JPH03291568A - 抗ミトコンドリアｍ↓２抗体の検出用試薬及び測定法 - Google Patents
抗ミトコンドリアｍ↓２抗体の検出用試薬及び測定法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
驚胆少亘酌
［産業上の利用分野］
本発明（よ原発性胆汁性肝硬変患者に特異的に出現する
抗ミトコンドリアＭ２抗体の検出用試薬及びその検出用
試薬を用いた抗ミトコンドリアＭ２抗体の測定法に関す
る。 ［従来の技術］ ヒトおよびラットの胃壁細胞、腎尿細管細胞、甲状腺上
皮細胞の各細胞質に特異蛍光を示す抗体が、原発性胆汁
性肝硬変（以下、ＰＢＣという）患者血清に高率に見ら
れることが、ウォーカーらによって初めて報告された（
Ｌａｎｃｅｔ Ｉ 、８２７，１９６５）。後に、この
抗体はミトコンドリアに対する抗体であることが判明し
、ＰＢＣ患者以外の患者においても出現することが明か
となった。バーブら（飄疾患群別に抗ミトコンドリア抗
体を数種類の亜型に分類し、対応抗原の生化学的分析を
行ってきた（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍ１ｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｐａｔｈｏｌ、、３，３５５．１９８０）。 その内のＭ２抗体［１ＰＢＣに特異的なミトコンドリア
抗体亜型といわ札近年で］よ その抗体を特異的に検出
する方法が開発されている（Ｈｅｐａｔ。 Ｉｏｇｙ、 ２．１．１９８２）。 その検出方法は臨床現場にて次のようにして実施されて
いる。まず、試薬として、抗ミトコンドリアＭ２抗体を
高濃度で有する患者血清（非検査対象）より抗ミトコン
ドリアＭ２抗体を精製する。 この抗ミトコンドリアＭ２抗体の一部を一次抗体として
、マイクロプレート等の不溶性支持体上に所定量を担持
させる。更１：、抗ミトコンドリアＭ２抗体の一部を酵
素等で標識し所定量の二次抗体とする。次に、上記不溶
性支持体上に抗原としてラット肝臓またはウシ心筋から
得られる粗ミトコンドリア画分を反応させる。この不溶
性支持体に対して、検体としての患者血清と上記二次抗
体とを混合状態で添加する。このことにより、不溶性支
持体上の一次抗体に対して検体と二次抗体との間で競合
反応を行わせる。二次抗体はその量が既知であることか
ら、不溶性支持体上に結合した二次抗体の量をその標識
に基づいて測定すれ（ヱ測定量と実際の添加量との差か
ら二次抗体の反応の阻害度がわかる。この阻害度（よ検
体中の抗体量に対応しているので、その阻害度から患者
血清中の抗ミトコンドリアＭ２抗体量（濃度）が決定で
きることになる。 ［発明が解決しようとする課題］ しかし、この様な方法では試薬として高濃度の抗ミトコ
ンドリアＭ２抗体を有する患者血清が必要であり、臨床
現場で（よ そのような血清を直ちに入手し難い場合が
ある。従って、一部の病院等でしか実行できず、広く臨
床現場で抗ミトコンドリアＭ２抗体を容易に定量測定で
きるとはいえなかった。 本発明は上記課題を解決し、広く臨床現場で容易に抗ミ
トコンドリアＭ２抗体を定量測定できる試薬および測定
法を提供することを目的とする。 登豊り構處 ［課題を解決するための手段及び作用］第１発明の抗ミ
トコンドリアＭ２抗体の検出用試薬（よ 免疫学的に抗ミトコンドリアＭ２抗体を検出する測定法
に用いられる試薬であって、精製したミトコンドリア間
２抗原を不溶性支持体に直接結合せしめてなることを特
徴とする。 第２発明の測定法（よ 免疫学的に抗ミトコンドリアＭ２抗体を検出する測定法
であって、 第１発明の検出用試薬に対し検体を反応せしめた後、検
体に含まれる抗ミトコンドリアＭ２抗体に特異的に反応
する抗体に標識をしたものを二次抗体として反応させ、
反応した二次抗体の標識量に基づいて検体に含まれる抗
ミトコンドリアＭ２抗体量を検出することを特徴とする
。 第３発明の測定法は、 免疫学的に抗ミトコンドリアＭ２抗体を検出する測定法
であって、 第１発明の検出用試薬に対し、検体とともに既知量の抗
ミトコンドリアＭ２抗体を含む基準試薬を競合反応させ
た後、検体に含まれる抗ミトコンドリアＭ２抗体に特異
的に反応する抗体に標識をしたものを二次抗体として反
応させ、反応した二次抗体の標識量に基づいて検体に含
まれる抗ミトコンドリアＭ２抗体量を検出することを特
徴とする。 以下、本発明を更に詳細に説明する。 抗ミトコンドリアＭ２抗体の検出用試薬に用いられる精
製したミトコンドリア間２抗原（よ動物から得られる。 特に、ラット肝臓またはウシ心筋がミトコンドリア間２
抗原を多量に含むので好ましい。これらの材料に含まれ
るミトコンドリア間２抗原の抽出および精製（友−船釣
に知られている各種の方法が用いられる。例えば大量迅
速に精製するに（よ クリストファースタンレイらの方
法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、 １９１．１４７．１９８
０）により行う。この方法で精製されたミトコンドリア
間２抗原は純度が高く、測定に際して高い特異性が得ら
れる。例え（′Ｌ ウシ心筋から上記方法でミトコンド
リア間２抗原を精製すると、ミトコンドリア間２抗原の
１種であるウシ心筋ビルベートデハイドロゲナーゼ（Ｐ
ＤＨ）が得られる。尚、Ｇｅｒｓｈｒｉｎらにより、ミ
トコンドリア間２抗原（友 ピルベートデハイドロゲナ
ーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
：ＰＤＨ）およびブランチドケトアシッドデハイドロゲ
ナーゼ（ｂｒａｎｃｈｅｄ ｋｅｔｏａｃｉｄ ｈｙｄ
ｒｏｇｅｎａｓｅ： ＢＣＫＤ）であることが証明され
ている（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ １ｍｍｕｎｏｌ−、ｉｎ
ｐｒｅｓｓ、１９８８）。 精製されたミトコンドリア間２抗原が結合される不溶性
支持体として１社例え１ヱ ポリスチレン樹脂、ポリカ
ーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等のプラ
スチックや、ガラスといった水に不溶の物質が該当する
。この不溶性支持体の形態（よ例えばスティック、ビー
ズ、マイクロプレートあるいは試験管状のものが挙げら
れる。この不溶性支持体への担持は単なる物理吸着でも
よく、化学的な結合でもよい。直接結合すると（友ミト
コンドリアＭ２抗原に対する抗体を介さずに結合される
ことを意味する。 二次抗体として（よ例え１ｆＳ 標識された抗ヒトイ
ムノグロブリン抗体等の、抗ミトコンドリアＭ２抗体に
特異的に反応する抗体が用いられる。標識は酵素標敷
ア“イソトープ標識等、一般に用いられている標識が使
用できる。酵素標識の場合の酵素として（よ ペルオキ
シダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオ
キシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペ
プチダーゼ、グリセルアルデヒド−３リン酸脱水素酵素
、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−ナーゼ、Ｐ−ナー
ゼ等を挙げることができる。 上記抗ヒトイムノグロブリン抗体として（友 精製ヒト
イムノグロブリンγ鎖、α鎖あるいはμ鎖表免疫源とし
て、公知の方法によりポリクロナール抗体またはモノク
ロナール抗体として得られる抗ヒトイムノグロブリン抗
体が挙げられる。上記ヒトイムノグロブリンγ鎖、α鎖
あるいはμ鎖に特異的な抗体を用いれ（ｉ抗ミトコンド
リアＭ２抗体に、対するイムノグロブリンのクラス別測
定が可能となる。 第３発明における、抗ミトコンドリアＭ２抗体を含む基
準試薬として（友通常の方法で、予め動物にミトコンド
リア間２抗原で免疫して作られた抗ミトコンドリアＭ２
抗体を用いることが出来る。 例え（ヱ マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ等の
動物にミトコンドリア間２抗原を免疫し、ポリクロナー
ル抗体あるいはモノクロナール抗体として作製する。 上述のように構成されている第１発明の検出用試薬（友
ミトコンドリア間２抗原を不溶性支持体に直接結合せ
しめてなることから、試薬としての高濃度の抗ミトコン
ドリアＭ２抗体を有する患者血清が不要となる。また、
このことにより、第１発明の検出用試薬表用いた第２発
明および第３発明の測定法は臨床現場にても容易に抗ミ
トコンドリアＭ２抗体量を検出することができる。 ［実施例］ 以下、本発明を、その好適な実施例により更に詳細に説
明する。 まず試薬の作製について説明する。 ［１］ミトコンドリアＭ２抗原の 制 大量迅速精製（よ おおむねクリストファースタンレイ
らの方法に準じて行った。即ち、ウシ心筋２５０ｇに対
して５００ｍｌの０． ３重量％トライトンＸ−１００
、０，１ｍＭジシオスレイトールを含む５０ｍＭＭ０Ｐ
ｓ緩衝液（ｐＨ７，０）とともにＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖ
ｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで破砕し、１００００Ｇで
２０分間遠心し、上清を集ぬた。 この上清に３５重量％ポリエチレングリコール水溶液を
０．１２容量加え、撹拌後、２５０００Ｇで１０分間遠
心し、得られた沈澱を４００ｍ１の上記ＭＯＰＳ緩衝液
に懸濁させた更に、２５０００Ｇにて遠心後、その上清
を最終濃度１３ｍＭ塩化マグネシウム、１重量％トライ
トンＸ−１００、５０ｍ１ｉ！リン酸緩衝溶液に調製し
、再度３５重量％ポリエチレングリコール水溶液を０．
１２容量加え、得られた沈澱を１００ｍ１上記ＭＯＰＳ
緩衝液に懸濁させた。４０００Ｇにて１時間遠心後、そ
の上清を最終濃度１３ｍＭ塩化マグネシウム、１重量％
トライトンＸ−１００、５０ｍＭリン酸緩衝液に調製し
たその後、酢酸にて０口５゜７に調製し、４℃で一晩放
置した後、２５０００Ｇで１０分間遠心し、３５重量％
ポリエチレングリコール水溶液を０．１４容量加え、得
られた沈澱を２０ｍ１の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）で溶解した更に、精製度を上げるためゲル（商品
名：セファロースＣＬ−２Ｂ）を用いてゲル濾過を行い
、ＰＤＨ（ピルベートデハイドロゲナゼ）酵素活性を測
定し、精製ミトコンドリアＭ２抗原を得た ［２］ミトコンドリアＭ 抗原に対するウサギポリクロ
ナール抗 の作Ｊ ■免疫用抗原の調製 ［１１で精製されたミトコンドリア間２抗原を免疫源と
して使用しム精製ミトコンドリアＭ２抗原の純度につい
ては公知の５ＤＳ−ＰＡＧＥ法により確認した ■［１］で得られたミトコンドリア間２抗原（タンパク
濃度１ ｍｇ／ｍｌ） ０． １ ｍｌと等量のフロイ
ント完全アジュバントを混合、乳化させた後、日本産ウ
サギ（メス３ｋｇ）の皮下に１週間毎に免疫を繰り返し
て行った免疫開始より６週間後に 耳朶静脈より１羽当
り５０ｍｌの血清を採取し、抗血清を得た更にこの抗血
清に等量の飽和硫安を加え、ＩｇＧを含む画分を沈澱さ
せ、抗血清量の半量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（９口８゜０）および２６ｍＭ塩化ナトリウムで溶解せ
しめた後、同緩衝液で一晩透析を行った同緩衝液で平衡
化したＤＥＡＥセルロースカラム（抗血清１０ｍ１当り
３０ｍ１の容量を使用した）に展開し、６倍カラム容量
の固液で、同カラムに未吸着画分であるＩｇＧを分取し
た。このＩｇＧ画分（よ更に減圧下透析チューブ中で、
タンパク濃度２０ｍｇ／ｍ１に濃縮しら ［３］酵素 識抗 （二次抗 ）の作制■免疫用抗原の
調製 公知の方法により、ヒト血清より精製されたヒトγ鎖を
免疫源として使用しＬ精製ヒトγ鎖の純度については、
公知の５ＤＳ−ＰＡＧＥ法により確認しら ■抗体の作製 上記■で精製されたヒトγ鎖を、上記［２］−■と同じ
方法でウサギに免疫し、ウサギ抗ヒトγ鎖抗体を作製し
、ＩｇＧ画分を調製した ■酵素標識抗体の調製 上記■で得たＩｇＧ画分を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４
，２）に透析し、タンパク濃度をそれぞれ５ｍｇ／ｍｌ
、１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した後、総タンパク
量の３重量％のペプシンを加えて、３７℃で一晩撹拌し
て反応を行っｆ−４２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
）を適量加えて反応を停止させた後、０．２Ｍ塩化ナト
リウムを含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐ口６．５）
で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４４ （ＬＫＢ社）カ
ラム（２、ＯＸ６０ｃｍ）でゲル濾過を行い、Ｆ （ａ
ｂ’） ２画分それぞれ２． ５ｍｇおよび１５ｍｇ’
ｆｆｌ得た。 スフシミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘ
キサン−１−カルボキシレート［Ｓｕｃｃｉｍｉ ｄｙ
ｌ ４−（Ｎ−ｍａ Ｉｅ ｉｍ ｉ ｄｏｍｅｔｈ
ｙ ｌ ）−ｃ ｙｃ ｌ ｏｈｅｘａ ｎ−１−ｃａ
ｒｂ。 ｘｙｌａｔｅ：Ｚｉｅｂｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
、、Ｌｔｄ、］を用いたヒンジ法（Ｊ、 １ｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ、 Ｖｏｌ、４．２０９．１９８３）に従い
、ＰＯＤ ［Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄ
ａｓｅ：シグマ社製］を、上記で得たウサギ抗ヒトγ鎖
のウサギＩｇＧ／Ｆａｂ’ に３日基を介して結合させ
て、酵素標識した次抗体を得た。
抗ミトコンドリアＭ２抗体の検出用試薬及びその検出用
試薬を用いた抗ミトコンドリアＭ２抗体の測定法に関す
る。 ［従来の技術］ ヒトおよびラットの胃壁細胞、腎尿細管細胞、甲状腺上
皮細胞の各細胞質に特異蛍光を示す抗体が、原発性胆汁
性肝硬変（以下、ＰＢＣという）患者血清に高率に見ら
れることが、ウォーカーらによって初めて報告された（
Ｌａｎｃｅｔ Ｉ 、８２７，１９６５）。後に、この
抗体はミトコンドリアに対する抗体であることが判明し
、ＰＢＣ患者以外の患者においても出現することが明か
となった。バーブら（飄疾患群別に抗ミトコンドリア抗
体を数種類の亜型に分類し、対応抗原の生化学的分析を
行ってきた（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍ１ｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｐａｔｈｏｌ、、３，３５５．１９８０）。 その内のＭ２抗体［１ＰＢＣに特異的なミトコンドリア
抗体亜型といわ札近年で］よ その抗体を特異的に検出
する方法が開発されている（Ｈｅｐａｔ。 Ｉｏｇｙ、 ２．１．１９８２）。 その検出方法は臨床現場にて次のようにして実施されて
いる。まず、試薬として、抗ミトコンドリアＭ２抗体を
高濃度で有する患者血清（非検査対象）より抗ミトコン
ドリアＭ２抗体を精製する。 この抗ミトコンドリアＭ２抗体の一部を一次抗体として
、マイクロプレート等の不溶性支持体上に所定量を担持
させる。更１：、抗ミトコンドリアＭ２抗体の一部を酵
素等で標識し所定量の二次抗体とする。次に、上記不溶
性支持体上に抗原としてラット肝臓またはウシ心筋から
得られる粗ミトコンドリア画分を反応させる。この不溶
性支持体に対して、検体としての患者血清と上記二次抗
体とを混合状態で添加する。このことにより、不溶性支
持体上の一次抗体に対して検体と二次抗体との間で競合
反応を行わせる。二次抗体はその量が既知であることか
ら、不溶性支持体上に結合した二次抗体の量をその標識
に基づいて測定すれ（ヱ測定量と実際の添加量との差か
ら二次抗体の反応の阻害度がわかる。この阻害度（よ検
体中の抗体量に対応しているので、その阻害度から患者
血清中の抗ミトコンドリアＭ２抗体量（濃度）が決定で
きることになる。 ［発明が解決しようとする課題］ しかし、この様な方法では試薬として高濃度の抗ミトコ
ンドリアＭ２抗体を有する患者血清が必要であり、臨床
現場で（よ そのような血清を直ちに入手し難い場合が
ある。従って、一部の病院等でしか実行できず、広く臨
床現場で抗ミトコンドリアＭ２抗体を容易に定量測定で
きるとはいえなかった。 本発明は上記課題を解決し、広く臨床現場で容易に抗ミ
トコンドリアＭ２抗体を定量測定できる試薬および測定
法を提供することを目的とする。 登豊り構處 ［課題を解決するための手段及び作用］第１発明の抗ミ
トコンドリアＭ２抗体の検出用試薬（よ 免疫学的に抗ミトコンドリアＭ２抗体を検出する測定法
に用いられる試薬であって、精製したミトコンドリア間
２抗原を不溶性支持体に直接結合せしめてなることを特
徴とする。 第２発明の測定法（よ 免疫学的に抗ミトコンドリアＭ２抗体を検出する測定法
であって、 第１発明の検出用試薬に対し検体を反応せしめた後、検
体に含まれる抗ミトコンドリアＭ２抗体に特異的に反応
する抗体に標識をしたものを二次抗体として反応させ、
反応した二次抗体の標識量に基づいて検体に含まれる抗
ミトコンドリアＭ２抗体量を検出することを特徴とする
。 第３発明の測定法は、 免疫学的に抗ミトコンドリアＭ２抗体を検出する測定法
であって、 第１発明の検出用試薬に対し、検体とともに既知量の抗
ミトコンドリアＭ２抗体を含む基準試薬を競合反応させ
た後、検体に含まれる抗ミトコンドリアＭ２抗体に特異
的に反応する抗体に標識をしたものを二次抗体として反
応させ、反応した二次抗体の標識量に基づいて検体に含
まれる抗ミトコンドリアＭ２抗体量を検出することを特
徴とする。 以下、本発明を更に詳細に説明する。 抗ミトコンドリアＭ２抗体の検出用試薬に用いられる精
製したミトコンドリア間２抗原（よ動物から得られる。 特に、ラット肝臓またはウシ心筋がミトコンドリア間２
抗原を多量に含むので好ましい。これらの材料に含まれ
るミトコンドリア間２抗原の抽出および精製（友−船釣
に知られている各種の方法が用いられる。例えば大量迅
速に精製するに（よ クリストファースタンレイらの方
法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、 １９１．１４７．１９８
０）により行う。この方法で精製されたミトコンドリア
間２抗原は純度が高く、測定に際して高い特異性が得ら
れる。例え（′Ｌ ウシ心筋から上記方法でミトコンド
リア間２抗原を精製すると、ミトコンドリア間２抗原の
１種であるウシ心筋ビルベートデハイドロゲナーゼ（Ｐ
ＤＨ）が得られる。尚、Ｇｅｒｓｈｒｉｎらにより、ミ
トコンドリア間２抗原（友 ピルベートデハイドロゲナ
ーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
：ＰＤＨ）およびブランチドケトアシッドデハイドロゲ
ナーゼ（ｂｒａｎｃｈｅｄ ｋｅｔｏａｃｉｄ ｈｙｄ
ｒｏｇｅｎａｓｅ： ＢＣＫＤ）であることが証明され
ている（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ １ｍｍｕｎｏｌ−、ｉｎ
ｐｒｅｓｓ、１９８８）。 精製されたミトコンドリア間２抗原が結合される不溶性
支持体として１社例え１ヱ ポリスチレン樹脂、ポリカ
ーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等のプラ
スチックや、ガラスといった水に不溶の物質が該当する
。この不溶性支持体の形態（よ例えばスティック、ビー
ズ、マイクロプレートあるいは試験管状のものが挙げら
れる。この不溶性支持体への担持は単なる物理吸着でも
よく、化学的な結合でもよい。直接結合すると（友ミト
コンドリアＭ２抗原に対する抗体を介さずに結合される
ことを意味する。 二次抗体として（よ例え１ｆＳ 標識された抗ヒトイ
ムノグロブリン抗体等の、抗ミトコンドリアＭ２抗体に
特異的に反応する抗体が用いられる。標識は酵素標敷
ア“イソトープ標識等、一般に用いられている標識が使
用できる。酵素標識の場合の酵素として（よ ペルオキ
シダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオ
キシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペ
プチダーゼ、グリセルアルデヒド−３リン酸脱水素酵素
、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−ナーゼ、Ｐ−ナー
ゼ等を挙げることができる。 上記抗ヒトイムノグロブリン抗体として（友 精製ヒト
イムノグロブリンγ鎖、α鎖あるいはμ鎖表免疫源とし
て、公知の方法によりポリクロナール抗体またはモノク
ロナール抗体として得られる抗ヒトイムノグロブリン抗
体が挙げられる。上記ヒトイムノグロブリンγ鎖、α鎖
あるいはμ鎖に特異的な抗体を用いれ（ｉ抗ミトコンド
リアＭ２抗体に、対するイムノグロブリンのクラス別測
定が可能となる。 第３発明における、抗ミトコンドリアＭ２抗体を含む基
準試薬として（友通常の方法で、予め動物にミトコンド
リア間２抗原で免疫して作られた抗ミトコンドリアＭ２
抗体を用いることが出来る。 例え（ヱ マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ等の
動物にミトコンドリア間２抗原を免疫し、ポリクロナー
ル抗体あるいはモノクロナール抗体として作製する。 上述のように構成されている第１発明の検出用試薬（友
ミトコンドリア間２抗原を不溶性支持体に直接結合せ
しめてなることから、試薬としての高濃度の抗ミトコン
ドリアＭ２抗体を有する患者血清が不要となる。また、
このことにより、第１発明の検出用試薬表用いた第２発
明および第３発明の測定法は臨床現場にても容易に抗ミ
トコンドリアＭ２抗体量を検出することができる。 ［実施例］ 以下、本発明を、その好適な実施例により更に詳細に説
明する。 まず試薬の作製について説明する。 ［１］ミトコンドリアＭ２抗原の 制 大量迅速精製（よ おおむねクリストファースタンレイ
らの方法に準じて行った。即ち、ウシ心筋２５０ｇに対
して５００ｍｌの０． ３重量％トライトンＸ−１００
、０，１ｍＭジシオスレイトールを含む５０ｍＭＭ０Ｐ
ｓ緩衝液（ｐＨ７，０）とともにＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖ
ｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで破砕し、１００００Ｇで
２０分間遠心し、上清を集ぬた。 この上清に３５重量％ポリエチレングリコール水溶液を
０．１２容量加え、撹拌後、２５０００Ｇで１０分間遠
心し、得られた沈澱を４００ｍ１の上記ＭＯＰＳ緩衝液
に懸濁させた更に、２５０００Ｇにて遠心後、その上清
を最終濃度１３ｍＭ塩化マグネシウム、１重量％トライ
トンＸ−１００、５０ｍ１ｉ！リン酸緩衝溶液に調製し
、再度３５重量％ポリエチレングリコール水溶液を０．
１２容量加え、得られた沈澱を１００ｍ１上記ＭＯＰＳ
緩衝液に懸濁させた。４０００Ｇにて１時間遠心後、そ
の上清を最終濃度１３ｍＭ塩化マグネシウム、１重量％
トライトンＸ−１００、５０ｍＭリン酸緩衝液に調製し
たその後、酢酸にて０口５゜７に調製し、４℃で一晩放
置した後、２５０００Ｇで１０分間遠心し、３５重量％
ポリエチレングリコール水溶液を０．１４容量加え、得
られた沈澱を２０ｍ１の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）で溶解した更に、精製度を上げるためゲル（商品
名：セファロースＣＬ−２Ｂ）を用いてゲル濾過を行い
、ＰＤＨ（ピルベートデハイドロゲナゼ）酵素活性を測
定し、精製ミトコンドリアＭ２抗原を得た ［２］ミトコンドリアＭ 抗原に対するウサギポリクロ
ナール抗 の作Ｊ ■免疫用抗原の調製 ［１１で精製されたミトコンドリア間２抗原を免疫源と
して使用しム精製ミトコンドリアＭ２抗原の純度につい
ては公知の５ＤＳ−ＰＡＧＥ法により確認した ■［１］で得られたミトコンドリア間２抗原（タンパク
濃度１ ｍｇ／ｍｌ） ０． １ ｍｌと等量のフロイ
ント完全アジュバントを混合、乳化させた後、日本産ウ
サギ（メス３ｋｇ）の皮下に１週間毎に免疫を繰り返し
て行った免疫開始より６週間後に 耳朶静脈より１羽当
り５０ｍｌの血清を採取し、抗血清を得た更にこの抗血
清に等量の飽和硫安を加え、ＩｇＧを含む画分を沈澱さ
せ、抗血清量の半量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（９口８゜０）および２６ｍＭ塩化ナトリウムで溶解せ
しめた後、同緩衝液で一晩透析を行った同緩衝液で平衡
化したＤＥＡＥセルロースカラム（抗血清１０ｍ１当り
３０ｍ１の容量を使用した）に展開し、６倍カラム容量
の固液で、同カラムに未吸着画分であるＩｇＧを分取し
た。このＩｇＧ画分（よ更に減圧下透析チューブ中で、
タンパク濃度２０ｍｇ／ｍ１に濃縮しら ［３］酵素 識抗 （二次抗 ）の作制■免疫用抗原の
調製 公知の方法により、ヒト血清より精製されたヒトγ鎖を
免疫源として使用しＬ精製ヒトγ鎖の純度については、
公知の５ＤＳ−ＰＡＧＥ法により確認しら ■抗体の作製 上記■で精製されたヒトγ鎖を、上記［２］−■と同じ
方法でウサギに免疫し、ウサギ抗ヒトγ鎖抗体を作製し
、ＩｇＧ画分を調製した ■酵素標識抗体の調製 上記■で得たＩｇＧ画分を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４
，２）に透析し、タンパク濃度をそれぞれ５ｍｇ／ｍｌ
、１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した後、総タンパク
量の３重量％のペプシンを加えて、３７℃で一晩撹拌し
て反応を行っｆ−４２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
）を適量加えて反応を停止させた後、０．２Ｍ塩化ナト
リウムを含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐ口６．５）
で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４４ （ＬＫＢ社）カ
ラム（２、ＯＸ６０ｃｍ）でゲル濾過を行い、Ｆ （ａ
ｂ’） ２画分それぞれ２． ５ｍｇおよび１５ｍｇ’
ｆｆｌ得た。 スフシミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘ
キサン−１−カルボキシレート［Ｓｕｃｃｉｍｉ ｄｙ
ｌ ４−（Ｎ−ｍａ Ｉｅ ｉｍ ｉ ｄｏｍｅｔｈ
ｙ ｌ ）−ｃ ｙｃ ｌ ｏｈｅｘａ ｎ−１−ｃａ
ｒｂ。 ｘｙｌａｔｅ：Ｚｉｅｂｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
、、Ｌｔｄ、］を用いたヒンジ法（Ｊ、 １ｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ、 Ｖｏｌ、４．２０９．１９８３）に従い
、ＰＯＤ ［Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄ
ａｓｅ：シグマ社製］を、上記で得たウサギ抗ヒトγ鎖
のウサギＩｇＧ／Ｆａｂ’ に３日基を介して結合させ
て、酵素標識した次抗体を得た。
【実施例］】不溶化担 への固 化による試 の住８
［１］で精製されたミトコンドリア間２抗原を生理食塩
水にて濃度が２０μｇ ７ｍ ｌのＭ２抗原溶液に調製
する。Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ （Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋ
ｅｄ Ｉｍｍｕｎ。 ５ｏｒｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ） 専用９６穴マイクロ
プレート（例：米国Ｄｙｎａｔｅｃｈ社１ｍｍｕｌｏｎ
２）の各−穴につき１００μｍずつ、上記ミトコンド
リア間２抗原溶液を分注し、室温にて１２〜１８時間静
置し、ミトコンドリアＭ２抗原分子をマイクロプレート
壁面に吸着させる。反応後、ミトコンドリア間２抗原溶
液を取り除き、 １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（９
日７．４）にて洗浄後、緩衝液を除く。 次にマイクロプレート壁面の内 ミトコンドリアＭ２抗
原分子が吸着しなかった部分をＢＳＡ （ｂｏｖｉｎｅ
ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）で被覆する。即ち、５
重量％のＢＳＡを含む １００ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐロア、４）を−穴につき３５０μｍずつ分注し
、室温にて１２〜１８時間静置する。こうしてマイクロ
プレート型試薬が完成する。 尚、このＢＳＡによる被覆（よ二次抗体等がマイクロプ
レート壁面に吸着されないようにして、測定系の定量性
が損なわれるのを防止するためである。
水にて濃度が２０μｇ ７ｍ ｌのＭ２抗原溶液に調製
する。Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ （Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋ
ｅｄ Ｉｍｍｕｎ。 ５ｏｒｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ） 専用９６穴マイクロ
プレート（例：米国Ｄｙｎａｔｅｃｈ社１ｍｍｕｌｏｎ
２）の各−穴につき１００μｍずつ、上記ミトコンド
リア間２抗原溶液を分注し、室温にて１２〜１８時間静
置し、ミトコンドリアＭ２抗原分子をマイクロプレート
壁面に吸着させる。反応後、ミトコンドリア間２抗原溶
液を取り除き、 １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（９
日７．４）にて洗浄後、緩衝液を除く。 次にマイクロプレート壁面の内 ミトコンドリアＭ２抗
原分子が吸着しなかった部分をＢＳＡ （ｂｏｖｉｎｅ
ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）で被覆する。即ち、５
重量％のＢＳＡを含む １００ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐロア、４）を−穴につき３５０μｍずつ分注し
、室温にて１２〜１８時間静置する。こうしてマイクロ
プレート型試薬が完成する。 尚、このＢＳＡによる被覆（よ二次抗体等がマイクロプ
レート壁面に吸着されないようにして、測定系の定量性
が損なわれるのを防止するためである。
【実施例２］
次に、実施例１にて作製したマイクロプレート型試薬を
用いた測定法について説明する。 （１）往生□週製 検体の調製法は以下の通りである。血清等の検体をＰＢ
Ｓ （希釈用食塩水）で１００１倍に希釈し、検体とす
る。また、検体中の抗ミド＝ンドリアＭ２抗体の含有量
が多く、本測定系の検出上限を越える場合（上上記ＰＢ
Ｓで検体を測定範囲内に入るように希釈し、その希釈検
体の定量値に希釈倍数を乗じて検体中の抗ミトコンドリ
アＭ２抗体の濃度とする。 実施例］にて作製したマイクロプレート型試薬中のブロ
ック用緩衝液（Ｂ Ｓ Ａ）を取り除いた後、１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液で３回洗浄し、同緩衝液をよく
取り除き、 （１）で調製した検体を一穴に１００μｍ
ずつ分注する。同時に抗ミトコンドリアＭ２抗体の含有
量が既知の基準検体最高濃度より５管、 （１）で使用
したＰＢＳにて倍々希釈（Ｘｌ、Ｘ２．Ｘ４．Ｘ８．Ｘ
１６）Ｌ、−穴に１００μｍずつ分注する。同時に同Ｐ
ＢＳのみを１００μｍ分注し、盲検とする。以上の反応
系を室温にて１時間静置する。反応終了後、 １０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐロア、４）で３回洗浄後、
同緩衝液舎よく取り除く。 ［３］で調製したＰＯＤで標識した抗ヒトγ鎖・ウサギ
ポリクロナール抗体を０． １重量％ＢＳＡ、０．１５
ＭＮａＣｌを添加した １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（０日８．０）にて２５０〜１０００倍に希釈し、
（２）で抗原抗体反応させたマイクロプレートに一穴に
つき１００μｍずつ分注し、室温にて１時間静置後、
１０−リン酸ナトリウム緩衝液（ｐロア、４）にて３回
洗浄後、同緩衝液をよく取り除く。 （４）装色見応 オルトフェニレンジアミン（シグマ社製）を０゜１Ｍク
エン酸リす酸ナトリウム緩衝Ｊ（ｐ）−１５゜１）にて
１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、 （３）でペルオキシダ
ーゼ標識ポリクロナール抗体で処理したマイクロプレー
トへ −穴につき１００μｍずっ分注し、室温にて］０
〜２０分間静置後、２Ｎ−硫酸を一穴につき１００μｍ
ずつ分注し、ｐ目を下げることによりペルオキシダーゼ
の酵素活性を停止させる。 こうしてマイクロプレートの各式に生じた発色の程度（
よ吸光度計（東ソー社製ＭＰＲ−Ａ４）にて波長４９２
ｎｍでの吸光度を測定することにより検出する。この吸
光度から検体中の抗ミトコンドリアＭ２抗体の濃度が判
る。吸光度から濃度を求めるには、次に示すごとく検量
線を作成して求める。 （５）検 の作成および検 の− 抗ミトコンドリアＭ２抗体の含有量既知の検体（９検体
）に対して、上記マイクロプレー１・型試薬を用いた検
出を行い、吸光度表測定した。その結果を第１表に示す
。 この表の濃度と片対数グラフの対数側に、吸光度を正規
側にプロットすると第１図に示すような検量線が完成す
る。 第１表 第２表 【実測例】 上述の試薬及び測定方法により、実際に正常人、ＰＢＣ
患者、ＰＢＣ以外の肝臓疾患患者および膠原病患者の血
清を測定した結果を第２表に示す。 第２表からも判るように抗ミトコンドリアＭ２抗体の含
有量が特異的に多いＰＢＣ患者において測定値が顕著な
高濃度を示すことが判る。 従って、本実施例の試薬を用い、本実施例の測定方法を
実施すれ（戴臨床現場でも容易に抗ミトコンドリアＭ２
抗体を測定でき、ＰＢＣ患者の発見が迅速に出来る。 【実施例３］ 実施例２の測定（１００１倍の希釈）では本測定系の検
出上限を越えてしまう検体５例を、ＰＢＳで１００１倍
に希釈すると同時１：、競合反応させるために［２］で
作成された既知量のウサギポリクロナール抗体１０μｍ
を各検体に添加する。これを検体として実施例２に準じ
て測定を行ったその結果を第３表に示す。第３表には上
記ウサギポリクロナール抗体を添加しない場合（実施例
２による測定）にて正確に測定するために必要な希釈倍
数を示しら 第３表 第３表からも判るように実施例３の方法によれば、患者
血清を大量の希釈剤を必要とせず、容易な希釈作業で迅
速に結果を得ることができる。 上述のごとく、本実施例の試薬を用い、本実施例の測定
方法を実施すれ（ｆ−、実施例２と同様の効果が得られ
るとともに、希釈作業が簡素化でき、希釈剤も節約でき
る。 以上本発明の実施例について説明したが、本発明はこう
した実施例に何等限定されるものではなく、本発明の要
旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得
ることは勿論である。 発明の効果 以上詳述したように、本発明の抗ミトコンドリアＭ２抗
体の検出用試薬及び測定法（よ試薬としての特別な患者
の血清を要せず、広く臨床現場で容易に抗ミトコンドリ
アＭ２抗体を測定できる。
用いた測定法について説明する。 （１）往生□週製 検体の調製法は以下の通りである。血清等の検体をＰＢ
Ｓ （希釈用食塩水）で１００１倍に希釈し、検体とす
る。また、検体中の抗ミド＝ンドリアＭ２抗体の含有量
が多く、本測定系の検出上限を越える場合（上上記ＰＢ
Ｓで検体を測定範囲内に入るように希釈し、その希釈検
体の定量値に希釈倍数を乗じて検体中の抗ミトコンドリ
アＭ２抗体の濃度とする。 実施例］にて作製したマイクロプレート型試薬中のブロ
ック用緩衝液（Ｂ Ｓ Ａ）を取り除いた後、１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液で３回洗浄し、同緩衝液をよく
取り除き、 （１）で調製した検体を一穴に１００μｍ
ずつ分注する。同時に抗ミトコンドリアＭ２抗体の含有
量が既知の基準検体最高濃度より５管、 （１）で使用
したＰＢＳにて倍々希釈（Ｘｌ、Ｘ２．Ｘ４．Ｘ８．Ｘ
１６）Ｌ、−穴に１００μｍずつ分注する。同時に同Ｐ
ＢＳのみを１００μｍ分注し、盲検とする。以上の反応
系を室温にて１時間静置する。反応終了後、 １０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐロア、４）で３回洗浄後、
同緩衝液舎よく取り除く。 ［３］で調製したＰＯＤで標識した抗ヒトγ鎖・ウサギ
ポリクロナール抗体を０． １重量％ＢＳＡ、０．１５
ＭＮａＣｌを添加した １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（０日８．０）にて２５０〜１０００倍に希釈し、
（２）で抗原抗体反応させたマイクロプレートに一穴に
つき１００μｍずつ分注し、室温にて１時間静置後、
１０−リン酸ナトリウム緩衝液（ｐロア、４）にて３回
洗浄後、同緩衝液をよく取り除く。 （４）装色見応 オルトフェニレンジアミン（シグマ社製）を０゜１Ｍク
エン酸リす酸ナトリウム緩衝Ｊ（ｐ）−１５゜１）にて
１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、 （３）でペルオキシダ
ーゼ標識ポリクロナール抗体で処理したマイクロプレー
トへ −穴につき１００μｍずっ分注し、室温にて］０
〜２０分間静置後、２Ｎ−硫酸を一穴につき１００μｍ
ずつ分注し、ｐ目を下げることによりペルオキシダーゼ
の酵素活性を停止させる。 こうしてマイクロプレートの各式に生じた発色の程度（
よ吸光度計（東ソー社製ＭＰＲ−Ａ４）にて波長４９２
ｎｍでの吸光度を測定することにより検出する。この吸
光度から検体中の抗ミトコンドリアＭ２抗体の濃度が判
る。吸光度から濃度を求めるには、次に示すごとく検量
線を作成して求める。 （５）検 の作成および検 の− 抗ミトコンドリアＭ２抗体の含有量既知の検体（９検体
）に対して、上記マイクロプレー１・型試薬を用いた検
出を行い、吸光度表測定した。その結果を第１表に示す
。 この表の濃度と片対数グラフの対数側に、吸光度を正規
側にプロットすると第１図に示すような検量線が完成す
る。 第１表 第２表 【実測例】 上述の試薬及び測定方法により、実際に正常人、ＰＢＣ
患者、ＰＢＣ以外の肝臓疾患患者および膠原病患者の血
清を測定した結果を第２表に示す。 第２表からも判るように抗ミトコンドリアＭ２抗体の含
有量が特異的に多いＰＢＣ患者において測定値が顕著な
高濃度を示すことが判る。 従って、本実施例の試薬を用い、本実施例の測定方法を
実施すれ（戴臨床現場でも容易に抗ミトコンドリアＭ２
抗体を測定でき、ＰＢＣ患者の発見が迅速に出来る。 【実施例３］ 実施例２の測定（１００１倍の希釈）では本測定系の検
出上限を越えてしまう検体５例を、ＰＢＳで１００１倍
に希釈すると同時１：、競合反応させるために［２］で
作成された既知量のウサギポリクロナール抗体１０μｍ
を各検体に添加する。これを検体として実施例２に準じ
て測定を行ったその結果を第３表に示す。第３表には上
記ウサギポリクロナール抗体を添加しない場合（実施例
２による測定）にて正確に測定するために必要な希釈倍
数を示しら 第３表 第３表からも判るように実施例３の方法によれば、患者
血清を大量の希釈剤を必要とせず、容易な希釈作業で迅
速に結果を得ることができる。 上述のごとく、本実施例の試薬を用い、本実施例の測定
方法を実施すれ（ｆ−、実施例２と同様の効果が得られ
るとともに、希釈作業が簡素化でき、希釈剤も節約でき
る。 以上本発明の実施例について説明したが、本発明はこう
した実施例に何等限定されるものではなく、本発明の要
旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得
ることは勿論である。 発明の効果 以上詳述したように、本発明の抗ミトコンドリアＭ２抗
体の検出用試薬及び測定法（よ試薬としての特別な患者
の血清を要せず、広く臨床現場で容易に抗ミトコンドリ
アＭ２抗体を測定できる。
第１図は吸光度から濃度を求めるための検量線のグラフ
を表す。
を表す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 免疫学的に抗ミトコンドリアＭ＿２抗体を検出する
測定法に用いられる試薬であつて、精製したミトコンド
リアＭ＿２抗原を不溶性支持体に直接結合せしめてなる
ことを特徴とする抗ミトコンドリアＭ＿２抗体の検出用
試薬。 ２ ミトコンドリアＭ＿２抗原がウシ心筋ピルベートデ
ハイドロゲナーゼであることを特徴とする請求項１記載
の抗ミトコンドリアＭ＿２抗体の検出用試薬。 ３ 免疫学的に抗ミトコンドリアＭ＿２抗体を検出する
測定法であって、請求項１記載の検出用試薬に対し検体
を反応せしめた後、検体に含まれる抗ミトコンドリアＭ
＿２抗体に特異的に反応する抗体に標識をしたものを二
次抗体として反応させ、反応した二次抗体の標識量に基
づいて検体に含まれる抗ミトコンドリアＭ＿２抗体量を
検出することを特徴とする抗ミトコンドリアＭ＿２抗体
の測定法。 ４ 免疫学的に抗ミトコンドリアＭ＿２抗体を検出する
測定法であって、請求項１記載の検出用試薬に対し、検
体とともに既知量の抗ミトコンドリアＭ＿２抗体を含む
基準試薬を競合反応させた後、検体に含まれる抗ミトコ
ンドリアＭ＿２抗体に特異的に反応する抗体に標識をし
たものを二次抗体として反応させ、反応した二次抗体の
標識量に基づいて検体に含まれる抗ミトコンドリアＭ＿
２抗体量を検出することを特徴とする抗ミトコンドリア
Ｍ＿２抗体の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9359890A JPH03291568A (ja) | 1990-04-09 | 1990-04-09 | 抗ミトコンドリアｍ↓２抗体の検出用試薬及び測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9359890A JPH03291568A (ja) | 1990-04-09 | 1990-04-09 | 抗ミトコンドリアｍ↓２抗体の検出用試薬及び測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03291568A true JPH03291568A (ja) | 1991-12-20 |
Family
ID=14086754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9359890A Pending JPH03291568A (ja) | 1990-04-09 | 1990-04-09 | 抗ミトコンドリアｍ↓２抗体の検出用試薬及び測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03291568A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011057475A1 (zh) * | 2009-11-12 | 2011-05-19 | 上海科新生物技术股份有限公司 | 胶体金层析法肝病检测试纸及其制备方法 |
| JP2013506837A (ja) * | 2009-10-05 | 2013-02-28 | アンバージェン， インコーポレイテッド | 自己抗原を使用する原発性胆汁性肝硬変（ｐｂｃ）を診断するための方法 |
-
1990
- 1990-04-09 JP JP9359890A patent/JPH03291568A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013506837A (ja) * | 2009-10-05 | 2013-02-28 | アンバージェン， インコーポレイテッド | 自己抗原を使用する原発性胆汁性肝硬変（ｐｂｃ）を診断するための方法 |
| US11885802B2 (en) | 2009-10-05 | 2024-01-30 | Ambergen, Inc. | Method for diagnosing primary biliary cirrhosis (PBC) using novel autoantigens |
| WO2011057475A1 (zh) * | 2009-11-12 | 2011-05-19 | 上海科新生物技术股份有限公司 | 胶体金层析法肝病检测试纸及其制备方法 |
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