JPH0327300A - 試料ｄｎａ断片化の評価方法 - Google Patents
試料ｄｎａ断片化の評価方法Info
- Publication number
- JPH0327300A JPH0327300A JP1271922A JP27192289A JPH0327300A JP H0327300 A JPH0327300 A JP H0327300A JP 1271922 A JP1271922 A JP 1271922A JP 27192289 A JP27192289 A JP 27192289A JP H0327300 A JPH0327300 A JP H0327300A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- dna
- sample dna
- minisatellite
- fragmentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 77
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 56
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 25
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 108091092919 Minisatellite Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 claims 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 abstract 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 abstract 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 abstract 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001479434 Agfa Species 0.000 description 1
- 241000931705 Cicada Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 241001495012 Tritirachium <Pucciniomycotina> Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009937 brining Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KEVMYFLMMDUPJE-UHFFFAOYSA-N diisoamyl Natural products CC(C)CCCCC(C)C KEVMYFLMMDUPJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 diisoamyl alcohol Chemical compound 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002594 fluoroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 101150015886 nuc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- IDOWTHOLJBTAFI-UHFFFAOYSA-N phenmedipham Chemical compound COC(=O)NC1=CC=CC(OC(=O)NC=2C=C(C)C=CC=2)=C1 IDOWTHOLJBTAFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 229920006298 saran Polymers 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業，」二の利用分野
本発明は、試料ＤＮＡ断片化両評価方法ならびにこの方
法に使用するためのポリヌクレオチドおよびポリヌクレ
オチド試料に関する。殊に、本発明による方法１ｉ、遺
伝特性決定方法における消化対照として有用である。
法に使用するためのポリヌクレオチドおよびポリヌクレ
オチド試料に関する。殊に、本発明による方法１ｉ、遺
伝特性決定方法における消化対照として有用である。
分析方法は、ＤＮＡ断片の大きさおよび／または組成を
研究するために開発された。特殊な方法の場合には、Ｄ
ＮＡ断片は、ハイブリッド化のために単鎖化されて１つ
またはそれ以上の遺伝坐位に対して特異的な試料にされ
る。試料は、有利に同定の目的のためにレイベル化され
る。こうして得られた試料断片ハイブリッドは、ゲル電
気泳動法のような公知方法を使用ずることにＪ：り、例
えば大きさに応じて検出することができ、かつ特性決定
することができる。オートラジオグラ７イーは、放射線
標識された試判断片ハイブリッドを同定するための有利
な方法である。
研究するために開発された。特殊な方法の場合には、Ｄ
ＮＡ断片は、ハイブリッド化のために単鎖化されて１つ
またはそれ以上の遺伝坐位に対して特異的な試料にされ
る。試料は、有利に同定の目的のためにレイベル化され
る。こうして得られた試料断片ハイブリッドは、ゲル電
気泳動法のような公知方法を使用ずることにＪ：り、例
えば大きさに応じて検出することができ、かつ特性決定
することができる。オートラジオグラ７イーは、放射線
標識された試判断片ハイブリッドを同定するための有利
な方法である。
試料ＤＮＡ断片化は、音波処理および化学的方法を含め
て種々の方法によって達戊される。
て種々の方法によって達戊される。
しかし、通常試料ＤＮＡは、例えば制限酵素またはエン
ドヌクレアーゼによって酵素的に切断される。制限エン
ドヌクレアーゼは、Ｄ Ｎ Ａ 中の標的ヌクレオチド
配列の確認を可能ならしめ、かつ標的配列との関連で断
定可能な方法でＤＮＡの切断を可能ならしめる。従って
、このようなエンドヌクレアーゼは、有用な分析用道具
として役立つことができる。ＤＮＡの酵素的断片化は、
屡々消化と称される。
ドヌクレアーゼによって酵素的に切断される。制限エン
ドヌクレアーゼは、Ｄ Ｎ Ａ 中の標的ヌクレオチド
配列の確認を可能ならしめ、かつ標的配列との関連で断
定可能な方法でＤＮＡの切断を可能ならしめる。従って
、このようなエンドヌクレアーゼは、有用な分析用道具
として役立つことができる。ＤＮＡの酵素的断片化は、
屡々消化と称される。
ヒトのゲノムは、既に情報的である遺伝坐位を同定する
ために研究された。多形態性坐位または超可変性坐位は
、特に重要であることが判明した。このような坐位の全
体数は、知られていないが、広大であるように思われる
。実際にヒトのゲノムは、かかる坐位を少なくとも１５
００個含有するかもしれない。一定の前記坐位は、遺伝
特性決定方法に有用であることが判明した。英国特許第
２１６６４４５号明細書（Ｌｉｓｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ）には、ｌ個よりも多い情報的遺伝坐位に関連してゲ
ノムＤＮＡを特性決定することができる試料が開示され
ている。また、１個の情報的坐位に関連してゲノムＤＮ
Ａを特性決定することができる試Ｎが開発され、これは
欧州特許出願第２３８３２９号明細書に開示されている
。
ために研究された。多形態性坐位または超可変性坐位は
、特に重要であることが判明した。このような坐位の全
体数は、知られていないが、広大であるように思われる
。実際にヒトのゲノムは、かかる坐位を少なくとも１５
００個含有するかもしれない。一定の前記坐位は、遺伝
特性決定方法に有用であることが判明した。英国特許第
２１６６４４５号明細書（Ｌｉｓｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ）には、ｌ個よりも多い情報的遺伝坐位に関連してゲ
ノムＤＮＡを特性決定することができる試料が開示され
ている。また、１個の情報的坐位に関連してゲノムＤＮ
Ａを特性決定することができる試Ｎが開発され、これは
欧州特許出願第２３８３２９号明細書に開示されている
。
ＤＮＡ断片の製造を含めて前記分析方法と屡々関連せる
問題は、試料ＤＮＡ断片化の程度を全ての関連バラメー
ターの完全な認識なしには容易に評価することができな
いかまたは見積もることができないことにある。このバ
ラメーターは、断片化方法の能力、例えば酵素の濃度、
ＤＮＡ試料の濃度、緩衝液の濃度および温度を包含する
。従って、完全または十分なＤＮＡ断片化が評価され得
る前に長期間の時間を経過ざせることが屓々必要とされ
る。このような遅延は、殊に多数の分析試験を実施する
場合には、ある程度の非能率さを生じる。更に、全ての
情報的ＤＮＡ断片、例えば１つまたはそれ以上の制限酵
素を用いる試料ＤＮＡの完全な消化から生じる全てのＤ
ＮＡ断片は、特性決定よりも先に生産され、したがって
断片から得ることができる最大の情報、例えば断片の大
きさＢよび／または組戊が得ることができる。
問題は、試料ＤＮＡ断片化の程度を全ての関連バラメー
ターの完全な認識なしには容易に評価することができな
いかまたは見積もることができないことにある。このバ
ラメーターは、断片化方法の能力、例えば酵素の濃度、
ＤＮＡ試料の濃度、緩衝液の濃度および温度を包含する
。従って、完全または十分なＤＮＡ断片化が評価され得
る前に長期間の時間を経過ざせることが屓々必要とされ
る。このような遅延は、殊に多数の分析試験を実施する
場合には、ある程度の非能率さを生じる。更に、全ての
情報的ＤＮＡ断片、例えば１つまたはそれ以上の制限酵
素を用いる試料ＤＮＡの完全な消化から生じる全てのＤ
ＮＡ断片は、特性決定よりも先に生産され、したがって
断片から得ることができる最大の情報、例えば断片の大
きさＢよび／または組戊が得ることができる。
発明を達戊するための手段
本発明は、例えば遺伝的特性決定方法に有用なゲノムＤ
ＮＡ中の一定の情報的坐位が断片化に抗するＤＮＡ領域
とも関連するという発見に基づいている。従って、かか
る坐位を有する断片の同定は、分析法においてＤＮＡ断
片化対照を得るために使用することができる。
ＮＡ中の一定の情報的坐位が断片化に抗するＤＮＡ領域
とも関連するという発見に基づいている。従って、かか
る坐位を有する断片の同定は、分析法においてＤＮＡ断
片化対照を得るために使用することができる。
従って、本発明の１つの特徴によれば、試料ＤＮ八切断
の間に形成された対照断片の存在を、特性決定すべきＤ
ＮＡ断片の１つまたはそれ以上の形成後に検出すること
を特徴とする、試料ＤＮＡ断片化の評価方法が得られる
。
の間に形成された対照断片の存在を、特性決定すべきＤ
ＮＡ断片の１つまたはそれ以上の形成後に検出すること
を特徴とする、試料ＤＮＡ断片化の評価方法が得られる
。
試料ＤＮＡ断片化は、任意の有利な切断方法、例えば奇
波処理または化学的方法にＪ：って行なわれるが、有利
には、１つまたはそれ以上の酵素を使用しで行なわれる
。従って、゛試ＮＤＮＡ断片化゛′ど″試料ＤＮＡ切断
”の表現は、同義的に使用される。本発明で使用するた
めの有利な酵素の例は、制限エンドヌクレアーゼのよう
な制限酵素を包含する。本発明による方法は、制限酵素
ヒンフ（Ｈｉｎｆ） Ｉを使用１る場合に消化対照と
して特に有用であることが見い出された。
波処理または化学的方法にＪ：って行なわれるが、有利
には、１つまたはそれ以上の酵素を使用しで行なわれる
。従って、゛試ＮＤＮＡ断片化゛′ど″試料ＤＮＡ切断
”の表現は、同義的に使用される。本発明で使用するた
めの有利な酵素の例は、制限エンドヌクレアーゼのよう
な制限酵素を包含する。本発明による方法は、制限酵素
ヒンフ（Ｈｉｎｆ） Ｉを使用１る場合に消化対照と
して特に有用であることが見い出された。
完全なＤＮＡ断片化は、本発明の実施には本質的なこと
ではない。ただ、ＤＮＡ対照断片が特性決定すべき断片
の後に形成されることは、必要なこｋである。従って、
対照断片は、例えば断片化５０％まで、７０％まで、８
０％までまたは９０％までの任意の望まし，い程度の断
片化を検出するために選択することができる。しかし、
有利には、対照断片は、対照断片が完全な試料ＤＮＡ断
片化を示すような程度に選択される。試料ＤＮＡは、有
利に例えばヒトＤＮＡのようなゲノムＤＮＡである。
ではない。ただ、ＤＮＡ対照断片が特性決定すべき断片
の後に形成されることは、必要なこｋである。従って、
対照断片は、例えば断片化５０％まで、７０％まで、８
０％までまたは９０％までの任意の望まし，い程度の断
片化を検出するために選択することができる。しかし、
有利には、対照断片は、対照断片が完全な試料ＤＮＡ断
片化を示すような程度に選択される。試料ＤＮＡは、有
利に例えばヒトＤＮＡのようなゲノムＤＮＡである。
対照断片は、任意の有利な大きさまたは組成を有するこ
とができ、この場合この対照断片は断片化耐性坐位内に
存在する。この゛断片化耐性坐位”の表現は、特性決定
すべきＤＮＡ断片を含有するｌつまたはそれ以上の坐位
よりも断片化に対して耐性の坐位に帰因することが認め
られる。対照断片は、例えば制限酵素を使用しかつＤＮ
Ａ断片の形成を監視することにより、ＤＮＡを切断する
ことによって同定するころができる。断片化耐性受位を
有する断片は、断片化方法の場合には後に消失し、それ
によって有利に対照断片は形成ざれる。対照断片の出現
はＤＮＡ断片を検出するための任意の有利な方法によっ
て検出することができる。１度対照断片を同定した場合
には、ＤＮＡ断片化方法を絶えず監視するここは、不必
要である。有利に十分な程度の断片化は、実験的親察に
基づいて評価され、さらに対照断片は、評価の有効性を
確認するために使用される。
とができ、この場合この対照断片は断片化耐性坐位内に
存在する。この゛断片化耐性坐位”の表現は、特性決定
すべきＤＮＡ断片を含有するｌつまたはそれ以上の坐位
よりも断片化に対して耐性の坐位に帰因することが認め
られる。対照断片は、例えば制限酵素を使用しかつＤＮ
Ａ断片の形成を監視することにより、ＤＮＡを切断する
ことによって同定するころができる。断片化耐性受位を
有する断片は、断片化方法の場合には後に消失し、それ
によって有利に対照断片は形成ざれる。対照断片の出現
はＤＮＡ断片を検出するための任意の有利な方法によっ
て検出することができる。１度対照断片を同定した場合
には、ＤＮＡ断片化方法を絶えず監視するここは、不必
要である。有利に十分な程度の断片化は、実験的親察に
基づいて評価され、さらに対照断片は、評価の有効性を
確認するために使用される。
本発明による方法は、試料ＤＮＡ断片化の程度により評
価が必要とさ・れ、例えば試料ＤＮＡ断片が大きさおよ
び／または組成により特徴決定される場合の任意の状況
において有用であると確信されている。この方法は、遺
伝的特性決定方法に特に有利である。
価が必要とさ・れ、例えば試料ＤＮＡ断片が大きさおよ
び／または組成により特徴決定される場合の任意の状況
において有用であると確信されている。この方法は、遺
伝的特性決定方法に特に有利である。
ゲノムＤＮＡのミニサテライト領域または超可変性坐位
が遺伝的特性決定方法に使用され得ることは、既に証明
された。英国特許第２１６６４４５号明細書（Ｌｉｓｔ
ｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｒｃｖｅｎｔｉｖ
ｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）には、１個よりも多いミニザテ
ライ１・領域または超可変性坐位に関連してゲノムＤＮ
Ａを特性決定するための方法および試料が開示されてい
る。更に、欧州特許出願第２３８３２９号明細書には、
個々のミニザテライト領域または超可変性坐位に関連し
てゲノムＤＮＡを特性決定するための方法８よび試料が
開示されている。
が遺伝的特性決定方法に使用され得ることは、既に証明
された。英国特許第２１６６４４５号明細書（Ｌｉｓｔ
ｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｒｃｖｅｎｔｉｖ
ｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）には、１個よりも多いミニザテ
ライ１・領域または超可変性坐位に関連してゲノムＤＮ
Ａを特性決定するための方法および試料が開示されてい
る。更に、欧州特許出願第２３８３２９号明細書には、
個々のミニザテライト領域または超可変性坐位に関連し
てゲノムＤＮＡを特性決定するための方法８よび試料が
開示されている。
本発明による方法は、ミニづテライト領域または超可変
性坐位に対して試判を使用することにより試料ゲノムＤ
ＮＡが特性決定さ１１る場合には、特に有用である。父
系および法廷」二での場合に結果を解釈する際に断片化
対照により十分に高い程度の確実さが得られる。
性坐位に対して試判を使用することにより試料ゲノムＤ
ＮＡが特性決定さ１１る場合には、特に有用である。父
系および法廷」二での場合に結果を解釈する際に断片化
対照により十分に高い程度の確実さが得られる。
有利なミニ９テライ１・試料は、英国特許第２１６６４
４５号明細書（１．ｉｓｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）中で特
許の保護が請求された多坐試料３３．６および３３．１
５ならびに欧州特許出願第２３８３２９号明細書中で特
許の保護が請求された単坐試料ｐＡ ｇ３、Ｍ Ｓ１
，ＭＳ８、ＭＳ ３ １、ＭＳ ３ ２およびＭＳ４３
を包含する。
４５号明細書（１．ｉｓｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）中で特
許の保護が請求された多坐試料３３．６および３３．１
５ならびに欧州特許出願第２３８３２９号明細書中で特
許の保護が請求された単坐試料ｐＡ ｇ３、Ｍ Ｓ１
，ＭＳ８、ＭＳ ３ １、ＭＳ ３ ２およびＭＳ４３
を包含する。
対照断片の検出は、有利に対照断片に対してハイブリッ
ド化を可能ならしめるポリヌクレオチドまたはボリヌク
１７オチド試料を使用して行なわれる。対照断片がミニ
サテライト領域または超可変性坐位を有する場合には、
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド試料は、脊利
に該領域または坐位に対してハイブリッド化する対照断
片は、有利に試料Ｉ） Ｎ Ａ断片をミニザテライ｝・
試料で検出１ることによって同定され、１つのミニサテ
ライト領域または超可変坐位を検出する。′ミニザテラ
イ１・領域”と“超可変性坐位”の用語は、同義的に使
用される。
ド化を可能ならしめるポリヌクレオチドまたはボリヌク
１７オチド試料を使用して行なわれる。対照断片がミニ
サテライト領域または超可変性坐位を有する場合には、
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド試料は、脊利
に該領域または坐位に対してハイブリッド化する対照断
片は、有利に試料Ｉ） Ｎ Ａ断片をミニザテライ｝・
試料で検出１ることによって同定され、１つのミニサテ
ライト領域または超可変坐位を検出する。′ミニザテラ
イ１・領域”と“超可変性坐位”の用語は、同義的に使
用される。
ミニサテライト試料は、対照グローブと見なすことがで
きる。このことにより、例えばハイブリソド化フィルタ
ーは対照試料で容易に再検出されるので対照断片の形成
をより容易に監視することができる。
きる。このことにより、例えばハイブリソド化フィルタ
ーは対照試料で容易に再検出されるので対照断片の形成
をより容易に監視することができる。
ＤＮＡ，ＲＮＡおよびＤＮＡに対してハイブリッド化可
能な任意の他の種類のポリヌクレオチドは、使用するこ
とができる。ポリヌクレオチドは、非ｌ／イベル化され
、かつ二本鎖（ｄｓ）または単鎖（ｓｓ）の形であるこ
とができる。
能な任意の他の種類のポリヌクレオチドは、使用するこ
とができる。ポリヌクレオチドは、非ｌ／イベル化され
、かつ二本鎖（ｄｓ）または単鎖（ｓｓ）の形であるこ
とができる。
股にポリヌクレオチドの少なくともヌクレオチド配列は
、単鎖の形であり、好ましくは試料は、全体が単鎖の形
でポリヌクレオチドからなる。本発明による方法に使用
するためのポリヌクレオチドは、有利にクローン化物質
の微生物的再生によるかまたは直接的な合戒により得ら
れる。
、単鎖の形であり、好ましくは試料は、全体が単鎖の形
でポリヌクレオチドからなる。本発明による方法に使用
するためのポリヌクレオチドは、有利にクローン化物質
の微生物的再生によるかまたは直接的な合戒により得ら
れる。
ポリヌクレオチド試料は、ポリヌクレオチドをレイベル
化またはマーキングすることによって得ることができる
。ｓ５の形のレイベル化ポリヌクレオチドは、試料なら
びにそのレイベル化前駆物質どして使用することができ
、このレイベル化前駆物質から３３の試料は、得ること
ができる。本発明で使用されるポリヌクレオチド試料は
、例えば任意の常法で３２ｐまたは３５Ｓで有利に放射
線標識化される。試料は、選択的にハイブリッド化技術
においてよく知られている非放射性手段、例えば蛍光性
基でレイベル化することができるか、またはこの試料は
、ビオチンまたはその誘導体で］／イベル化することが
できる。
化またはマーキングすることによって得ることができる
。ｓ５の形のレイベル化ポリヌクレオチドは、試料なら
びにそのレイベル化前駆物質どして使用することができ
、このレイベル化前駆物質から３３の試料は、得ること
ができる。本発明で使用されるポリヌクレオチド試料は
、例えば任意の常法で３２ｐまたは３５Ｓで有利に放射
線標識化される。試料は、選択的にハイブリッド化技術
においてよく知られている非放射性手段、例えば蛍光性
基でレイベル化することができるか、またはこの試料は
、ビオチンまたはその誘導体で］／イベル化することが
できる。
多形態性坐位または超可変性坐位に対してハイブリッド
化を可能ならしめるポリヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチド試料が使用され、かつ制限酵素が試料ＤＮＡの切
断のために使用されることは、評価さ＃１、さらにＤＮ
Ａの酵素的切断が試料／断片ハイブリッド化を妨害しな
いような程度に選択された試料／酵素組合せ物が存在す
ることは、望ましい。
化を可能ならしめるポリヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチド試料が使用され、かつ制限酵素が試料ＤＮＡの切
断のために使用されることは、評価さ＃１、さらにＤＮ
Ａの酵素的切断が試料／断片ハイブリッド化を妨害しな
いような程度に選択された試料／酵素組合せ物が存在す
ることは、望ましい。
消化耐性は、ＭＳ５１と称されるミニザテライト領域に
隣接して観察された。このことは、第ｌにこのミニザデ
ライトに瞬接せるヒン７（Ｈｉｎｆ）Ｉｍｌｌエンドヌ
クレアーゼ切断に影響を及ぼす。理論的考慮と結び付け
ることは、望まないけれども、断片化耐性、例えば消化
耐性がＤＮＡの第３１Ｊ造における変化から生じ得るこ
とは確実なことである。この選択的構造は、例えばヌク
レオチドの特殊な配列、環境的条件（ｐｌ４イオンの強
さ）または相互作用の長い範囲によって惹起され得る。
隣接して観察された。このことは、第ｌにこのミニザデ
ライトに瞬接せるヒン７（Ｈｉｎｆ）Ｉｍｌｌエンドヌ
クレアーゼ切断に影響を及ぼす。理論的考慮と結び付け
ることは、望まないけれども、断片化耐性、例えば消化
耐性がＤＮＡの第３１Ｊ造における変化から生じ得るこ
とは確実なことである。この選択的構造は、例えばヌク
レオチドの特殊な配列、環境的条件（ｐｌ４イオンの強
さ）または相互作用の長い範囲によって惹起され得る。
このような選択的構造の性質は、ウエルズ（Ｒ．Ｄ．Ｗ
ｅｌ Ｉｓ）およびハーベイ（Ｓ．Ｃ．Ｈａｒｖｅｙ）
著、 ”Ｕｎｕｓｕａｌ Ｄ Ｎ Ａ Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ（１９８８、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ社
刊）によって論評された。第３構造に対する変化は、例
えば制限酵素の能力に影饗を及ぼすことができ、核酸結
合部位および／または核酸切断能力を認める．ｒｔ要な
ヌクレオチド配列は、鎖内ハイブリッド化および殊に非
ワトソン クリック（ＷａｔｓｏｎＣｒｉｃｋ）対に包
含されるものを包含する。このようなヌクレオチド配列
は、例えばＧリッチであることがアさる。“Ｇリッチ”
の用語は、例えばグアニン基少なくとも５０％、少なく
とも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％また
は少なくとも９０％を有するヌクレオチド配列に滞因す
ることができる。第３構造におけるかかる変化は、有利
にリアミチェフ（Ｖ．Ｉ．Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ）他著、
ネイチャ− （Ｎａｔｕｒｅ）紙、３３９，（１９８９
）、６３４−６３７に記載されている。更に、予想ざれ
る構造的変化は、リアこチェフ（Ｖ．Ｉ．Ｉ＋ｙａｍｉ
ｅｈｅｖ）他著、ネイチャ（ Ｎａｔｕｒｅ）紙、３３
９、（１９８９）、６３４〜６３７に包含されている。
ｅｌ Ｉｓ）およびハーベイ（Ｓ．Ｃ．Ｈａｒｖｅｙ）
著、 ”Ｕｎｕｓｕａｌ Ｄ Ｎ Ａ Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ（１９８８、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ社
刊）によって論評された。第３構造に対する変化は、例
えば制限酵素の能力に影饗を及ぼすことができ、核酸結
合部位および／または核酸切断能力を認める．ｒｔ要な
ヌクレオチド配列は、鎖内ハイブリッド化および殊に非
ワトソン クリック（ＷａｔｓｏｎＣｒｉｃｋ）対に包
含されるものを包含する。このようなヌクレオチド配列
は、例えばＧリッチであることがアさる。“Ｇリッチ”
の用語は、例えばグアニン基少なくとも５０％、少なく
とも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％また
は少なくとも９０％を有するヌクレオチド配列に滞因す
ることができる。第３構造におけるかかる変化は、有利
にリアミチェフ（Ｖ．Ｉ．Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ）他著、
ネイチャ− （Ｎａｔｕｒｅ）紙、３３９，（１９８９
）、６３４−６３７に記載されている。更に、予想ざれ
る構造的変化は、リアこチェフ（Ｖ．Ｉ．Ｉ＋ｙａｍｉ
ｅｈｅｖ）他著、ネイチャ（ Ｎａｔｕｒｅ）紙、３３
９、（１９８９）、６３４〜６３７に包含されている。
もう１つの予想される構造的変化は、三重鎖の形成、例
えばホモビリミジン核酸を包含することができる。この
こたは、有利にラジャゴバル（Ｐ．Ｒａｊａｇｏｐａｌ
）他著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）紙、３ ３ ９、
（１９８９）、６３７〜６４０に記載されている。
えばホモビリミジン核酸を包含することができる。この
こたは、有利にラジャゴバル（Ｐ．Ｒａｊａｇｏｐａｌ
）他著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）紙、３ ３ ９、
（１９８９）、６３７〜６４０に記載されている。
従って、ＭＳ５１ミニサテライトを有する断片および殊
にヒンフＩ断片は、本発明方法の場合に対照断片として
有用であることができる。
にヒンフＩ断片は、本発明方法の場合に対照断片として
有用であることができる。
勿論、ＭＳ５１ミニサテライトが、試料ＤＮＡ断片の評
価に有用であるだ《フでなく、例えば欧州特許出願第２
３８３２９号明細書に開示されでいるように遺伝特性決
定方法の場合の１個の坐位試利としても有用であること
は、評価される。
価に有用であるだ《フでなく、例えば欧州特許出願第２
３８３２９号明細書に開示されでいるように遺伝特性決
定方法の場合の１個の坐位試利としても有用であること
は、評価される。
ＭＳ５１は、ｐ Ｍ ５ １とｌ７て後記されたものに
関連仕るヌクレオチド配列、すなわち５′−ＡＣＡＴＧ
ＧＣＡＧＧ （ＡＧＧＧＣＡＧＧ）ｎＴＧＧＡＧＧＧ−
３’［但し、ｎはｌまたは２であるものとする１および
その直列の繰返しによって特異的に同定可能である。
関連仕るヌクレオチド配列、すなわち５′−ＡＣＡＴＧ
ＧＣＡＧＧ （ＡＧＧＧＣＡＧＧ）ｎＴＧＧＡＧＧＧ−
３’［但し、ｎはｌまたは２であるものとする１および
その直列の繰返しによって特異的に同定可能である。
それ故に、本発明のもう１つの観点においてヌクレオヂ
ド配列５’−ＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧ（ＡＧＧＧＣＡＧＧ
）ｎＴＧＧＡＧＧＧ−３’［但し、ｎはｌまたは２であ
るものとする１およびその直列の繰返しによって特異的
に同定可能な試料ＤＮＡ断片に対して選択的に／虱イブ
リ／ド化するポリヌクレオチドが得られる。試料ＤＮＡ
断片は、有利に試料ＤＮＡの制限酵素切断、例えばヒン
フＩ切断から生じる。直列の繰返しが所定の配列の必ず
しも完全な繰返しでないことは、評価され、この場合に
は、配列の相同関係の応分の程度が存在する。
ド配列５’−ＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧ（ＡＧＧＧＣＡＧＧ
）ｎＴＧＧＡＧＧＧ−３’［但し、ｎはｌまたは２であ
るものとする１およびその直列の繰返しによって特異的
に同定可能な試料ＤＮＡ断片に対して選択的に／虱イブ
リ／ド化するポリヌクレオチドが得られる。試料ＤＮＡ
断片は、有利に試料ＤＮＡの制限酵素切断、例えばヒン
フＩ切断から生じる。直列の繰返しが所定の配列の必ず
しも完全な繰返しでないことは、評価され、この場合に
は、配列の相同関係の応分の程度が存在する。
本発明のｌつの好ましい実施態様によれば、例えばヌク
レオチド少なくとも６個、少なくとも８個または有利に
少なくとも１０個を有する前記のヌクレオチド配列およ
びその直列の繰返しならびにそれに対して補足的な配列
またはその有利な任意の部分を有するポリヌクレオチド
が得られる。ポリヌクレオチドは、より有利には前記の
ヌクレオチド配列およびその有利な任意の繰返し数を有
する。
レオチド少なくとも６個、少なくとも８個または有利に
少なくとも１０個を有する前記のヌクレオチド配列およ
びその直列の繰返しならびにそれに対して補足的な配列
またはその有利な任意の部分を有するポリヌクレオチド
が得られる。ポリヌクレオチドは、より有利には前記の
ヌクレオチド配列およびその有利な任意の繰返し数を有
する。
また、本発明は、前記のポリヌク１７オチドの任意のｌ
つをレイベルまたはマーカー成分と一緒にその検出の簡
易化のために有利に有する試料にも関する。
つをレイベルまたはマーカー成分と一緒にその検出の簡
易化のために有利に有する試料にも関する。
また、本発明は、対照・断片の検出のための断片化対照
キッ１・にも関する。このキツ１・は、有利にミニサテ
ライト試料を有し、このミニサテライト試料は、特性決
定すべき１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片の形成後にヒ
ン７Ｉを用いて試料ＤＮＡ消化の間に形成された幻照断
片に対して選択的にハイブリッド化する。次の項目の少
なくとも１つもキット中に存在している：適当な緩衝液
、包装および使用のための構成。必要に応じて、キット
は制限酵素ヒンフＩをも包含する。
キッ１・にも関する。このキツ１・は、有利にミニサテ
ライト試料を有し、このミニサテライト試料は、特性決
定すべき１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片の形成後にヒ
ン７Ｉを用いて試料ＤＮＡ消化の間に形成された幻照断
片に対して選択的にハイブリッド化する。次の項目の少
なくとも１つもキット中に存在している：適当な緩衝液
、包装および使用のための構成。必要に応じて、キット
は制限酵素ヒンフＩをも包含する。
本発明の１つの好ましい実施態様によれば、対照キッｉ
・は、ヌク１／オチド配列５ ’−Ａ Ｃ Ａ ＴＧＧ
ＣＡＧＧ （ＡＧＧＧＣＡＧＧ）ｎＴＧＧＡＧＧＧ−３
’［但し、ｎはｌまたは２であるものとする］およびそ
の直列の繰返しによって特異的に同定可能な試料ＤＮＡ
断片に対して選択的にハイブリッド化するポリヌクレオ
チド試料からなる。試料ＤＮＡ断片は、有利に試料ＤＮ
Ａの制限酵素切断、例えばヒン７■切断から生じる。
・は、ヌク１／オチド配列５ ’−Ａ Ｃ Ａ ＴＧＧ
ＣＡＧＧ （ＡＧＧＧＣＡＧＧ）ｎＴＧＧＡＧＧＧ−３
’［但し、ｎはｌまたは２であるものとする］およびそ
の直列の繰返しによって特異的に同定可能な試料ＤＮＡ
断片に対して選択的にハイブリッド化するポリヌクレオ
チド試料からなる。試料ＤＮＡ断片は、有利に試料ＤＮ
Ａの制限酵素切断、例えばヒン７■切断から生じる。
本発明のさらに１つの好ましい実施態様によれば、対照
キッ］・は、前記のヌクレオチド配列おＪ：びその直列
の繰返しならびにそれに対して補足的な配列からなるポ
リヌクレオチド試料を包含する。試料ＤＮＡ断片化の手
段は、有利に制限酵素およびＪ：り有利にヒンフＩであ
る。
キッ］・は、前記のヌクレオチド配列おＪ：びその直列
の繰返しならびにそれに対して補足的な配列からなるポ
リヌクレオチド試料を包含する。試料ＤＮＡ断片化の手
段は、有利に制限酵素およびＪ：り有利にヒンフＩであ
る。
次に、本発明を図面および実施例につき詳説するが、本
発明は、これらによって限定されるものではない。
発明は、これらによって限定されるものではない。
実施例
次の実施例中、ＤＮＡ単離、制限酵素の消化、電気泳動
法およびザザンプロテイング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌ
ｏｔｔｉｎｇ）は、次のようにして実施された：ＤＮＡ
単離 ＤＮＡをヒト供与体（ＡＦＭｌ６）の全面から単離した
。白血球を血液２０ｒｎｌ２から分離しかつ１回ＩＸｓ
ｓｃ （２ＯＸＳＳＣはＮａＣＱ ３．０モル／クエ
ン酸三ナトリウム０．３そルである）中で洗浄した。
法およびザザンプロテイング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌ
ｏｔｔｉｎｇ）は、次のようにして実施された：ＤＮＡ
単離 ＤＮＡをヒト供与体（ＡＦＭｌ６）の全面から単離した
。白血球を血液２０ｒｎｌ２から分離しかつ１回ＩＸｓ
ｓｃ （２ＯＸＳＳＣはＮａＣＱ ３．０モル／クエ
ン酸三ナトリウム０．３そルである）中で洗浄した。
次に、この白血球を０．２モルの酢酸ナトリウム３．７
５ｍｆｆＳｐＨ７．０、ｌ Ｏ ｍ ｇ／ ｍ Ｑのグ
ロテアーゼーＫ １ ０ ０ ｔｔ Ｑ （Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ社のトリヂラキウム アルブム（ Ｔｒｉｔ
ｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｌ）ｕｍ））、ｌＯ％のＳ Ｄ
Ｓ ２ ５ Ｏ ｓ Ｑ中に５６℃で３時間溶解した
。次に、このリゼートを７ェノール／クロロホルム（フ
ェノール２５ｍ：クロ０ホルム２４部二イソアミルアル
コール１部）で抽出シ、カつ１回クロロボルム（クロロ
ホルム２４部：イソアミルアルコール１部）で抽出した
こσ）ＤＮＡを１００％のエタノール２容量の添加後に
スプールに巻取り、かつ０．２モルの酢酸ナ１・リウム
中に再溶解した。次に、ｉｏｏ％のエタノールで沈澱さ
せ、かつ８０％のエタノ・−ルで洗浄し、さらに乾燥し
た。最後にこのＤＮＡを１０ミリモルのトリスｐＨ８／
１ミリモルのＥＤＴＡ緩衝液中に再溶解した。
５ｍｆｆＳｐＨ７．０、ｌ Ｏ ｍ ｇ／ ｍ Ｑのグ
ロテアーゼーＫ １ ０ ０ ｔｔ Ｑ （Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ社のトリヂラキウム アルブム（ Ｔｒｉｔ
ｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｌ）ｕｍ））、ｌＯ％のＳ Ｄ
Ｓ ２ ５ Ｏ ｓ Ｑ中に５６℃で３時間溶解した
。次に、このリゼートを７ェノール／クロロホルム（フ
ェノール２５ｍ：クロ０ホルム２４部二イソアミルアル
コール１部）で抽出シ、カつ１回クロロボルム（クロロ
ホルム２４部：イソアミルアルコール１部）で抽出した
こσ）ＤＮＡを１００％のエタノール２容量の添加後に
スプールに巻取り、かつ０．２モルの酢酸ナ１・リウム
中に再溶解した。次に、ｉｏｏ％のエタノールで沈澱さ
せ、かつ８０％のエタノ・−ルで洗浄し、さらに乾燥し
た。最後にこのＤＮＡを１０ミリモルのトリスｐＨ８／
１ミリモルのＥＤＴＡ緩衝液中に再溶解した。
制限酵素の消化
ＤＮＡの濃度をヘツフ７ − （Ｈｏｅｆｆｅｒ）Ｔ
ｌ ２０−１００ＤＮＡ蛍光分析計を使用してヒン７Ｉ
消化貯蔵物ＤＮＡのアリコー１・を蛍光分析することに
よって評価した。ＡＦＭｌ６血液から抽出された高分子
量ＤＮＡ３０μｇをヒン７Ｉ酵素（２０単位／μａでＢ
ＣＬによって供給した）を用いて１４０μαの容量で消
化した。ヒンフ■酵素１４０単位を使用し，かつ恒温保
持の第１の時間の間ｌＯ分間隔で混合しなから３７゜Ｃ
で恒温保持した。
ｌ ２０−１００ＤＮＡ蛍光分析計を使用してヒン７Ｉ
消化貯蔵物ＤＮＡのアリコー１・を蛍光分析することに
よって評価した。ＡＦＭｌ６血液から抽出された高分子
量ＤＮＡ３０μｇをヒン７Ｉ酵素（２０単位／μａでＢ
ＣＬによって供給した）を用いて１４０μαの容量で消
化した。ヒンフ■酵素１４０単位を使用し，かつ恒温保
持の第１の時間の間ｌＯ分間隔で混合しなから３７゜Ｃ
で恒温保持した。
アリコート２０μａを１００ミリモルのＥＤＴＡＩμＱ
，ｐＨ８中に試料採取し、かつ２０分、４０分および６
０分後ならびに２時間、３時間、４時問および２４時間
後に−２０℃で凍結乾燥した。
，ｐＨ８中に試料採取し、かつ２０分、４０分および６
０分後ならびに２時間、３時間、４時問および２４時間
後に−２０℃で凍結乾燥した。
電気泳動法
２０ｃｍＸ２５ｃｔｎのアガロースゲル０．７％（ Ｓ
ｉｇｍａ−１、ｏｖＥＥｏ型式Ｉ）をｌｘＴＢＥ（トリ
ス１３４ミリモル、Ｈ３ＢＯ＄７４．９ミリモル、Ｎａ
２ＥＤＴＡ２．５ミリモル、ｐＨ８）電気泳動緩衝液中
で得る。ヒンフＩ＠＠ＤＮＡ試料を分子量マーカーおよ
びＢｇｌｌ制限酵素（１０単位／ ｐ ＱでＡｎｇｌｉ
ａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって供給された
）で消化されたｐＢＲ３２２プラスミドＤ Ｎ Ａ Ｑ
． ５ ｐ ｇ （Ａｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｅ
ｈｎｏ１ｏｇｙｓ ２ ｍ ｙ ／ ｍ ＋２）と一緒
にゲル上に負荷した。７５Ｖの一定の電圧をアガロース
ゲルを介して供給し、ｐＢＲ３２２ ８ｇｌＩＤＮＡ
からの２．３キロベースの分子量マーカーを起源から１
８．５ｃｒｎにランさせる。
ｉｇｍａ−１、ｏｖＥＥｏ型式Ｉ）をｌｘＴＢＥ（トリ
ス１３４ミリモル、Ｈ３ＢＯ＄７４．９ミリモル、Ｎａ
２ＥＤＴＡ２．５ミリモル、ｐＨ８）電気泳動緩衝液中
で得る。ヒンフＩ＠＠ＤＮＡ試料を分子量マーカーおよ
びＢｇｌｌ制限酵素（１０単位／ ｐ ＱでＡｎｇｌｉ
ａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって供給された
）で消化されたｐＢＲ３２２プラスミドＤ Ｎ Ａ Ｑ
． ５ ｐ ｇ （Ａｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｅ
ｈｎｏ１ｏｇｙｓ ２ ｍ ｙ ／ ｍ ＋２）と一緒
にゲル上に負荷した。７５Ｖの一定の電圧をアガロース
ゲルを介して供給し、ｐＢＲ３２２ ８ｇｌＩＤＮＡ
からの２．３キロベースの分子量マーカーを起源から１
８．５ｃｒｎにランさせる。
サザーンブロッティング
ゲルを０．２５モルのｉ｛ Ｃ Ｑ中で１５分間脱プリ
ンし、ＮａＯＨ ０．５モル／ＨＣ０． １．５モル
中で３０分間変性し、かつ１・リス０．５モル、ｐＨ７
．５、ＮａＣ（２３．０モル中で３０分間中和させた。
ンし、ＮａＯＨ ０．５モル／ＨＣ０． １．５モル
中で３０分間変性し、かつ１・リス０．５モル、ｐＨ７
．５、ＮａＣ（２３．０モル中で３０分間中和させた。
ＤＮＡをサザーンブ口ツティングにＪ：ッてハイボンド
ーＮ （ Ａｍｅｒｓｂａｍ）に移し、かつ紫外線照射
によって固定した。
ーＮ （ Ａｍｅｒｓｂａｍ）に移し、かつ紫外線照射
によって固定した。
例ｌ
試料のレイベリングおよびハイブリッド化３３．１５試
料８０ｎｇ（英田特許第２１６６４４５号明細書に記載
の方法により得た）をαＧ２Ｐ ａＧｒｒｃトリシン
ｌＯミリモル中のＤｕＰｏｎｔ−３ ０ ０ ０ Ｃ
ｉ／ Ｅリモル）でプライマーの伸長によってレイベ
ル化した。
料８０ｎｇ（英田特許第２１６６４４５号明細書に記載
の方法により得た）をαＧ２Ｐ ａＧｒｒｃトリシン
ｌＯミリモル中のＤｕＰｏｎｔ−３ ０ ０ ０ Ｃ
ｉ／ Ｅリモル）でプライマーの伸長によってレイベ
ル化した。
緩衝液Ｂ３６ｔｔＱを３３．１５緩衝液２４μｆｆに添
加し、かつ５分間沸騰させ、次いで氷上でｌＯ分間冷却
した。次に、緩衝液ＣＩ６μａをσ３２Ｐ ｄＧＴＰ
２０μＱおよびクレノウ酵素４μＱと一緒に添加ｌ７た
（ＢＣＬ配列決定度−５単位／μ０。この反応を室温で
３時間恒温保持し、これは１つのハイブリッド化チャン
バー（２ １ ｃｍＸ２ １ ｃｍのシール可能な透視
箱）にどって十分な試料である。
加し、かつ５分間沸騰させ、次いで氷上でｌＯ分間冷却
した。次に、緩衝液ＣＩ６μａをσ３２Ｐ ｄＧＴＰ
２０μＱおよびクレノウ酵素４μＱと一緒に添加ｌ７た
（ＢＣＬ配列決定度−５単位／μ０。この反応を室温で
３時間恒温保持し、これは１つのハイブリッド化チャン
バー（２ １ ｃｍＸ２ １ ｃｍのシール可能な透視
箱）にどって十分な試料である。
ＮＩＣＫカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−５０カラム）をカラム緩衝液１０ｒｒ＋（＋（
トリス２０ミリモル、ｐＨ７．５、ＮａＣＱ２ミリモル
、ＥＤＴＡ２ミリモル、ＳＤＳＯ−２５％）で平衡にさ
せる。この試料反応混合物をカラムに通過させ、次いで
カラ五緩衝液Ｏ。４ｍＱを添加しかつ廃棄し、第２のカ
ラム緩衝液０ ．４ ＋ｒｌを添加し、これを捕集し、
かつ精製された試料として使用する。
ｘ Ｇ−５０カラム）をカラム緩衝液１０ｒｒ＋（＋（
トリス２０ミリモル、ｐＨ７．５、ＮａＣＱ２ミリモル
、ＥＤＴＡ２ミリモル、ＳＤＳＯ−２５％）で平衡にさ
せる。この試料反応混合物をカラムに通過させ、次いで
カラ五緩衝液Ｏ。４ｍＱを添加しかつ廃棄し、第２のカ
ラム緩衝液０ ．４ ＋ｒｌを添加し、これを捕集し、
かつ精製された試料として使用する。
ハイボンドーＮフィルターを１ｘｓＳＣ中で湿潤させ、
かつｌ×デンハルＬス（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）（ＢＳＡ
Ｏ−２％（ｔ断片Ｖ ） 、Ｆｉｃｏｌｌ ４ ０
０ ０．２％、ポリビニルビロリドン０．２％（平均分
子量４００００，ＩＸｓｓｃ））中で６２℃で６０分間
プリハイブリッド化する。
かつｌ×デンハルＬス（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）（ＢＳＡ
Ｏ−２％（ｔ断片Ｖ ） 、Ｆｉｃｏｌｌ ４ ０
０ ０．２％、ポリビニルビロリドン０．２％（平均分
子量４００００，ＩＸｓｓｃ））中で６２℃で６０分間
プリハイブリッド化する。
ｌｍｇ／ｒｎｒＩ．剪断されたヒト胎盤ＤＮＡ０．５ｍ
ｌ２（ＮａＯＨ ０．３モル、ＥＤＴＡ２０ミリモル
中でｌＯＯ℃で５分間剪断し、次いでＨＣＱで中和した
）をハイブリッド化チャンバーごとに使用すべき試料に
添加し、かつ７分間沸騰させ、次いで氷上でＩＯ分間冷
却する。
ｌ２（ＮａＯＨ ０．３モル、ＥＤＴＡ２０ミリモル
中でｌＯＯ℃で５分間剪断し、次いでＨＣＱで中和した
）をハイブリッド化チャンバーごとに使用すべき試料に
添加し、かつ７分間沸騰させ、次いで氷上でＩＯ分間冷
却する。
この試料をプリハイブリッド化チャンバー中でＣＨＦＭ
ｌ６０ｍＱ（ポリエチレングリコール６０００ ６％
（１×デンハルトス（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）、ＳＤＳ
Ｏ．１％、ポリエチレングリコール６０００ ６％
）に添加する。フィルターをプリハイブリッド化溶液か
ら移し、かつ６２℃で１６時間恒温保持し、温和に振盪
きせる。
ｌ６０ｍＱ（ポリエチレングリコール６０００ ６％
（１×デンハルトス（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）、ＳＤＳ
Ｏ．１％、ポリエチレングリコール６０００ ６％
）に添加する。フィルターをプリハイブリッド化溶液か
ら移し、かつ６２℃で１６時間恒温保持し、温和に振盪
きせる。
フィルターをＩＸＳＳＣ ４００ｍＣ，蝉の精液ＤＮ
Ａ２５／１ｇ／ｍ（２（ｇ）、ＳＤＳ Ｏ．ｌ％中で
６２℃で３０分間洗浄し、４回繰り返す。次に、これを
キコーリックス（Ｃｕｒｉｘ）ＭＲ８０強化スクリーン
を封する光校正カセット（目ｇｈｔ ｐｒｏｏｆ ｃａ
ｓｓｅｔｔｅ）（Ａｇｆａ社）中に置き、Ｘ線感光性フ
ィルムに−７０℃で１０日間露光する。
Ａ２５／１ｇ／ｍ（２（ｇ）、ＳＤＳ Ｏ．ｌ％中で
６２℃で３０分間洗浄し、４回繰り返す。次に、これを
キコーリックス（Ｃｕｒｉｘ）ＭＲ８０強化スクリーン
を封する光校正カセット（目ｇｈｔ ｐｒｏｏｆ ｃａ
ｓｓｅｔｔｅ）（Ａｇｆａ社）中に置き、Ｘ線感光性フ
ィルムに−７０℃で１０日間露光する。
緩衝液旦：
緩衝液Ａ４４μ＋２（トリス１．２１モル、ｐＨ８０、
Ｍｇ（１２０．１２モル、２−メルカプトエタノールＯ
．２５モル）、２モルのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）１ １
０ ｐＱ， ｐ Ｈ ６ ．６、逆澄透水２４２μ０．
（ Ｍｉ口ｉ−Ｑ Ｈ２０）（ａ小細孔一試薬グレー
ド水系）、分割量化しかつ−２０℃での貯蔵）．３３．
１５緩衝液： ジアグ（Ｄｉａｇ）２ ５ ７．７ ｐｍ ２０
ｐＱ（常法で得られたオリゴヌクレオチド）、２０ｎｇ
／μＱ ３３．１５挿入断片 ４ｔｔＱ．．干渉液Ｃ
： １ミリモルのｄＡＴＰ４４μＱ％ １ミリモルのｄｃＴ
Ｐ４４μｆｆ，１ミリモルのＴＴＰ４４μＱおよびｌ
Ｏｍｇ／ｍｇＢＡＳ ４ ４ ｐＱ，分割量化しかつ−
２０℃での貯蔵（ｄＡＴＰ，ｄＣＴ Ｐ ， Ｔ Ｔ
Ｐ −Ｐｈａｒｍａｃｉｐ ｌ ０ ０ミリモルの溶液
）Ｏ 例２ 試料のレイベリングおよびハイブリッド化試料ＭＳ５１
２０ｎｇ（本明細書中に記載されている挿入配列）
をランダムなオリゴヌクレオチドブライミングによって
レイベル化した（ Ｆｅｉｎｂｅｒｇ８よびＶｏｇｅｌ
ｓｔｅｉｎ， ｌ ９ ８ ４、Ａｎａ １．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．、１３７、２６６頁〜２６７頁）６この試料
を５分間沸騰させ、次いで氷上でｌＯ分間冷却した。オ
リゴレイベリング干渉液１０μＱを５ ｍｇ ／ ｍ
Ｑ牛血清アルブミン４μＱ，α３２Ｐ ｄ Ｇ Ｔ
Ｐ ７／Ｊ Ｑ（ＤｕＦｏｎｔ）およびクレノウ酵素２
μεと一ＨＩこ添加した（５単位／μＱでのＢｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ一配列決定度）。この反応容量を逆浸透水
の添加によって５０μＱにさせ、混合し、かつ室温で３
時間恒温保持する。この試料を前記例ｌの記載のように
ＮＩＣＫ力ラムを通して精製する。ハイボンドーＮフィ
ルターを例ｌの３３．１５試料から、０．４モルのＮａ
ＯＨ中で４５゜０で３０分間の洗浄によって剥離し、次
いでｏ．ｉｘｓｓｃ，ｏ。ＩＸｓＤｓ，０．２モルのト
リス、ｐ Ｈ ７ ．５中で４５℃で３０分間中和した
。
Ｍｇ（１２０．１２モル、２−メルカプトエタノールＯ
．２５モル）、２モルのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）１ １
０ ｐＱ， ｐ Ｈ ６ ．６、逆澄透水２４２μ０．
（ Ｍｉ口ｉ−Ｑ Ｈ２０）（ａ小細孔一試薬グレー
ド水系）、分割量化しかつ−２０℃での貯蔵）．３３．
１５緩衝液： ジアグ（Ｄｉａｇ）２ ５ ７．７ ｐｍ ２０
ｐＱ（常法で得られたオリゴヌクレオチド）、２０ｎｇ
／μＱ ３３．１５挿入断片 ４ｔｔＱ．．干渉液Ｃ
： １ミリモルのｄＡＴＰ４４μＱ％ １ミリモルのｄｃＴ
Ｐ４４μｆｆ，１ミリモルのＴＴＰ４４μＱおよびｌ
Ｏｍｇ／ｍｇＢＡＳ ４ ４ ｐＱ，分割量化しかつ−
２０℃での貯蔵（ｄＡＴＰ，ｄＣＴ Ｐ ， Ｔ Ｔ
Ｐ −Ｐｈａｒｍａｃｉｐ ｌ ０ ０ミリモルの溶液
）Ｏ 例２ 試料のレイベリングおよびハイブリッド化試料ＭＳ５１
２０ｎｇ（本明細書中に記載されている挿入配列）
をランダムなオリゴヌクレオチドブライミングによって
レイベル化した（ Ｆｅｉｎｂｅｒｇ８よびＶｏｇｅｌ
ｓｔｅｉｎ， ｌ ９ ８ ４、Ａｎａ １．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．、１３７、２６６頁〜２６７頁）６この試料
を５分間沸騰させ、次いで氷上でｌＯ分間冷却した。オ
リゴレイベリング干渉液１０μＱを５ ｍｇ ／ ｍ
Ｑ牛血清アルブミン４μＱ，α３２Ｐ ｄ Ｇ Ｔ
Ｐ ７／Ｊ Ｑ（ＤｕＦｏｎｔ）およびクレノウ酵素２
μεと一ＨＩこ添加した（５単位／μＱでのＢｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ一配列決定度）。この反応容量を逆浸透水
の添加によって５０μＱにさせ、混合し、かつ室温で３
時間恒温保持する。この試料を前記例ｌの記載のように
ＮＩＣＫ力ラムを通して精製する。ハイボンドーＮフィ
ルターを例ｌの３３．１５試料から、０．４モルのＮａ
ＯＨ中で４５゜０で３０分間の洗浄によって剥離し、次
いでｏ．ｉｘｓｓｃ，ｏ。ＩＸｓＤｓ，０．２モルのト
リス、ｐ Ｈ ７ ．５中で４５℃で３０分間中和した
。
次に、このフィルター・をｌｘｓｓｅ中で洗浄し、かつ
０．１％の牛血清アルブミン（Ｂｅｔ．ｈｅｓｄａ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ＬａｂＯｒａｔＯｆｉｅＳ−核酸酵素
度）、五ミリモルのＥＤＴＡ，７％の５０５，Ｑ。５モ
ルのビロ燐酸ナトリウム、ｐＨ７．２中で６５℃で２０
分間ブリハイブリッド化した［ＣｈｕｒｅｈおよびＧｉ
ｌｂｏｒｔ、、ｌ９８４、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．、ＩＪＳＡ
， ８ １１９９１頁〜ｌ９９５頁］。
０．１％の牛血清アルブミン（Ｂｅｔ．ｈｅｓｄａ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ＬａｂＯｒａｔＯｆｉｅＳ−核酸酵素
度）、五ミリモルのＥＤＴＡ，７％の５０５，Ｑ。５モ
ルのビロ燐酸ナトリウム、ｐＨ７．２中で６５℃で２０
分間ブリハイブリッド化した［ＣｈｕｒｅｈおよびＧｉ
ｌｂｏｒｔ、、ｌ９８４、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．、ＩＪＳＡ
， ８ １１９９１頁〜ｌ９９５頁］。
精製された試料をｌｍｇ／ｒｎｌ２剪断されたヒト胎盤
ＤＮＡＯ．５ｍ（２＆〜緒に沸騰させ、次いで氷上でＩ
Ｏ分間冷却し、かつｌＸｓｓｃｉ６ＱｍＱ，ポリエチレ
ングリコール６０００ ６％に添加する。フィルター
をプリハイブリッド化溶液から移し、かつ６５℃で１６
時間恒温保持した。ハイブリッド化後、このフィルター
を４０ミリモルの＃Ｉ酸ナトリウム、ＳＤＳＯ。
ＤＮＡＯ．５ｍ（２＆〜緒に沸騰させ、次いで氷上でＩ
Ｏ分間冷却し、かつｌＸｓｓｃｉ６ＱｍＱ，ポリエチレ
ングリコール６０００ ６％に添加する。フィルター
をプリハイブリッド化溶液から移し、かつ６５℃で１６
時間恒温保持した。ハイブリッド化後、このフィルター
を４０ミリモルの＃Ｉ酸ナトリウム、ＳＤＳＯ。
ｌ％（ｐＨ７．２）中で６５℃でｌ５分間洗浄し、引続
き２回ｇ，５ｘｓｓｃ，ＳＤＳ Ｏ−Ｏｌ％中で６５
℃でｌ５分間洗浄し、最後に２回０．２ＸＳＳＣ，ＳＤ
Ｓ Ｏ．０ １％中で６５°Ｃで１５分間洗浄した。
き２回ｇ，５ｘｓｓｃ，ＳＤＳ Ｏ−Ｏｌ％中で６５
℃でｌ５分間洗浄し、最後に２回０．２ＸＳＳＣ，ＳＤ
Ｓ Ｏ．０ １％中で６５°Ｃで１５分間洗浄した。
次に、このフィルターを３ｘｓｓｃ中で洗浄１，、短時
間空気乾燥し、かつ例ｌの記載のようにオートラジオグ
ラフィーのためにサランラップ中に包み、１〜２日間露
光した。
間空気乾燥し、かつ例ｌの記載のようにオートラジオグ
ラフィーのためにサランラップ中に包み、１〜２日間露
光した。
例３
物質および方法は、例２の記載ｔ全く同様であるが、試
料ｐＡｇ３ （欧州特許出願第２３８３２９号明細書に
開示された方法により得た）をｐＭｓ５１の代わりに使
用した．ｐＪｇ３の配列は、ＡＧＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧ
ＧＣＧＧＧＹＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＧＧＧΔＧＲＧＧＣ
（但し、ＹはＣ，Ｔまたはｔｙであり、ＲはＡまたは
Ｇであり、ＴはＴまたはＵである）８よびその直列の繰
返しである。
料ｐＡｇ３ （欧州特許出願第２３８３２９号明細書に
開示された方法により得た）をｐＭｓ５１の代わりに使
用した．ｐＪｇ３の配列は、ＡＧＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧ
ＧＣＧＧＧＹＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＧＧＧΔＧＲＧＧＣ
（但し、ＹはＣ，Ｔまたはｔｙであり、ＲはＡまたは
Ｇであり、ＴはＴまたはＵである）８よびその直列の繰
返しである。
第１図は、ゲノムＤＮＡ試料の部分的消化の結果を示し
フィンガーグリント図であり、この場合この試料は、そ
れぞれ２０分間、４０分間６０分間、１時間、２時間、
４時問および２４時間消化され、かつバンドは、如何に
してＤＮＡ７ ｛ンガーグリントが時間と共に変化する
のかを明示しており、 第２図は、同じＤＮＡ試料をＰＭＳ５１で検出した結果
をす７インガープリント図であり、この場合バンドは、
消化およびバンドの変化パターンに対するＭＳ５１対立
遺伝子の耐性を明示しており、 第３図は、同じＤＮＡ試料を試料ｐＪｇ３で検出した結
果を示すフィンガープリント図であり、この場合ｇ３対
立遺伝子は、断片化耐性の任意の評価し得る程度を示さ
ず、かつバンドは迅速に安定化するここが認められ、１
ｆａの対立遺伝子のみは前記試料を使用することにより
目視できることが認められるはずであり、第４図は、Ｍ
Ｓ５１ミニザテライト坐位に牌接したエコ（Ｅｃｏ）Ｒ
Ｉ ，ヒンド（Ｈｉｎｄ）ＩＩＩ ，ヒンフ（Ｈｉｎ
ｆ） Ｉ ， グスト（ＰＳ丁）Ｉｊ；よびザウ（Ｓ
ａｉ１）３Ａ制服部位の位置を示す略図である。 図面の浄書（内容に変更なし》 〜・７・ ｙ’ｕ １ｋｂ
フィンガーグリント図であり、この場合この試料は、そ
れぞれ２０分間、４０分間６０分間、１時間、２時間、
４時問および２４時間消化され、かつバンドは、如何に
してＤＮＡ７ ｛ンガーグリントが時間と共に変化する
のかを明示しており、 第２図は、同じＤＮＡ試料をＰＭＳ５１で検出した結果
をす７インガープリント図であり、この場合バンドは、
消化およびバンドの変化パターンに対するＭＳ５１対立
遺伝子の耐性を明示しており、 第３図は、同じＤＮＡ試料を試料ｐＪｇ３で検出した結
果を示すフィンガープリント図であり、この場合ｇ３対
立遺伝子は、断片化耐性の任意の評価し得る程度を示さ
ず、かつバンドは迅速に安定化するここが認められ、１
ｆａの対立遺伝子のみは前記試料を使用することにより
目視できることが認められるはずであり、第４図は、Ｍ
Ｓ５１ミニザテライト坐位に牌接したエコ（Ｅｃｏ）Ｒ
Ｉ ，ヒンド（Ｈｉｎｄ）ＩＩＩ ，ヒンフ（Ｈｉｎ
ｆ） Ｉ ， グスト（ＰＳ丁）Ｉｊ；よびザウ（Ｓ
ａｉ１）３Ａ制服部位の位置を示す略図である。 図面の浄書（内容に変更なし》 〜・７・ ｙ’ｕ １ｋｂ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、試料ＤＮＡ断片化を評価する方法において、試料Ｄ
ＮＡ切断の間に形成された対象断片の存在を、特性決定
すべきＤＮＡ断片の１つまたはそれ以上の形成後に検出
することを特徴とする、試料ＤＮＡ断片化の評価方法。 ２、試料ＤＮＡを酵素消化作用によって断片化する、請
求項１記載の方法。 ３、対照断片は完全な試料ＤＮＡ断片化を示す、請求項
１または２に記載の方法。 ４、対照断片をミニサテライトプローブを使用して検出
する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法
。 ５、ミニサテライトプローブを１つのミニサテライト領
域または超可変性坐位を検出するために使用する、請求
項４記載の方法。 ６、ミニサテライトプローブが選択的にハイブリッド化
し、ヌクレロチド配列５′−ＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧ（Ａ
ＧＧＧＣＡＧＧ）ｎＴＧＧＡＧＧＧ−３′［但し、ｎは
１または２であるものとする］およびその直列の繰返し
によって特異的に同定可能の試料ＤＮＡ断片に変わる、
請求項５記載の方法。 ７、制限酵素ヒンフ I を試料ＤＮＡの切断のために使
用する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方
法。 ８、選択的にハイブリッド化し、ヌクレロチド配列５′
−ＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧ（ＡＧＧＧＣＡＧＧ）ｎＴＧＧ
ＡＧＧＧ−３′［但し、ｎは１または２であるものとす
る］およびその直列の繰返しによって特異的に同定可能
の試料ＤＮＡ断片に変わる、ポリヌクレオチド。 ９、レイベルまたはマーカー成分と一緒にされている、
請求項８記載のポリヌクレオチド。 １０、ヌクレロチド配列５′−ＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧ（
ＡＧＧＧＣＡＧＧ）ｎＴＧＧＡＧＧＧ−３′［但し、ｎ
は１または２であるものとする］およびその直列の繰返
しからなるポリヌクレオチド試料。 １１、特性決定すべき１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片
および少なくとも１つの緩衝液の形成、包装および使用
のための構成の後にヒンフ I を用いて試料ＤＮＡ消化
の間に形成され た対照断片に対して選択的にハイブリッド化するミニサ
テライト試料からなる対照キット。 １２、ミニサテライト試料がヌクレロチド配列５′−Ａ
ＣＡＴＧＧＣＡＧＧ（ＡＧＧＧＣＡＧＧ）ｎＴＧＧＡＧ
ＧＧ−３′［但し、ｎは１または２であるものとする］
およびその直列の繰返しからなる、請求項１１記載の対
照キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888824531A GB8824531D0 (en) | 1988-10-20 | 1988-10-20 | Polynucleotide probes |
| GB8824531.1 | 1988-10-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0327300A true JPH0327300A (ja) | 1991-02-05 |
Family
ID=10645480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1271922A Pending JPH0327300A (ja) | 1988-10-20 | 1989-10-20 | 試料ｄｎａ断片化の評価方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0327300A (ja) |
| DE (1) | DE3935022A1 (ja) |
| FR (1) | FR2638171A1 (ja) |
| GB (2) | GB8824531D0 (ja) |
| IT (1) | IT1237107B (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6207373B1 (en) | 1998-02-25 | 2001-03-27 | Nanogen, Inc. | Methods for determining nature of repeat units in DNA |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IS1355B6 (is) * | 1984-11-12 | 1989-04-19 | Lister Institute Of Preventive Medicine | Fjölkjarna kannar |
| GB8606719D0 (en) * | 1986-03-19 | 1986-04-23 | Lister Preventive Med | Genetic probes |
-
1988
- 1988-10-20 GB GB888824531A patent/GB8824531D0/en active Pending
-
1989
- 1989-10-19 FR FR8913697A patent/FR2638171A1/fr not_active Withdrawn
- 1989-10-19 GB GB8923621A patent/GB2224573B/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-10-20 JP JP1271922A patent/JPH0327300A/ja active Pending
- 1989-10-20 IT IT02209289A patent/IT1237107B/it active IP Right Grant
- 1989-10-20 DE DE3935022A patent/DE3935022A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3935022A1 (de) | 1990-04-26 |
| FR2638171A1 (fr) | 1990-04-27 |
| GB8824531D0 (en) | 1988-11-23 |
| IT8922092A1 (it) | 1991-04-20 |
| GB8923621D0 (en) | 1989-12-06 |
| IT8922092A0 (it) | 1989-10-20 |
| IT1237107B (it) | 1993-05-18 |
| GB2224573B (en) | 1993-05-12 |
| GB2224573A (en) | 1990-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11268133B2 (en) | Methods of detecting gene fusions | |
| US5093245A (en) | Labeling by simultaneous ligation and restriction | |
| US5376529A (en) | Lactam-containing compositions and methods useful for the hybridization of nucleic acids | |
| JPH06500021A (ja) | 均質検定システム | |
| JPS61242598A (ja) | 植物の遺伝地図作成およびそれによる交雑育種の方法 | |
| EP2536843B1 (en) | Methods and materials for detecting contaminated food products | |
| CN106414738A (zh) | 人kras中单核苷酸多态性的检测 | |
| US20060003337A1 (en) | Detection of small RNAS | |
| CA2005927A1 (en) | Method of preparing nucleotide probes using a bridging complement | |
| CN109423518A (zh) | 检测Septin9基因的甲基化DNA的组合物和方法 | |
| WO1998049345A1 (en) | Methods and compositions for targeted dna differential display | |
| EP1842922B1 (en) | Method of increasing specificity of nucleic acid hybridization using zwitterionic compound | |
| WO1991002088A1 (en) | Lactam-containing compositions and methods useful for the hybridization of nucleic acids | |
| Latorra et al. | Characterization of human AFLP systems apolipoprotein B, phenylalanine hydroxylase, and D1S80. | |
| Pfeifer et al. | Genomic footprinting by ligation mediated polymerase chain reaction | |
| JPH03130100A (ja) | Ｖｎｔｒ遺伝子座に対するｄｎａプローブ | |
| JPH0327300A (ja) | 試料ｄｎａ断片化の評価方法 | |
| Pfeifer et al. | Footprinting with UV irradiation and LMPCR | |
| Pfeifer et al. | Genomic sequencing | |
| WO1999001580A1 (en) | Compositions and methods for detection of genomic imprinting disorders | |
| Hull et al. | Protein—DNA interactions in vivo—examining genes in Saccharomyces cerevisiae and Drosophila melanogaster by chromatin footprinting | |
| Delagoutte et al. | The isomerization of the UvrB–DNA preincision complex couples the UvrB and UvrC activities | |
| Milici et al. | Study of the Alzheimer's A4 precursor gene promoter region by genomic sequencing using Taq polymerase | |
| JP7488519B2 (ja) | Ｌａｍｐプライマーセット及びプライマー対 | |
| Pfeifer et al. | In vivo footprinting using UV light and ligation-mediated PCR |