FR2638171A1 - Procede d'evaluation de fragmentation d'adn, sondes polynucleotidiques et kits pour sa mise en oeuvre - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'évaluation de la fragmentation d'un échantillon d'ADN, par détection de la présence ou de l'absence d'un fragment-témoin formé, pendant le clivage de cet ADN, après formation d'un ou plusieurs des fragments d'ADN à caractériser. Des polynucléotides et sondes polynucléotidiques, ainsi que des kits de contrôle les contenant, permettent d'effectuer cette évaluation. Application : procédé perfectionné pour le contrôle de la digestion en caractérisation génétique.

Description

La présente invention a pour Objet un procédé d'évaluation de la

fragmentation de l'ADN d'un échantillon,

ainsi que des polynucléotides et des sondes polynucléotidi-

ques destinés à être utilisés dans le procédé. Le procédé de la présente invention est en particulier utile comme contrôle de digestion dans des procédés de caractérisation génétique. Des procédés analytiques ont été élaborés pour étudier les dimensions et/ou la composition de fragments d'ADN. En particulier, il a été élaboré des procédés dans lesquels les fragments d'ADN sont rendus monocaténaires pour permettre l'hybridation à des sondes spécifiques d'un ou plusieurs loci génétiques. Les sondes sont marquées de manière convenable à des fins d'identification. Les hybrides sonde-fragment ainsi obtenus peuvent être détectés et caractérisés, par exemple suivant les dimensions, en

utilisant des techniques connues telles que l'électro-

phorèse sur gel. L'autoradiographie constitue un procédé convenable pour l'identification d'hybrides sonde-fragment

radiomarqués.

La fragmentation de l'ADN d'un échantillon est effectuée par différents procédés, comprenant le traitement par ultrasons et des moyens chimiques. Cependant, l'ADN de l'échantillon est couramment clivé par voie enzymatique,

par exemple par des enzymes ou endonucléases de restric-

tion. Les endonucléases de restriction sont capables de reconnaître des séquences nucléotidiques-cibles dans l'ADN et peuvent cliver l'ADN d'une manière prévisible en rapport avec la séquence-cible. En conséquence, ces endonucléases

peuvent servir d'outils analytiques utiles. La fragmenta-

tion enzymatique de l'ADN est souvent appelée digestion.

Le génome humain a déjà été étudié pour

identifier des loci génétiques portant des informations.

Un intérêt particulier a été porté aux loci polymorphes ou hypervariables. Le nombre total de ces loci est inconnu mais est vraisemblablement important. En effet, le génome humain pourrait contenir au moins 1500 de ces loci. Il a été montré que certains de ces loci sont utiles dans des procédés de caractérisation génétique. Dans le brevet du Royaume-Uni N 2 166 445 (Lister Institute of Preventive Medicine) sont décrites des sondes capables de caractériser 1'ADN génomique par référence à plus d'un locus génétique informatif. Des sondes qui sont capables de caractériser l'ADN génomique par référence à un seul locus informatif ont été également élaborées et sont décrites dans la demande de brevet européen de la Demanderesse publiée sous

le N 238 329.

Un problème souvent lié aux procédés analy-

tiques précités et faisant intervenir la préparation de fragments d'ADN est l'impossibilité d'évaluer ou estimer

aisément le degré de fragmentation de l'ADN d'un échantil-

lon sans une connaissance complète -de tous les paramètres concernés. Ces paramètres peuvent comprendre la puissance des moyens de fragmentation, par exemple la concentration en enzymes, la concentration de l'échantillon d'ADN, la concentration en tampon et la température. En conséquence, il est souvent nécessaire de laisser un temps long s'écouler avant qu'une fragmentation totale ou suffisante de l'ADN puisse avoir lieu. Ces délais introduisent un certain degré d'inefficacité, notamment lorsque de nombreux tests analytiques sont effectués. En outre, il est souhaitable que tous les fragments d'ADN informatifs, par exemple tous les fragments d'ADN résultant de la digestion totale de l'ADN de l'échantillon avec un ou plusieurs

enzymes de restriction, soient produits avant caractéri-

sation, de sorte que l'information maximale qui peut être

acquise à partir des fragments, par exemple leurs dimen-

sions et/ou leur composition, puisse être obtenue.

La présente invention est basée sur la découverte que certains loci informatifs dans l'ADN génomique, utiles par exemple dans des procédés de caractérisation génétique, sont également associés à des

régions d'ADN résistant à la fragmentation. L'identifica-

tion de fragments contenant ces loci peut donc être utilisée pour fournir un contrôle de fragmentation de l'ADN dans des procédés analytiques.

En conséquence, conformément à une caractéris-

tique de la présente invention, il est proposé un procédé pour évaluer la fragmentation de l'ADN d'un échantillon, qui consiste a détecter la présence d'un fragment-témoin formé, pendant le clivage de l'ADN de l'échantillon, après

formation d'un ou plusieurs des fragments d'ADN a carac-

tériser. La fragmentation de l'ADN d'un échantillon est effectuée par n'importe quels moyens de clivage convenables tels que, par exemple, un traitement par ultrasons ou des moyens chimiques, mais est de préférence effectuée en utilisant un ou plusieurs enzymes. Ainsi, les expressions "fragmentation de l'ADN d'un échantillon" et "clivage de

l'ADN d'un échantillon" sont utilisées à titre de syno-

nymes. Des exemples d'enzymes convenables pour l'utilisa-

tion dans la présente invention comprennent des enzymes de restriction tels que des endonucléases de restriction. Le procédé de la présente invention s'est révélé être particulièrement utile comme contrôle de digestion dans le

cas o l'enzyme de restriction Hinf I est utilisé.

Une fragmentation totale de l'ADN n'est pas

essentielle pour les performances de la présente invention.

Il est seulement nécessaire que le fragment d'ADN servant de témoin soit formé après les fragments à caractériser. En conséquence, le fragment témoin peut être choisi pour détecter n'importe quel degré désiré de fragmentation, tel que, par exemple, une fragmentation allant jusqu'à 50 %,

jusqu'à 60 %, jusqu'à 70 %, jusqu'à 80 % ou jusqu'à 90 %.

Cependant, de manière convenable, le fragment-témoin est choisi de manière qu'il indique une fragmentation totale de l'ADN de l'échantillon. L'ADN de l'échantillon est de manière convenable de l'ADN génomique, tel que, par

exemple, de l'ADN humain.

Un fragment-témoin peut avoir n'importe quelles dimensions ou n'importe quelle composition convenables, sous réserve qu'il soit présent à l'intérieur d'un locus

résistant à la fragmentation. Il est entendu que l'expres-

sion "locus résistant à la fragmentation" désigne un locus plus résistant à la fragmentation qu'un ou plusieurs loci

contenant les fragments d'ADN à caractériser. Un fragment-

témoin peut être identifié, par exemple, par clivage de l'ADN, par exemple au moyen d'enzymes de restriction, et contrôle de la formation des fragments d'ADN. Les fragments

comprenant un locus résistant à la fragmentation disparais-

sent seulement ultérieurement au cours de la mise en oeuvre du procédé de fragmentation, ce qui permet la formation

d'un ou plusieurs fragments-témoins convenables. L'appari-

tion d'un fragment-témoin peut être détectée par n'importe quel moyen convenable pour la détection des fragments d'ADN. Une fois un fragmenttémoin identifié, il n'est pas

nécessaire de contrôler constamment le procédé de-fragmen-

tation d'ADN. De manière convenable, un degré suffisant de fragmentation est estimé sur la base d'observations empiriques et le fragment-témoin est ensuite utilisé pour

confirmer la validité de l'estimation.

Le procédé de la présente invention est considéré comme étant utile dans n'importe quel cas o le degré de fragmentation de l'ADN d'un échantillon nécessite une évaluation, par exemple dans le cas o les fragments d'ADN de l'échantillon sont caractérisés suivant leurs

dimensions et/ou leur composition. Le procédé est par-

ticulièrement utile dans des procédés de caractérisation génétique. Il a été déjà démontré que des régions minisatellites ou des loci hypervariables dans l'ADN génomique peuvent être utilisés dans des procédés de caractérisation génétique. Dans le brevet du Royaume-Uni Ne 2 166 445 (Lister Institute of Preventive Medicine) sont décrits des procédés et des sondes pour la caractérisation d'ADN génomique par référence à plus d'une région mini- satellite ou locus hypervariable. En outre, la demande de brevet européen de la Demanderesse publiée sous le NI 238 329 décrit des procédés et des sondes pour la caractérisation de l'ADN génomique par référence à des

régions minisatellites ou loci hypervariables distincts.

Le procédé de la présente invention est particulièrement utile lorsque l'ADN génomique d'un échantillon est caractérisé en utilisant des sondes pour

des régions minisatellites ou loci hypervariables.

L'obtention d'un témoin de fragmentation permet un degré encore plus grand de certitude lors de l'interprétation des résultats, par exemple dans des cas de paternité et des cas judiciaires.

Des sondes minisatellites convenables compren-

nent les sondes multiloci 33,6 et 33,15 revendiquées dans le brevet du Royaume-Uni N 2 166 445 (Lister Institute of Preventive Medicine) et les sondes à un seul locus p lambda g3, MSl, MS8, MS31, MS32 et MS43 revendiquées dans la demande de brevet européen de la Demanderesse, publiée sous

la Ne 238 329.

La détection d'un fragment-témoin est effectuée convenablement en utilisant des polynucléotides ou des sondes polynucléotidiques capables d'hybridation au fragment-témoin. Lorsque le fragment-témoin comprend une région minisatellite ou un locus hypervariable, le polynucléotide ou la sonde polynucléotidique s'hybride de

manière convenable à ladite région ou audit locus.

Le fragment-témoin est de préférence identifié par sondage de fragments d'ADN d'un échantillon avec une sonde minisatellite - pour détecter une seule région

minisatellite ou un seul locus hypervariable. Les expres-

sions "région minisatellite" et "locus hypervariable" sont utilisées à titre de synonymes. La sonde minisatellite peut être considérée comme étant une sonde-témoin. Cela permet de contrôler plus aisément la formation d'un fragment- témoin puisque, par exemple, des filtres d'hybridation sont

aisément soumis à un nouveau sondage avec la sonde-témoin.

Des polynucléotides d'ADN, d'ARN et de n'importe quel autre type hybridable à 1'ADN peuvent être utilisés. Les polynucléotides sont non marqués et peuvent

être sous forme bicaténaire (bc) ou sous forme monocaté-

naire (mc). En général, au moins la séquence nucléotidique du polynucléotide est sous forme monocaténaire mais, de préférence, la sonde comprend le polynucléotide totalement sous forme monocaténaire. Des polynucléotides destinés à être utilisés dans le procédé de la présente invention sont préparés convenablement par reproduction microbiologique

d'un matériel cloné ou bien par synthèse directe.

Des sondes polynucléotidiques peuvent être obtenues par marquage ou repérage de polynucléotides. Des polynucléotides marqués sous forme mc peuvent être utilisés comme sondes ainsi que leurs précurseurs marqués, à partir desquels des sondes mc peuvent être produites. Les sondes polynucléotidiques utilisées dans la présente invention sont de préférence radiomarquees, par exemple avec le 32p ou avec le 35S, par exemple de n'importe quelle manière convenable. En variante, les sondes peuvent être marquées par des moyens non radioactifs bien connus dans la pratique

de l'hybridation, par exemple avec des groupes fluores-

cents, ou bien elles peuvent être marquées avec la biotine ou ses dérivés. On notera que, lorsque des polynucléotides ou des sondes polynucléotidiques capables d'hybridation à des loci polymorphes ou hypervariables sont utilisés et des enzymes de restriction sont utilisés pour cliver l'ADN de l'échantillon,.il est alors souhaitable que l'association sonde/enzyme choisie soit telle qu'un clivage enzymatique

de l'ADN n'interfère pas avec l'hybridation sonde/fragment.

Une résistance à la digestion a été observée en

position adjacente à la région minisatellite appelée MS51.

Cela influence principalement le clivage par l'endonucléase de restriction Hinf I adjacent à ce minisatellite. Sans souhaiter être lié à des considérations théoriques, il est considéré que la résistance à la fragmentation, par exemple

la résistance à la digestion, peut résulter de modifica-

tions dans la structure tertiaire de l'ADN. Ces autres structures peuvent être provoquées, par exemple, par une séquence particulière de nucléotides, par des conditions de milieu (pH, force ionique) ou par des interactions à longue distance. Les propriétés de ces autres structures ont été passées en revue par R.D. Wells et S.C. Harvey dans "'Unusual DNA Structures" (1988, Springer Verlag). Des modifications de la structure tertiaire peuvent avoir une influence sur l'aptitude, par exemple, d'un enzyme de restriction à reconnaître un site de liaison d'un acide

nucléique et/ou son aptitude à cliver l'acide nucléique.

Les séquences nucléotidiques intéressantes comprennent celles qui sont impliquées, par exemple, dans l'hybridation intracaténaire et, en particulier, dans un appariement non conforme à Watson et Crick. Ces séquences nucléotidiques peuvent être, par exemple, riches en G. L'expression "riche

en G" peut désigner, par exemple, des séquences nucléotidi-

ques qui comprennent au moins 50 %, au moins 60 %, au moins

%, au moins 80 % ou au moins 90 % de résidus guanine.

Ces modifications de la structure tertiaire sont conve-

nablement illustrées dans l'article de V.I. Lyamichev et collaborateurs dans Nature, 339, (1989), 634-637. Une autre modification possible de structure peut faire intervenir la formation de triples brins, par exemple d'un acide homopyrimidine-nucléique. Cela est illustré de manière convenable dans l'article de P. Rajagopal et collaborateurs

dans Nature, 339, (1989), 637-640.

Des fragments qui comprennent le minisatellite MS51 et, en particulier, des fragments Hinf I, peuvent donc être utiles comme fragments-témoins dans le procédé de la présente invention. Bien entendu, on notera que le

minisatellite MS51 est non seulement utile dans l'évalua-

tion de la fragmentation de l'ADN d'un échantillon mais également, par exemple, comme sonde à un seul locus dans des procédés de caractérisation génétique, par exemple de la manière décrite dans la demande de brevet européen

publiée sous le N 238 329.

Le minisatellite MS51 est identifiable

spécifiquement par la séquence nucléotidique désfgnée ci-

après sous le nom de pMS51, à savoir 5'-ACATGGCAGG(AGGGCAGG)nTGGAGGG-3', dans laquelle n est égal à 1 ou 2, et ses motifs répétés en tandem. N'importe

quel nombre convenable de motifs répétés peut être présent.

En conséquence, dans un autre aspect de la présente invention, il est proposé un polynucléotide qui

s'hybride sélectivement à un fragment d'ADN d'un échantil-

lon identifiable spécifiquement par la séquence nucléoti-

dique 5'-ACATGGCAGG(AGGGCAGG)nTGGAGGG-3', dans laquelle n est égal à 1 ou 2 et ses motifs répétés en tandem. Le fragment d'ADN de l'échantillon est obtenu convenablement par clivage avec un enzyme de restriction, par exemple par clivage avec Hinf I, de l'ADN de l'échantillon. On notera

que les motifs répétés en tandem ne sont pas obligatoire-

ment des motifs répétés parfaits de la séquence donnée, sous réserve qu'un degré raisonnable d'homologie des

séquences soit présent.

Dans un aspect apprécié de la présente invention, il est proposé un polynucléotide quai comprend la séquence nucléotidique précitée et ses motifs répétés en tandem, ainsi que des séquences complémentaires à cette séquence ou n'importe quelle partie convenable de cette séquence, par exemple d'au moins 6, d'au moins 8 ou, de préférence, d'au moins 10 nucleotides. Le polynucléotide comprend de préférence la séquence nucléotidique précitée et n'importe quel nombre convenable de motifs répétés de cette séquence. La présente invention concerne également des sondes qui comprennent de manière convenable n'importe lequel des polynucléotides précités, en association avec un constituant servant de marqueur ou d'indicateur destiné à

faciliter leur détection.

La présente invention concerne également un kit de contrôle de fragmentation destiné à la détection d'un fragment-témoin. Le kit comprend convenablement une sonde

minisatellite, qui s'hybride sélectivement & un fragment-

témoin formé au cours de la digestion de l'ADN d'un échantillon avec Hinf I apres formation d'un ou plusieurs des fragments d'ADN à caractériser. Au moins l'un des articles suivants est également présent dans le kit: un tampon approprié, un conditionnement et des instructions pour l'utilisation. Lorsque cela est requis, le kit comprend également l'enzyme de restriction Hinf I. Dans un aspect apprécié de la présente

invention, le kit de contrôle comprend une sonde polynu-

cléotidique qui s'hybride sélectivement à un fragment d'ADN d'un échantillon identifiable spécifiquement par la séquence nucléotidique 5'ACATGGCAGG(AGGGCAGG)nTGGAGGG-3' dans laquelle-n est égal à I ou 2 et ses motifs répétés en tandem. Le fragment d'ADN de l'échantillon est obtenu convenablement par clivage avec un enzyme de restriction,

par exemple par clivage avec Hinf I, de l'ADN de l'échan-

tillon. Dans un aspect plus apprécié de la présente

invention, le kit de contrôle comprend une sonde polynuclé-

otidique qui renferme la séquence nucléotidique précitée et ses motifs répétés en tandem, ainsi que des séquences complémentaires à cette séquence. Les moyens pour la fragmentation de 1'ADN d'un -échantillon sont de préférence un enzyme de restriction et, notamment, Hinf I. La présente invention est illustrée à présent, mais à titre non limitatif, par référence à l'exemple et aux figures annexées, sur lesquelles: La figure 1 représente les résultats d'une

digestion partielle d'un échantillon d'ADN génomique.

L'échantillon a été digéré, respectivement, pendant 20 minutes, 40 minutes, 60 minutes, 1 heure, 2 heures,

4 heures et 24 heures.

Les bandes montrent nettement comment l'em-

preinte de l'ADN varie au cours du temps.

La figure 2 représente les résultats du sondage du même échantillon d'ADN avec pMS51. La bande montre nettement la résistance d'allèles MS51 à la digestion et le

motif modifié des bandes.

La figure 3 représente les résultats du sondage du même échantillon d'ADN avec la sonde p lambda g3. On peut constater que les allèles g3 ne présentent pas un

degré appréciable quelconque de résistance à la fragmenta-

tion et que les bandes se stabilisent rapidement. Il faut noter que seul un allèle est visible en utilisant cet échantillon. La figure 4 représente l'emplacement des sites de restriction Eco RI, Hind III, Hinf I, Pst I et Sau 3A

adjacents au locus minisatellite MS51.

Dans les exemples suivants, une séparation d'ADN, une digestion par un enzyme de restriction, une électrophorèse et une analyse de transfert par la méthode de Southern ont été effectuées de la manière suivante: Séparation d'ADN De l'ADN a été séparé du sang entier d'un donneur humain -(AFM16). Les leucocytes ont été séparés d'échantillons de 2D ml de sang et ont été lavés une fois dans lxSSC (20xSSC est un mélange NaCl 3, 0M/citrate

trisodique 0,3M).

Les cellules ont été ensuite lysées dans 3,75 ml d'acétate de sodium 0,2M à pH 7,0, 100 pm de protéinase K à 10 mg/ml (Boehringer-provenant de Tritira-

chium album), 250 pl de SDS à 10 % à 56'C pendant 3 heures.

Puis le lysat a été soumis à une extraction avec un mélange phénol/chloroforme (25 parties de phénol: 24 parties de chloroforme: 1 partie d'alcool isoamylique) et à une extraction avec du chloroforme (24 parties de chloroforme:

1 partie d'alcool isoamylique).

L'ADN a été dévidé après addition de 2 volumes d'éthanol absolu et a été resolvaté dans de l'acétate de sodium O,2M. Puis il a été précipité avec de l'éthanol absolu et a été rincé dans de l'éthanol à 80 %, et a été ensuite séché. Finalement, 1'ADN a été totalement resolvaté

dans du tampon tris 10 mM à pH 8/EDTA 1 mM.

Digestion avec un enzyme de restriction La concentration d'ADN a été estimée par

fluorimétrie sur une portion aliquote d'ADN de l'échantil-

lon de base digéré avec Hinf I en utilisant un fluorimètre Hoeffer T120100 pour analyse d'ADN. 30 pg d'ADN de haut poids moléculaire extrait du sang du donneur AFMl6 ont été digérés dans un volume de 140 pl avec l'enzyme Hinf I (fourni par BCL, à 20 unités/pl). 140 unités d'enzyme Hinf I ont été utilisées et incubées à 37*C, en effectuant un mélange à des intervalles de 10 minutes pendant la

première heure d'incubation.

Des portions aliquotes de 20 pl ont été prélevées dans 1 Il d'EDTA 100 mM a pH 8 et ont été congelées à -20'C au bout de 20, 40 et 60 minutes, ainsi

qu'au bout de 2, 3, 4 et 24 heures.

Electrophorèse Un gel d'agarose à 0,7 %, de 20 cm x 25 cm (Sigma-Low EEO Type I), a été préparé dans du tampon d'électrophorèse lxTBE (Tris 134 Im, H3BO3 74,9 mM, Na2EDTA 2,5 mM, à pH 8). Les échantillons d'ADN traités avec l'endonucléase de restriction Hinf I ont été placés sur le gel conjointement avec des marqueurs de poids moléculaire et 0,5 pg d'ADN de plasmide pBR322 (Anglian Biotechnology, 2 mg/ml) digéré avec l'enzyme de restriction BglI (fourni par Anglian Biotechnology, à 10 unités/gl). Une tension constante de 75 volts a été appliquée à travers le gel d'agarose et le marqueur de poids moléculaire égal à 2,3 kilobases provenant de l'ADN pBR 322-BglI a été amené à

migrer à 18,5 cm du point de départ.

Analyse de transfert par la méthode de Southern Le gel a été débarrassé des bases puriques dans HCl 0,25 M pendant 15 minutes, a été dénaturé dans un mélange NaOH 0,5 M/NaCl 1,5 M pendant 30 minutes et a été neutralisé dans un mélange Tris 0,5 M, à pH 7,5/NaCl 3,0 M pendant 30 minutes. L'ADN a été transféré sur de l'Hybond-N (Amersham) par analyse de transfert par la méthode de

Southern et a été fixé par irradiation aux U.V.

Exemple 1

Marquage et hybridation de la sonde ng de sonde 33,15 (préparés suivant les procédés décrits dans le brevet du Royaume-Uni NO

2 166 445) ont été marqués avec du alpha-32P-dGTP (DuPont-

3000 Ci/mmole dans de la Tricine 10 mM) par extension d'amorce. 36 gl de tampon B ont été ajoutés à 24 Al de tampon 33,15 et ont été soumis à une ébullition pendant minutes, puis ont été refroidis sur de la glace pendant 10 minutes. 16 Ml de tampon C ont été ensuite ajoutés, conjointement avec 20 gl de alpha-32P-dGTP et 4 Al d'enzyme de Klenow (BCL, qualité pour séquençage-5 unités/gl). Le mélange réactionnel a été incubé à température ambiante pendant 3 heures, donnant une quantité suffisante de sonde pour une enceinte d'hybridation (une boite en Perspex de 21

cm x 21 cm, pouvant être fermée).

Une colonne NICK (Pharmacia - colonne de Sephadex G-50) a été équilibrée avec 10 ml de tampon pour colonne (Tris 20 mM à pH 7,5, NaCl 20 mM, EDTA 2 mM, 0,25 % de SDS). Le mélange réactionnel contenant la sonde a été passé à travers la colonne, puis 0,4 ml de tampon pour colonne a été ajouté et amené à se déplacer jusqu'à évacuation, une seconde quantité de 0,4 ml de tampon pour colonne a été ajoutée et celle-ci a été recueillie et

utilisée comme sonde purifiée.

Le filtre Hybond-N a été mouillé dans du 1xSSC et préhybridé dans du lx Denhardts (0,2 % de SAB (fraction

V Sigma), 0,2 % de Ficoll 400, 0,2 % de polyvinylpyr-

rolidone (poids moléculaire moyen égal à 40 000, 1xSSC)

pendant 60 minutes à 62 C.

0,5 ml d'ADN placentaire humain à 1 mg/ml, traité par cisaillement (traité par cisaillement dans du NaOH 0,3 M, EDTA 20 mM à 100"C pendant 5 minutes, puis neutralisé avec HCl) a été ajouté a la sonde à utiliser par enceinte d'hybridation et a été soumis à une ébullition pendant 7 minutes, puis a été refroidi sur de la glace

pendant 10 minutes.

La sonde a été ajoutée à 160 ml de CHFM (6 % de polyéthylèneglycol 6000 (lxDenhardts, 0,1 % de SDS, 6 %

de polyéthylèneglycol 6000) dans une enceinte de préhybri-

dation. Le filtre a été transféré de la solution de préhybridation et a été incubé à 62C pendant 16 heures,

sous agitation modérée par secousses.

Le filtre a été lavé dans 400 ml de lxSSC, 25 pg/ml d'ADN de sperme de saumon (Sigma), 0,1 % de SDS à 62'C pendant 30 minutes, le traitement étant répété à quatre reprises. Puis il a été rincé dans 3xSSC et séché à l'air brièvement avant d'être enveloppé dans du Saran. Puis il a été placé dans une cassette étanche à la lumière avec un écran d'intensification Curix MR 800 (Agfa) et a été exposé à un film sensible aux rayons X pendant 10 jours

à -70 C.

Tampon B: 44 p1 de tampon A (Tris 1,21 M à pH 8,0, MgCl2 0,12 M, 2mercaptoéthanol 0,25 M), 110 pi d'Hepes 2M à pH 6,6, 242 pi de H20 MilliQ (Millipore - eau de qualité pour réactifs), mis sous forme de portions aliquotes et

entreposé à -20C.

Tampon 33.15: 20 p1 de Diag 25 7,7 pm (oligonucléotides préparés de la manière habituelle), 40 p1 d'élément

d'insertion 33.15 à 20 ng/pl.

Tampon C: 44 pi de dATP 1 mM, 44 pi de dCTP 1 mM, 44 pi de TTP 1 mM et 44 pi de SAB à 10 mg/ml, mis sous forme de portions aliquotes et entreposés à -20'C (solutions 100 mM

de dATP, dCTP, TTP - Pharmacia).

Exemple 2

Marquage et hybridation de la sonde ng de la sonde MS51 (dont la séquence

d'insertion est indiquée dans cette description) ont été

marqués par une amorce oligonucléotidique aléatoire

(Feinberg et Vogelstein, 1984, Anal. Biochem. 137, pages-

266-267). La sonde a été soumise à une ébullition pendant minutes, puis a été refroidie sur de la glace pendant 10 minutes. 10 p1 de tampon d'oligomarquage ont été ajoutés conjointement avec 4 plde sérum-albumine bovine à 5 mg/ml (BRL), 7 p1 d'alpha-32P-dGTP (DuPont) et 2 p1 d'enzyme de

Klenow (Boehringer - de qualité pour séquençage, à 5 uni-

tés/pl). Le volume réactionnel a été porté à 50 p1 par addition de H20 MilliQ, a été soumis à un mélange et à une incubation à température ambiante pendant 3 heures. La sonde a été purifiée à travers une colonne NICK, de la manière indiquée dans l'exemple 1 ci-dessus. Le filtre HybondN a été débarrassé de la sonde 33,15 de l'exemple 1 par lavage dans NaOH 0,4 M à 45'C pendant 30 minutes, puis a été neutralisé dans 0,1xSSC, 0, lxSDS, Tris 0,2M à pH 7,5,

pendant 30 minutes à 45*C.

Le filtre a été ensuite rincé dans lxSSC et préhybridé à 65 C pendant 20 minutes dans de la sérum

albumine bovine à 0,1 % (Bethesda Research Laboratories-

de qualité enzymatique pour acides nucléiques), de l'EDTA 1 mM, 7 % de SDS, du pyrophosphate de sodium 0,5 M à pH 7,2

[Church et Gilbert, 1984, P.N.A.S., USA, 81, pages 1991-

1995].

La sonde purifiée a été soumise à une ébulli-

tion pendant 5 minutes avec 0,5 ml d'ADN placentaire humain à 1 mg/ml, ayant été soumis à un-cisaillement, puis a été refroidie sur de la glacependant 10 minutes et ajoutée à ml de lxSSC, 6 % de polyéthylèneglycol 6000. Le filtre a été transféré dans la solution d'hybridation et incubé à C pendant 16 heures. Apres hybridation, les filtres ont été lavés à 65'C dans du phosphate de sodium 40 mM, 0,1 % de SDS (pH 7,2) pendant 15 minutes, puis ont été lavés à deux reprises pendant 15 minutes à 65-C dans 0,Sx SSC, 0o,01 % de SDS et, finalement, ont été lavés a deux reprises pendant 15 minutes à 65 C dans 0,2x SSC, 0,01 % de SDS. Le filtre a été ensuite rincé dans 3xSSC, séché brièvement à l'air et enveloppé dans du Saran pour être soumis à une autoradiographie de la manière décrite dans l'exemple 1,

mais avec une exposition de I à 2 jours.

Exemple 3

Les matières et les méthodes étaient exactement ceux décrits, pour l'exemple 2, sauf que la sonde p lambda g3 (préparée suivant les procédés décrits dans la demande de brevet européen publiée sous le NI 238 329) a été utilisée à la place de pMS51. La séquence de p lambda g3 est AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGGGCAGGGAGRGGC (dans laquelle Y représente C, T ou U, R représente A ou G et T représente

T ou U) et ses motifs répétés en tandem.

Claims (12)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour évaluer la fragmentation de l'ADN d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter la présence d'un fragmenttémoin formé, pendant le clivage de l'ADN de l'échantillon, après formation d'un ou

plusieurs des fragments d'ADN à caractériser.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'ADN de l'échantillon est fragmenté

par digestion enzymatique.

3. Procédé suivant la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le fragment-témoin

indique une fragmentation totale de l'ADN de l'échantillon.

4. Procédé suivant l'une quelconque des

revendications i à 3, caractérisé en ce que le fragment-

témoin est détecté en utilisant une sonde minisatellite.

5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la sonde minisatellite est utilisée pour détecter une seule région minisatellite ou un seul

locus hypervariable.

6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la sonde minisatellite s'hybride sélectivement à un fragment d'ADN d'un échantillon identifiable spécifiquement par la séquence nucléotidique 'ACATGGCAGG(AGGGCAGG)nTGGAGGG-3', dans laquelle n est

égal à 1 ou 2, et ses motifs répétés en tandem.

7. Procédé suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'enzyme de

restriction Hinf I est utilisé pour cliver l'ADN de l'échantillon.

8. Polynucléotide, caractérisé en ce qu'il

s'hybride sélectivement à un fragment d'ADN d'un échantil-

lon identifiable spécifiquement par la séquence nucléoti-

dique '-ACATGGCAGG(AGGGCAGG)nTGGAGGG-3', dans laquelle n est

égal à 1 ou 2, et ses motifs répétés en tandem.

9. Polynucleotide suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est associé à un constituant

servant de marqueur ou d'indicateur.

10. Sonde polynucléotidique, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence nucléotidique '-ACATGGCAGG(AGGGCAGG)nTGGAGGG-3', dans laquelle n est

égal à 1 ou 2, et ses motifs répétés en tandem.

11. Kit de contrôle, caractérisé en ce qu'il

comprend une sonde minisatellite qui s'hybride sélecti-

vement à un fragment-témoin formé pendant la digestion de l'ADN de l'échantillon avec Hinf I, après formation d'un ou plusieurs des fragments d'AND à caractériser, et au moins un article choisi entre un tampon, un conditionnement et

des instructions pour l'utilisation.

12. Kit de Contrôle suivant la revendication 11, caractérisé en ce que la sonde minisatellite comprend

la séquence nucléotidique 5'-ACATGGCAGG(AGGGCAGG)nTGGAGGG-

3', dans laquelle n est égal à i ou 2, et ses motifs

répétés en tandem.