JPH03262483A - インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼに対する阻害剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は医療技術、より詳細にはインフルエンザの診断
、ウィルスの抗原構造の研究およびワクチンの製造に利
用できるインフルエンザウィルス〔従来の技術〕 インフルエンザウィルスのノイラミニダーゼ阻害剤の製
造方法は、当該技術分野で既知である（Ｗ、Ｌｉｎ、　
Ｋ、０ｉｓｈｉ、　ａＫｏＡｉｄａ、　Ａ　ｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌ　ａｎｄＢｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒ　、　１９７５＋　３９．　Ｎｏ、３．７５９〜
７６５ページ）。

その方法は、ノイラミニダーゼ阻害剤の生産菌を、炭素
源、窒素源、無機塩および増殖刺激因子を含有する栄養
培地で増殖させることからなる。

その生産菌としてはアクチノミセス（ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｓ）が使用されている。増殖後、培養液を分離しそ
してエタノールで繰り返し処理されている。得られた残
渣はリン酸緩衝液に溶解され、リン酸緩衝液に対して透
析されている。調製品の回収および精製工程の所用期間
は、ノイラミニダーゼ活性阻害剤の調製および同定に要
する時間を考慮に入れないで１２日である。また、目的
生産物の収量は培養液１１当たり３３■である。こうし
て得られた目的生産物は、Ａ２型インフルエンザウィル
スのノイラミニダーゼを８０％阻害することを保証する
。

この方法は、長い処理期間、生産されたノイラミニダー
ゼ阻害剤の不十分な活性および低い収量に特徴がある。

［発明が解決しようとする課Ｈ］ 本発明の主な目的は、得られるノイラミニダーゼ団害剤
の収量および活性の改善にある。

本発明のもう一つの目的は、処理期間の短縮化にある。

〔課題を解決するための手段］ 本発明の主な目的およびもう一つの目的は、炭素源、窒
素源、無機塩および増殖刺激因子を栄養培地に組み入れ
、その培養液の分離、それらのエタノール処理、次いで
目的生産物の分離精製によるインフルエンザウィルスの
ノイラミニダーゼ阻害剤の製造方法において、本発明で
はノイラミニダーゼ阻害剤の生産菌としてスタフィロコ
ッカス・アウレウス（鉦鮭肚困並匹並ａｕｒｅｕｓ）種
二こ属する微生物を使用することにより達成される。

新規な生産菌スタフィロコッカス種は、高い抗ノイラミ
ニダーゼ活性を有する。

本発明に従う方法は、簡単であり、目的生産物の高収量
および高活性に特徴がある。得られるインフルエンザウ
ィルスのノイラミニダーゼ阻害剤は、それらの１００％
阻害を保証し、そして既知の方法で生産される阻害剤よ
りもほぼ■０倍を越える活性を示す。得られる阻害剤は
、熱安定性であり、酸およびアルカリの作用によってそ
の活性が変化しない。

本発明の阻害剤は、インフルエンザウィルスのりプロダ
クションを増加させるので診断の促進およびその精度の
改善、ならびにインフルエンザウィルスの循環型株に対
するワクチンの迅速な調製およびインフルエンザウィル
ス予防用のそれらに基づくモノワクチンの調製に使用す
ることができる。

方法を簡略化するには、ゲル濾過法により精製素源、無
機塩および増殖因子を組み入れた栄養培地で培養される
。まず最初にスタフィロコッカス・アウレウスを２４時
間前記栄養培地５＋ｄで増殖させ、次いでさらに２４時
間栄養培地１００　ｄで培養して種母培養物を蓄積する
。こうして得られた種母培養物は酵素の栄養培地に導入
され、そこで連続的撹拌下２４時間増殖される。次に、
培養液は分離され、そしてエタノールで処理される。沈
殿物は分離され、そして上澄液は廃棄される。沈殿物は
エタノールで洗浄され、次いでリン酸緩衝液に溶解され
た後に再びエタノールで沈殿される。得られる沈殿を溶
解し、その溶液を加熱して形成した残渣が除去される。

目的生産物は、上澄液からセファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ　）を通すゲル濾過によりそれを精製し、次いで
凍結乾燥により得られる。

本発明の方法による目的生産物の回収の所用期間は５日
である。目的生産物の収量は、培地１ｅ当たり６７〜７
０■である。

得られた物質は、高い阻害活性により特徴付けられ、そ
の１％）容液はインフルエンザウィルスＡのノイラミニ
ダーゼの９０−１００％阻害を保証する。

得られる物質の高い活性は、長時間（１０〜６０分）沸
騰後、およびρ）１１．０〜１０．０で２４時間インキ
ュヘーシゴン後も失われない。

〔実施例〕

本発明の理解を深めるために、以下にノイラミニダーゼ
阻害剤の製造方法を具体的に説明する幾つかの特定の例
を示す。

班土 スタフィロコッカス・アウレウスＮｏ、　３９２　Ｃフ
ァゴグループ（ｐｈａｇｏｇｒｏｕｐ）　ｆｆｌ、ビレ
ット（Ｐｉｌｌｅｔ）量線型１８〕を下記組成の栄養培
地で増殖させた。

（質量％） １．０ １．０ ０．３ ０．０５ 残余 酵素性ペプトン ラクトース 酵母エキス ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ リン酸緩衝剤 （培地のｐＨ７，２） 種母培養物を蓄積するために、前記菌株を前記組成の栄
養培地５−中で１日間増殖させ、次いで栄養培地１０Ｍ
でさらに１日間増殖させた。この増殖は３７°Ｃで行っ
た。得られた種母培養物を栄養培地３１に導入し、連続
撹拌条件下で工日間増殖させた。次に、１５分間、８，
０ＯＯｒ、ｐ、ｍで遠心することにより培養液を分離し
た。得られた上澄液を、比率１：１．５のエタノールを
用い４°Ｃの温度で１２時間持続して沈殿させ、次いで
１５分間６，０００〜８、０ＯＯｒ、ｐ、ｍで遠心した
。上澄液を除去した。沈殿を、比率１：１．５の６０％
エタノールを用い、１５〜３０分間６．０００〜８．０
ＯＯｒ、ｐ、−で遠心にがけて洗浄した。得られた沈殿
をｐＨ７，２のリン酸緩衝液に再び溶解し、この溶液を
１００″Ｃの温度で１ｏ分間加熱し、１５分間６，００
０〜８．００Ｏｒ、ｐ、ｍテ遠心シ、得うレタ沈殿を除
去した。上澄液を、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ
）Ｇ２００　（７アルマシア社製）を有するカラム（２
，ＯＸ　３０．Ｏｃｍ　）を通してゲル濾過した。

得られた溶出液を凍結乾燥して、均一な粉末状の乾燥塊
とした。目的生産物の収量は、初期培地容量１４２当た
り６７ｇであった。

こうして得た目的生産物は、分子量９４，０００〜１２
０．０００を有し、比率１：１０で蛋白質と炭水化物を
、炭素原子１１〜２０個の脂肪酸を含む。この蛋白質の
アミノ酸組成は次のとおりであった：フェニルアラニン
、チロシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バ
リン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン、セ
リン、スレオニン、アスパラギン、ヒスチジン、リジン
。

この阻害剤の炭水化物は、中性単Ｗ類−２４：ｌの比率
でマンノースとグルコースを、２つのへキソサミンｉ−
１：３．５の比率でガラクトサミンとグルコサミン、を
示した。

こうして得た物質の光学濃度のピークは、波長２１０ｎ
ｍで検出された。

得た物質の化学的組成に関して、その物質はインフルエ
ンザウィルスのノイラミニダーゼ阻害剤と同一の糖脂質
蛋白複合物を含む。得た物質の阻害活性は、インフルエ
ンザＡ　ｏ　、　Ａ　＋　、　Ａ　ｚの各ウィルスのノ
イラミニダーゼについて実験室試験にかけた。

１：１．０．２５１　ｇ　７．５　ＥＩｎｓ。濃度のイ
ンフルエンザＡ０．Ａ、Ａｚの各ウィルス懸濁液０．２
　ｄに、得た物質の１０％水溶液０．２−を加えた。こ
の混合物を、３７℃の温度で水浴中３０分間インキユヘ
ーションした。同様な特徴の各インフルエンザウィルス
の対照懸濁液は、生理食塩水０．２　ｄを加えた。

インフルエンザウィルスのノイラミニダーゼ試料のすべ
てについて、常法に従って試験した。試験は、既知の方
法で生産した阻害剤の活性と比較することで行った。試
験結果は、下記の表に示す。

この方法は、前記例１に記載したのと同様の方法で行っ
た。生産菌として、ストレプトコッカス・アウレウスＮ
ｃｔ１０２５株を使用した。目的生産物の収量は、培地
ＩＩ！、当たり７ｏ、３■であった。得られた生産物の
化学的組成は、前記例１に記載したものと同一であった
。

インフルエンザＡ　ｏ　、Ａ　、Ａ　ｚの各ウィルスの
ノイラミニダーゼに関する得た生産物の阻害活性は、例
１のものと同様な方法で試験した。

試験結果は、下記の表に示す。

舅ｌ この方法は、前記例１に記載したのと同様の方法で実施
した。スタフィロコッカス・アウレウス１４３１株を使
用した。目的生産物の収量は、培地１１当たり６６．７
ｇＩｇであった。得られた生産物の化学的組成は前記例
１で得たものと同一であった。得た生産物の阻害活性試
験は、例１に記載したのと同−の方法で実施した。

試験結果を下記表に示す。

表 倍高く、その１００％阻害を保証する。

か゛ した の

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、スタフィロコッカス・アウレウス（￥Ｓｔａｐｈｙ
   ｌｏ−ｃｏｃｃｕｓ￥￥ａｕｒｅｕｓ￥）種に属するノ
   イラミニダーゼ阻害剤の生産菌を、炭素源、窒素源、無
   機塩および増殖刺激因子を含有する栄養培地で増殖し、
   その培養液を分離し、エタノールでそれを処理し、次い
   で目的生産物を単離精製することを特徴とするインフル
   エンザウイルスのノイラミニダーゼに対する阻害剤の製
   造方法。 ２、前記目的生産物の精製をゲル濾過で実施する請求項
   １記載の方法。