JPH03292970A - 脂肪族塩素化合物の微生物分解方法及びその微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は特定の固定化微生物による飽和及び／又は不飽
和脂肪族塩素化合物の分解方法及びその方法に用いる新
規固定化微生物に関するものである。

更に詳しくは工場からの排水又は排ガス中、或いは土壌
中等に含まれるトリクロロエチレンのような揮発性脂肪
族塩素化合物の微生物による分解除去方法に関するもの
である。

［従来の技術］ 工場からの排水又は排ガス、或いは土壌中には各種有機
塩素化合物が混入されており、近時、環境汚染等の問題
から、これらの有効な除去が注目されるところとなって
いる。

殊にトリクロロエチレン（ＴＣＥ）は、ＩＣ産業等で用
いられている難分解性化合物であり、発ガン性を有し、
地下水汚染物質として問題になっている。

従来、排水中或いは排ガス中から、トリクロロエチレン
のような有機塩素化合物を除去するには、活性炭による
吸着除去法等が行われてきたが、これらは多量の吸着剤
や特別の装置及び設備を必要とするものであり、必ずし
も効率的かつ経済的な除去手段とはなっていない。

一方、有機塩素系化合物の効率的かつ簡便な分解除去手
段として、微生物を用いる方法もいくつか試みられ報告
されている。

例えば、ロドトルラ属、クラドスポリウム属、キャンデ
イダ属、サツカロミセス属及びストレプトミセス属の微
生物等を用いてポリクロル化されたビフェニルのような
有機塩素化合物を分解除去する例（特開昭４８−９８０
８５号、特開昭４８−９８０８８号、特開昭４９−８１
８６号）、及びメチロシナス属、メチロシスチス属、メ
チロコツカス属及びメチロバクテリウム属の細菌のよう
なメタン資化性細菌を用いて、ｍ−クロルトルエンのよ
うなハロゲン置換ベンゼンを分解する例（特開昭５５−
１２７１９８号）が報告されている。

しかしながらトリクロロエチレン及びその類縁化合物の
ような脂肪族塩素化合物を有効に分解除去する微生物に
ついてはほとんど報告されておらず、わずかに本出願人
による提案（特願昭６３−２３９７５３号）があるのみ
である。

［発明の解決しようとする課題］ 本発明は、前記特願昭６３−２３９７５３号において提
案した脂肪族塩素化合物の分解方法を工業的に一層有利
に利用するための改善方法を提供すること、及びその方
法に用いる新規な固定化微生物を提供することを目的と
するものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者は、前記の出願において開示した微生物の固定
化につき鋭意検討してきたが、ある種の担体が前記微生
物の固定化に特に有効であることを知見し、本発明に至
った。

すなわち、本発明は、 （１）メチロシナス属に属し、脂肪族塩素化合物分解能
を有する微生物を、アガロ−スゲル、に−カラギ−ナン
ゲル、及び／又はアルギン酸カルシウムゲルで固定化し
、この固定化微生物を脂肪族塩素化合物又はその含有物
と接触させることを特徴とする脂肪族塩素化合物の分解
方法、及び（２）メタン及びメタノールを唯一炭素源と
して生育し、トリクロロエチレンを分解するメタン資化
性菌であるメチロシナス・トリコスポリウム・ＴＳＵＫ
ＬＩＢＡをアガロ−スゲル、に−カラギ−ナンゲル及び
／又はアルギン酸カルシウムゲルで固定化した固定化微
生物からなるものである。

本発明の微生物自体はすでに述べたように特願昭６３−
２３９７５３号に開示したものである。これは各種土壌
に広く分布しこれから採取し得られるが、その採取の方
法としては、例えば次のような方法を用いる。

すなわち、培養はブチルゴム栓及びアルミシールで密閉
したバイアル瓶を用い、３０℃にて振とうする。トリク
ロロエチレン量はへラドスペースより気相を一定量取り
、ガスクロマトグラフィーにより定量し、ヘンリーの法
則式より液相濃度を算出する。

前記手段を用い、例えば採取した土壌をｉｐｐｍトリク
ロロエチレン及びメタンの存在下で集積培養を繰り返し
、トリクロロエチレンをよく分解する混合微生物系を得
る。トリクロロエチレンの分解には酸素及びメタンが必
須であることから、混合微生物系からメタノドローフの
単離を行う。

本発明において単離された菌は、公知のメチロシナス・
トリコスポリウムに属するメチロシナス・トリコスポリ
ウム・ＴＳＵＫＵＢＡである。

この菌を顕微鏡で観察すると、巾　０．６〜１μｍ１長
さ　１〜５μｌの短桿菌で以下の表に示すような特性を
有するものである。

ＣｈｒａｃｔｅｒｉｓＮｃｓ　　ｏｆ　　ｍｅｔｈａｎ
ｅ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｇｒａｌ　５ｔａｉｎ　　　　　　　　　　　　　　　
　ＮｅｇａｔｉｖｅＣｅｌｌ　　５ｈａｐｅ　　　　　
　　　　　　　　　５ｈｏｒｔ　　ｒｏｄＮｕｍｂｅｒ
　ｏｆ　　ｆ’ｌａｇｅｌａ　　　　　　　　　　　　
　ＯＭｏｔｌｌｌｔｙ Ｇｒｏｗｔｈ　　ｏｎ ｍｅｔｈａｎｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　＋ｔｈａｎｅ ｐｒｏｐａｎｅ ｎ−ｂｕｔａｎｅ ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　＋ｅｔｈａｎｏｌ ｎｕｔｒｉｅｎｔ　　ｂｒｏｔｈ Ｇｒｏｗｔｈ　　ａｔ　　３０℃　　　　　　　　　　
　　　　　　＋３７℃十 ４５℃ Ｍｏ１％Ｇ＋ＣＯＦ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　
　８４．５Ｍａｊｏｒ　　ｒａｔｔｙ　　ａｃｉｄ　　
　　　　　　　　Ｃ＋ｓＩ＋　　（９８，５％）Ｈｙｄ
ｒｏｘｙ　　ｆ’ａｔｔｙ　　ａｃｉｄ　　ｔｙｐｅ　
　　　　２−　ＯＨＱｕｉｎｏｎｅ　　ｔｙｐｅ ８ 以上の菌学的性質に基づき、本発明のメチロシナス菌株
の同定を行った。

本発明のメチロシナスの菌株は、菌の形態、ダラム染色
などの顕微鏡的所見、生理学的諸性質などから、公知菌
メチロシナス・トリコスポリウム０Ｂ３ｂの性状につい
て記載した文献（１，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ
ｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　６１゜２０５−２
１８（１９７０）　、２．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｇｒｏ
ｗｔｈ　ｏｎ　Ｃ＋Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｐ、　１２３
〜１３Ｂ（１９ｇ４）　、３．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’
Ｇｅｎｅｒａｌ＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ　３ｇ、　１３５〜１８５（１９８７）］に記され
ているＷｈｉｔｔｅｎｂｕｒｙら、及び駒形らの分類に
基づき、メチロシナス・トリコスポリウム０Ｂ３ｂに近
縁の株と同定された。

しかしながら、鞄毛を有せずＣ１０の飽和脂肪酸も有せ
ず、又、ロゼツトを形成しない点で、メチロシナス・ト
リコスポリウム０Ｂ３ｂとは明らかに相違し、新菌株と
同定され、メチロシナス・トリコスポリウム・ＴＳＵＫ
ＬＩＢＡと命名された。

本発明の菌は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第１０００４号として寄託されている。

本発明の菌はトリクロロエチレン及びその各種類縁化合
物、すなわち、シス−１，２−ジクロロエチレン、トラ
ンス−１，２−ジクロロエチレン、１．１−ジクロロエ
チレン、　１．１，２．２−テトラクｂロエタン、１，
１．２−　トリクロロエタン、１．２−ジクロロエタン
、クロロホルムを分解する性質を有し、１０ｐＩ）１１
の高濃度トリクロロエチレンを１０日間で約半分に分解
する能力を持つ。

本発明においては、上記のメチロシナス・トリコスポリ
ウム・ＴＳＵＫＵＢＡの反復利用を可能とし、又、反応
系からの分離を容易にして、この菌体を工業的に一層有
利に利用するため、この菌体を固定化する。

本発明において用いる上記菌体には担体特異性があり、
その固定化のための担体の選択はきわめて重要である。

菌体の担体としてはポリウレタン、光硬化性樹脂、高分
子電解質なども知られているが、これらの担体は上記の
菌体の固定化のためには不適当である。これらを用いて
固定化した場合には、上記菌体が本来有するトリクロロ
エチレン等脂肪族塩素化合物を分解する特性が著しく減
殺されてしまう。

本発明者の研究では上記菌体の固定化にはアガロ−スゲ
ル、アルギン酸カルシウムゲル及びに−カラギ−ナンゲ
ルを担体として用いた場合だけが、菌体の有用な属性を
実質上損うことなく固定化することができる。

本発明の方法を実施するに当っては、本発明の固定化微
生物をトリクロロエチレン或いは該化合物を含有する排
水或いは排ガス等と溶液状態で接触させることによって
行われる。

［実施例コ 以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明する。

（固定化菌体の調製法） バイアル瓶（１５５ｍｌ）に以下の蒸留水に溶解した無
機塩培地３０１を入れ、メチロシナス・トリコスポリウ
ム・ＴＳＵＫＩＪＢＡを接種した後にｌｐｐ■のトリク
ロロエチレン及びメタンを加えて、ブチルゴム栓、及び
アルミシールで完全密封して３０℃にて振とう培養を行
った。

ＫＨ２ＰＯ４ に２　ＨＰＯ４ Ｈ４Ｃｌ Ｃａ　（ＮＯ３）２ ＭｇＳＯ４７Ｈ２０ １；’　ｅｓｏ４ Ｔｒａｃｅ　ｍｅｔａｌｓ Ｄ、Ｗ。

ＣＨ＜ 又はＣＨ３０Ｈ ０，４５ｇ１５１ ｉ、ｔ’ｙｇ１文 ２．１４ｇ／交 ４．８Ｂ／交 １２１Ｂ／Ｑ ２Ｂｉｇ１５１ ｐＨ７，２ ２０ｍ１／ｂｏｔｔｌｅ Ｏ，３ｍｌ／ｂｏｔｔｌｅ Ｈ２０ Ｈ２０ 培養液６０１を集菌したのち、ｉｏ＋ａＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）　２．５ｍｌに懸濁し、４％アルギン酸
ソーダ溶液２，５１を加え　５％塩化カルシウム溶液中
に滴下してアルギン酸カルシウムゲル固定化菌体を調製
した。又、前記菌体懸濁液にそれぞれアガロースあるい
はに一カラギーナンを加え、１化することにより　４％
アガロース、２％に一カラギ−ナンゲル固定化菌体を調
製した。又、比較のために光硬化性樹脂（関西ペイント
株式会社％） 及びウレタンポリマー（東洋ゴム工業株式会社製ＰＩ　
８）を担体として用いて固定化した。

実施例１ 上記で得た固定化菌体を、直径３■のビーズ又はキュー
ブ状に成形して、前記無機塩培地の入ったバイアル瓶（
第１図）１本に入れ、トリクロロエチレンの分解実験を
行った。

分解実験では実験結果の解析を容易にするために、生育
炭素源は加えずに休止菌体として行った。

なお、固定化休止菌体を賦活化する場合にはメタンある
いはメタノールを前記の量だけ加えて、一定時間振とう
培養を行った。

なお、トリクロロエチレンの減少量はヘッドスペース法
によりガスクロにて定量した。

まず、各種固定化菌体のｉｐｐｍのトリクロロエチレン
に対する分解能を比較測定した。その結果を第２図に示
す。

縦軸には反応開始時のバイアル瓶内のトリクロロエチレ
ン量を１００％とした時の残存率を示している。第２図
から明らかなように、ポリウレタン、光硬化性樹脂では
ほとんどトリクロロエチレンの減少はみられず、高分子
電解質で固定化した場合でも１０％程度の減少しかみら
れない。一方、遊離の休止菌体では１４時間後約６０％
の分解がみられ、又、アガロ−スゲル、に−カラギ−ナ
ンゲルで固定化した場合においてもほぼ同程度の減少が
みられ、アルギン酸カルシウムゲルで固定化した場合に
は遊離菌よりも分解率がよく、１４時間後に９０％以上
の減少がみられた。

実施例２ 次にトリクロロエチレンの減少が顕著に認められたアガ
ロ−スゲル、に−カラギ−ナンゲル、及びアルギン酸カ
ルシウムゲルによる固定化菌体について、繰返し使用に
よる分解能の変化とゲルの耐久性について検討を加えた
。

ここでは５回の繰返し使用を行った。まずメタンを炭素
源としてメチロシナス・トリコスポリウム・ＴＳＵＫＵ
ＢＡを調製して、固定化し、１回目の実験を行い、その
後メタン又はメタノールを加えて賦活化し、再び休止菌
体として分解実験を行った。２回目以降も同様に毎回賦
活化して分解実験を繰返した。この結果を第１表に示す
。表中の数値は分解率をあられし、１回目の減少量を１
００％として表わしている。又、ゲルの崩壊については
、十が正常なゲル、土はゲルの一部が崩壊したとき、−
は完全に崩壊したことを示す。

アルギン酸カルシウムゲルで固定化した場合、第２図に
おいては１回目で遊離菌よりも高い分解能がみられたが
、繰返し使うと３回目からゲルの崩壊が始まった。一方
、アガロ−スゲルでは５回の繰返し使用でもゲルの崩壊
はみられず、コンスタントな分解能の保持が観察された
。に−カラギ−ナンゲルでは４回目にゲルが壊れ始めた
。又、それぞれの固定化菌体をメタンあるいはメタノー
ルで賦活化した場合、１回目のメタノールでの賦活化で
はメタンでの賦活化よりも高い分解率が認められたが、
２回目以降では全般的にメタンでの賦活化の方が良くな
る傾向が認められた。

第１表 実施例３ 次にアガロース固定化休止菌体が分解し得るトリクロロ
エチレン濃度の上限を検討した。第３図において縦軸は
バイアル瓶内の初発トリクロロエチレン量を１００％と
してその相対的な残存率をあられしている。

第３図から、液相濃度が１００ｐｐ１１ではトリクロロ
エチレンの減少は全くみられないが、８５ｐｐｍ以下の
濃度ではそれぞれ減少がみられ、かなり高い濃度でも分
解されることが明らかである。

ここには示していないが、遊離菌においてもほぼ同様の
結果が得られた。次にここで得られた結果をもとに、各
濃度における分解速度を求め、トリクロロエチレン濃度
との関係を調べてみた。

第４図は基質であるトリクロロエチレンの濃度とその分
解速度との関係を表した図である。

縦軸には分解速度、横軸にはトリクロロエチレンの濃度
を示している。上が固定化菌体、下が遊離の菌体の場合
である。

この図からも明らかなようにアガロースに固定化した場
合のトリクロロエチレンの分ｓ４パターンはＭｉｃｈａ
ｅｌｌｓ−Ｍｅｎｔｅｎ型であることがわかる。

そこでＬｉｎｅｖｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋの方法により、
最大分解速度ｖ、、８と飽和定数に、を求めてみた。

第５図はＬｌｎｅｖｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋのプロットで
ある。

これからＶ　ｍ　ａ　ｘとに、を求めると、固定化菌体
のＶ、１１は３．１５μｇ　ＴＣＥ／ｉｇ　ｃｅｌｌ／
ｈｒで、遊離菌体では２，８２と求められ、一方に、は
固定化菌体では１００μＮ１遊離菌体で６６μＭであっ
た。

これらの数値より、固定化しても遊離菌と比べて分解能
が顕著に低下することは認められず、■１．８は固定化
した方が若干高くなる傾向がある。又、ｋ、は固定化菌
体の方が大きく、基質であるトリクロロエチレンとの親
和力が弱いことがわかる。基質との親和力が弱いのは固
定化担体であるアガロ−スゲルが菌体への基質の拡散を
阻害しているためだと考えられ、特に高濃度トリクロロ
エチレンの場合にはゲルが菌体を保護し有効であると思
われる。

ついで分解速度の温度による影響について検討を行った
。その結果を第６図に示す。縦軸の分解速度は０．１０
から示しである。

１５℃と３５℃では分解速度は急激に低下しているが、
２０℃で最も高い分解速度を示した。又、２０℃から３
０℃にかけても比較的安定で゛あることがわかった。

第７図は、分解速度に対するｐＨの影響について検討し
た結果である。ｐＨ８から　７．５の広い範囲において
分解速度はほとんど一定であるがｐＨ８では急激に分解
速度が低下していることがわかる。又、ｐＨ６で分解速
度が若干大きくなったことについては、酸性溶液なため
にアガロ−スゲルの強度が弱くなり、菌体が多少漏れ出
し、そのため遊離菌によるトリクロロエチレンの分解が
進んだためと考えられる。したがって、この固定化菌体
ではアルカリ側では分解活性は低下するが、中性ではそ
れほど大きな活性の変化はないといえる。

［発明の効果］ 以上説明したように、本発明により特定の担体を選択す
ることによりメチロシナス・トリコスポリウム・ＴＳＵ
ＫＵＢＡが有する脂肪族塩素化合物の分解特性を実質上
低下させることなく固定化することができ、この新規固
定化微生物を使用することにより、難分解性の汚染物質
を効率的に分解することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明実施例に供した試験装置の説明図、第２
図は各種担体に固定化した場合のトリクロロエチレンの
分解特性を説明する図、第３図はアガロースに固定した
菌体によるトリクロロエチレン分解特性のその濃度によ
る変化を説明する図、第４図は同菌体のトリクロロエチ
レンの分解速度に及ぼすその濃度の影響について説明す
る図、第５図は同菌体によるトリクロロエチレン分解の
Ｌｉｎｅｖｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを表わす図、
第６図は同菌体によるトリクロロエチレン分解特性に及
ぼす温度の影響を説明する図、第７図は同菌体によるト
リクロロエチレン分解特性に及ぼすｐＨの影響を説明す
る図。 回定１ζ困俸 第５ 図 第７ 図 Ｈ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）メチロシナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属に
   属し、脂肪族塩素化合物分解能を有する微生物を、アガ
   ロ−スゲル、カラギ−ナンゲル、及び／又はアルギン酸
   ゲルで固定化し、この固定化微生物を脂肪族塩素化合物
   又はその含有物と接触させることを特徴とする脂肪属塩
   素化合物の分解方法。
2. （２）微生物がトリクロロエチレンを分解するメタン資
   化性細菌である請求項（１）記載の方法。
3. （３）微生物がメチロシナス・トリコスポリウム・ＴＳ
   ＵＫＵＢＡ（微工研菌寄Ｎｏ．１０００４）である請求
   項（１）又は（２）に記載の方法。
4. （４）メタン資化性であり、トリクロロエチレンを分解
   するメチロシナス・トリコスポリウム・ＴＳＵＫＵＢＡ
   （微工研菌寄Ｎｏ．１０００４）をアガロ−スゲル、κ
   −カルギ−ナンゲル及び／又はアルギン酸カルシウムゲ
   ルで固定化した固定化微生物。