipopulaation saa- miseksi, joka olisi rikastunut niiden fragmenttien suhteen, jotka sisältävät joitakin PmKRl-tolueenimono-oksyge- . naasigeenejä tai kaikki nämä geenit, käytettäväksi tämän « «
35 Sacl-kirjaston rakentamiseksi osittain pilkottu PmKRl-DNA
104379 14 fraktioitiin koon perusteella tavanomaisilla menettelyillä 10 % - 40 % -sakkaroositiheysgradienttia käyttäen. DNA-fraktiot otettiin talteen sentrifugoimalla 24 tunnin ajan 26 000 kierr./min. kierrosnopeudella SW-28-sentrifugiput-5 kissa ja -roottorilla, minkä jälkeen niitä testattiin hybridoimalla. 9,4 kb:n Bglll-fragmentti, joka eristettiin esimerkin 2 mukaan rakennetusta Bglll-klrjastosta ja jonka tiedettiin esimerkin 5 mukaan komplementoivan tolueenin käytön osalta kaikkia PmKRl-mutanttikantoja ja joka siten 10 oletettavasti sisältäisi ainakin yhden PmKRl-tolueenimono-oksygenaasigeeneistä, leimattiin radioaktiivisella leimalla, minkä jälkeen sitä koettimena käyttäen valikoitiin sakkaroosigradienttituotteesta hybridoituvia fraktioita. Hybridoituvat fraktiot yhdistetiiin pooliksi DNA-fragment-15 tipopulaation saamiseksi, joka on rikastunut PmKRl-toluee- nimono-oksygenaasipitoisten fragmenttien suhteen. Tätä rikastettua DNA-fragmenttipopulaatiota käyttäen rakennettiin Sacl-kirjasto.
Rikastettu Sacl;llä pilkottu PmKRl-DNA sekoitettiin 20 Sacl:llä pilkottuun pKY235-plasmidi-DNA:han ja inkuboitiin DNA-ligaasilla. Ligatoidulla DNA:11a transformoitiin coli HB101 ja transformoituneet solut maljoitettiin L-
« I
,V, agar-valikointimaljoihin, joissa kasvualusta sisälsi 10 mikrogrammaa/ml tetrasykliiniä. Valikointimaljapinnoilla 25 kykenevät kasvamaan vain menestyksekkäästi transformoidut **!,· sekä pKY235-plasmidin tai yhdistelmä-pKY235-plasmidin, '·** joka sisältää PmKRl-DNA:ta, sisältävät solut. Transfor- *.*.* manttipesäkkeitä testattiin PmKRl-tolueenimono-oksygenaa- sigeenien suhteen esimerkin 3 mukaisella konjugaatio- ja Γί 1 30 komplementaatiomäärityksellä.
:*Γ: Esimerkki 9 • " 20,5 kb:n Sacl-fragmentin eristys . Useita (10) tolueenia ainoana hiililähteenä käyttä viä transkonjugaatteja karakterisoitiin edelleen eristä- :*/.[ 35 mällä plasmidi-DNA, transformoimalla sillä E^ coli HB101 s .,.,: • · 104379 15 sekä konjugoimalla PmY4001:een kasvun tolueenilla suhteen testaamiseksi esimerkin 5 mukaan. coli HB101 -transfor-manttia, joka sisälsi tolueenimono-oksygenaasigeenejä sisältävän yhdistelmä-pKY235-plasmidin (nimettiin 5 pKY266:ksi), kasvatettiin ja plasmidi-DNA eristettiin tavanomaisten menetelmien mukaan. pKY266-plasmidi-insertin restriktioentsyymianalyysi osoitti insertin sisältävän kaksi Sacl-fragmenttia, 10,2 kb:tä ja vastaavasti 10,3 kb:tä. 10,2 kb:n Sacl-fragmentti sisältää 8 kb:tä esimer-10 kissä 5 kuvattua 9,4 kb:n Bglll-fragmenttla.
Esimerkki 10
Yhdistelmäplasmidien rakentaminen tolueenimono-oksygenaasigeenien kartoittamiseksi pKY266:n 10,2 kb:n Sacl-fragmentti alakloonattiin 15 edelleen korkean kopioluvun omaavaan E^ coli -ilmaisuvek-toriin pUC19, jota kuvaavat Yanisch-Perron et.ai., Gene 33 (1985) 103-119, ja saatu yhdistelmäplasmidi nimettiin pKY277:ksi. pKY277-plasmidilla transformoitiin coli JM109 -soluja. Tämä uusi, JM109/pKY277:ksi nimetty coli 20 -kanta syntetisoi L-liemessä sinistä pigmenttiä, joka omasi indigolle tyypillisiä ominaisuuksia. Tällä kannalla todettiin myös tolueenimono-oksygenaasiaktiivisuutta. Tolueenimono-oksygenaasigeenien lisäkartoitus yhdisti indigoa tuottavan ominaisuuden tolueenimono-oksygenaasiak-25 tiivisuuden läsnäoloon. (Katso taulukko I).
pKY277:n 10,2 kb:n Sacl-fragmenttia pilkottiin • · “ joukolla restriktioentsyymejä ja muodostettiin kuviossa 3 • · · *«*·’ esitetyn mukainen osittainen restriktiokartta. Tämän rest- riktiokartan nojalla 10,2 kb:n Sacl-fragmentin pKY277:ssä • · * V : 30 toisesta päädystä poistettiin joukko DNA-fragmentteja, : jolloin saatiin kuviossa 3 esitetyt plasmidit pKY280, pKY281, pKY282 ja pKY283. Alakloonaamalla 4,6 kb:n XhoI- • i . fragmentti pKY282:sta pUC19:n Sali-keskukseen saatiin , plasmidi pMY401. 4,6 kb:n XhoI-fragmentin sisältävä 4,6 V·': 35 kb: n BamHI-Sphl-fragmentti pMY401:stä insertoitiin « • · ί6 104379
Yanisch-Perronin et.ai., Gene 33 (1985) 103-119, kuvaamaan E. coll -ilmaisuvektoriin pUC18, jolloin saatiin plasmidi pMY404. pUC18-plasmidi on pUC19:ään nähden identtinen lukuunottamatta, että monlkloonauskeskus on suuntautunut 5 lac-promoottoriin nähden vastakkaisesti. Seurauksena tästä 4,6 kb:n XhoI-fragmentti insertoitui pUC18-plasmidiin suuntauksen lac-promoottoriin osalta pUC19-plasmidiin nähden vastakkaisesti. pKY277:n 4,6 kb:n XhoI-fragmentti kloonattiin myös laajan isäntävalikoiman omaavaan plasmi-10 divektoriin pMMB66EH, jota kuvaavat Furste et.ai., Gene 48 (1986) 119-131, plasmidin pMY402 rakentamiseksi. Lisäksi kuten esitetty kuviossa 3 pKY282:n 5,9 kb:n Sacl-Xmal-fragmentin vasemmasta päädystä poistettiin 2,2 kb:n Sacl-Bglll-fragmentti pilkkomalla pKY282-DNA:ta Sacl:llä ja 15 Bglll:11a, täyttämällä päädyt E^ coli DNA-polymeraasi-I:n suurella fragmentilla sekä ligatoimalla päädyt. Saatu plasmidi nimettiin pMY400:ksi.
Kuten esitetty taulukossa I (esimerkin 11 määrityksen mukaisesti) pMY402:n sisältävät solut reagoivat 20 IPTG:hen tolueenimono-oksygenaasigeenien indusoinnissa.
Tämä tulos paikansi tolueenimono-oksygenaasigeenit 4,6 kb:n XhoI-fragmenttiin ja paljasti tolueenimono-oksygenaa-sigeenien transkription suunnaksi vasemmalta oikelle kuten « < esitetty kuviossa 3. Erot 4,6 kb:n XhoI-fragmentin suun-25 tauksessa pMY401:ssä ja pMY404:ssä sekä tolueenimono-oksy- genaasiaktiivisuudessa pMY401:n ja pMY404:n sisältävissä ‘•Λ* soluissa (taulukko I) sopivat samoin loogisesti yhteen i o t *·'* tolueenimono-oksygenaasigeenien juuri tämän transkriptio- suunnan kanssa. Tolueenimono-oksygenaasigeenien ilmaisemi- • Il V * 30 seksi korkealla tasolla pKY282:n 4,6 kb:n XhoI - fragmentti ' kloonattiin myös E^ coli -ilmaisuvektorin pCFM1146 XhoI- keskukseen (kuten kuvattu esimerkissä 7) pKY287:n rakenta- I 9 #<<t; miseksi.
• · « · ^ii 35 u 104379
Esimerkki 11
Tolueenimono-oksygenaasimääritys
Soluja kasvatettiin 0,4 % glutamaattia sisältävässä PAS-kasvualustassa tai L-liemessä kyllästyspisteeseen. Ne 5 uudelleenlietettiin sopivaan tilavuuteen samaa kasvualustaa pitoisuudeksi, joka vastasi optista tiheyttä 3,0 660 nm:n aallonpituudella. Näyte-erä soluja käytettiin proteiinipitoisuuden määrittämiseksi Bradfordin menetelmällä, Anal.Blochem. 72 (1976) 248, Bio-Rad -proteiinimääritystä 10 käyttäen. 0,5 ml:n erä soluja sekoitettiin 4 mikromooliin p-kresolia 10 mikrolitrassa ja 15 nanomooliin radioaktiivista tolueenia (tolueenirengas-14C, Sigma Chemical Co., 56,3 mCi/mmol) 5 mikrolitrassa ja seosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa silloin tällöin vortex-sekoittajalla 15 sekoittaen 20 minuutin ajan. Inkuboinnin päätyttyä 20 mikrolitraa seosta sijoitettiin täpliksi pienelle palaselle ohutkerroskromatografialevyä, minkä jälkeen levyä kuivattiin ilmassa 20 minuutin ajan. Suodattimelle jäänyt ei-haihtuva radioaktiivisuus määritettiin nestetuikelaskijal-20 la ja siitä laskettiin levyn käsittämän tolueenihajoamis-tuotteen määrä ja tolueenimono-oksygenaasin spesifinen aktiivisuus. Tulokset on esitetty taulukossa I.
• «
I I I « I
I I I I « 1
• I
: 25 • f * ··· · ·«· • · · • « · fl
• I
• · · • · · • · ··· V ; 30 • « « « · · • ♦ « r i i i r 1 0·1 35 « t 1S 104379
Taulukko I
Tolueenlmono-oksygenaasi- (TMO-) geenien Ilmaisu E.
collssa ja mendoclnassa 5
Plas- Indusori Isäntäsolu TMO:n spesi- Indinen ftidi finen aktii- muodostus visuus (nmole min~l mg~i) 10 pAUTl tolueeni £. pondoclnA KR1 0.13Ö + pAUTl - £. mcndoclna KR1 0.010 + pKY266 - £. puclda KT2AA0 0.020 + pKY277 - £. fcftU JH109 0.010 + pKYA05 - £. poll HB101 0.005 pMYA05 IPTG £. £fili HB101 0.015 + pKY280 - £. coll JM109 0.010 + 1S pKY28i - £. coll JM109 0.010 + pKY282 - £. coll JH109 0.010 + pKY283 - E. coll JM109 0.005 pHYAOO - £. fiftll JM83 0.005 pHYAOi - £. coll JM83 0.035 + pMYAOA - £. coll JM83 0.010 + pMYA02 - £. coll HB101 0.005 pMYA02 IPTG £. coll HB101 .0.200 + 20 pHY287 lämpö £. coll FM5 0.500 + pUC19 - £. coll JM109 0.005 pHMB66EH IPTG £. coll HB101 0.005 pFCMllA6 lämpö £. coll FM5 0.005 i i
III
i r i
f I
Esimerkki 12 :\ 25 Tiettyjen fenyyliyhdisteiden muuttaminen tietyiksi : .·. fenoliyhdisteiksi « « · #·;·, A. Muuttaminen PmKRl-soluilla « « · I . Monet fenyyliyhdisteet, mukaanlukien tolueeni, « i · *·’·1 metyylifenyylietikkahappo, etyyli f enyylietikkahappo, 2- 30 fenyylietanoli, asetanilidi, fluoribentseeni ja etyyli-
Ml V · bentseeni, voivat toimia PmKRltn tolueenimono-oksygenaasi- • Il V : järjestelmän substraatteina ja siten tulla para-hydroksy- loinnin kautta muutetuiksi sen toimesta fenoliyhdisteiksi.
Seuraava kaavio havainnollistaa useita mahdollisia konver-
• I
• · 35 sioita: • « • · « • i • · 19 104379
CH
I II
jossa: 10 I on tolueeni II on p-kresoli cHjCOoaij aijcooaij ,s ό > φ
CH
III IV
20 jossa: III on metyylifenyylietikkahappo IV on p-hydroksimetyylifenyylietikkahappo ac2<a2on cs2cm2cm 1 o —» φ
30 CK
v vi • · « • · · • « * ·;·· jossa: ....: V on 2-fenyylietanoli /' 35 VI on p-hydroksi-2-fenyylietanoli « · « a 9 « 20 104379
Kutakin konversiota varten fenyyliyhdistesubstraat-tia (esimerkiksi kaavan I, III tai V mukaista) sekoitettiin PmKRl-soluihin ja inkuboitiin riittävän pitkän ajan biokonversion aikaansaamiseksi, minkä jälkeen fenoliyhdis-5 teiden läsnäolo määritettiin seuraavasti.
Pseudomonas mendocina KR-1 -soluja kasvatettiin 25-30°C:ssa 50 ml:ssa PAS-kasvualustaa, jota oli täydennetty 0,4 %:lla glutamaattia, stationääriseen kasvuvaiheeseen (12-16 tunnin ajan) 2,5 ml:sta tolueenia peräisin olevan 10 tolueenihöyryn läsnäollessa (indusoitu) tai puuttuessa (ei-indusoitu). 5-50 ml:n erä soluja uudelleenlietettiin samaan tilavuuteen samaa kasvualustaa tai konsentroitiin 2,5x samassa kasvualustassa. Soluihin sekoitettiin substraattia tietty määrä niin, että muodostui 15-30 mM liuos, 15 ja seosta inkuboitiin 25-30°C:ssa kiivaasti ravistellen 1-24 tunnin ajan. Tyypillisesti seosta inkuboitiin 5-6 tunnin ajan. Fenoliyhdisteiden muodostuminen määritettiin Guptan et.ai., Clin.Biochem. 16:4 (1983) 220-221, analyysimenetelmän mukaan. Taulukossa II on esitetty analyysitu-20 lokset useammam fenyylisubstraatin konversiolle fenoliyh-disteeksi eri inkubointiajoilla ja -lämpötiloissa.
« I
25 • m • · · • · · • · · · • •V • · · • · · • · • · c • · « • · 30 ] · · · ··· « t · • * · e • · « MM* • a · 35 • · · • a » • · * « · · — · · 21 104379
Taulukko II
Fenollyhdlsteiden synteesi Pseudomonas mendocina KR-1 -tolueenimono-oksygenaasilla 5
Substraatti (inkubointialka la Analyysin -lämpötila) O.D„-lukema asetanilidi (6 tuntia, 25°C) 1,07 10 fluoribentseeni (24 tuntia, 25eC) 0,73 metyylifenyyliasetaatti (6 tuntia, 30°C) 0,23 etyylifenyyliasetaatti (6 tuntia, 30°C) 0,13 etyylibentseeni (6 tuntia, 30°C) 0,37 2-fenyylietanoli (5 tuntia, 30°C) 0,16 15 substraatti ei-indusoidussa viljelmässä 0,03 B. Konversio mikro-organismi-isäntäsoluilla, jotka sisältävät PmKRl-tolueenimono-oksygenaasigeenejä koodaavia yhdistelmäplasmideja 20 Samat osan A mukaiset konversiot voidaan aikaansaa da käyttämällä mikro-organismi-isäntäsoluja, jotka sisältävät esimerkin 10 mukaisia yhdistelmäplasmideja. Mitä tahansa yhdistelmäplasmidia (paitsi pKY283:a tai ΡΜΥ400:ää), joka koodaa funktionaalisia PmKRl-tolueeni-25 mono-oksygenaasigeenejä, voidaan käyttää sopivan mikro-organismi-isäntäsolun transformolmiseksi kuten kuvattu esimerkissä 10. Edullisen menetelmän mukaan pMY402:ta käytetään yhdistelmäplasmidina, EL coli HB101:tä mikro- • · organismi-isäntäsoluna ja IPTG:tä indusorina kuten kuvattu 1 esimerkissä 11. Saatu kanta nimettiin HB101/pMY402:ksi.
• · · I,. Toisen edullisen menetelmän mukaan pKY287:ää käytetään • · · yhdistelmäplasmidina, EL coli FM5:tä mikro-organismi-isän-täsoluna ja lämpöä (42°C, 1-3 tuntia) indusorina. Saatu kanta nimettiin FM5/pKY287:ksi.
I I « I I m 104379 22
Kutakin konversiota varten fenyyliyhdistettä (esimerkiksi kaavan I, III tai V mukaista) sekoitetaan HBl01/pMY402- tai FM5/pKY287-soluihin. Seosta inkuboidaan riittävän pitkän ajan biokonversion aikaansaamiseksi, 5 minkä jälkeen se analysoidaan kuten kuvattu osassa A feno-liyhdisteiden läsnäolon suhteen. Kutakin biokonversiota HBl01/pMY402-soluilla silmälläpitäen soluja täytyy kasvattaa ja ne tulee analysoida IPTG:n läsnäollessa PmKRl-to-lueenimono-oksygenaasiaktiivisuuden indusoimiseksi seuraa-10 vasti. Soluja kasvatetaan PAS-kasvualustassa, joka sisältää 0,4 % glutamaattia ja pitoisuuden 1 mM IPTG, tai niitä kasvatetaan L-liemessä, joka käsittää pitoisuuden 1 mM IPTG, kyllästyspisteeseen. Solut uudelleenlietetään sopivaan tilavuuteen samaa kasvualustaa optiseen tiheyteen 3,0 15 660 nm:n aallonpituudella ja inkuboidaan substraatilla, minkä jälkeen suoritetaan määritys kuten kuvattu osassa A. Kutakin biokonversiota FM5/pKY287-soluilla silmälläpitäen soluja tulee kasvattaa seuraavissa lämpötila-olosuhteissa PmKRl-tolueenimono-oksygenaasiaktiivisuuden indusoimisek-20 si. FM5/pKY287-soluja kasvatetaan L-liemessä optiseen tiheyteen 0,4 660 nm:n aallonpituudella. Viljelmiä inkuboidaan ravistellen 42°C:ssa 3 tunnin ajan, minkä jälkeen «li ne siirretään 30°C:seen ja inkuboidaan edelleen 2 tunnin ajan. Solut uudelleenlietetään tuoreeseen L-liemeen opti- 25 seksi tiheydeksi 3,0 660 nm:n aallonpituudella, niitä : inkuboidaan substraatilla ja suoritetaan määritys kuten kuvattu osassa A.
.*.*. Esimerkki 13 « « · .
• «
Tolueenin muuttaminen p-hydroksifenyylietikkahapok- ... 30 si
• f I
• · · I.. A. Konversio PmKRl-soluilla • · · • · · *. Tolueenisubstraatin muuttamiseksi p-hydroksifenyy- « ':"ί lietikkahapoksi tolueenia sekoitetaan PmKRl-mutanttiin, joka on puutteellinen p-hydroksibentsaldehydidehydrogenaa- 35 sin osalta, kuten kuvattu esimerkissä 4, ja inkuboidaan • « · : · « · 23 104379 riittävän pitkän ajan tolueenin muuttamiseksi p-hydroksi-bentsyylialkoholiksi. Toisessa vaiheessa p-hydroksibent-syylialkoholivälituotteen sisältävä soluseos saatetaan reagoimaan nikkelin (Ni) ja hiilimonoksidin (CO) kanssa 5 sellaisina pitoisuuksina ja sellaisissa lämpötiloissa, jotka ovat riittävät p-hydroksibentsyylialkoholin muuttamiseksi p-hydroksifenyylietikkahapoksi, US-patenttijulkaisujen 4 482 497; 4 659 518; 4 631 348 menetelmien mukaan, Jotka sisällytetään täten tähän viitteiksi. Konversiokaa-10 vio esitetään seuraavasti:
CH, CH. CH.OH CH.COOH
I * tolueeni- p-kresoli- I I
I mono-oksy- I hydroksy-
genaasi (^r^\ laasi f^i) NI.CO
i5 UsJJ
OH OH OH
tolueeni p-Kresoli p-hydroksibent- p-hydroksifenyyli- syylialkoholi etikkahappo 1 B. Konversio mikro-organismi-isäntäsoluilla, jotka sisältävät PmKRl-tolueenlmono-oksygenaasigeenejä koodaavia yhdistelmäplasmide j a
Sama osan A mukainen konversio voidaan suorittaa käyttämällä mikro-organismi-isäntäsoluja, jotka sisältävät . 25 p-kresolihydroksylaasigeenin ja esimerkin 10 mukaisia "I/ yhdistelmäplasmideja. p-Kresolihydroksylaasigeeni voidaan • · * *·** kloonata tavanomaisilla geenimanipulointitekniikoilla ’·*·* lukuisista tämän geenin sisältävistä mikro-organismeista, mukaanlukien esimerkiksi PmKRl:stä tai plasmidlsta pND50 ·,' · 30 (Hewetson et.ai., Genet.Res♦ Camb. 32 (1978) 249-255). Mitä tahansa yhdistelmäplasmidia (lukuunottamatta pKY283:a tai pMY400:ää), joka koodaa funktionaalisia PmKRl-tolueeni-mono-oksygenaasigeenejä, voidaan käyttää sopivan, esimerkissä 10 kuvatun mukaisen mikro-organismi-isäntäsolun 35 transformoimiseksi. Edullisen menetelmän mukaan käytetään 24 104379 HBl01/pMY402-soluja. Toisen edullisen menetelmän mukaan käytetään FM5/pKY287-soluja.
Osassa A esitettyä konversiota silmälläpitäen tolueenia sekoitetaan HBl01/pMY402-soluihin, joita kasva-5 tetaan suorittaen indusointi IPTGillä, tai FM5/pKY287-soluihin, joita kasvatetaan suorittaen indusointi lämmöllä kuten kuvattu esimerkissä 12. Seosta inkuboidaan riittävän pitkän ajan tolueenin muuttamiseksi p-hydroksibentsyylial-koholiksi, minkä jälkeen se saatetaan reagoimaan Ni:n ja 10 CO:n kanssa osan A mukaisesti konversion p-hydroksifenyy- lietikkahapoksi aikaansaamiseksi.
Esimerkki 14
Metyylifenyylietikkahapon konversio p-hydroksife-nyylietikkahapoksi 15 A. Konversio PmKRl-soluilla
Metyy1i fenyy1ietikkahapposubstraatin muuttamiseksi p-hydroksifenyylietikkahapoksi metyylifenyylietikkahappoa sekoitetaan esimerkissä 12 kuvatun mukaisesti kasvatettuun PmKRlteen ja inkuboidaan riittävän pitkän ajan metyylife-20 nyylietikkahapon muuttamiseksi p-hydroksimetyylifenyyli- etikkahapoksi. Toisessa vaiheessa p-hydroksifenyylietikka-happo-välituotteen sisältävään soluseokseen kohdistetaan • · · '·’· happohydrolyysi happopitoisuuksissa ja lämpötiloissa, « < \v jotka ovat riittävät p-hydroksimetyylifenyylietikkahapon t « ; 25 muuttamiseksi p-hydroksifenyylietikkahapoksi. Konversio- : :*: kaavio esitetään seuraavasti: ·«· 9 *·· • ♦ · • ♦ · • · I « · • * · • · 30 9 9 ♦ 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 «
Hill • I 1 HU' « « .·: : 35 < i « I f t « I « I < « 104379
CH.COOCH, CHjCOOCH. CH COOH
5 tolueeni- I
1 mono-oksyge- happo- JL
i\ naasi_^ i* \] hydrolyysi
OH OH
10 metyylifenyyli- p-hydroksimetyyli- p-hydroksifenyyli- etikkahappo fenyylietikkahappo etikkahappo 15 B. Konversio mikro-organismi-isäntäsoluilla, jotka sisältävät PmKRl-tolueenimono-oksygenaasigeenejä koodaavia yhdistelmäplasmideja
Sama osan A mukainen konversio voidaan suorittaa käyttämällä mikro-organismi-isäntäsoluja, jotka sisältävät 20 esimerkin 10 mukaisia yhdistelmäplasmideja. Mitä tahansa yhdistelmäplasmidia (lukuunottamatta pKY283:a tai pMY400:ää), joka koodaa funktionaalisia PmKRl-tolueeni-mono-oksygenaasigeenejä, voidaan käyttää sopivan, esimer-
f I
.! ' kissä 10 kuvatun mukaisen mikro-organismi-isäntäsolun I 4 1 * . 25 transformoimiseksi. Edullisen menetelmän mukaan käytetään • * · HB101/pMY402-soluja. Toisen edullisen menetelmän mukaan V ! käytetään FM5/pKY287-soluja.
• ·
Konversion suorittamiseksi osassa A esitetyn mukaisesti metyylifenyylietikkahappoa sekoitetaan HB101/pMY402-
III
’t’ ! 30 soluihin, joita kasvatetaan suorittaen indusointi IPTGrllä, tai FM5/pKY287-soluihin, joita kasvatetaan suo- <#’ι; rittaen indusointi lämmöllä, kuten kuvattu esimerkissä 12.
• f . Seosta inkuboidaan riittävän pitkän ajan p-hydroksimetyy- lietikkahapon biokonversion aikaansaamiseksi, minkä jäl- !/·· 35 keen seokseen kohdistetaan happohydrolyysi happopitoisuuk- 26 104379 sissa ja lämpötiloissa, jotka ovat riittävät p-hydroksife-nyylietikkahapon saamiseksi.
Esimerkki 15
Indolin konversio indigoksi 5 A. Konversio PmKRl-soluilla
Indolisubstraatin muuttamiseksi indigoksi 50 mikrogrammaa/ml indolia sekoitettiin esimerkissä 12 kuvatun mukaisesti kasvatettuihin PmKRl-soluihin ja inkuboi-tiin riittävän pitkän ajan indolin muuttamiseksi indigok-10 si, yleensä 48 tuntia. Indigo voidaan eristää soluseokses-ta Ensleyn US-patenttijulkaisun n:o 4,520,103 esimerkissä 5 kuvaaman menettelyn mukaan.
B. Konversio mikro-organismi-isäntäsoluilla, jotka sisältävät PmKRl-tolueenimono-oksygenaasigeenejä koodaavia 15 yhdistelmäplasmideja
Sama osan A mukainen konversio voidaan suorittaa käyttämällä mikro-organismi-isäntäsoluja, jotka sisältävät esimerkin 10 mukaisia yhdistelmäplasmideja. Mitä tahansa yhdistelmäplasmidia (lukuunottamatta pKY283:a tai 20 pMY400:ää), joka koodaa funktionaalisia PmKRl-tolueeni- mono-oksygenaasigeenejä, voidaan käyttää sopivan, esimerkissä 10 kuvatun mukaisen mikro-organismi-isäntäsolun « i » transformoimiseksi. Edullisen menetelmän mukaan käytetään * 1 \v HBl01/pMY402-soluja. Toisen edullisen menetelmän mukaan i '·· 25 käytetään FM5/pKY287-soluja.
:#ί : Osassa A esitetyn konversion suorittamiseksi indo- lia sekoitetaan HB101/pMY402-soluihin, joita kasvatetaan suorittaen indusointi IPTG:llä, tai FM5/pKY287-soluihin, • · joita kasvatetaan suorittaen indusointi lämmöllä, kuten 30 kuvattu esimerkissä 12. Seosta inkuboidaan riittävän pit- ♦ 1 kän ajan indolin biokonversion indigoksi saamiseksi.
• « ·
Indigo voidaan eristää soluseoksesta osan A mukaisella menettelyllä.
i | « 4 « « · « » 1 I « · Ί · ' «
Claims (27)
1. Eristetty, biologisesti funktionaalinen plasmi-di, joka on peräisin tolueenimono-oksygenaasigeenejä sis- 5 ältävästä Pseudomonas mendocina KR-l:stä, tunnettu siitä, että geeni sijaitsee DNA-fragmentilla, jolla on kuviossa 3 esitetty restriktiokartta, ja että eristetyllä, biologisesti funktionaalisella plasmidilla on sellaiset tunnisteominaisuudet, että se sisältää tolueenimono-oksy-10 genaasigeenejä ja kykenee täten siirtämään kyvyn muuttaa tolueenia p-kresoliksi mikro-organismi-isäntäsolulle, jolta puuttuu tämä kyky.
2. Pseudomonas-suvun mikro-organismi-isäntäsolu, tunnettu siitä, että siihen on siirretty konjugoi- 15 maila patenttivaatimuksen 1 mukainen biologisesti funktio naalinen plasmidi.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen mikro-organismi-isäntäsolu, tunnettu siitä, että Pseudomonas on Pseudomonas putidä Y2101.
4. Yhdistelmäplasmidi, tunnettu siitä, että se käsittää plasmidivektorin, johon on insertoitu DNA-segmentti, jolla on kuviossa 3 esitetty restriktio- • i kartta ja joka koodaa Pseudomonas mendocina KR-l:stä eris- i i V.' tettyjä tolueenimono-oksygenaasigeenejä. « < ; 25 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdistelmäplasmi- \ml ; di, joka yhdistelmäplasmidi on biologisesti funktionaali- :*·*: nen, tunnettu siitä, että se kykenee transformoi- maan mikro-organismi-isäntäsolun ja tuottamaan kyvyn muut- • · taa tolueenia p-kresoliksi mikro-organismi-isäntäsolulle, 30 jolta puuttuu tämä kyky. • · ·
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdistelmäplasmi- • t * *, di, tunnettu siitä, että plasmidivektori on r '"'ί pUC18, pUC19, pKY235, joka on talletettu E. coli -kantaan ·:·: ATCC 67671, PMMB66EH, pMB66HE tai pCFM1146, joka on talle- ; 35 tettu E. coli -kantaan ATCC 67672. i « · f f I * 28 104379
7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdistelmäplasmi-di, tunnettu siitä, että DNA-segmentti on 20,5 kb:n Sacl-fragmentti, jonka restriktiokartta on kuviossa 3 esitetyn mukainen, tai sen aktiivinen alafragmentti.
8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdistelmäplasmi- di, tunnettu siitä, että DNA-segmentti on 10,2 kb:n Sacl-fragmentti, jonka restriktiokartta on kuviossa 3 esitetyn mukainen.
9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdistelmäplasmi- 10 di, tunnettu siitä, että DNA-segmentti on 7,7 kb:n Sacl-BamHI-fragmentti. jonka restriktiokartta on kuviossa 3 esitetyn mukainen.
10. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdistelmäplas-midi, tunnettu siitä, että DNA-segmentti on 6,2 15 kb:n Sacl-Sohi-fragmentti, jonka restriktiokartta on ku viossa 3 esitetyn mukainen.
11. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdistelmäplas-midi, tunnettu siitä, että DNA-segmentti on 5,9 kb:n Sacl-Xmal-fragmentti. jonka restriktiokartta on ku- 20 viossa 3 esitetyn mukainen.
12. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdistelmäplas- ,. midi, tunnettu siitä, että DNA-segmentti on 4,6 • « · kb:n XhoI-fragmentti. jonka restriktiokartta on kuviossa 3 V.' esitetyn mukainen. • i i 25 13. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdistelmäplas- • · ϊ ! ! midivektori, tunnettu siitä, että se käsittää pKY235:n, joka on talletettu E. coli -kantaan ATCC 67671, tai pCFM1146:n, joka on talletettu E. coli -kantaan ATCC 67672.
14. Mikro-organismi-isäntäsolu, tunnettu • · · I..> siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 4 mu- • · · *. kaisella yhdistelmäplasmidilla. r
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen mikro-organis-mi-isäntäsolu, tunnettu siitä, että mikro-orga-·1 · 35 nismi-isäntäsolu on E. coli JM109. JM83. HB101 tai FM5. I I I ' 1 « « · | « m « « « « • · 29 104379
16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen mikro-organis-mi-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 7 mukaisella yhdistelmäplas-midilla.
17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen mikro-organis- mi-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 8 mukaisella yhdistelmäplas-midilla.
18. Patenttivaatimuksen 14 mukainen mikro-organis- 10 mi-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on trans formoitu patenttivaatimuksen 9 mukaisella yhdistelmäplas-midilla.
19. Patenttivaatimuksen 14 mukainen mikro-organis-mi-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on trans- 15 formoitu patenttivaatimuksen 10 mukaisella yhdistelmäplas- midilla.
20. Patenttivaatimuksen 14 mukainen mikro-organis-mi-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 11 mukaisella yhdistelmäplas- 20 midilla.
21. Patenttivaatimuksen 14 mukainen mikro-organismi -isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on trans- I I I formoitu patenttivaatimuksen 12 mukaisella yhdistelmäplas- « I V,' midilla. I '
22. DNA-segmentti, tunnettu siitä, että se | :’i käsittää 20,5 kb:n Sacl-fragmentin, jonka restriktiokartta ;*·*: on kuviossa 3 esitetyn mukainen, tai sen alafragmentin, joka DNA-segmentti koodaa Pseudomonas mendocina KR-l:stä • · eristettyjä tolueenimono-oksygenaasi-geenejä. #...t 30 23. Menetelmä fenyyliyhdisteen mikrobiaalisen bio- • · · I.. konversion fenoliyhdisteeksi suorittamiseksi hydroksyloi- maila, tunnettu siitä, että fenyyliyhdiste saate- f '!"! taan reagoimaan Pseudomonas mendocina KR-1 -solujen kans- : · * i sa, tai patenttivaatimuksen 14 mukaisten mikro-organismi- . 35 isäntäsolujen kanssa, jolloin soluja on käsitelty toluee- ‘ nimono-oksygenaasigeenejä indusoivalla aineella. I « 30 104379
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fenyyliyhdiste käsittää tolu-eenia, metyylifenyylietikkahappoa, etyylifenyylietikkahap-poa, 2-fenyylietanolia, asetanilidia, fluoribentseeniä tai 5 etyylibentseeniä.
25. Mikrobiaalisentsymaattinen menetelmä p-hydrok-sifenyylietikkahapon valmistamiseksi tolueenista, tunnettu siitä, että (a) tolueeni saatetaan reagoimaan Pseudomonas mendocina KR-1 -mutanttikannan kanssa, joka 10 sisältää puutteellisen p-hydroksibentsaldehydidehydroge- naasin, tai patenttivaatimuksen 14 mukaisten mikro-orga-nismi-isäntäsolujen kanssa, ja (b) käsitellään Ni:llä ja hiilimonoksidilla riittävän pitkän ajan, jotta tolueeni on oleellisesti muuttunut p-hydroksifenyylietikkahapoksi.
26. Mikrobiaalisentsymaattinen menetelmä p-hydrok- sif enyylietikkahapon valmistamiseksi metyylifenyylietikka-haposta, tunnettu siitä, että (a) metyylifenyyli-etikkahappo saatetaan reagoimaan Pseudomonas mendocina KR-1 -solujen kanssa, tai patenttivaatimuksen 14 mukaisten 20 mikro-organismi-isäntäsolujen kanssa, jolloin soluja on käsitelty tolueenimono-oksygenaasigeenejä indusoivalla aineella, ja (b) hydrolysoidaan hapolla riittävän pitkän ajan, jotta metyylifenyylietikkahappo on oleellisesti V,: muuttunut p-hydroksifenyylietikkahapoksi. '25 27. Mikrobiaalisentsymaattinen menetelmä indigon • valmistamiseksi indolista, tunnettu siitä, että • ·· · indoli saatetaan reagoimaan Pseudomonas mendocina KR-1 -solujen kanssa, tai patenttivaatimuksen 14 mukaisten mikro-organismi-isäntäsoluj en kanssa, jolloin soluja on käsi-30 telty tolueenimono-oksygenaasigeenejä indusoivalla aineel- • · · la. • · · « · » • III'’
4 I « « f I f 104379
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17763188 | 1988-04-05 | ||
| US07/177,631 US5017495A (en) | 1988-04-05 | 1988-04-05 | Plasmid encoding the Pseudomonas mendocina toluene monooxygenase gene |
| PCT/US1989/001445 WO1989009828A1 (en) | 1988-04-05 | 1989-04-04 | Method and materials for the microbial bioconversion of toluene and other phenyl compounds |
| US8901445 | 1989-04-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI895788A0 FI895788A0 (fi) | 1989-12-04 |
| FI104379B true FI104379B (fi) | 2000-01-14 |
Family
ID=22649341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI895788A FI104379B (fi) | 1988-04-05 | 1989-12-04 | Menetelmä ja materiaaleja tolueenin ja muiden fenyyliyhdisteiden biokonvertoimiseksi |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5017495A (fi) |
| EP (1) | EP0336719A3 (fi) |
| JP (1) | JP2862301B2 (fi) |
| KR (1) | KR0157301B1 (fi) |
| AU (1) | AU625220B2 (fi) |
| CA (1) | CA1337977C (fi) |
| DK (1) | DK175789B1 (fi) |
| FI (1) | FI104379B (fi) |
| IL (1) | IL89845A (fi) |
| NO (1) | NO301548B1 (fi) |
| WO (1) | WO1989009828A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA892503B (fi) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5171684A (en) * | 1988-04-05 | 1992-12-15 | Amgen Inc. | Bioconversions catalyzed by the toluene monooxygenase of Pseudomanas mendocina KR-1 |
| CA2069741C (en) * | 1990-09-28 | 1996-06-18 | Kwang-Mu Yen | Cloning cartridges and expression vectors in gram-negative bacteria |
| WO1998013474A1 (en) * | 1996-09-25 | 1998-04-02 | Genencor International, Inc. | Microorganisms with ability to degrade indole and enzymes therefrom |
| US6642031B2 (en) | 1995-11-20 | 2003-11-04 | Genencor International, Inc. | Microorganisms with ability to degrade indole and enzymes therefrom |
| US6190892B1 (en) * | 1995-11-20 | 2001-02-20 | Genencor International, Inc. | Microbial production of indigo |
| US5958757A (en) * | 1996-09-13 | 1999-09-28 | Envirogen, Inc. | Biological conversion of organic compounds |
| US6395539B1 (en) | 1997-05-05 | 2002-05-28 | Ohio University | Composition and methods for bioremediation |
| US6551814B1 (en) | 1997-05-05 | 2003-04-22 | Ohio University | Methods for bioremediation by degrading toluene |
| US6830899B1 (en) | 1997-06-13 | 2004-12-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the production of para-hydroxybenzoate in Pseudomonas mendocina |
| WO1999023224A1 (en) * | 1997-10-31 | 1999-05-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | A GENE ENCODING A PUTATIVE EFFLUX PROTEIN FOR SOLVENTS/ANTIBIOTICS IN $i(PSEUDOMONAS MENDOCINA) |
| WO2000037480A1 (en) | 1998-10-26 | 2000-06-29 | University Of Iowa Research Foundation | Novel naphthalene dioxygenase and methods for their use |
| US6586229B1 (en) * | 2000-06-01 | 2003-07-01 | North Carolina State University | Method for the production of ρ-Hydroxybenzoate in species of pseudomonas and agrobacterium |
| CA2418155A1 (en) * | 2000-07-18 | 2002-01-24 | National Research Council Of Canada | Cloning, sequencing and expression of a comamonas cyclopentanone 1,2-monooxygenase-encoding gene in escherichia coli |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1436573A (en) * | 1972-06-07 | 1976-05-19 | Gen Electric | Microorganisms |
| US4477570A (en) * | 1981-09-24 | 1984-10-16 | Occidental Chemical Corporation | Microbial degradation of obnoxious organic wastes into innocucous materials |
| WO1984001154A1 (en) * | 1982-09-20 | 1984-03-29 | Amgen | Method and materials for the microbiological oxidation of aromatic hydrocarbons |
| US4520103A (en) * | 1982-10-27 | 1985-05-28 | Amgen | Microbial production of indigo |
| US4959315A (en) * | 1987-04-30 | 1990-09-25 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The Environmental Protection Agency | Biodegradation of chloroethylene compounds |
-
1988
- 1988-04-05 US US07/177,631 patent/US5017495A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-04-03 CA CA000595484A patent/CA1337977C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-04 WO PCT/US1989/001445 patent/WO1989009828A1/en not_active Ceased
- 1989-04-04 EP EP89303329A patent/EP0336719A3/en not_active Withdrawn
- 1989-04-04 KR KR1019890702299A patent/KR0157301B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-04 IL IL8984589A patent/IL89845A/en unknown
- 1989-04-04 JP JP1504385A patent/JP2862301B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-04 AU AU34104/89A patent/AU625220B2/en not_active Expired
- 1989-04-05 ZA ZA892503A patent/ZA892503B/xx unknown
- 1989-12-04 FI FI895788A patent/FI104379B/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-12-04 NO NO894845A patent/NO301548B1/no not_active IP Right Cessation
- 1989-12-04 DK DK198906090A patent/DK175789B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1989009828A1 (en) | 1989-10-19 |
| NO894845D0 (no) | 1989-12-04 |
| ZA892503B (en) | 1991-12-24 |
| KR0157301B1 (ko) | 1998-10-15 |
| NO301548B1 (no) | 1997-11-10 |
| KR900700612A (ko) | 1990-08-16 |
| JP2862301B2 (ja) | 1999-03-03 |
| EP0336719A3 (en) | 1989-11-15 |
| AU625220B2 (en) | 1992-07-02 |
| DK609089D0 (da) | 1989-12-04 |
| JPH03500126A (ja) | 1991-01-17 |
| EP0336719A2 (en) | 1989-10-11 |
| NO894845L (no) | 1990-02-02 |
| IL89845A (en) | 1994-11-28 |
| US5017495A (en) | 1991-05-21 |
| DK609089A (da) | 1990-01-24 |
| CA1337977C (en) | 1996-01-23 |
| IL89845A0 (en) | 1989-12-15 |
| AU3410489A (en) | 1989-11-03 |
| DK175789B1 (da) | 2005-02-21 |
| FI895788A0 (fi) | 1989-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI104379B (fi) | Menetelmä ja materiaaleja tolueenin ja muiden fenyyliyhdisteiden biokonvertoimiseksi | |
| Kotani et al. | PropaneMonooxygenase and NAD+-dependent secondary AlcoholDehydrogenase in propane metabolism by gordonia sp. StrainTY-5 | |
| Cheng et al. | Genetic analysis of a gene cluster for cyclohexanol oxidation in Acinetobacter sp. strain SE19 by in vitro transposition | |
| US20040267001A1 (en) | Genes encoding baeyer-villiger monooxygenases | |
| Rijnen et al. | Expression of a heterologous glutamate dehydrogenase gene in Lactococcus lactis highly improves the conversion of amino acids to aroma compounds | |
| Luers et al. | Glycerol conversion to 1, 3-propanediol by Clostridium pasteurianum: cloning and expression of the gene encoding 1, 3-propanediol dehydrogenase | |
| Kong et al. | Enhanced antioxidant activity in Streptococcus thermophilus by high-level expression of superoxide dismutase | |
| Mars et al. | Bioconversion of limonene to increased concentrations of perillic acid by Pseudomonas putida GS1 in a fed-batch reactor | |
| Friello et al. | XYL, a nonconjugative xylene-degradative plasmid in Pseudomonas Pxy | |
| Benson et al. | Plasmid-determined alcohol dehydrogenase activity in alkane-utilizing strains of Pseudomonas putida | |
| Zuniga et al. | Plasmid-and chromosome-mediated dissimilation of naphthalene and salicylate in Pseudomonas putida PMD-1 | |
| Keil et al. | Gene organization of the first catabolic operon of TOL plasmid pWW53: production of indigo by the xylA gene product | |
| Kivisaar et al. | Degradation of phenol and m-toluate in Pseudomonas sp. strain EST1001 and its Pseudomonas putida transconjugants is determined by a multiplasmid system | |
| AU651142B2 (en) | Bioconversions catalyzed by the toluene monooxygenase of pseudomonas mendocina KR-1 | |
| IE83308B1 (en) | Bioconversions catalyzed by the toluene monooxygenase of pseudomonas mendocina KR-1 | |
| Bestetti et al. | Molecular characterization of a plasmid from Pseudomonas fluorescens involved in styrene degradation | |
| Senthilkumar et al. | Disruption of the Zymomonas mobilis extracellular sucrase gene (sacC) improves levan production | |
| Perez et al. | Resistance to androstanes as an approach for androstandienedione yield enhancement in industrial mycobacteria | |
| Cheng et al. | Role of the H protein in assembly of the photochemical reaction center and intracytoplasmic membrane in Rhodospirillum rubrum | |
| Csáki et al. | Molecular characterization of structural genes coding for a membrane bound hydrogenase in Methylococcus capsulatus (Bath) | |
| Wahbi et al. | Construction and use of recombinant Escherichia coli strains for the synthesis of toluene cis-glycol | |
| CN113736815B (zh) | 一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法 | |
| Tan et al. | Molecular analysis of the plasmid-borne bed gene cluster from Pseudomonas putida ML2 and cloning of the cis-benzene dihydrodiol dehydrogenase gene | |
| US5173425A (en) | Enhancement of naphthalene dioxygenase activity during microbial indigo production | |
| JP2004528842A (ja) | 芳香族化合物の酸化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: AMGEN INC. |
|
| MA | Patent expired |