JPH03282261A

JPH03282261A - ニワトリ抗ヒトＨｂ特異抗体およびその製造法

Info

Publication number: JPH03282261A
Application number: JP8104690A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Kaneda; 伸一金田; Kenichi Abe; 賢一阿部
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1990-03-30
Filing date: 1990-03-30
Publication date: 1991-12-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ニワトリ抗ヒトＨｂ（ヘモグロビン）特異抗
体およびその製造法に関する。

〔従来の技術〕

糞便中の潜血は、消化管の潰瘍、腫瘍等による出血と密
接に関連しており、潜血検査はこれらの疾患の有力な診
断手段となる。

糞便中の潜血検査法としては、Ｈｂのペルオキシダーゼ
様作用を利用した呈色法、抗ヒトＨｂ抗体（ポリクロー
ナルまたはモノクローナル抗体）を用いたラテックス凝
集法、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ法等が考案されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、呈色反応を用いた便潜血検査においては
、摂食された肉類に由来する他動物種のＨｂが判定を誤
まらせる原因となるため、検査に際しては動物食品、生
野菜等の食物や薬物の厳しい摂取制限が必要とされる。

また、抗ヒトＨｂ抗体を用いて、抗原とじてＨｂを特異
的に検出する方法においても、ポリクローナル抗体を使
用した場合には、肉食によって糞便中に混入した他種動
物のＨｂとの交差反応が結果に影響を与えることとなり
、食事制限の完全な解決にはならなかった。

そこで、新たに考案されたのが、ヒト）ｆｂとのみ反応
し、他の動物種のＨｂとは反応しない、ヒ）Ｈｂに固有
のエピトープに対するモノクローナル抗体を用いる方法
である。この方法によれば、食事制限の必要なしに、ヒ
トＨｂの特異的な検出が可能であると考えられるが、モ
ノクローナル抗体の調製のため、コスト高になることは
避けられない。

本発明は、このような従来の便潜血測定法の問題点に鑑
み、他の動物種のＨｂとは反応性を有しない、抗ヒトＨ
ｂ特異抗体およびそれを極めて低コストで調製する方法
を提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕一般に、Ｈｂは、動物種間で免疫学的相同性が高く、選
択的抗ヒトＨｂ抗体は哺乳動物を被免疫動物とした場合
には作りにくいと言われているが、系統発生学的に遠い
位置にあるニワトリを用いることにより、比較的高い抗
体価を持った抗体を得やすいという利点がある。しかし
、そのままではこのＨｂ抗体は、他の動物種のＨｂと免
疫学的反応性を有する。そこで反応性を消失させた、す
なわち、糞便検査において誤判定の原因となり得る動物
（例えばウシ、ブタ、魚類等、この場合ニワトリは被免
疫動物であることから除外できる）のＨｂを吸収用抗原
とし、ニワトリＨｂ抗体に対して吸収操作を行う。この
際、Ｈｂを固相化したものを用いると、抗原と吸収され
なかった抗体との分離が容易である。この操作により抗
ヒトＨｂ抗体の中で、ヒトと動物に共通のエピトープに
対する抗体は除去され、ヒトＨｂに固有のエピトープに
対する抗体のみが残存し、ヒトＨｂとのみ特異的に反応
する抗体が得られる。

また、卵黄から抗体を精製する場合には、免疫宿主に対
して何ら損傷を加えることなく、同一個体から継続的に
多量の抗体を得ることができ、抗体製造の大幅なコスト
ダウンか可能となる。さらに、卵黄からの抗体精製にお
いては、脂質含有量の高さか精製の妨げとなり、精製手
順の繁雑さの原因となっていたが、有機溶媒沈澱法及び
デキストラン硫酸等の硫酸化多糖類によるリポ蛋白沈澱
除去を行うことにより、抗体の回収か効率良く行えるよ
うになる。

本発明は上記知見に基づいて完成されたものであり、下
記の構成を有する。

（１）ヒト以外の動物種由来のヘモグロビン（Ｈｂ）に
対する免疫学的交差性を有しないニワトリ抗ヒトＨｂ特
異抗体。

（２）ニワトリ抗ヒトＨｂ抗体をヒト以外の動物種由来
のＨｂによる抗原吸収法によって製造された１項に記載
のニワトリ抗ヒトＨｂ特異抗体。

（３）　　ヒトＨｂによって免疫されたニワトリの卵黄
または血清より抽出される１項または２項に記載のニワ
トリ抗ヒ）Ｈｂ特異抗体。

（４）　　ヒトＨｂによって免疫されたニワトリの卵黄
から有機溶媒による沈澱法または硫酸化多糖類による脂
質除去法によってニワトリ抗ヒトＨｂ抗体を得、次いで
これをヒト以外の動物種由来のＨｂによる抗原吸収処理
することを特徴とするニワトリ抗ヒトＨｂ特異抗体の製
？ｉ法。

本発明のニワトリ抗ヒ）Ｈｂ特異抗体は、常法に従って
ヒトＨｂを筋注または静注によってニワトリに投与して
免疫し、抗ヒトＨｂ抗体を免疫ニワトリから採取し、こ
れを適当な担体に固定したヒト以外の動物のＨｂと反応
させることによって得られる。免疫ニワトリがら抗ヒト
Ｈｂを採取するに際しては、免疫ニワトリの卵黄から採
取すると、免疫ニワトリに損傷を５えないで繰り返し採
取することが可能であり、製造コストの而で有利である
。卵黄からの抗体の採取は、有機溶媒沈澱法またはデキ
ストラン硫酸法によって行なわれる。

血清から抗体を採取するには、常法に従って血〆ｈに硫
酸アンモニウム等を加えて塩析し、次いでイオン交換ク
ロマトで分離する。あるいは、血清から抗体を分離する
ことなく、血清をそのまま抗体溶液として使用すること
もできる。

かくして得られるニワトリ抗ヒトＨｂ抗体を、食物とし
て摂取する可能性のある動物、例えばウシ、ブタ、魚類
等のＨｂと反応させ、その抗原を該抗体に吸収させる。

その際、Ｈｂを固相化したものを用いると、抗原と吸収
されなかった抗体との分離が容易である。この処理によ
り、抗ヒトＨｂ抗体の中で、ヒトと動物に共通のエピト
ープに対する抗体は除去され、ヒトＨｂに固有のニブト
ープに対する抗体のみが残存し、ヒトＨｂとのみ特異的
に反応する抗体が得られる。

〔実　施　例〕

次に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。

［実施例１］ニワトリの免疫化ホワイトレグホーン産卵鶏に対してＧｏｏｄｍｏｎら（
Ｂｆｏｏｄ（１９５３）　８．４２２−４３３）の方法
に準じて、ヒトＨｂの免疫を行った。すなわち、０．２
，４．７日月にヒトＨｂ溶液４００ｍｇ１０．８ｍｌを
Ｏ，１ｍｌずつ８ケ所に筋注し、初回免疫後１４日日月
２６０目に静注による追加免疫を行い、３９０目には再
度筋注による追加免疫を行った。以後免疫個体のうち、
抗体価の上昇が良好であった２個体を選択し、追加免疫
と、血清および卵黄中の抗体価追跡を行った。

なお、１個体については筋注により、他方の個体につい
ては静注による追加免疫を継続し、１５０日目日目個体
に静注による追加免疫を行って、免疫を終了した。

抗体価の測定は、ＰＨＡ　（受身赤血球凝集）反応によ
り行った。すなわち、ニワトリ赤血球をＰＢＳ　（リン
酸緩衝生理食塩水）にて遠心洗浄し、ヘマトクリット値
が５％となるように、０．５％グルタルアルデヒド−Ｐ
ＢＳ溶液に浮遊させ、水浴上で１時間保持して赤血球を
固定した後、再度ＰＢＳ洗浄を行い、グルタルアルデヒ
ド固定赤血球（ＧＡ−ＲＢＣ）を調製した。

５％Ｃ；Ａ−ＲＢＣを等量の０．００５％タンニン酸と
混合し、３７℃で１０分間処理する。再びＰＢＳ洗浄を
行い、５　ｍｇ　／　ｍｌのヒトＨｂ溶液（抗原液）と
等全混合し、３７℃で１時間反応させる。１９６非動化
正常ニワトリ血清−ＰＢＳ　（１％ＮＣ３ＰＢＳ）で遠
心洗浄を行い、１％ＮＣ３−ＰＢＳで１．５％感作赤血
球浮遊液とした。９６穴−Ｕ型マイクロプレートの各式
に１％ＮＣ３−ＰＢＳを２５ｍを分注し、試料の倍数希
釈系列を作製した。

１．５％感作赤血球浮遊液２５ｍを各式に加え、十分に
振盪した後、室温で一晩静置し、判定した。

判定は、感作赤血球か管底に広がった陽性、管底の中央
部に集まったものを陰性とし、陽性と判定された最大希
釈倍率を、その試料の抗体価とした。

ＤＭＡ反応により、ヒトＨｂて免疫されたニワトリの血
清抗体価は、最大で２６〜２９程度であった（第１図）
。一方、卵黄中の抗体価は、２５〜２６と、血清抗体価
よりは低値ではあったが、被免疫固体の卵黄中に特異抗
体が存在することが確認された（第２図参照）。さらに
、卵黄中の抗体価を追従した２個体においては、最終免
疫後６０日まで２　の抗体価を維持し、うち１個体は１
４０日目日目いてもなお、２５の抗体価を維持しており
、この長期間にわたって、多量の採血という大きな損傷
を加えることなく、産卵によって、安定して抗体の供給
か為されることが示された（第２図）。

［実施例２］ニワトリ抗ヒトＨｂ抗体の特異性実施例１で得られた抗ヒ）Ｈｂニワトリ血清と、卵黄抽
出抗体について、その特異性を検討した。

卵黄からの抗体の抽出は、有機溶媒沈澱法またはデキス
トラン硫酸法により行った。有機溶媒沈澱法の手順は次
の通りである。卵黄１個当り１００ｍ１の一２０℃に冷
却した２−プロパツールを、卵黄に徐々に添加し、混和
後ブフナーロート上で吸引ン濾過する。沈澱を２−プロ
パツール（−２０’Ｃ）で３〜４回洗浄後、さらにアセ
トン（−２０’Ｃ）で３〜４回洗浄し、乾燥すると粉末
状の抽出物が得られる。この粉末をＰＢＳに溶解し、Ｐ
ＥＧ　（ポリエチレングリコール６０００）沈澱（終濃
度１２％）操作を行い、沈澱物をＰＢＳに溶解して、抗
体抽出物とする。一方、デキストラン硫酸沈澱法は、次
のような手順で行う。卵黄にＴＢＳ（トリス緩衝化生理
食塩水１０ａ＋Ｍ　ｐＨ７，５）を加え、卵黄１個当り
　１００ｍ１となるようメスアップする。デキストラン
硫酸と塩化マンガンを各々終濃度で０．５％。

１８０ｍＭなるよう添加し、混合後４℃で２時間静置す
る。遠心（２０，０００Ｘ　ｇ、　　１０分、１０℃）
し、得られた上清についてＰＥＧ沈澱（終濃度１２％）
操作を行い、沈澱をＴＢＳにて溶解して抗体抽出物とす
る。

抗体の特異性検討は、ＰＨＡ反応とＤｏｔＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａにより行った。ＰＨＡ反応は実施例１で述べた手順に
よって行った。Ｄｏｔ−ＥＬＩＳＡは、マイクロフィル
トレージョン装置（ＢＩＯ−ＤＯＴＴＭ　Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ社）を用いて、ニトロセルロースメンブレン上にブロ
ッティングしたＨｂを、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ　ＡＢＣ
ＫＩＴ（ＶＥＣＴＯＲＬａｂ、　Ｉｎｃ、）により免疫
染色した。Ｈｂは０．１ａ＋ｇ／ｍｌ濃度の溶液を、１
サンプルスリット当り　２００ハ使用した。また、１次
抗体は４００倍希釈で、２次抗体は３００倍希釈て用い
た。発色した各サンプルスリットを５８ｏｎ−で比色し
、得られた各ピークの面積計算から、抗ヒトＨｂ抗体の
特異性検討を行った。対照となる抗体としては、市販の
アフィニティー精製抗ヒトＨｂヤギ抗体（ＫＰＬ社：　
Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ＰｅｒｒｙＬａｂ。

Ｉｎｃ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いた。

ＰＩ（Ａ反応、Ｄｏｔ−ＥＬＩＳＡによる他の動物種の
Ｈｂとの交差反応性検討結果を、各々表１゜表２に示し
た。両方法での結果はほぼ相関しており、今回調査した
動物種の中では、イヌで非常に高い交差反応が認められ
た。

［実施例３］抗原吸収法による特異抗体の調製とその交差反応性の検
討実施例２で交差反応性の検討を行った動物種のうち、最
も交差反応の強かったイヌと、食物として摂取されるウ
シについて、各々のＨｂを吸収用抗原として吸収操作を
行い、吸収前後における抗ヒトＨｂニワトリ抗血清と、
ヒト、イヌ、ウシＨｂとの反応性を検討した。

すなわち、抗ヒトＨｂニワトリ血清と、１０ｍｇ／ｍｌ
の濃度に調製したヒト、イヌ、ウシのＨｂ溶液を各々１
対１て混合し、３７℃で１時間静置した。

遠心（９，０００Ｘｇ、　２０分、４℃）によって得た
上清を交差反応性の検討に用いた。

交差反応性の検討は、ＰＨＡ反応、ＥＬ　Ｉ　ＳＡによ
って行った。ＰＨＡ反応は実施例１に記載した方法によ
り行ったが、交差反応の検索のため、ヒト、イヌ、ウシ
のＨｂを感作した３種類の感作赤血球を用いて行った。

ＥＬＩＳＡは大島ら〔日法医誌（１９８４）　３８（４
）、　４０３〜４０９〕の方法に準じて行った。すなわ
ち、平底９６穴（マイクロプレートの各人に１％ＢＳＡ
−ＰＢＳを２００ポすつ分注し、３７℃で２日間インキ
ュベーションした。

ＰＢＳで洗浄後５％グルタルアルデヒド０．１ｔａＭＮ
　ａ　ＨＣＯｓ溶液を２０ＯＩずつ分注し、４℃で１晩
固定した。ＰＢＳで洗浄後、各人に０．１９６Ｈｂ（ヒ
ト、イヌ、ウシ）ＰＢＳを２０ＯＩずつ分注し、４℃で
１晩静置しＨｂを吸着させ、ＰＢＳ洗浄後抗体の反応を
行わせた。まず吸収操作を行った抗ヒトＨｂニワトリ血
清を、Ｄ、０５％Ｔ　ｖｅｅ口２０ＰＢＳ　（ＴＰＢＳ
）で倍数希釈し、ヒト、イヌ、ウシのＨｂをコートした
各プレートに２０ＯＪずつ分注した。室温で１時間イン
キュベーションした後ＴＰＢＳで洗浄し、ＴＰＢＳで５
００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ニワトリＩｇ
Ｇウサギ抗体を２００ハずっ分注し、室温で１時間反応
させた。ＴＰＢＳでプレートを洗浄後、基質溶液（０−
）二二レンジアミン０．２４ａ＋ｇ／ｍｌ、　　Ｈ２Ｏ
２３，３％終濃度）を２００Δずつ分注し、室温にて酵
素反応を行わせ、６Ｎ硫酸５０Δずつを分注して反応を
停止後、４９５ｎａ＋て比色定量を行った。

ＰＨＡとＥＬＳＡの結果を表３２表４に示した。

いずれの方法においても、ヒトＨｂて吸収操作を行うと
、ヒト、イヌ、ウシのいずれのＨｂとも反応しなくなる
が、イヌ、ウシＨｂによる吸収操作では各々イヌ、ウシ
Ｈｂに対する反応性は消失するものの、ヒトＨｂとの反
応性は残存しており、イヌ、ウシＨｂとは交差反応を示
さない、抗ヒトＨｂｌｆＩｌ？ｉが調製できたことが示
された。

表１ヤギ抗体はＡｆ’ｆ’１ｎｉｔｙ　Ｐｕｒｉｆ’ｉｅｄ
抗ヒトＨｂＩｇＧ分画。

ＰＨＡ反応では同力価で交差判定を行わせるため、ヒト
Ｈｂに対するＰＨＡ価が２５になるようにニワトリ全血
清を希釈して用いた。

表（％）表表抗体値は、未吸収の抗ヒトＨｂ抗体を反応させた際に得
られた吸光度を１００とした、吸光度の相対値で表現し
た。

表１は、ＰＨＡ反応により、抗ヒトＨｂニワトリ血清と
他の動物種のＨｂとの反応性を、市販の抗ヒトＨｂヤギ
抗体を対照として調べたものである。

表２は、Ｄｏｔ−ＥＬＩＳＡ法により、抗ヒトＨｂニワ
トリ血清及び卵黄抽出抗体と他の動物種のＨｂとの反応
性を、抗ヒトＨｂヤギ抗体を対照として調べたものであ
る。

表３は、抗ヒトＨｂニワトリ血清及びヒト、ウシ、イヌ
のＨｂて吸収した抗ヒトＨｂニワトリ血清の、ヒトＨｂ
、　ウシＨｂ、イヌＨｂに対する反応性をＰＨＡ反応に
より調べた結果である。

表４は、抗ヒトＨｂニワトリ血清及びヒト、ウシ、イヌ
のＨｂで吸収した抗ヒトＨｂニワトリ血清のヒトＨｂ、
　ウシＨｂ、イヌＨｂに対する反応性をＥＬＩＳＡによ
り検討した結果を示したものである。未吸収の抗ヒトＨ
ｂニワトリ血清を反応させた際の吸光度を１００とした
、吸光度の相対値で抗体価を表現した。

〔効　　果〕

ヒトＨｂを免疫したニワトリの卵黄もしくは血清より得
られた抗ヒトＨｂ抗体に対して反応性を除去したい動物
種のＨｂによる吸収操作か為されると、その動物種のＨ
ｂとは交差反応を持たない特異的な抗ヒトＨｂ抗体か得
られる。

さらに、抗体を卵黄から抽出することにより、被免疫個
体に何らの損傷も加えることなく長期に渡って、継続的
かつ安定して抗体を得ることができる。

従って本発明によれば、ヒト以外の動物種のＨｂとは交
差反応性を有しない抗ヒトＨｂ抗体を安定して安価に供
給することができ、その結果、食事制限を必要としない
便潜血測定試薬を定コストで製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は免疫化スケジュールとそれに伴う血清抗ヒトＨ
ｂ抗体ｉ　（ＰＨＡ価）の変動を示したものである。第１図において、←は筋注、←は静注による抗原の投与
を示す。１００日目日月の抗体価は被免疫個体の平均値
を示し、１２０日目以降は追加免疫を行なった２個体の
抗体価をそれぞれ示す。第２図は最終免疫後の血清および卵黄中の抗ヒトＨｂ抗
体価の経時的変動を追跡した結果を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒト以外の動物種由来のヘモグロビン（Ｈｂ）に
対する免疫学的交差性を有しないニワトリ抗ヒトＨｂ特
異抗体。
（２）ニワトリ抗ヒトＨｂ抗体をヒト以外の動物種由来
のＨｂによる抗原吸収法によって製造された請求項１に
記載のニワトリ抗ヒトＨｂ特異抗体。
（３）ヒトＨｂによって免疫されたニワトリの卵黄また
は血清より抽出される請求項１または２に記載のニワト
リ抗ヒトＨｂ特異抗体。
（４）ヒトＨｂによって免疫されたニワトリの卵黄から
有機溶媒による沈澱法または硫酸化多糖類による脂質除
去法によってニワトリ抗ヒトＨｂ抗体を得、次いでこれ
をヒト以外の動物種由来のＨｂによる抗原吸収処理する
ことを特徴とするニワトリ抗ヒトＨｂ特異抗体の製造法
。