JPH03262481A - リポミセス属酵母用合成寒天培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、リポミセス属酵母を培養するための寒天培
地に関する。

［従来の技術］ リポミセス属酵母は菌体内に油脂を生産蓄積する性質を
持っており、この性質を利用して農業廃棄物、工業廃棄
物又は未利用有機物資源（例えば、低品位草炭）等がら
食料用油脂を産生ずる試験が世界各国で行なわれている
。リポミセス属酵母による油脂産生の成否を決定するの
は、栄養学的に価値の高い油脂をどれ程の効率で産生ず
る菌体を取得できるかにかかっており、このような優良
菌株の取得及び育種には、胞子形成とそこから得られる
遺伝形質が均一な純系株の入手と、それらの交雑及び選
抜が最ら重要な基礎技術となっている。

従来より、リポミセス属酵母の培地として用いられてい
る培地１例えば野菜汁・Ｖ−８培地、無窒素寒天培地、
ＹＭ培地等を用いると、リポミセス属酵母を自然界から
分離した当初は胞子を形成することができるが、その後
研究室や微生物保存機関で継代されると、上記の培地を
用いても胞子を形成しにくくなる性質があった。この性
質は単胞子分雌純粋系菌株の取得や交雑による優良形質
を安定的に備えた優良菌株を育種する上で最大の欠点と
なっていた。

本発明者らは、研究室で長期間継代培養して胞子形成し
にくくなったリポミセス属酵母を（ａ）大豆もしくは大
豆誘導体、（ｂｌペクチン、ｔｃ＋　グルカン、ｆｄｌ
　マンナン及びｆｄ）コハク酸と酵母抽出物から成る群
より選ばれる少なくともいずれか１つを含む寒天培地で
培養すると、胞子を形成させることができることを特開
平１−１８１７８７号に開示している。

しかしながら、これらの培地はいずれも構成成分として
天然物を含んでいるために、それら天然物の産地、収穫
時の天候、輸送・保存方法、加工方法、精製の程度等に
よって一定の品質の６のを入手することが困難であった
。このため、培地の化学組成上の相違が生じ、この化学
組成の相違がリポミセス属酵母の胞子形成に重大な影響
を与えるという欠点を有している。

［発明が解決しようとする問題点］ 従って、本発明の目的は、上記問題点を解決し、リポミ
セス属酵母の胞子形成を停止することなく繰り返し継代
培養ができ、かつ試薬のみを用いて調製することができ
るリポミセス属酵母用培地を提供することである。

Ｅ問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、上記した大豆もしくは大豆誘導体を含む
寒天培地（以下、大豆寒天培地と言う）がリポミセス属
酵母の培養に優れていることからリポミセス属酵母の胞
子形成に必要な成分を大豆に含まれる成分を分析するこ
とにより検索した。その結果及び文献調査による結果か
ら、天然の大豆に代えて化学薬品を用いてその効果が得
られることを見い出し、この発明を完成した。

すなわち、本発明は、窒素源としてアスパラギン酸、グ
ルタミン酸、尿素、グアニン、バリン、チロシン、リシ
ン、炭酸アンモニウム、グリシン、トレオニン、グルタ
ミン、ヒスチジン、塩化アンモニウム、アラニン、トリ
プトファン、アスパラギン、アルギニン、プロリン及び
キサンチンから成る群より選ばれる化合物の少なくとも
１つを含むリポミセス属酵母用合成寒天培地を提供する
。

［発明の効果］ 本発明の寒天培地を用いると、継代培養を繰り返した後
であって、従来の培地を用いて培養したのでは胞子及び
胞子嚢を形成しないリポミセス属酵母を、胞子及び胞子
嚢形成能力を維持したまま培養することが可能である。

また、培地成分として組成が不明瞭な天然物を含まない
ので、試薬のみを用いて一定の化学組成のちのを適宜調
製することができる。従って、この発明は、産業上有用
なリポミセス属酵母の優良菌株の取得及び育種に大きく
貢献するものである。

［発明の詳細な説明］ 上述のように、本発明の培地は、窒素源として、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸、尿素、グアニン、バリン、チ
ロシン、リシン、炭酸アンモニウム、グリシン、トレオ
ニン、グルタミン、ヒスチジン、塩化アンモニウム、ア
ラニン、トリプトファン、アスパラギン、アルギニン、
プロリン及びキサンチンから成る群より選ばれる化合物
の少なくとも１つを含むにれらのうち、好ましいちのは
、尿素、グルタミン酸、アスパラギン酸及びグアニンで
あり、最ち好ましいちのはグルタミン酸及びアスパラギ
ン酸である。

上記窒素源の濃度は、特に限定されないが。

通常０．０００１％〜１％、さらに好ましくは０．ＯＩ
％〜０．５％である。

本発明の培地は、上記窒素源に加え、炭素源を含むこと
が好ましい。炭素源としては、六炭糖、その少糖類及び
多糖類並びにグリセロールが好ましく、特に好ましいち
のの具体例として、ブドウ糖、果糖、ガラクトース、マ
ンノース、アラビノース、ショ糖、マルトース、トレハ
ロース、ラクトース、セロビオース、ラフィノース、マ
ルトペンタオース、デキストラン、イヌリン、溶性デン
プン及びグリセロールを挙げることができる。

上記炭素源の濃度は、特に限定されないが、通常、０．
００１％〜１０％、好ましくはｏ、８１％〜１％程度で
ある。

本発明の培地は、無機成分として、鉄、亜鉛、マンガン
、マグネシウム、カリウム及びリン酸を含んでいてもよ
い。これらの無機成分は必須的なものではないが、上記
のうち亜鉛は含んでいた方が好ましい。これらの無機成
分の濃度は下記実施例４に示されるように特に重要では
なく、下記実施例に示される程度の濃度で良い。

上記した成分を有する本発明の寒天培地の具体的な培地
組成としては、表１の合成培地Ａ−Ｅを挙げることがで
きるが、これらに限られるものではない。

本発明の寒天培地は、例えば蒸留水に市販の前記した糖
類、窒素源及び無機イオン等を溶解し、次いで寒天を例
えば２重量％程度加えて加熱溶解した後、加圧滅菌して
無菌的条件下で固化させることによって調製することが
できる。また、本発明の培地のｐＨは、加圧滅菌する前
にｐＨ３，５〜８．５に調整して用いることができる。

本発明の寒天培地は、従来のリポミセス属酵母用寒天培
地と同様にしてリポミセス属酵母の培養に用いることが
できる。すなわち、寒天培地上に酵母を塗布し、１５℃
〜３０℃で酵母を培養することができる。

また、本発明の寒天培地は、リポミセス属に属する何れ
の種及び株の培養にも用いることができ、リポミセス属
酵母の具体例としては、リポミセス・スターキー（Ｌｉ
ｐｏｍｙｃｅｓ　５ｔａｒｋｅｙｉ）、リポミセス・コ
ノネンコアエ（Ｌ、　ｋｏｎｏｎｅｎｋｏａｅ）、　　
リポミセス・テトラスポルス（Ｌ、　ｔｅｔｒａｓｐｏ
ｒｕｓｌを挙げることかできる。

［実施例］ 以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本
発明の実施例はこれらに限られるものではない。

各個の説明に先立ち、各個において採用した胞子及び胞
子嚢の形成を確認する手順を説明する。

ＹＭ寒天培地に植え継いで保存されてきたリポミセス属
酵母を白金耳で取り出し、酵母エキス、ブドウ糖、無機
塩で作った半合成培地（文献は後述）に入れて、菌濃度
が濁度（ｏｏｓａａｎｍｌで１付近になるまで３０℃で
３６〜４８時間培養した。ここで得られた菌体の少量を
ブドウ糖、ビオチン、無機塩から作る合成培地（文献は
後述）に植え継ぎ、３０℃で９６時間通気培養した。こ
こで得られた菌を培養液に入ったままで一定量とり、遠
心分離機を用いて菌体と培養液区分とに分け、菌体部分
は滅菌水で懸濁しては遠心する操作を２回繰り返して十
分に洗浄した。最後に菌体を原容量の滅菌水に懸濁し、
これを白金耳を使って胞子形成用寒天培地に塗布した。

菌を塗布した寒天培地を１８℃〜２５℃に調整した室内
に静置し、７日目毎に菌体の一部又は全部を取り出して
胞子及び胞子嚢形成を確かめた６以上の操作は全て無菌
条件下で行なった。胞子形成用培地から取り出した菌体
を０．７Ｍマンニトール水溶液に懸濁し、光学顕微鏡で
１０００倍で観察した。

なお、リポミセス属酵母は胞子形成に先立って、栄養細
胞から角状あるいはひも状に突起したアクチブバド（ａ
ｃｔｉｖｅ　ｂｕｄ）を形成し、これがそのまま胞子嚢
に発達したり、あるいは他の細胞や。

そこから出たアクチブバドに接合したところに胞子嚢を
形成して胞子を蓄える。これらのアクチブバド、胞子、
胞子嚢は光学顕微鏡で容易に識別できるが、胞子染色を
用いれば胞子の確認は更に容易になる。胞子嚢中には１
個から２０個以上の胞子が形成されているので、形成さ
れた胞子の数を基準にして胞子の作られ易さを表現する
より６胞子を含んだ胞子嚢をどの程度作るかを基準にし
た方が計数が容易である。計数した全細胞数（通常５０
０個以上）に対して胞子を含んだ胞子嚢を持った細胞の
数の割合を百分率にして胞子嚢形成率と呼ぶ。

文献：兎束　保之、「肥満型酵母の生理学、ｌｌ（微生
物の探索、分離、育種　１９８４年、ＣＭＣ出版）なお
、下記実施例において、％は特に明示がない限り全て重
量％を示す。

及五班ユ 精製水１０１００Ｏに表１に示すように培地Ａ〜工の各
培地成分を加えて溶かし、水酸化カリウムでｐ）Ｉを共
に６．７に調整した後、精製寒天２０ｇを加えてから沸
騰水で加熱して溶解させた。試験管に８ｍｌずつ分注し
、常法により綿栓をしてから。

オートクレーブで１１０℃、１０分間高圧滅菌し、これ
らの試験管を取り出して傾斜させながら固化させて斜面
培地とした。前述の方法で液体培養して無菌条件下で洗
浄した酵母リポミセス・スターキーＣＢ５１８０７株を
白金耳を用いて培地Ａ−Ｉに塗布し、２０〜２５℃で静
置した。７〜１０日経過する毎に１本ずつ試験管を取り
出し、綿栓を取り外した後に０．７Ｍマンニトール水溶
液を５ｍｌ加え、斜面部分の菌体を分散させるように振
った。この菌体懸濁液を別の試験管に取り、その−部を
使って胞子嚢形成率を調べた。

結果を図１に示す、窒素源にアスパラギン酸及び／また
はグルタミン酸を用いた培地Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥは胞
子嚢を大量に形成することが分かった。しかし、−数的
な酵母用合成培地に用いられる硫酸アンモニウムを窒素
源とした培地Ｆ、Ｇ、Ｈ及び工は胞子嚢形成が殆ど見ら
れなかった。

太１四艷ｌ 実施例１で調製した本発明の培地Ｃを作製し、表２に示
すリポミセス属酵母及びその類縁属酵母を実施例１と同
様にして培地Ｃに塗布、培養した。培１１２１日目の試
験管を取り出し、実施例１と同様にして胞子嚢形成率を
測定した。なお。

比較用培地として大豆寒天培地を使用した６結果を表２
に示す。本発明の培地Ｃが大豆寒天培地と同様に胞子形
成に効果があることが分かった。

１玉１引旦 実施例１で調製した培地Ｃ中の窒素源成分を表３に示す
化合物に代えて各々窒素含量として０．１８　ｇになる
ように添加すること以外は実施例１と同様にして培地を
作製、培養して胞子嚢形成率を測定した。

結果を表３に示す、アスパラギン酸、グルタミン酸、グ
アニンを窒素源として用いた場合、胞子嚢形成に高い効
果があり、リジン、グリシン、ヒスチジン、アスパラギ
ン等のアミノ酸、さらに尿素５炭酸アンモニウムも胞子
形成に効果があることが分かった。しかし、−数的な酵
母用合成培地に用いられる硫酸アンモニウムを窒素源と
した培地では胞子嚢形成が見られなかった。

大過０引ま 実施例１で調製した培地Ｃ中の炭素源成分を表４に示す
化合物に代え各々５ｇずつ添加すること以外は実施例１
と同様にして培地を作製し、培養して胞子嚢形成率を測
定した。

結果を表４に示す。ジヒドロオキシアセトン及びグリセ
ルアルデヒドの両三炭糖を除いて試験したすべての炭素
源が胞子形成に有効であった。

中でも、果糖、ガラクロース、マンノース、ブドウ糖等
の六炭糖類と、これらの六炭糖から構成される少糖類、
多糖類、すなわち蔗糖、マルトース、トレハロース、セ
ロビオース、ラクトース、ラフィノース、マルトペンタ
オース、デキストラン、イヌリン、溶性デンプン等が優
れていた。また、糖アルコールのグリセロールち優れた
効果があった。

表５ 衷圭Ｑ生旦 実施例１で調製した培地Ｃ中の無機イオンのうち何れか
１つについて濃度を培地Ｃ中の濃度の１０倍あるいは全
く加えない培地とすることを除いて実施例１と同様にし
て各々の培地を作製し、リポミセス・スターキーＣＢ５
１８０７株を塗布、培養して胞子形成率を？ｊ１１足し
た。結果を表５に示す。

率の経口変化を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）窒素源としてアスパラギン酸、グルタミン酸、尿
   素、グアニン、バリン、チロシン、リシン、炭酸アンモ
   ニウム、グリシン、トレオニン、グルタミン、ヒスチジ
   ン、塩化アンモニウム、アラニン、トリプトファン、ア
   スパラギン、アルギニン、プロリン及びキサンチンから
   成る群より選ばれる化合物の少なくとも１つを含むリポ
   ミセス属酵母用合成寒天培地。
2. （２）前記窒素源は尿素、グルタミン酸、アスパラギン
   酸及びグアニンから成る群より選ばれる請求項１記載の
   リポミセス属酵母用合成寒天培地。
3. （３）前記窒素源はアスパラギン酸及びグルタミン酸か
   ら成る群より選ばれる請求項２記載のリポミセス属酵母
   用合成寒天培地。
4. （４）炭素源として六炭糖、その少糖類及び多糖類並び
   にグリセロールから成る群より選ばれる化合物の少なく
   とも１つをさらに含む請求項１ないし３のいずれか１項
   に記載のリポミセス属酵母用合成寒天培地。
5. （５）前記炭素源は、ブドウ糖、果糖、ガラクトース、
   マンノース、アラビノース、ショ糖、マルトース、トレ
   ハロース、ラクトース、セロビオース、ラフィノース、
   マルトペンタオース、デキストラン、イヌリン、溶性デ
   ンプン及びグリセロールから成る群より選ばれる請求項
   ４記載のリポミセス属酵母用合成寒天培地。