JPH0329856A - ＨＩＶｐ２４抗原の定量法、それに用いる組成物およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生物学的試料中のＨＩＶｐ２４抗原の定量法
、それに用いる組成物およびキッｌ・に関ずる。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）酵素
イムノアッセイ法は、生物学的試料中の抗Ｈ　Ｉ　Ｖ抗
体の検出に用いられている。そのような試験は、過去に
Ｈ　Ｉ　Ｖに暴露されたことを示す高感度の検出法では
あるが、ウィルスの存在の直接的証拠を示すものではな
い。血岐や他の体肢中の生きたウィルスの検出は、しば
しば、複雑な培養法に』：ってのみ行うことが可能であ
る［ザラハツジン（Ｓ　ａｌａｈｕｄｄｉｎ）ら、ＰＮ
ＡＳ（＋　９　８　５）８　２４ 希釈において充分な再現性を得ることが困難であること
のために精度が過酷に制限されるからである。

１｛　Ｔ　Ｖに感染した患者の血清または血漿において
、「ｐ２／Ｉ」として知られるＩ−１　１　Ｖタンパク
質の巖度は、そのような患者の免疫抑制のひどさに応じ
て変わることが知られている。従って、疾患の進行をモ
ニターし、さらにＹ■Ｔ　Ｖに感染した患者における治
療法の有効性をモニターするために、ＨＩＶｐ２４の定
量的に正確なアッセイを提供することが望まれている。

（課題を解決するための手段） 本発明は、生物学的試料中のＨＩＶｐ２４抗原の定量法
であって、 該試料をＨＩＶｐ２４抗原に特異的な抗体と接触させて
検出可能な抗原一抗体複合体を生成させ、ついで 精製ウィルスＨＴＶｐ２４抗原を含む組戚物からなる定
量パネルを標準として用いて、生成した抗原一抗体複合
体を定量する ことを特徴とする方法； 精製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原およびバッファーを含む
ことを特徴とする、ＨＩＶｐ２４標準に適した組成物： 精製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原を含む組或物からなる定
量パネルを含むことを特徴とする、生物学的試料中のＨ
ＩＶｐ２４抗原を定量するためのキット：および 生物学的試料中のＨＩＶウィルス抗原の検出方法であっ
て、該試料をＨＩＶｐ２４抗原に特異的な抗体と接触さ
せて検出可能な抗原一抗体複合体を生成させ、ついで生
成した抗原一抗体複合体を検出することを特徴とする方
法において、該生成した抗原一抗体複合体の定量を、精
製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原を含む組成物からなる定量
パネルを標準として用いて行うことを特徴とする方法を
提供することを目的とする。

本発明は、生物学的試料中のＨＩＶｐ２４抗原を定量す
る（すなわち、力価を決定する）ためのイムノアツセイ
法、該方法に用いる組成物および該７一 セイ法に比べて著しく改良されたものである。改良点は
、定量パネルにおいて精製ウィルスＨ　Ｉ　Ｖｐ２４抗
原を用いることにある。

別の態様において、本発明は、精製ウィルスＨＩＶｐ２
４抗原およびバッファーを含むことを特徴とする、ＨＩ
Ｖｐ２４標準に適した組成物を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、精製ウィルスＨＩ
Ｖｐ２４抗原を含む組成物からなる定量パネルを含むこ
とを特徴とする、生物学的試料中のＨＩＶｐ２４抗原を
定量するためのキットを提供する。

本明細書Ｉこおいて「精製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原」
とは、ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２もしくはウィルスの他の
株から得たＨＩＶ．ｐ２４、または遺伝子組換えにより
調製され、該ウィルス株から得られたｐ２４とは免疫学
的に識別できないｐ２４を意味する。ただし、その上う
なｐ２４は、そのようなｐ２４を含む試料中のタンパク
質の少なくとも９５％を構成する。精製ウィルスＨＩＶ
ｐ２４方法を行うためのキットを提供するものである。

試料中のＨＩＶｐ２４抗原の力価とＩ｛ＩＶｐ２４のた
めの試料のイムノアッセイからのシグナルの強度との間
の相関関係を確立するために用いるコントロール試料に
おいて、抗原試薬として精製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原
を用いることが特に有利であることがわかった。従って
、本発明の方法は、これまで得られたことのない精度で
１−１１Ｖｐ２４抗原の定量を可能とするものである。

一つの態様において、本発明は、生物学的試料中のＨＩ
Ｖｐ２４抗原の定量法であって、該試料をＨＩＶｐ２４
抗原に特異的な抗体と接触させて検出可能な抗原一抗体
複合体を生成させ、ついで 精製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原を含む組成物からなる定
量パネルを標準として用いて、生戊した抗原一抗体複合
体を定量する ことを特徴とする方法を提供する。

本発明のこの方法は、生物学的試料中のＨｆＶウィルス
抗原を検出するための従来のイムノアッ８ 抗原は、ｐ２４抗原Ｚこ対するモノクローナル抗体を用
いたイムノアフィニティー精製法により、Ｈ　Ｔ　Ｖウ
ィルス抗原調製物から下記のようにして調製することが
できる。

本明細書において、本発明の方法における「ＨＩＶｐ２
４抗原に特異的な抗体」とは、ウィルスＨＩＶｐ２４上
のエピトープを認識するがポリクローナル抗体凋製物の
一部である抗体か、またはウィルスＨＩＶｐ２４上のエ
ピトープを認識するモノクローナル抗体を意味する。

本発明の方法において生威した抗原〜抗体複合体は、そ
のような複合体を検出するためにイムノアッセイの技術
分野において知られた数多くの方法のいずれを用いても
検出することができる。たとえば、検出可能な標識もし
くは検出可能なシグナルを生威し得る残基（酵素など）
でＨＩＶｐ２４抗原に特異的な抗体を直接標識してもよ
いし、またはＥＬ　ＩＳＡ法もしくは放射性標識した第
二の抗体を用いた他のサンドイッチアッセイ法を用いる
こともできる。別法としては、競合アッセイ法を用いる
こともでき、その場合はＩ−１１Ｖｐ２４抗原に特異的
な抗体への結合に関して、試料中のＨＩＶｐ２４が標識
精製ウィルスＩ｛ＩＶｐ２４抗原と競合する。

本明細書において「定量パネル」とは、一組みの溶肢ま
たは一組みの多量の屹燥（たとえば凍結乾燥）試薬をい
う。一組みの多量の乾燥試薬である定量パネルは、当業
者には容易に理解され、また下記で説明するように、水
または適当な塩溶液またはバッファーおよび塩の水溶肢
を加えるだけで、一組みの溶肢である定量パネルに変換
することができる。好ましいバッファーはトリスバッフ
ァーであるが、当業者により理解されるように他のバッ
ファ一、たとえばＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−１＝ドロキソ
エヂルコピペラジンーＮ’−［２−エタンスルホン酸］
）、Ｐ　Ｉ　ＰＥＳ（ピペラジンーＮ，Ｎ’−ビス［２
エタンスルホン酸］）、ＭＯＰＳ（１−［Ｎ−モルホリ
ノ］プロパンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ヒス［２
−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）
、ＴＢＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２
−アミノエタンスルホン酸）およびリン酸塩（＝塩基性
および二塩基性）も用いることができる。本発明の定量
パネルにおいてＮａＣｌが適当な塩であるが、これも当
業者により理解されるように、ＫＣＩなどの他の塩も用
いることができる。

当業者には容易に理解されるように、本発明の定量パネ
ルにおける「コントロール組成物」とは、１−１１Ｖｐ
２４抗原を含まないが、他の点ではＨＩＶｐ２４抗原を
含み本発明の定量パネルの一部を構戚ずる［｛ＩＶｐ２
４抗原を含む組成物と組成が同じものを意味し、該コン
トロール組成物も本発明の定量パネルの一部を構成する
。

本発明において定量パネルの組成物は、本発明の方法に
従って生成した抗原一抗体複合体に基づくングナルの強
度と試料中のＨＩＶｐ２４抗原の濃度との間の相関関係
（たとえば「標準［１１］線」）を確立するために用い
る。従って、本発明の定量パネル（組成物が溶液である
もの）は、少なくとも２種の異なる巖度のＨＩＶｐ２４
の組戚物、通常は３種の異なる濃度の組成物（そのうち
の一つは濃度が０である、すなわちｐ２４抗原を含まな
い）からなる。定量パネル（組成物が溶液であるもの）
中の濃度範囲は、０〜約４００ｐｉ＋精製ウィルスＩ−
１　１　Ｖｐ２４抗原／πＱ溶肢、一層好ましくは０〜
約３００ｐｇ精製ウィルスＩ−ＩＩＶｐ２４抗原／ｆｆ
ｆｆ溶液、さらに一層好ましくは約Ｏ〜約１００ｐｇ精
製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原／ｍＱ溶液である。本発明
のパネルの組成物（溶液であって精製ウィルスＨ　Ｉ　
Ｖｐ２４抗原を含むもの）において、ｐ２４抗原の濃度
の範囲は約０　．　５　９９／ａ〜約４　０　０　ｐ９
／ｒｔｒＱ，層好ましくは約１　ｐｇ／ｍ（１　〜３　
０　０　ｐ９／７！ｃ、さらに一層好マシくハ約１０ｐ
ｇ／ｍ（１〜約＋　０　０　ｐｇ／ｒｔｔ（ｌである。

本発明の方法に従ったＨ　Ｉ　Ｖ抗原陽性試料中のＨＩ
Ｖｐ２４抗原の定量の感度お上び再現性を、従来の半定
量法（ウィルス溶解物からの抗原混合物を用いて標準曲
線を確立するもの）から得られた結果の感度および再現
性との比較で評価した。

本発明の方法によれば、ｐ２４抗原自身の定量をＩｐｇ
／ｍ（ｌ未満まで行うことが可能である。組成物の成分
を凍結乾燥した本発明の定量パネルでも、再現性の優れ
た（典型的なアッセイ内偏差、くｌＯ％、アッセイ間偏
差、＜１５％）アッセイが得られた。

精製ＨＩＶｐ２４抗原を用いることにより改善された純
度は、定量パネルの安定性および該パネルを用いて行っ
たアッセイの再現性を高め、その結果、標準としてウィ
ルス溶解物抗原を用いたアッセイに比べて患者抗原レベ
ルの測定における信頼性が著しく改善される。

アフィニティー精製においてモノクローナル抗体を用い
ることにより少なくとも９５％の純度のウィルスｐ２４
抗原が得られ、これを本発明のパネルに用いる。凍結乾
燥は該パネルに対して２〜８℃において８箇月以上の安
定性を付与し、バッファーは再構成されたパネルに対し
て２〜８℃において６週間以上の安定性を付与する。本
発明の方法における血清および血漿からの定量値の再現
性はＪ５％未満の偏差であるのに対して、従来の半定量
法では４０％の偏差であることが示された。

生物学的試料中のＨＩＶｐ２４抗原の定量のための本発
明の方法は、精製ウィルスｐ２４抗原を用いるものであ
り、純度が改良されていること、標準の安定性が改良さ
れていること、および標準曲線から得られる定量値の再
現性が改良されていることのために、抗ウィルス治療を
受けている患者のｐ２４抗原レベルをモニターするのに
有用で信頼性の高い手段となる。

本発明の方法により容易に試験できる生物学的試料とし
ては、ヒトおよび動物の体液および組織（血漿および血
清など）、並びに組織培養液などが挙げられる。

精製ウィルス｝｛ｌＶｐ２４抗原を希釈するためニ溶液
中に用いるバッファーは、再構成後のパネルに一層良好
な安定性を付与する。この溶液は、緩衝食塩水が好まし
い。たとえば、トリス（トリス［ヒドロキシメチルコア
ミノメタン）（シグマ・ケミカル、セントルイス、ＭＯ
より市販）を食塩水を緩衝するために用いることができ
る。

−１５〜 て２時間）遠心分離にかけることによりペレット化した
。このペレット化した細胞を、ｌｍＭ｝リス、１　５ｍ
Ｍ　’ＮａＣｌおよびＯ．ＩｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．５
を含む溶液（ＴＥＮ）中に再懸濁した。

この再懸濁したペレットを１０，ＯＯＯＲＰＭにて約１
５分間遠心分離することにより清澄化した。この上清を
デカントし、得られたペレットをＴＮＥ中に再懸濁し再
び遠心分離にかけた。この上清を集め、もう１度遠心分
離にかけた。

遠心管中にて、上記で得た上清の下に２０％シヨ糖溶液
の層を生成させ、２〜８℃、３　５．０　０　ＯＲＰＭ
にて４時間（または２０，ＯＯＯＲＰＭにて１６〜２２
時間、または４３，ＯＯＯＲＰＭにて２時間４５分間）
遠心分離させることにより、２０％シヨ糖パッドを用い
て該上清中に含まれるウィルスをペレット化した。この
ペレットをＴＮＥ中に再懸濁した。

ついで、この再懸濁したウィルスを当業者によく知られ
た手順［たとえば、ザ・メソッド・オブ・サンドキスト
（ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＳｕｎｄｑｕｉｓＬ）
、本発明に用いるｐ２４抗原は、ＨＩＶ−１感染細胞か
ら得ることができる。種々のＨＩＶ−１単離物が同定さ
れており、そのうちのーっはＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ−ＩＩＩ　
（ｂ）ｆｆｉ染Ｈ９細胞により製造された単離物であり
、これは当業者に入手可能である（ＨＴＬＶ−ＩＩＩは
現在はＨＩＶ−１と呼ばれている）。

従って、ＨＩＶ−１ウィルスが棲息している細胞であれ
ばいかなるものであってもｐ２４抗原の適当な採取源と
なる。

本明細書に開示した方法を用いれば、Ｈ　Ｉ　Ｖ　−２
などの他のいかなるヒト免疫不全ウィルスに対しても、
該ウィルスから精製ウィルスｐ２４抗原を得ることによ
り、当業者は定量曲線を得ることができる。

タンパク質ｐ２４抗原の精製 Ｈ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−　ＩＩＩ　（ｂ）に感染したＨ９細
胞を、成長曲線の対数期のピーク（約７〜ｌＯ日）に採
取した。

この細胞を限外濾過により濃縮し、ついで２０．００　
ＯＲＰＭにて一夜（または２５．００ＯＲＰＭにて３時
間、または４３，ＯＯＯＲＰＭにｌ６ Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｖｆｒｏｌｏｇｙ（１　９　
８　１）６　８　：　Ｉ　Ｉ　５〜１２７を参照］に従
い、シヨ糖勾配中の平衡沈降によりバンド化した。簡単
に説明すると、上記再懸濁したウィルスを、下記のよう
にして調製したシヨ糖勾配の頂部に層として置いた。遠
心管中にて、３０％シヨ糖溶液の下に４５％シヨ糖溶液
の層を生成させ、この勾配上に再懸濁したウィルスの層
を生成させ、ついでスイングパケットローター（たとえ
ば、ＳＷ−２５）中、２５．００ＯＲＰＭにて一夜遠心
分離させることにより勾配を凋製した。この勾配を分画
し、ｐ４１活性を示すタンパク質を含む画分をプールし
た。このバンド化したウィルスをＴＮＥ中に希釈し、２
〜８℃、３５．００ＯＲＰＭにて４時間（または２０．
ＯＯＯＲＰＭにて１６〜２２時間、または４３，ＯＯＯ
ＲＰＭにて２時間４５分間）遠心分離することによりペ
レット化した。このペレット化ウィルスをＴＮＥ中に再
懸濁し、０．５Ｍ　ＮａＣｌおよび０．５％トリスＸ−
１００を含む溶液中で超音波処理し、３５，ＯＯＯＲＰ
Ｍにて４時間（または４３，ＯＯＯＲＰＭにて２時間４
０分間）遠心分離にかけることにより清澄化した。この
上清をデカントして精製ウィルス溶解物を得た。

この精製ウィルス溶解物からモノクローナル抗体［モノ
クローナル抗体の産生の一般的方法は、モノクローナル
・ハイブリドーマ・アンチボディーズ：テクニークス・
アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、
ノ＼レル（Ｊ．ＧＲ　．　Ｈ　ｕｒｒｅ１　１）編［Ｃ
ＲＣプレス、１９８．２］に概説されている］を用いた
イムノアフイニテイーク口マトグラフィーによりｐ２４
タンパク質を単離した。簡単に説明すると、まずセファ
ロースゲル、たとえばセファロース４Ｂ（ファルマシア
・ファイン・ケミカルズ、ウプサラ、スウェーデン）を
ＨＩＶ−１ｐ２４に特異的なモノクローナル抗体と結合
させ、０．０５％のグルタールアルデヒドで架橋し、つ
いで０，ＯＩＭ｝リス、０．００１Ｍ　ＥＤＴＡ，０．
７５Ｍ　ＮａＣｌおよび０．５％トリトンＸ−１００を
含む溶ｉ（ｐＨ　８　．　１　、洗浄溶らなる。このパ
ネルは、精製ｐ２４抗原のストックをバッファーとＮａ
Ｃｌの水溶液中に１ｏ　Ｏ　ｐｇ／村の最終濃度まで希
釈することにより調製する。

他のパネル成分は、この第一の成分を系列希釈すること
により調製することができる。別のやり方として、精製
ｐ２４抗原のスｌ・ツクをバツファーとＮａＣｌの水溶
液中に所望の濃度まで希釈することにより、それぞれの
パネル成分を調製することもできる。

定量パネルのロット１（ＱＰＩ）を下記のようにして調
製した。既知濃度（　１　７　．　Ｏ　ｎ９／ｍＱ）の
精製ＨＩＶｐ２４抗原のストック溶液を、＋５０ｍＭＮ
ａＣｌ，ｌ％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．
１％ＮａＮ３（０．０２Ｍトリス）を含む０．０２Ｍト
リス（ｐＨ７．２）で希釈して１　０　０ｐ９／ｒｐＱ
パネル成分を調製した。１５００ｍｌ２の０．０２Ｍ｝
リスを８．８２ｘ（２のＩ−ＴＩＶｐ２４抗原ストック
溶液と混合した。試験してみると濃度が低かったたため
０．５９ｘＱのストック溶液をさらに加えた。他の戒分
は、このＩ　０　０　ｐｇｌｍＱＫ分を系列希釈する液
）で洗浄した。ついで、この洗浄ゲルを上記精製ウィル
ス溶解物（２ｍｇ抗原／１１Ｑゲル）と混合し、回転装
置上で２〜８゜Ｃにて１２〜２４時間翻転させた。つい
で、この溶解物／ゲル混合物をカラム中に注ぎ、５カラ
ム容量の洗浄溶液で洗浄し、４．０ＭグアニジントＩＣ
１てＩ）２４を溶出した。タンパク質を含有する両分を
プールし、溶出したｐ２４を、Ｏ．ｌ　４　５Ｍ　Ｎａ
Ｃｌを含む０．０　１　７Ｍリン酸塩溶液（ｐＨ７．２
）中で一夜透析した。

タンパク質アッセイ、たとえば製造者の手順に従ってバ
イオ−ラド試薬（バイオーラド・ラボラトリーズ、リッ
チモンド、ＣＡ）を用いたタンパク質アッセイを行って
タンパク質濃度を決定し、走査濃度計測を用いて絶対ｐ
２４タンパク質濃度に補正した。これらの手順により、
９５％Ｈ　Ｉ　Ｖｐ２４以上の抗原調製物を機械的に得
ることかできる。

パネル成分の調製 定量パネルは、ｐ２４濃度が１００、５０、２５、１　
２．５およびＯ　ｐｙ／πｇの５成分パネルかことによ
り調製した。

凍結乾燥手順 すべての凍結乾燥ザイクルは、ソーク（ｓｏａｋ）セグ
メントとランプ（ｒａｍｐ）セグメントで定義される。

ソークセグメントは、設定値を特定の時間保持するもの
として定義される。ランプセグメントは、設定値を変更
する割合または時間として定義される。基本的なザイク
ルは３つのセグメントからなる。すなわち、（１）最初
のシエルフ／生或物冷セグメント（ソーク）、（２）室
圧を制御するシエルフ／生成物加熱セグメント（ランプ
）、および（３）なお室圧を制御する最後のシエルフ／
生成物乾燥セグメント（ソーク）である。

製造業者［ハル・コーポレーション（ＨｕｌｌＣ　ｏｒ
ｐｏｒａｔ　ｉｏｎ）、ハットボロ、ペンシルベニア］
による一般的な使用説明書に従い、ハルリオフイライザ
ー（Ｈｕｌｌ　Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ）を用いた。凍
結乾燥ザイクルは、生戊物の前冷却要求、生成物の凍結
温度、乾燥ザイクルの間の絶対室圧および所望のシェル
フ乾燥温度に基づいていた。リオフイライザーのシェル
フは、前以て−４５℃またはそれ以下に冷却しておいた
。充填バイアルをシェルフ上に置き、温度が−２０℃に
達するまで生成物を凍結させ、この温度またはそれ以下
の温度に少なくとも３時間保った。ついで、冷却器プレ
ートを冷却し真空にすることにより乾燥ザイクルを開始
した。真空の設定値は１００ミクロンであった。シェル
フ温度を−４０℃の設定値から２５℃に８．０時間かけ
てランプした。シェルフ温度を２５℃に保ち、生成物を
０℃以上の定常温度まで達する上うにし、栓をする前に
この温度に７〜２０時間保持した。５〜１５インチの水
銀真空下、窒素を用いて室を充填しバイアルに栓をした
。

他の２つの定量パネルのロット（ＱＰ２、ＱＰ３）も上
記のようにして調製した。

ＨＩＶ抗原アッセイ試験法 ｐ２４を定量するために、Ｈ　Ｉ　Ｖ　−　１抗原（Ａ
ｇ）の検出のための酵素イムノアッセイを用いた（アボ
ット・ラボラトリーズ、アボットパーク、Ｉ　Ｌから市
販）。簡単に説明すると、Ｉ４■Ｖ−１に対するヒト抗
体をコーティングしたポリスチレンビーズを試料かまた
はｐ２４定量パネルの成分のいずれかと室温にて１６〜
２０時間インキユベートした。インキコベート後、未結
合物質を吸引し、ビーズを洗浄した。ついで、ウサギ抗
体をビーズとともに４０℃にて４時間インキユベートし
、これはＨＩＶ−ＩＡｇに結合した。未結合物質を吸引
し、ビーズを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼを
結合した抗ウサギＩｇＧヤギ抗体をビーズとともに４０
℃にて２時間インキユベートし、これはウサギ抗体に結
合した。未結合物質を吸引し、ビーズを洗浄した。つい
で、過酸化水素を含むＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ
）溶液をビーズに加え、３０分インキユベートした後、
ビーズに結合したＨＩＶ−ＩＡｇの量に比例して黄−オ
レンジ色が発色した。ＩＮＨｔＳＯ，を加えて酵素反応
を停止させた。分光光度計を用い、４９２ｎｍにおける
色の強度を読み取った。

ＨＩＶ−Ｉ　　Ａｇの存在または不存在は、試料の吸光
度をカットオフ値と相関させることにより決一騒 ２４ 定する。カットオフ値は、陰性コントロール平均または
細胞培養平均の吸光度プラス係数０．０　５　０である
。カットオフ値より大きいかまたはカットオフ値と等し
い吸光度を有する試料は、ＨＩＶ−ＩＡｇに対して反応
性とされる。カットオフ値よりも小さい吸光度を有する
試料は、ＨＩＶ−ＩＡｇに非反応性であるとされる。

つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものでない。

実施例１ アッセイ再現性： ５戊分パネルを、上記プロトコールに従ったＨＩＶ抗原
アッセイで試験した。各パネル成分の吸光度を濃度に対
してプロットした。得られた曲線図表は実質的に直線で
あり、再現性が非常に高かった。特定の抗原アッセイキ
ットを用い、３つの異なる臨床部位について試験したと
ころ、ＱＰ１，ＱＰ２およびＱＰ３の複合平均相関係数
は０．９　９　６　７（ｎ＝２　２）であり、偏差の相
関係薮（標準偏差ＣＶ／平均）は０．２％であった。さ
らに、各定量パネルについて、異なる抗原アッセイキッ
ト間で良好な相関がみられた。

各定量パネル成分のアッセイ内およびアッセイ間の再現
性、並びにパネルのロット間の再現性は非常に良好であ
る。特定の抗原アッセイキットを用い、３つのすべての
定量バネルロットについて１つの臨床部位で試験したと
ころ、各パネル成分の吸光度は非常に再現性が高い。第
１表に示すように、各パネル成分のＣｖは１０％未満で
ある。

髪土豪 （注）ａ：試験数は２８である。

実施例２ 試料の定量・ １０個の試料セットを３つのＨＩＶｐ２４抗原定量パネ
ルの各パネルに対して定量し、％ＣＶを計算した。試料
セットは下記のものからなっていた。

試料１〜３　正常ヒト血漿に既知濃度（ｐｙ／　ｍＱ）
で加えた精製ｐ２４抗原 抗原陽性供血者から直漿のｌ：２希 釈（ｐｉ＋／１１Ｑ）； 試料５〜７　抗原陽性供血者血漿の非希釈試料（ｐ９／
村）； ５％ウシ胎仔血清および０．５％ト リトンＸ−１００を含むＲＰＭＩ ｌ６４０組織培養培地に加えた精製 ｐ２４抗原（＋）９／ＩＲ１２）； 上記組織培養培地に一層高濃度で加 えた精製ｐ２４抗原であって、試験 する前にＩｇｌｏｏ希釈する必要が あるもの 上記組織培養培地に一層高濃度で加 えた精製ｐ２４抗原であって、試験 試料ｌ０ 試料９ 試料８ 試料４ ずる前に１・３００希釈する必要が あるもの 下記第２表に示すように、３つのロット（ＱＰ１、ＱＰ
２およびＱＰ３）間でのＨＩＶｐ２４抗原パネルのロッ
ト間の再現性は優れたものであった。生物学的試料中の
Ｔ−ｒＩＶｐ２４抗原を定量するための本発明の方法に
より、平均分散が７％未満（４．５％〜１１．２％）の
血漿に対ずるアッセイ値が得られた。加えて、界面活性
剤の含量（０．５％トリトンＸ−１　０　０）および試
験前に行う希釈のために一層偏差が大きい組織培養試料
は、本発明の方法において２０％未満の偏差を示した。

（以下余白） 第２表 ２７ ２８一 抗原を定量するための本発明の方法により、平均分散が
７％未満（４．８％〜１０．８％）の血漿に対するアッ
セイ値が得られた。加えて、０　５％トリトンＸ−１０
０を含む組織培養試料は、２０％未満の偏差を示した。

寒１表 加えて、３つのＨＩＶｐ２４抗原定量ノ＜ネル（ＱＰＩ
，ＱＰ２およびＱＰ３）の各パネルを用い、３つの異な
るＨ　Ｉ　Ｖ抗原アツセイキットに対して試料セットを
定量した。各定量パネルについて、３つの異なるＩ−１
　１　Ｖ抗原アツセイキット間でのア・ソセイ間の再現
性ｉよ非常に良好であった。下記第３表に示すように、
Ｈ　Ｉ　Ｖ抗原パネルＱＰ＋の再現性は優れていた。生
物学的試料中のＩ｛ＩＶｐ２／１さらに、Ｈ　Ｉ　Ｖ抗
原を試験する１００個の血漿および血清試料のサンプリ
ングにおいて、それら試料の９１％は曲線の限度内で定
量することができた、ずなわち、試利の濃度は０〜１０
０ｐ９／ｍＱｐ２４の範囲であった。

実施例３ 比較データ： 従来の定量法は、Ｈ　Ｉ　Ｖ　−　１抗原の検出のため
の診断キット中に提供される陽性コントロール試薬を系
列希釈して標準曲線を作成することからなる。この方法
の不利な点は、陽性コントロールがウィルスの溶解物溶
液であるために、ｐ２４の量が間接的に測定されること
である。このウィルス溶解物溶液は組織培養液から得ら
れ、多くの種類のタンパク質を含んでいる。本発明の開
示する方法は、陽性コントロールの希釈を利用した従来
の方法に比べて陽性試料の再現性が著しく改善されてい
る。下記第４表に示すデータは、従来法および本発明の
方法の両方について陽性試料の偏差をまとめたものであ
る。各陽性試料を、両方法において５つの異なるＨＩＶ
抗原アッセイキットに対して試験した。本発明の方法は
、試験した各試料について偏差を改善する。

越えて拡張される。１２５、１５０，１７５および２　
０　０　ｐ９／ＩＲ（ｌの濃度も含まれるようにパネル
成分を加えて実験を行った。かくして得られたｌｌｌ線
は実質的に直線であり、相関係数は０．９　９　Ｆ３　
５であった。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）生物学的試料中のＨＩＶｐ２４抗原の定量法であ
   って、 該試料をＨＩＶｐ２４抗原に特異的な抗体と接触させて
   検出可能な抗原−抗体複合体を生成させ、ついで 精製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原を含む組成物からなる定
   量パネルを標準として用いて、生成した抗原−抗体複合
   体を定量する ことを特徴とする方法。
2. （２）定量パネルにおいて、精製ウィルスＨＩＶｐ２４
   抗原を含む組成物が該精製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原お
   よびバッファーを含む溶液であり、該精製ウィルスＨＩ
   Ｖｐ２４抗原の該溶液中の濃度が１〜３００ｐｇ／ｍｌ
   の範囲であり、該定量パネルがさらにコントロール組成
   物を含み、該コントロール組成物は該バッファーを含む
   が該精製ＨＩＶｐ２４抗原は含まない溶液である、請求
   項（１）に記載の方法。
3. （３）精製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原およびバッファー
   を含むことを特徴とする、ＨＩＶｐ２４標準に適した組
   成物。
4. （４）凍結乾燥した請求項（３）に記載の組成物。
5. （５）バッファーがトリスバッファーであり、組成物が
   さらにＮａＣｌを含む請求項（３）に記載の組成物。
6. （６）バッファーがトリスバッファーであり、組成物が
   さらにＮａＣｌを含む請求項（４）に記載の組成物。
7. （７）精製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原を含む組成物から
   なる定量パネルを含むことを特徴とする、生物学的試料
   中のＨＩＶｐ２４抗原を定量するためのキット。
8. （８）定量パネルにおいて、精製ウィルスＨＩＶｐ２４
   抗原を含む組成物がバッファーも含み、定量パネルがさ
   らにコントロール組成物を含み、該コントロール組成物
   は該バッファーは含むが該精製ウィルスＨＩＶｐ２４抗
   原は含まない、請求項（７）に記載のキット。
9. （９）定量パネルの組成物が凍結乾燥したものである、
   請求項（８）に記載のキット。
10. （１０）定量パネルの組成物において、該バッファーが
    トリスバッファーであり、組成物がさらにＮａＣｌを含
    む、請求項（９）に記載のキット。
11. （１１）生物学的試料中のＨＩＶウィルス抗原の検出方
    法であって、該試料をＨＩＶｐ２４抗原に特異的な抗体
    と接触させて検出可能な抗原−抗体複合体を生成させ、
    ついで生成した抗原−抗体複合体を検出することを特徴
    とする方法において、該生成した抗原−抗体複合体の定
    量を、精製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原を含む組成物から
    なる定量パネルを標準として用いて行うことを特徴とす
    る方法。
12. （１２）定量パネルにおいて、精製ウィルスＨＩＶｐ２
    ４抗原を含む組成物が該精製ウィルスＨＩＶｐ２４抗原
    およびバッファーを含む溶液であり、該精製ウィルスＨ
    ＩＶｐ２４抗原の該溶液中の濃度が１〜３００ｐｇ／ｍ
    ｌの範囲であり、該定量パネルがさらにコントロール組
    成物を含み、該コントロール組成物は該バッファーを含
    むが該精製ＨＩＶｐ２４抗原は含まない溶液である、請
    求項（１１）に記載の方法。