IT8922092A1 - Sonde polinucleotidiche. - Google Patents
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di nazionalit?: inglese
con sede in: LONDON (GRAN BRETAGNA)
Inventori designati : 1) Alee John JEFFREYS 2) Andrew Hawley CAWOOD 3} Michael Brian TIBRELL WEBB Depositato il 2 0 0TT.T989
220 9 2 A/89
RIASSUNTO
Un procedimento per la valutazione della fram?
mentazione di DNA campione che consiste nel mettere
in evidenza la presenza oppure l 'assenza di un fram?
mento di controllo formatosi , durante la scissione
di un DNA-campione dopo che uno o pi? dei frammenti
di DNA da caratterizzare. Poi i nucl eoti di e sonde
costituite da poi i nucl eoti di da usare nel procedimento e anche corredi di controllo che comprendono
questi . In particolare il procedimento dell 'invenzione ? utile come controllo di digestione in procedimenti di caratterizzazione genetica
La presente invenzione riguarda un procedimento per la valutazione di una frammentazione del
DNA-campione e anche poi i nucl eoti di e sonde costi
tuite da poiinucleotidi da usare nel procedimento. In particolare il procedimento dell'invenzione ? utile come controllo di digestione in metodi di caratterizzazione genetica.
Si sono sviluppati metodi analitici per esaminare la dimensione e/o la composizione di frammenti di DNA. In particolare sono stati sviluppati metodi in cui i frammenti di DNA vengono resi a semplice filamento per una ibridazione verso sonde specifiche per uno o pi? loci genetici. Le sonde sono opportunamente marcate per scopi di identificazione. Gli ibridi frammento-sonda cosi ottenuti possono venire messi in evidenza e possono venire caratterizzati per esempio a seconda delle dimensioni, adottando tecniche note come elettroforesi su gel. Una autoradiografia ? un metodo conveniente per la identificazione di Ibridi frammento-sonda radio-marcati.
La frammentazione di DNA-campione viene realizzata mediante diversi metodi, ivi compresi il trattamento con ultrasuoni e mezzi chimici. Tuttavia, comunemente il DNA-campione viene scisso enzimaticamente, per esempio con enzimi di restrizione o endonuc1easi. Le endonucleasi di restrizione sono in grado di riconoscere sequenze di nucleotidi-bersaglio in DNA e sono in grado di scindere il DNA in modo prevedibile in rapporto alla sequenza bersaglio. Tali endonucleasi pertanto possono servire come strumenti analitici utili. La frammentazione enzimatica del DNA spesso viene denominata digestione.
Il genoma umano ? gi? stato esaminato per identificare i loci genetici che sono informativi. Si ? dimostrato un particolare interesse in loci polimorfici oppure ipervariabi1i. Il numero totale di tali loci non ? noto ma ? probabile che sia grande. In effetti il genoma umano potrebbe contenere almeno 1500 di tali loci. Si ? dimostrato che alcuni di questi loci sono utili in metodi di caratterizza.zione genetica. Nel brevetto UK N? 2166445 (Lister Institute of Preventive Hedicine) vengono descritte sonde 1n grado di caratterizzare il DNA genomico riferendosi a pi? di un locus genetico informativo. Le sonde che sono in grado di caratterizzare il DNA genomico riferendosi ad un singolo locus informativo sono state inoltre sviluppate e vengono descritte nella domanda di brevetto europeo della richiedente, numero di pubblicazione 238329.
Un problema spesso associato con i metodi analitici delineati sopra e che comportano la preparazione di frammenti di DNA consiste nel fatto che non si pu? facilmente valutare oppure calcolare la misura della frammentazione del DNA campione senza una completa conoscenza di tutti i parametri relativi. Questi possono comprendere il potere del mezzo di frammentazione per esempio la concentrazione di enzima, la concentrazione del campione di DNA, la concentrazione della sostanza tampone e la temperatura. Pertanto spesso ? necessario lasciar trascorrere un lungo periodo di tempo prima d1 poter ammettere una frammentazione del DNA completa oppure sufficiente. Tali ritardi comportano un certo grado di inefficienza in particolare quando si devono effettuare molte prove analitiche. Inoltre ? desiderabile che tutti i frammenti di DNA informativi, per esempio tutti i frammenti di DNA risultanti dalla digestione completa del DNA-campione con uno o pi? enzimi di restrizione, vengano prodotti prima della caratterizzazione in modo da potere ottenere la massima informazione che si pu? ottenere dai frammenti, per esempio la loro dimensione e/o la loro composizione.
La presente invenzione si basa sulla scoperta che certi loci informativi in DNA genomico, utili per esempio in metodi d1 caratterizzazione genetica, sono anche associati con regioni del DNA resistenti alla frammentazione. L'identificazione di frammenti contenenti tali loci pertanto pu? venire adottata per ottenere un controllo di frammentazione.del DNA in metodi analitici.
Pertanto secondo una caratteristica della presente invenzione la richiedente mette a disposizione un procedimento per valutare la frammentazione di DNA-campione che consiste nel mettere in evidenza la presenza di un frammento di controllo formatosi, durante la scissione del DNA-campione dopo la formazione di uno o pi? dei frammenti di DNA da caratterizzare .
La frammentazione di DNA-campione viene effettuata adottando qualsiasi metodo di scissione opportuno come per esempio un trattamento con ultrasuoni oppure mezzi chimici ma preferibilmente essa viene effettuata impiegando uno o pi? enzimi. Cos? le espressioni "frammentazione di DNA-campione" e "scissione di DNA-campione vengon usate come sinonimi. Esempi di enzimi adatti da usare nella presente invenzione comprendono enzimi di restrizione come endonucleasi di restrizione. Si ? trovato che il metodo della presente invenzione ? particolarmente utile come controllo di digestione quando si usa l'enzima di restrizione Hinf I.
Una frammentazione del DNA completa non ? essenziale per la realizzazione dell'invenzione. E1 soltanto necessario che il frammento di controllo del DNA venga formato dopo i frammenti da caratterizzare. Il frammento di controllo pertanto pu? venire selezionato in modo da rivelare qualsiasi grado desiderato di frammentazione come per esempio una frammentazione che arriva fino a 50%, fino a 60%, fino a 70% fino as 80% oppure fino a 90%. Tuttavia, opportunamente il frammento di controllo viene scelto in modo che il frammento di controllo indichi una frammentazione del DNA-campione completa. Il campione di DNA ? opportunamente DNA genomico, come per esempio DNA umano.
Un frammento di controllo pu? avere qualsiasi dimensione opportuna oppure qualsiasi composizione opportuna a condizione che esso sia presente entro un locus resistente alla frammentazione. Si deve intendere che l'espressione "locus resistente alla frammentazione" si riferisce ad un locus pi? resistente alla frammentazione rispetto a uno o pi? loci che contengono frammenti di DNA da caratterizzare. Un frammento di controllo per esempio, pu? venire identificato mediante scissione del DNA, per esempio impiegando enzimi di restrizione e controllando la formazione di frammenti di DNA. I frammenti che comprendono un locus resistente alla frammentazione scompar iranno soltanto successivamente nel processo di frammentazione per cui si former? un opportuno frammento di controllo (frammenti di controllo). La comparsa di un frammento di controllo pu? venire messa in evidenza mediante qualsiasi metodo opportuno per la rivelazione di frammenti di DNA. Una volta che si ? identificato un frammento di controllo, non ? necessario controllare in modo costante il processo di frammentazione del DNA. Opportunamente si valuta un sufficiente grado d1 frammentazione basandosi su osservazioni empiriche e il frammento di controllo viene quindi usato per confermare la validit? della valutazione.
Si ritiene che il metodo della presente invenzione sia utile in qualsiasi situazione in cui la misura della frammentazione del DNA-campione richiede una valutazione, per esempio quando i frammenti di DNA-campione vengono caratterizzati a seconda delle loro dimensioni e/o della loro composizione. Il procedimento ? particolarmente utile in metodi di caratterizzazione genetica.
E' gi? stato dimostrato che in metodi di caratterizzazione genetica si possono usare regioni mi ni satei 1 i ti o loci i pervari abi 1 i in DNA genomico. Nel brevetto UK N? 2166445 (Lister Institute of Preventive Medicine) vengono descritti metodi e sonde per caratteri zzare DNA genomico riferendosi a pi? di una regione mi ni satei 1 i te o locus ipervariabile. Inoltre la domanda di brevetto europeo della richiedente, numero di pubblicazione 238329 descrive metodi e sonde per caratterizzare DNA genomico riferendosi a singole regioni mi ni satei 11 ti o loci 1 pervari abi 11.
Il procedimento della presente Invenzione ? parti col armente utile quando il DNA genomico di campione viene caratterizzato impiegando sonde per regioni mini satei 1 iti o loci i pervari abi 1 i . La realizzazione di un controllo della frammentazione consente un grado ancora maggiore di certezza quando si interpretano i risultati, per esempio in casi di paternit? e in casi giudiziari.
Opportune sonde mi ni satei 1 i ti comprendono le sonde multilocus 33,6 e 33,15 rivendicate nel brevetto UK N? 2166445 (Li ster Institute of Preventive Medicine) e le sonde per singoli loci p Lambda g3, MSI, MS8 , MS31, MS 32 e MS43 rivendicate nella domanda di brevetto europeo della richiedente numero di pubblicazione 238329.
La rivelazione di un frammento di controllo viene effettuata opportunamente impiegando polinucleotidi oppure sonde costituite da poi i nucl eoti di in grado di ibridazione verso il frammento di controllo. Quando il frammento di controllo comprende una regione mi ni satei 1 i te o locus 1 pervari abi 1 e il poi i nucl eoti de oppure la sonda poi i nucl eoti ca opportunamente si ibridizza verso detta regione o detto 1 ocus .
Il frammento di controllo pref eri bi Imente viene identificato analizzando con una sonda frammenti di ONA-campione con una sonda m1 ni satei 1 i te per mettere in evidenza una singola regione mi ni sate 11 1 te o singolo locus i pervari abi 1 e . I termini "regione minisatellite" e ?locus i pervari abi 1 e" vengono usati come sinonimi. La sonda mi ni satei 1 i te pu? venire considerata come una sonda di controllo. Ci? consente la formazione di un frammento di controllo da controllare pi? facilmente poich? per esempio i filtri di ibridazione vengono facilmente di nuovo analizzati con la sonda di controllo.
Si possono usare poi i nucleotidi di DNA, RNA e di qualsiasi altro tipo che ? in grado di ibridi zzare verso il DNA. I poi i nucl eti di sono non marcati e possono essere nella forma a doppio filamento (df) oppure nella forma a singolo filamento (ss). In generale almeno la sequenza nucleotidica del polinucleotlde sar? sotto forma di singolo filamento, per? preferibi1mente la sonda comprender? il polinucleotide completamente nella forma a singolo filamento. Poiinucleotidi da usare nel procedimento della presente invenzione vengono preparati opportunamente mediante riproduzione microbiologica di un materiale clonato oppure mediante sintesi diretta.
Sonde poiinucleotidiche possono venire ottenute marcando poiinucleotidi. Poiinucleotidi marcati in una forma a singolo filamento possono venire usati come sonde e anche loro precursori marcati dai quali si possono produrre sonde a singolo filamento. Le sonde poiinucleotidiche usate nella presente invenzione preferibilmente sono radio marcate, per esemplo con P o con S, per esempio in qualsiasi modo opportuno. Le sonde possono venire marcate in modo alternativo mediante metodi non radioattivi ben noti nel settore della ibridazione, per esempio con gruppi fluorescenti oppure essi possono venire marcati con biotina oppure con loro derivati.
Si noter? che quando s1 usano poiinucleotidi oppure sonde poiinuc1eotid1che in grado di ibridazione verso loci polimorfici oppure 1pervariabi1i e si usano enzimi di restrizione per scindere il DNA-campione allora ? desiderabile che la combinazione sonda/enzima scelta sia tale che la scissione enzimatica del DNA non interferisca con la ibridazione sonda/frammento.
Si ? osservata una resistenza alla digestione in posizione adiacente alla regione del minisatellite denominata MS51. Questa influisce prevalentemente sulla scissione con endonucleasi di restrizione Hinf I adiacente a questo minisatei1ite. Mentre la richiedente non desidera essere legata da considerazioni teoriche, si ritiene che la resistenza alla frammentazione per esempio una resistenza alla digestione, possa derivare da cambiamenti nella struttura terziaria del DNA. Queste strutture alternative possono venire provocate per esempio da una particolare sequenza di nucleotidi a causa di condizioni ambientali (pH forza ionica) oppure a causa di Interazioni a largo raggio. Le propriet? di tali strutture alternative sono state esaminate da R.D. Wells and S.C. Harvey in "Unusual DNA Structures" (1988, Springer Verlag). Cambiamenti nella struttura terziaria possono Influire per esempio sulla capacit? di un enzima di restrizione a riconoscere un sito di legame di un acido nucleico e/o sulla sua capacit? a scindere l'acido nucleico. Sequente nucleotidiche interessanti comprendono quelle che sono coinvolte per esempio nella ibridazione intra-filamento e in un particolare non-accoppi amento di Watson Crick. Tali sequenze di nucleotidi per esempio possono essere ricche in G. Il termine "ricche in G" si pu? riferire per esempio a sequenze nuc 1 eoti di che che comprendono almeno 50%, almeno 60%, almeno 70%, almeno 80% oppure almeno 90% di residui di guanina. Tali cambiamenti della struttura terziaria vengono Illustrati opportunamente nella relazione di V.I. Lyamichev et al 1n Nature, 339, (1989), 634-637. Un ulteriore possibile cambiamento di struttura pu? comportare la formazione d1 tripli filamenti, per esempio omopiridina acido nucleico. Ci? viene Illustrato opportunamente nella relazione di P. Rajagopal et al in Nature, 339, (1989), 637-640.
I frammenti che comprendono il mi ni satei 1 i te MS51 e 1n particolare i frammenti Hinf I pertanto possono essere utili come frammenti di controllo nel metodo della presente invenzione. Naturalmente si dovr? comprendere che il mi ni satei 1 i te MS 51 ? utile non soltanto nella valutazione di una frammentazione di DNA-campione ma inoltre per esempio come una sonda di ?ocus singolo in metodi di caratterizzazione genetica per esempio come descritti nella domanda di brevetto europeo della richiedente, numero di pubblicazione 238329.
Il mi ni satei 11 te MS51 ? identificabile in modo specifico per mezzo della sequenza nucleotidica denominata qui di seguito come pMS51 ossia 51 -ACATGGCAGG { AGGGCAGG ) TGGAGGG-3 ' in cui n = 1 oppure 2 e le sue ripetizioni in doppio. Pu? essere presente un qualsiasi numero opportuno di ripetizi onl .
Pertanto in un ulteriore aspetto della presente invenzione la richiedente mette a disposizione un poli nucleotlde che 1br1dizza selettivamente verso un frammento di DNA-camp1one identificabile in modo specifico dalla sequenza nucleotidica 5'-ACATGGCAGG(AGGGCAGG)nTGGAGGG-3l in cui n = l oppure 2 e dalle sue ripetizioni 1n doppio. Il frammento di ONA-campione opportunamente deriva dalla scissione con enzima d1 restrizione, per esempio scissione con Hinf I, di DNA-campi one . Si noter? che le ripetizioni a tandem non sono necessariamente ripetizioni perfette della determinata sequenza a condizione che sia presente un ragionevole grado di omologia della sequenza .
In un aspetto preferito della presente invenzione si mette a disposizione un poi i nucl eoti de che comprende la sequenza nucleotidica data direttamente sopra e sue ripetizioni a tandem e sequenze complementari a queste oppure una qualsiasi loro parte opportuna per esempio di almeno 6, almeno 8 o preferibilmente almeno 10 nucleotidi. Il polinucleotide pi? preferibilmente comprende la sequenza nucleotidica riportata sopra e qualsiasi opportuno numero di sue ripetizioni.
L'invenzione riguarda inoltre sonde che comprendono opportunamente uno qualsiasi dei pollnucleotidi di cui sopra insieme con un componente di marcatura per facilitare la loro rivelazione.
La presente invenzione riguarda anche un corredo per il controllo della frammentazione per mettere in evidenza un frammento di controllo. Il corredo comprende opportunamente una sonda minisatellite, che ibridizza selettivamente verso un frammento di controllo formatosi durante una digestione del DNA-campione con Hinf I dopo la formazione di uno o pi? frammenti di DNA da caratteri zzare . Nel corredo ? presente anche almeno uno dei seguenti articoli : sostanza tampone adatta, confezione e istruzioni per l 'uso. Se richiesto, che il corredo comprende anche l'enzima di restrizione Hinf I.
In un aspetto preferito della presente invenzione il corredo di controllo comprende una sonda poiinucleotidica che ibridizza selettivamente verso un frammento di ONA-campione identificabile in modo specifico per mezzo della sequenza nucleotidica 5 '-ACATGGCAGG(AGGGCAGG)^TGGAGGG-3' in cui n=l oppure 2 e sue ripetizioni a tandem. Il frammento di DNA--campione opportunamente deriva da una scissione con enzima di restrizione, per esempio una scissione con Hinf I, di DNA-campione.
In un aspetto pi? preferito della presente invenzione il corredo di controllo comprende una sonda poiinucleotidica che comprende la sequenza nucleotidica riportata qui sopra e sue ripetizioni a tandem e sequenze complementari a queste. Il mezzo per la frammentazione del DNA-campione preferibilmente ? un enzima di restrizione e pi? preferibilmente Hinf I.
L'invenzione verr? ora illustrata ma non limitata riferendosi alle figure e all'esempio che seguono e in cui:
la figura 1 mostra i risultati di una digestione parziale di un campione di ONA genomico. Il campione ? stato sottoposto a digestione rispettivamente per 20 minuti, 40 minuti 60 minuti, 2 ore, 4 ore e 24 ore .
Le bande mostrano chiaramente come l 'impronta del DNA cambi con il passare del tempo.
La figura 2 mostra i risultati di una analisi con sonda del medesimo campione di DNA con pMS51. Le bande mostrano chiaramente la resistenza di alleli MS51 nei confronti di una digestione e il modello di cambiamento delle bande.
La figura 3 mostra i risultati di una analisi con sonda del medesimo campione di DNA con la sonda p lambda g3. Si pud vedere che gli alleli g3 non mostrano un qualsiasi grado apprezzabile di resistenza alla frammentazione e che le bande si stabilizzano rapidamente. Si deve notare che impiegando questo campione ? visibile soltanto un allele.
La figura 4 mostra la disposizione dei siti di restrizione Eco RI, Hind III, Hinf I, Pst I e Sau 3A adiacenti al locus del mi ni satei 1 i te MS51.
Negli esempi che seguono si sono effettuati l 'isolamento del DNA, la digestione con enzima di restrizione, la el ettrof oresi .e la macchiatura di Southern nel modo seguente:
Isolamento del DNA
Si ? isolato il DNA da sangue intero di un donatore umano (AFM 16). I globuli bianchi sono stati separati da 20 mi di sangue e sono stati lavati una volta in lxSSC (20xSSC ? 3,0M NaCl/0,3M tri-sodio citrato ) .
Le cellule sono quindi state sottoposte a lisi in 3,75 mi di acetato di sodio 0,2 M pH 7,0, 100 m1crol1tr1 d1 proteinasi-K da 1 mg/ml ( Boehr i nger-da Tritirachium album), 250 ul di SOS al 10% a 56?C per 3 ore. Il Usato ? stato quindi estratto con fenolo/cloroformio (25 parti di fenolo: 24 parti di cloroformio: 1 parte di alcol isoamilico) e una volta con cloroformio (24 parti di cloroformio: una parte di alcol isoamilico).
Il DNA ? stato svoltolato dopo aggiunta di 2 volumi di etanolo al 100% ed ? stato risolvatato in acetato di sodio 0,2 M. E1 stato quindi fatto precipitare con etanolo al 100% ed ? stato lavato 1n etanolo all'80%, quindi ? stato essiccato. Alla fine il DNA ? stato completamente risolvatato in tampone 10 mM Tris pH8/ ImM EDTA.
Digestione con enzima di restrizione
La concentrazione del DNA ? stata valutata mediante fluorimetria su una porzione d1 DNA-campione digerito con HinfI impiegando un fluorlmetro Hoeffer T120-1Q0 DNA. 30 ug di DNA di peso molecolare elevato estratto dal sangue AFM16 ? stato fatto digerire in un volume di 140 ul con enzima Hinfl (fornito dalla BC1) in concentrazione di 20 unit?/ul). Si sono usate 140 unit? di enzima Hinfl e si ? effettuata l'incubazione a 37?C mescolando a intervalli di 10 minuti per la prima ora di 1 ncubazi one .
Porzioni da 20 ul sono state prelevate in 1 ul di 100 mM EOTA pH8 e sono state congelate ad una temperatura di -20?C dopo 20, 40 e 60 minuti e anche dopo 2, 3, 4, e 24 ore.
Elettroforesi
Un gel d1 agarosio al 0,72 20 cm x 25 cm (Slgma-Low ??0 Type I) ? stato preparato 1n un tampone per elettroforesi lxTBE (134mM Tris, 74,9mM H^BO^, 2,5mM Na^EOTA pH8. I campioni di DNA digeriti con Hinfl sono stati caricati sul gel insieme con marcatori del peso molecolare e con 0,5 ug di DNA-plasmide pBR322 (Anglian Biotechnol ogy , 2mg/ml ) sottoposto a digestione con enzima di restrizione BglI (fornito dalla Anglian Biotechnology a 10 unit?/ul). Attraverso il gel di agarosio si ? applicato un voltaggio costante di 75 volt e si ? lasciato muovere il marcatore di peso molecolare 2,3 k?lobas? ottenuto dal pBR322 BglI DNA di 18,5 cm dal punto di origine.
Macchiatura di Southern
Il gel ? stato depurinato in HC1 0,25 M per ?5 minuti, ? stato denaturato in NaOH 0,5 M/NaCl 1,5 M per 30 minuti ed ? stato neutralizzato in tris 0,5 M pH 7,5, NaCI 3,0 M per 30 minuti. Il DNA ? stato trasferito in hybond-N (Amersham) mediante macchiatura di Southern ed ? stato fissato mediante irradiazione UV.
ESEMPIO 1
Marcatura e ibridazione della sonda
8o ng di sonda 33,15 (preparata secondo i metodi descritti nel brevetto UK 2166445) sono stati 32
marcati con alfa P dGTP (DuPont-3000 Ci/mMoli in tricina lOmM) mediante estensione con innesco.
SI aggiungono 36 ul di tampone B a 24 ul di tampone 33,15 e si fa bollire per 5 minuti, quindi si raffredda su ghiaccio per 10 minuti. Si sono quindi aggiunti 16 ul di tampone C insieme con 20 ul 32
di alfa P dGTP e 4ul di enzima di Klenow (qualit? di sequenza BCL-5 unit?/ul). La reazione ? stata fatta incubare a temperatura ambiente per 3 ore, questa ? una sonda sufficiente per una camera di ibridazione (una scatola sigillabile perspex da 21 cm x 21 cm).
Una colonna NICK (Parmacia-Sephadex G-50 column) viene equilibrata con 10 mi di tampone per colonna (tris 20mM pH 7,5, NaCl 20mM, EDTA 2mM SDS al 0,25%). La miscela di reazione della sonda viene fatta passare attraverso la colonna, quindi si aggiuntono 0,4 mi di tampone per colonna e si lascia scorrere scartandolo, si aggiungono una seconda volta 0,4 mi di tampone per colonna e questo viene raccolto e viene usato come sonda purificata. Il filtro hybond-N viene umidificato in IxSSC e viene pre-ibridizzato in 1x Denhardts (0,2% di BSA (Sigma frazione V), 0,2% di Ficoll 400, 0,2% di po11v1n11 pirrolidone (peso molecolare medio di 40000, IxSSC) per 60 minuti a 62?C.
0,5 mi di DNA di placenta umana tagliata a 1 mg/ml (tagliata in idrossido di sodio 0,3 M, EDTA 20 raM a 100?C per 5 minuti e quindi neutralizzata con HC1) vengono aggiunti alla sonda da usare per la camera di ibridazione e si fa bollire per 7 minuti, quindi si raffredda su ghiaccio per 10 minuti. La sonda viene aggiunta a 160 mi di CHFM (6% di poiietilenglicol 6000 (Ix Denhardts, 0,1% di SDS, 6% di poiietilenglicol 6000) in una camera di preibridazione. Il filtro viene trasferito dalla soluzione di preibridazione e viene fatto incubare a 62?C per 16 ore agitando blandamente. Il filtro viene lavato in 400 mi di lxSSC, 25ug/ml di DNA di sperma di aringa (Sigma), 0,1% di SOS a 62?C per 30 minuti, il lavaggio viene ripetuto 4 volte. Si lava quindi in 3xSSC e si essicca all ?aria per breve tempo prima di avvolgerlo in "saran wrap". Esso viene quindi posto in una cassetta a prova di luce con un filtro rinforzante Curix MR 800 (Agfa) e viene esposto ad una pellicole sensibile ai raggi X per 10 giorni a -70?C .
Tampone B: 44 ul di tampone A ( 1 , 21 M Tris pH8,0, 0.12M Mg C 12 , 0.25M 2-mercaptoetanol o ) , 110 ul d1 Hepes 2M pH 6,6, 242 u 1 di MilliQ ^0 (Millipore-sistema acquoso di qualit? reagente) diviso in porzioni e conservato a -20oC.
Tampone 33,1 5: 20 ul di Diag 25 7,7 um (oligonucleotidi preparati su misura), 4 ul di inserto 33,15 da 20 ng/ml
Tampone C: 44 ul ImM dATP, 44 ul ImM dCTP, 44 ul ImM TTP e 44ul di BSA da 10 mg/ml diviso in porzioni e conservato a -20?C (dATP, dCTP, TTP -Pharmacia soluzioni 100 mM).
ESEMPIO 2
Marcatura della sonda e ibridazione
20ng della sonda MS51 (la cui sequenza di Inserzione viene delineata in questa descrizione) sono stati marcati mediante innesco di oligonucleotidi casuale (Feinberg and Vogelstein, 1984, Anal . Biochem, 137, pag. 266-267). La sonda ? stata fatta bollire per 5 minuti e quindi ? stata raffreddata su ghiaccio per 10 minuti. 10 ul di tampone oligomarcante ? stato aggiunto insieme con 4ul di albumina 32 di siero bovino da 5mg/ml (BRL), 7ul di alfa P dGTP (DuPont) e 2ul di enzima Klenow (qualit? di analisi di sequenza Boehringer a 5 unit?/ul). Il volume di reazione viene portato a 50 ul aggiungendo MilliQ H^O, si mescola e si fa incubare a temperatura ambiente per 3 ore. La sonda viene purificata attraverso una colonna NICK come descritto nell'esempio 1 di cui sopra. Il filtro hybond-N ? stato privato della sonda 33,15 dell'esempio 1 lavandolo in idrossido di sodio 0,4 m a 45?C per 30 minuti, quindi ? stato neutralizzato in O.lxSSC, O.lxSDS 0,2 M Tris pH 7,5 per 30 minuti a 45?C.
Il filtro ? stato quindi lavato in lxSSC ed ? stato sottoposto a pre-i bridazione a 65?C per 20 minuti in albumina di siero bovino allo 0,1% (Bethesda Research Laboratories -qualit? di enzima di acido nucleico), EDTA ImM, 7% di SDS, pirofosfato sodico 0,5M ph 7,2 /Church and Gilbert, 1984, P.N.A.S., USA, 81, Pagine 1991-1995/.
La sonda purificata ? stata fatta bollire per 5 minuti con 0,5 mi di DNA di placenta umana tagliato a lmg/ml, quindi ? stata raffreddata su ghiaccio per 10 minuti ed ? stata aggiunta a 160 mi di IxSSC, 6% di poiieti1englicol 6000. Il filtro ? stato quindi trasferito dalla soluzione di ibridazione ed ? stato fatto incubare a 65?C per 16 ore. Dopo ibridazione, i filtri sono stati lavati a 65?C in fosfato sodico 40 mM, 0,1% di SDS (pH 7,2) per 15 minuti dopo di che si sono effettuati 2 lavaggi da 15 minuti a 65?C in 0,5xSSC, 0,01% di SDS e alla fine 2 lavaggi da 15 minuti a 65?C 1n 0,2 x SSC, 0,01% d1 SDS. Il filtro ? stato quindi risciaquato in 3xSSC, ? stato essiccato all'aria per breve tempo ed ? stato avvolto 1n "saran wrap" per la autoradiografia come descritto nell'esempio 1 ma con esposizione da 1-2 giorni.
ESEMPIO 3
I materiali ed i metodi erano esattamente come descritti nell'esempio 2 tranne che al posto di pMS51 si ? usata la sonda p lambda g3 (preparata secondo i metodi descritti nella domanda d1 brevetto europeo, Numero di pubblicazione 238329). La sequenza di p lambda g3 ? AGGAAATAGAAGGCGGGYGGTGTGGGCAGGGAGRGGC (in cui Y ? C, T o U, R ? A o G e T ? T o U) e sue ripetizioni a tandem.
Claims (12)
- RIVENDICAZIONI 1. Un procedimento per ?a valutazione di una frammentazione di DNA-campione che consiste nel mettere in evidenza la presenza di un frammento di controllo formato, durante la scissione del DNA ^campione, dopo la formazione di uno oppure pi? dei frammenti di DNA da caratteri zzare .
- 2. Un procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1 in cui il DNA-campione viene frammentato mediante digestione enzimatica.
- 3. Un procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1 oppure nella rivendicazione 2 in cui il frammento di controllo indica una f rammentazione completa del DNA-campione.
- 4. Un procedimento come rivendicato in un qualsiasi delle ri vendi cazi oni 1-3 in cui il frammento di controllo viene messo in evidenza impiegando una sonda mi ni satei 1 i te .
- 5. Un procedimento come rivendicato nella rivendicazione 4 in cui la sonda minisatellite viene usata per mettere in evidenza una singola regione mi ni satei 1 i te o singolo locus i pervarl abi 1 e .
- 6. Un procedimento come rivendicato nella rivendicazione 5 in cui la sonda mi ni satei 1 i te ibridizza selettivamente verso un frammento di DNA-campione identificabile in modo specifico dalla sequenza di nucleotidi 5 ' -ACATGGCAGG { AGGGCAGG)nTGGAGGG-3 ' in cui n=l oppure 2 e sue ripetizioni a tandem.
- 7. Un procedimento come rivendicato in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6 in cui si usa l 'enzima di restrizione Hinf I per scindere 11 DNA-campione.
- 8. Un polinucleotide che ibridizza selettivamente verso un frammento di DNA-campione identificabile in modo specifico mediante la sequenza di nucleotidi 5 ' -ACATGGCAGG( AGGGCAGG) TGGAGGG-31 in cui n?l oppure 2 e sue ripetizioni a tandem.
- 9. Un polinucleotide come rivendicato nella rivendicazione 8 insieme con un componente marcatore .
- 10. Una sonda poi 1 nucl eoti di ca che comprende la sequenza di nucleotidi 51 -ACATGGCAGG ( AGGGCAGG ) TGGAGGG-31 in cui n= 1 oppure 2 e sue ripetizioni a tandem.
- 11. Un corredo di controllo che comprende una sonda mi ni satei 1 i te che ibridizza selettivamente verso un frammento di controllo formatosi durante una digestione di un DNA-campione con Hinf I dopo la formazione di uno o pi? frammenti di DNA da caratterizzare e almeno una delle seguenti caratteristiche: sostanza-tampone, confezionz e istruzioni per 1'uso.
- 12. Un corredo di controllo come rivendicato nella rivendicazione 11 in cui la sonda minisatei1ite comprende la sequenza di nucleotidi 5'-ACATGGCAGG(AGGGCAGG)^TGGAGGG-3' in cui n=l oppure 2 e sue ripetizioni a tandem.
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| GB888824531A GB8824531D0 (en) | 1988-10-20 | 1988-10-20 | Polynucleotide probes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
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ID=10645480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Also Published As
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 0001 | Granted |