JPH03251186A - 酵母における外来性遺伝子の発現方法 - Google Patents
酵母における外来性遺伝子の発現方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
- C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００月
【産業上の利用分野】
本発明は外来性遺伝子の発現、特に酵母における組換え
因子ＸＩＩＩａ （ｒＦＸＩＩＩａ）の発現、の最適化
に関する。 ［０００２］ 最適化は、バイブリドＧ ａ ｌ ＵＡＳ ／ Ｃｙ
ｃ Ｉプロモーターの使用、ＦＸＩＩＩａｃＤＮＡの５
′非副］訳領域の欠失および３′非翻訳領域の切詰め、
特異的酵母株の選択およびホエーまたはホエー加水分解
物からなる特に適する増殖培地によって実質的に行われ
た。このようにして達成できるＦ ＸＩＩＩ ａの量は
、振盪培養で１００ｍｇ／ｌまたはそれ以上で、スケー
ルアップ後の発酵において５００ｍｇ／ １またはそれ
以上である。 ［０００３］
因子ＸＩＩＩａ （ｒＦＸＩＩＩａ）の発現、の最適化
に関する。 ［０００２］ 最適化は、バイブリドＧ ａ ｌ ＵＡＳ ／ Ｃｙ
ｃ Ｉプロモーターの使用、ＦＸＩＩＩａｃＤＮＡの５
′非副］訳領域の欠失および３′非翻訳領域の切詰め、
特異的酵母株の選択およびホエーまたはホエー加水分解
物からなる特に適する増殖培地によって実質的に行われ
た。このようにして達成できるＦ ＸＩＩＩ ａの量は
、振盪培養で１００ｍｇ／ｌまたはそれ以上で、スケー
ルアップ後の発酵において５００ｍｇ／ １またはそれ
以上である。 ［０００３］
凝固因子ＸＩＩＩ （ＦＸＩＩＩ）は、天然血液凝固プ
ロセスにおける凝固カスケードの最終要素を形成する。 ＦＸＩＩＩは、１９４４年にＲｏｂｂｉｎｓによって血
清因子として最初に記述された。Ｒｏｂｂｉｎｓは、高
度に精製されたフィブリノーゲンおよびトロンビンから
の凝固は尿素溶液中で可溶であるのに対して、正常全血
液からのフィブリン凝固は不溶であることを観察した。 ［０００４］ 血漿からのＦＸＩＩＩの分子量は、約３００ｋｄである
。血漿タンパク質は、約８０ｋｄのサブユニッ）ａおよ
び約７５ｋｄのサブユニッ）ｂから成り、二つのａおよ
び二つのｂのテトラマー（ａ２ｂ２）として存在する。 サブユニットａ （ＦＸＩＩＩａ）は酵素的活性を含む
。Ｆ ＸＩＩＩ ａは、４ｋｄの大きさのアミノ末端ペ
プチドのトロンビンによる切断によって活性化されて、
Ｆ ＸＩＩＩ ａ を生じさせる。この活性化型ＦＸ
ＩＩＩａは、カルシウムイオンの存在下でトランスグル
タミナーゼとして作用して、分子間γ−グルタミルーε
−リジン結合を介してフィブリンモノマーを架橋させて
、より強固な凝血を生じさせる。 ［０００５］ ｃＤＮＡおよび大腸菌、動物細胞および酵母におけるＦ
ＸＩＩＩａの発現の最初の例は欧州特許第０．２３６．
９７８号明細書に記述されている。しかし、酵母におけ
る活性Ｆ ＸＩＩＩ ａの収量は、記述された方法では
かなり低く、１５０ｎｇ／ｍｌである。 ［０００６］ Ｆ ＸＩＩＩ ａは、大腸菌において高収量で発現され
得る（Ａｍａｎｎら：Ｇｅｎｅ ６９．３０１−３１５
．１９８８）。しかし、大腸菌中で合成されたＦＸＩＩ
Ｉａのほとんどは不溶性で、したがって、酵素的に活性
ではない。原核生物中における異種発現に代わる適当な
ものは、真核生物細胞における合成である。生物学的に
活性のＦ ＸＩＩＩ ａのＣＨＯ細胞中における異種発
現は、既に示されている（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌおよ
びＫａｒｇｅｓ ：（１９８９）、ＸＩＩｔｈ Ｃｏｎ
ｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ ５ｏｃｉｅｔｙ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａ
ｈｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、 Ｔｏｋｙｏ ）。し
かしながら、この場合の収量は費用効果的生産を保証す
るには不適当である。 ［０００７］ 酵母は、一方では分子生物学的操作のためにそれらの遺
伝的性質が充分に特徴付けされており、クローニングお
よび発現ベクターが利用でき、真核生物としてそれらは
典型的なｔｌＵ訳後の修飾機構を有していることから、
宿主細胞として適している。他方、微生物として、それ
らはどちらかといえば短い世代時間を有しており、酵母
を高細胞密度で培養するための発酵工程の充分な発達が
あった。生物学的に活性なＦＸＩＩＩａがパン酵母中で
調製され得ることは、欧州特許出願筒ＥＰＡ２０．２３
６．９７８号明細書において例のかたちで既に示された
。組換え活性Ｆ ＸＩＩＩ ａはまた、分裂酵母シゾサ
ツカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）中で分子生物学的技術（Ｂｏ
ｅｋｅｒ およびＢａｅｕｍｌ： ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ、 ２４８．１０５−１１０．１９８９）を用いても
合成され得る。しかし、記述された二つの例における収
量はそれぞれ０．１５および２ｍｇ／ｌであって、調製
が経済的と思われる範囲にはない。 より高い収量は、欧州特許出願筒Ａ２０．２６８． ’
７１２号明細書に記述されている。ＦＸＩＩＩ ａ合成
が強力な解糖ＴＰＩプロモーターの調節の下にあるプラ
スミドは、１０ｍｇ／ｌの合成率をもたらす。５０ｍｇ
／ｌはＡＤＨＩＩプロモーターを用いて達成される。 ［０００８］ 〔発明の概要〕 ［０００９］
ロセスにおける凝固カスケードの最終要素を形成する。 ＦＸＩＩＩは、１９４４年にＲｏｂｂｉｎｓによって血
清因子として最初に記述された。Ｒｏｂｂｉｎｓは、高
度に精製されたフィブリノーゲンおよびトロンビンから
の凝固は尿素溶液中で可溶であるのに対して、正常全血
液からのフィブリン凝固は不溶であることを観察した。 ［０００４］ 血漿からのＦＸＩＩＩの分子量は、約３００ｋｄである
。血漿タンパク質は、約８０ｋｄのサブユニッ）ａおよ
び約７５ｋｄのサブユニッ）ｂから成り、二つのａおよ
び二つのｂのテトラマー（ａ２ｂ２）として存在する。 サブユニットａ （ＦＸＩＩＩａ）は酵素的活性を含む
。Ｆ ＸＩＩＩ ａは、４ｋｄの大きさのアミノ末端ペ
プチドのトロンビンによる切断によって活性化されて、
Ｆ ＸＩＩＩ ａ を生じさせる。この活性化型ＦＸ
ＩＩＩａは、カルシウムイオンの存在下でトランスグル
タミナーゼとして作用して、分子間γ−グルタミルーε
−リジン結合を介してフィブリンモノマーを架橋させて
、より強固な凝血を生じさせる。 ［０００５］ ｃＤＮＡおよび大腸菌、動物細胞および酵母におけるＦ
ＸＩＩＩａの発現の最初の例は欧州特許第０．２３６．
９７８号明細書に記述されている。しかし、酵母におけ
る活性Ｆ ＸＩＩＩ ａの収量は、記述された方法では
かなり低く、１５０ｎｇ／ｍｌである。 ［０００６］ Ｆ ＸＩＩＩ ａは、大腸菌において高収量で発現され
得る（Ａｍａｎｎら：Ｇｅｎｅ ６９．３０１−３１５
．１９８８）。しかし、大腸菌中で合成されたＦＸＩＩ
Ｉａのほとんどは不溶性で、したがって、酵素的に活性
ではない。原核生物中における異種発現に代わる適当な
ものは、真核生物細胞における合成である。生物学的に
活性のＦ ＸＩＩＩ ａのＣＨＯ細胞中における異種発
現は、既に示されている（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌおよ
びＫａｒｇｅｓ ：（１９８９）、ＸＩＩｔｈ Ｃｏｎ
ｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ ５ｏｃｉｅｔｙ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａ
ｈｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、 Ｔｏｋｙｏ ）。し
かしながら、この場合の収量は費用効果的生産を保証す
るには不適当である。 ［０００７］ 酵母は、一方では分子生物学的操作のためにそれらの遺
伝的性質が充分に特徴付けされており、クローニングお
よび発現ベクターが利用でき、真核生物としてそれらは
典型的なｔｌＵ訳後の修飾機構を有していることから、
宿主細胞として適している。他方、微生物として、それ
らはどちらかといえば短い世代時間を有しており、酵母
を高細胞密度で培養するための発酵工程の充分な発達が
あった。生物学的に活性なＦＸＩＩＩａがパン酵母中で
調製され得ることは、欧州特許出願筒ＥＰＡ２０．２３
６．９７８号明細書において例のかたちで既に示された
。組換え活性Ｆ ＸＩＩＩ ａはまた、分裂酵母シゾサ
ツカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）中で分子生物学的技術（Ｂｏ
ｅｋｅｒ およびＢａｅｕｍｌ： ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ、 ２４８．１０５−１１０．１９８９）を用いても
合成され得る。しかし、記述された二つの例における収
量はそれぞれ０．１５および２ｍｇ／ｌであって、調製
が経済的と思われる範囲にはない。 より高い収量は、欧州特許出願筒Ａ２０．２６８． ’
７１２号明細書に記述されている。ＦＸＩＩＩ ａ合成
が強力な解糖ＴＰＩプロモーターの調節の下にあるプラ
スミドは、１０ｍｇ／ｌの合成率をもたらす。５０ｍｇ
／ｌはＡＤＨＩＩプロモーターを用いて達成される。 ［０００８］ 〔発明の概要〕 ［０００９］
したがって、本発明の目的はＦ ＸＩＩＩ ａの発現を
改良して、１００ｍｇ／ １またはそれ以上の値を達成
することである。そのような発現率では、Ｆ ＸＩＩＩ
ａの遺伝子工学的な調製は、胎盤からの古典的精製よ
りもより費用効果的である。 ［００１０１
改良して、１００ｍｇ／ １またはそれ以上の値を達成
することである。そのような発現率では、Ｆ ＸＩＩＩ
ａの遺伝子工学的な調製は、胎盤からの古典的精製よ
りもより費用効果的である。 ［００１０１
【課題を解決するための手段］
発明者らは、バイブリドＧ ａ Ｉ ＵＡＳ ／ Ｃｙ
ｃ Ｉプロモーターの使用、発現ベクター中のＦＸＩ
ＩＩａ ｃＤＮＡの５′非劃」訳領域の欠失および３
′非翻訳領域の切詰め、特異的酵母株の選択およびグル
コースおよびガラクトースを単独でまたは組合せて含む
きわめて適切な増殖培地の使用によって、高収率のＦ
ＸＩＩＩ ａがもたらされることを見出した。バイブリ
ドＧ ａ ｌ ＵＡＳ ／ Ｃｙ ｃ Ｉプロモーター
は、ｐＥＭＢＬｙｅｘ４ （Ｃｅｓａｒｅｎｉ、
Ｇ、 およびＭｕｒｒａｙ、 Ａ、Ｈ，： Ｓｅｔ
ｌｏｗ 、 Ｊ、に、 （編集） Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ 、 Ｖｏｌ、 ９．１３
５−１５４、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１９８７ ）に由来する。 ［００１１］ 〔発明の詳細な説明〕 代表的なベクターは５′非観訳および３′非翻訳ｃＤＮ
Ａ領域のないＦ ＸＩＩＩ ｃＤＮＡを含み、後者は好
ましくは４１９塩基対（ｂｐ）から僅かの１２０ｂｐに
と短縮される。特異的ベクターｐＭＢ ３０７およびｐ
ＭＢ ３３０の合成は図および諸例に示される通りであ
る。基本的な基礎的ベクターは、そのポリリンカーに上
記の切り詰められたＦＸＩＩＩａ ｃＤＮＡが連結し
ている、上記のベクターｐ ＥＭＢＬｙ ｅ ｘ ４で
ある。 ［００１２］ ｐＥＭＢＬｙｅｘ４は、エピソームとして酵母中で約５
０個／細胞のコピー数で存在しており、選択マーカーＬ
ｅｕ２ｄおよびＵｒａ３を有しており、したがって、遺
伝子型１ｅｕ２およびｕｒａ３を有する酵母株の補完が
可能である。 Ｔｒｐ１株の補完もまた、ｐＭＢ ３０７におけるＴｒ
ｐｌ遺伝子の挿入（例２を参照されたい）で起きて、ｐ
ＭＢ３０７Ｔをもならす。 ［００１３］ ｐＭＢ３０７（７）ためにはサツカロミセス・セレビシ
ェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） ＡＨ２２および
Ｃ１３ＡＢＹＳ８６株が、ｐＭＢ３０７Ｔのためには同
１５０−２Ｂ株が、最も適していた。ＡＨ２２はＨｉ
ｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 ＵＳＡ、７５１９２９−１９３３、１９７８
）によって記述されており、Ｃ１３ＡＢＹＳ８３は欧州
特許第ＥＰ−Ａｌ−０，３２７，７９７号明細書に開示
されており、１５０−２ＢはＣ，Ｂａ１ｄａｒｉら（Ｅ
ＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、６．２２９−２３４Ｌ 、１９
８３）によって記述されている。 ［００１４］ 培地中のグルコースの存在は、ガラクトースによるＧａ
ｌまたはＧａｌ／ＵＡｓプロモーターの誘導を抑制する
。驚いたことに、発酵の開始時からグルコースに加えて
ガラクトースも培地中に存在する場合に、合成速度が著
しく増加する。加水分解されたホエー粉末は特に適して
おり、さらに、純ガラクトースと比較して安価に入手で
きる。これに代わるものとしては、β−ガラクトシダー
ゼまなはラクトースを切断する微生物を加えたホエー粉
末がある。 ［００１５］ したがって、本発明は、ガラクトースで誘導可能なブロ
ーモーターの調節下における酵母発現プラスミドと共の
加水分解ホエー粉末の使用（１）に関し、好ましくはバ
イブリドＧａＩＵＡｓ／Ｃｙｃ■プロモーター（２）
および好ましくは５′非翻訳領域が欠失されて３′非翻
訳領域が切り詰められたＦＸＩＩＩａ ｃＤＮＡを挿
入したｐＥＭＢＬｙｅｘ４ベクター構造（３）を用いる
。発現のための好ましい株は、ＬｅｕまたはＵｒａ選択
のためにはＡＨ２２株（４）およびＣ１３ＡＢＹＳ８６
（５） Ｔｒｐ選択のためには１５０−２Ｂ株（６
）である。 ［００１６］ 上記の特徴（１） （２） （３） （５
）および（６）の組合せは、ＦＸＩＩＩａ発現の最適化
に特に好ましい。１００リツトルまたはそれ以上の大き
さのファーメンタ中での工業的規模の実施においては、
５００ｍｇ／ １またはそれ以上のＦＸＩＩＩ ａ濃度
が上記の方法で達成された。 ［００１７］ ７暑開平３−２ｂｌ１８ｔ：ｉ （７）【実施例】 本発明は、以下の諸例および特許請求の範囲に更に示さ
れる通りである。 例： ココテ用いられる分子生物学的技術は、主にＭａｎｉａ
ｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 １９８
２ ）による記述、および酵母に関連しては、特にＲｏ
ｄｒｉｇｕｅｚら（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、 Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅ
ｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ 、 Ｌｏ
ｎｄｏｎ１９８３）による記述に基づいている。ＦＸＩ
ＩＩａの合成のために用いる宿主は、一つまたはそれ以
上の生合成酵素に欠陥を有する一般に入手可能なパン酵
母サツカロミセス・セレビシェの実、験室株であった。 これらの欠陥は、それぞれの場合にベクター上で対応し
て機能する遺伝子によって補完される。酵母株を、分裂
酵母のために最適にするために熱ショックを４６℃では
なく４２℃で行うように修飾したＬｉＣ１法（Ｂｒｏｅ
ｋｅｒ： 、 Ｍ、 ： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
５．５１６−５１８．１９８７）によって形質転換し
た。単一のクローンをＹＮＢ最少最少上地上ラスミドＤ
ＮＡによる形質転換の３〜４日後に選択することができ
る。Ｆ ＸＩＩＩ ａを得るための液体培養中での形質
転換体の培養を次のようにして行った。バッフルを側面
に備えた２ ５０ｍｌのエルシンマイエルフラスコ中の
５０ｍ１のＹＮＢ培地に単一コロニーを接種して、３０
℃で２日間振盪した。遺伝学的欠陥の全体がベクターに
よって補完されない酵母株を用いた場合には、０．０２
〜０．０４ｍｇ／ｌの適当なアミノ酸または塩基を培地
に加えた。そのような前培養の１０ｍ１を用いて１００
ｍ１の複合ＹＰＤ培地に接種した。これらの非選択的条
件下でのプラスミドの損失は、用いるプラスミドおよび
酵母株で異なった。Ｇａｌプロモーターを誘導するため
に、Ｆ ＸＩＩＩ ａ合成がガラクトースによって調節
し得るＧａ ｌ １またはＧ ａ Ｉ ＵＡＳ ／ Ｃ
ｙ ｃ １ハイブリドプロモーターの調節下である培養
物を、接種後２４時間に２％ガラクトースと混合した。 パン酵母は、ガラクトースを唯一の炭素源として含む培
地上で増殖することができる。ガラクトースは特異的な
ガラクトースパーミアーゼを介して細胞中に輸送されて
、最後にグルコース１−ホスフェートとして解糖系に入
る。次の酵素がこれに関与する。ガラクトキナーゼ（Ｇ
ａｌｌ） Ｄ−ガラクトース−１−ホスフェートウリ
ジルトランスフェラーゼ（Ｇａ１７）およびウリジンー
ジホスフオグルコース４−エピメラーゼ（ＧａｌｌＯ）
。これらの酵素の遺伝子は隣接しており、同等の調節の
支配を受ける。炭素源がグリセロールまたはグルコース
からガラクトースに代わると、これら遺伝子の転写は１
０００倍に増強される。ガラクトースが存在しないと、
Ｇａ ｌ １、Ｇａ１７およびＧａｌ１０はＧａ１８０
遺伝子によってコードされる負の調節タンパク質によっ
て抑制される。Ｇａ１４遺伝子によってコードされる正
の調節タンパク質はＧａ １１、Ｇａ１７およびＧａ１
１０の発現に必要とされる。少量のＧａ１８０およびＧ
ａ１４タンパク質の構成的合成がある。Ｇａ１８０タン
パク質はＧａ１４タンパク質に結合して、このようにし
て、Ｇａ１４タンパク質による遺伝子の活性化を阻害す
る。誘導物質（ガラクトースまたはこの糖の誘導体）は
、おそら（Ｇａ１８０上の部位に結合して、それによっ
てＧａ１８０タンパク質のＧａ１４タンパク質への親和
性が低減されて、Ｇａ１４が遊離するようになると考え
られる。ここでＧａ１４はおそらくそのアミノ末端とと
もにＧａ ｌ １、Ｇａ１７およびＧａｌ１０の５′領
域に結合して、遺伝子の増強された転写を引き起こす。 酵母遺伝子のこれら末端のＤＮＡ調節要素は、上流活性
化配列（ＵＡＳ）と称される。 ［００１８］ 例１ニブラスミドｐＭＢ ３０７の合成出発材料はｐ
ＦＸＩＩＩ−１０４（Ａｍａｎｎら： Ｂｅｈｒｉｎｇ
Ｉｎ５ｔ、 Ｍｉｔｔ、 ８２．３５−４２．１９８
８、図１）およびｐＥＭＢＬｙｅｘ４である。プラスミ
ドｐＥＭＢＬｙｅｘ４は大腸菌シャトルベクターである
。ベクターの必須の関連の性質は、これらが大腸菌にお
いてアンピシリン耐性遺伝子に基づいて選択され得ると
いうことである。酵母においては、選択は、ロイシンお
よび／またはウラシル栄養要求株においてＵｒａ３また
はＬｅｕ２遺伝子を介して行われる。酵母における安定
した複製は２μＤＮＡの含有によって確実となる。ベク
ターの特殊な性質はＧａ ｌ−ＣｙＣハイブリドプロモ
ーターである。遺伝子をこの要素のポリリンカー中の３
′末端に挿入することができ、それによって、この型の
組換えプラスミドを有する酵母において外来性遺伝子の
発現は調節し得るＧａ１−Ｃｙｃプロモーターの調節下
となる。効率的な転写終結は、ポリリンカーの３′末端
に位置する適当なりＮＡ単位によって確実となる。ｐＭ
Ｂ ３０７の構築は、図面に模式的に示される通りであ
る。 １２０ｂｐを越える３′非翻訳領域の欠失を有するプラ
スミドは、発現においてさらなる増加を達成しなかった
。 ［００１９］ 例２ニブラスミドｐＭＢ３０７Ｔの合成プラスミドｐＭ
Ｂ ３０７は、選択マーカーとして、遺伝子Ｌｅｕ２−
ｄおよびＵｒａ３を有しており、遺伝子型１ｅｕ２およ
びｕｒａ３を有する株を補完するために用いる。Ｔｒ
ｐ １遺伝子を有する修飾されたｐＭＢ ３０７を用い
ての形質転換は、酸加水分解タンパク質を窒素源として
含む複合培地における遺伝子型ｔｒｐｌを有する株にお
いて起きるプラスミド損失がきわめて少ないという利点
を有する。アミノ酸トリプトファンは酸によって容易に
分解されて、もはやそのような培地に存在しない。した
がって、複合培地自体がＴｒ ｐ １マーカーに関して
選択培地となる。 ベクターｐＭＢ ３０７をＢｓｔＥＩＩで線状にして、
８３０ｂｐの大きさでＴｒｐ１遺伝子を有する、プラス
ミドｐＧＬ２ （Ｄａｓ 、 Ｓ、、 Ｋｅｌｌｅｒ
ｍａｎｎ 、 Ｅ、およびＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、
Ｃ，： Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １５８．１１
６５−１１６７．１９８４ ）からの、５ｔｕＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ ＤＮＡ断片を、連結して入れた。新たなプラ
スミドｐＭＢ ３０７Ｔはまた、ここでｔｒｐ１株を補
完することができる。種々の株をｐＭＢ ３０７Ｔで形
質転換させて、Ｆ ＸＩＩＩ ａ収量を測定した。試験
株中で最高のＦ ＸＩＩＩ ａ合成率を有する株は、１
５０−２Ｂであった。 ［００２０］ 例４ニブラスミドｐＭＢ ３３０の合成欧州特許第ＥＰ
Ｏ，２３６，９７８号明細書に記載のＦＸＩＩＩａ
ｃＤＮＡは、位置８８（ＣＴＣ）でアミノ酸ロイシン
をコードする。Ｉｃｈｉｎｏｓｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ２５．６９００−６９０６．１９８６ ）は
、これに対して、この位置でフェニールアラニンをコー
ドするＴＴＣトリプレットを見出した。Ｔａｋａｈａｓ
ｈ ｉ ら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８３ ８０１９−８０２３．１９
８６ ）によって決定されたＦ ＸＩＩＩ ａのアミノ
酸配列も同様に位置８８にフェニールアラニンを見出し
た。したがって、欧州特許第ＥＰ Ｏ，２３６，９７
８号明細書に記載されている位置８８で推定されたアミ
ノ酸ロイシンはフェニールアラニンに比べると比較的ま
れな対立形質であることが可能である。プラスミドｐＭ
Ｂ ３０７と完全に同じ構造であってＣＴＣコドンがＴ
ＴＣコドン、すなわち位置８８のフェニールアラニンを
コードするコドン、で置換されている点のみが異なるＦ
ＸＩＩＩ ａ発現ベクター（ｐＭＢ ３３０）が、し
たがって構築された。 ［００２１］ 例５ニブラスミドｐＭＢ ３０７またはｐＭＢ３０７Ｔ
を用いての、Ｆ ＸＩＩＩ ａ合成率に及ぼす種々の株
の影響プラスミドｐＭＢ ３０７により、サツカロミセ
ス・セレビシェ２５２において最適培養条件下で約５ｍ
ｇ／ｌのＦ ＸＩＩＩ ａ合成が確実となる。ＨＤ株に
おけるＦＸＩＩＩ ａの収量は、かなり低かった。これ
は、高いＦ ＸＩＩＩ ａ合成率がプラスミドおよび培
地に依存することだけでなく、細胞性因子もまた収量に
影響を及ぼし得ることを示す。したがって、いくつかの
株をベクターｐＭＢ ３０７で別々に形質転換させて、
振盪培養におけるＦ ＸＩＩＩ ａの合成能を分析した
。結果は表１にまとめられた通りである。各々の株で広
範囲に異なるＦＸＩＩＩａ収量を達成することが可能で
あることが判明した。高収量のＦ ＸＩＩＩ ａ合或は
、高細胞密度に達しておりプラスミド損失が小さい株に
おいてのみ達成することが可能であった。一方、よく増
殖してプラスミド損失が少ない株は、Ｆ ＸＩＩＩ ａ
の充分な収量を必ずしも保証しない。驚いたことに、そ
の能力はほとんどの栄養要求性マーカーとも関連しない
。これは生合成酵素に三つまたは五つもの欠陥を有する
株でさえも５〜７ｍｇ／ｌのかなりのＦ ＸＩＩＩ ａ
収率を達成するからである。試験株中で注目されるもの
は、１０ｍｇ／ｌを越えるＦ ＸＩＩＩ ａの収量を示
すＡＨ２２およびＣ１３ＡＢＹＳ８６株である。プラス
ミドｐＭＢ ３０７は選択マーカーとして遺伝子Ｌｅｕ
２−ｄおよびＵｒａ３を有し、これは遺伝子型１ｅｕ２
およびｕｒａ３を有する株の補完に用いられる。Ｔｒｐ
ｌ遺伝子を有する修飾されたｐＭＢ ３０７による形質
転換は酸加水分解タンパク質を窒素源として含む複合培
地における遺伝子型ｔｒｐｌを有する株において起きる
プラスミド損失がきわめて少ないという利点を有する。 アミノ酸トリプトファンは酸によって容易に分解されて
、もはやそのような培地に存在しない。したがって、複
合培地自体がＴｒ ｐ １マーカーに関して選択培地と
なる。 ベクターｐＭＢ ３０７をＢｓｔＥＩＩで線状にして、
８３０ｂｐの大きさでＴｒｐ１遺伝子を有する、プラス
ミドｐＧＬ２ （Ｄａｓ 、 Ｓ、、 Ｋｅｌｌｅｒ
ｍａｎｎ 、 Ｅ、およびＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ 、
Ｃ，： Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １５８．１
１６５−１１６７．１９８４ ）からの、５ｔｕＩ／Ｅ
ｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を、連結して入れた。新たなプ
ラスミドｐＭＢ ３０７Ｔもまた、ここでｔｒｐ１株を
補完することができる。種々の株をｐＭＢ ３０７Ｔで
形質転換させて、Ｆ ＸＩＩＩ ａ収量を決定した。試
験株中で最高のＦ ＸＩＩＩ ａ合成率を有する株は１
５０−２Ｂで、Ｆ ＸＩＩＩ ａの収量は８ｍｇ／ｌで
あった。 ［００２２］ 例６：ｐＭＢ３０７形質転換体におけるＦ ＸＩＩＩ
ａ収量に及ぼす培地の影響通常の培地中での振盪培養で
プラスミドｐＭＢ ３０７を用いて達成された収量から
出発して、培地の組成を変えることによって合成率を高
める試みがなされた。プラスミドｐＭＢ ３０７を有す
る酵母細胞におけるＦ ＸＩＩＩ ａ特異性ｃＤＮＡの
転写は、炭素源によって調節される。グルコースのみを
含む培地ではＦ ＸＩＩＩ ａは産生されない。試験は
また、Ｆ ＸＩＩＩ ａ特異性転写の誘導のタイミング
がＦ ＸＩＩＩ ａ収量に影響するかどうかおよび増殖
期中にＦ ＸＩＩＩ ａの収率を低減させることなくエ
ネルギー源のグルコースを他の炭素源で置換され得るか
どうかを知るために行われた。 ＹＰＤ培地中のグルコースをマルトースまたはグリセロ
ールで置換し、２４時間後に培地に２％ガラクトースを
加える場合には、再び収量は約２．５〜３ｍｇ／ｌであ
る。これに対して、培地中のグルコースを最初からガラ
クトースで置換する場合には、Ｆ ＸＩＩＩ ａの収量
は僅かに約１ｍｇ／ｌである。細胞数がグルコースのみ
を含むまたは２４時間後にガラクトースを加えた培養物
と全く同じく約５×１０８７ｍ１と高いことから、この
比較的低い収量は低減された増殖に起因するものではな
い。おそら（ＦＸＩＩＩａ合成は増殖期の間でさえも細
胞代謝に悪影響を及ぼし、このようにして、イディオ期
中のＦ ＸＩＩＩ ａ合成を害するものと考えられる。 Ｆ ＸＩＩＩ ａ合成が強力ではあるが構成的なＡＤＣ
プロモーターの調節下にある振盪培養においてＦ ＸＩ
ＩＩ ａの収量が同様に１ｍｇ／ｌを越えないという事
実によって、この観察は支持される。 酵母におけるＦ ＸＩＩＩ ａの収量は、グルコースが
培地にもはや存在しない場合には２４時間後にガラクト
ースを加えることによってＦ ＸＩＩＩ ａ合成を誘導
するだけではなく、さらに２４時間および４８時間後に
ガラクトースを再度加えることによって、４ｍｇ／ｌに
まで増加し得る。各々の場合、ガラクトースの最終濃度
は２％である。発酵の開始時に複合培地がグルコースの
みならずさらにガラクトースをも含む場合およびガラク
トースの添加を各日付う場合には、生産率は５ｍｇ／１
以上に増加さえする。このＹＰＤ培地へのグルコースお
よびガラクトース添加を以下ＹＰＤＧ培地と称する。Ｆ
ＸＩＩＩ ａ合或は、培地にグルコースが存在する限
りはガラクトースによっては誘導されないようである。 一方、これらの条件下でグルコース消費後の代謝転換が
直ちに起き得て、後期増殖期においてガラクトースはエ
ネルギー源および誘導物質の双方として作用する。した
がって、培地の適当な組成を用いることによってＦ Ｘ
ＩＩＩ ａの収量を通常の標準培地に較べて約２倍にす
ることが可能であった。 ［００２３］ 例７：ガラクトース源としてのホエーおよびホエー加水
分解物ヘクターｐＭＢ ３０７およびｐＭＢ３３０のた
めに、Ｆ ＸＩＩＩ ａ合或は培地中のグルコースによ
って厳しく抑制され、ガラクトースによって誘導される
。グルコースが培地に存在する限り、ガラクトースの存
在下でさえも誘導は防止されることは明かである。ガラ
クトースは高価な糖であることから、純ガラクトースに
よらず、ガラクトースを特に含む手ごろな価格の培地に
よって誘導を起こさせる試みがなされた。Ｍｏ１ｋｅｒ
ｅｉ−Ｚｅｎｔｒａｌｅ Ｗｅｓｔｆａｌｅｎ−Ｌｉｐ
ｐｅ ｅＧ （Ｍｕｅｎｓｔｅｒ）からの加水分解ホエ
ー粉末をこの目的のために試験した。このホエー粉末は
、タンパク質、脂質およびミネラルの他に、約１８％の
グルコース、１３％のガラクトースおよび約２３％のラ
クトースをも含む。 ２０ｇの加水分解ホエー粉末を１００ｍ１の水中で撹拌
して、６０℃に加熱してから溶解した。この調製物を１
０，０００ｇで３０分間遠心分離して、次いで上清を濾
過滅菌した。この溶液を、滅菌水で１：１に（Ａ）また
は濃縮したＹＰＤで１：１に（Ｂ）希釈した。サツカロ
ミセス・セレビシェＣ１３ＡＢＹＳ８６ ［ｐＭＢ ３
０７またはｐＭＢ ３３０］にょるＦ ＸＩＩＩ ａの
収率は、培地Ａにおイテ僅かに約５ｍｇ／ｌであった。 これに対して、１００ｍｇ／ １以上のＦ ＸＩＩＩ
ａが培地Ｂにおいて検出された。したがって、酪農業に
おいて過剰に生産されるためにきわめて手ごろな価格と
なるホエー粉末カミ含有ラクトースをグルコースおよび
ガラクトースに加水分解した後にＦ ＸＩＩＩ ａの組
換え合成のための適切な物質として、使用され得ること
を示すことが可能であった。事実、まだ同定されていな
い物質によって、純ガラクトースを用いて誘導された培
養物に較べてがなり高いＦＸＩＩＩａ合成がもたらされ
る。Ｄｅ Ｍｅｌｋ−ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ Ｂｅｇｈｅ
ｌ （ＢＡ Ｂｅｇｈｅｌ 、 ＮＬ ）からの部分
的に脱塩した濃縮チーズホエーを用いた場合に高いＦ
ＸＩＩＩ ａ収量を達成することも可能であった。代替
物としての他の適当なガラクトース源としては、未処理
状態で、ラクトースを含むがガラクトースを含まないホ
エー粉末がある。ホエー粉末に存在するこのラクトース
を、その粉末をＹＰＤ中に懸濁しておいた後に大腸菌か
らのβ−ガラクトシダーゼを用いてグルコースおよびガ
ラクトースに加水分解した。この型の調製もまた、酵母
における高Ｆ ＸＩＩＩ ａ合成をももたらした。大腸
菌またはクルベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ １ａｃｔｉｓ）からのβガラクトシダー
ゼ（遊離型または固定化されたもの）をホエー粉末添加
酵母培養物に加えることによって、発酵中にだけガラク
トースが切断によって遊離させることもさらに可能であ
った。 さらにＦ ＸＩＩＩ ａ生産のために適しているガラク
トース源としてホエー加水分解物の代わりになるものは
ラクトース加水分解物である。市販のラクトース加水分
解物（例えばＢｉｏｌａｃ ＧｍｂＨ、Ｄ−３２２１Ｈ
ａｒｂｅｒｎｓｅｎ またはＩＭＡ ＧｍｂＨｌＤ−
６０７８Ｚｅｐｐｅｌｉｎｈｅｉｍ ）は、全糖含有量
的５０％でグルコースとガラクトースノ割合は約１：１
で、単糖類の他に、切断されていないラクトースもまた
５〜１５％の濃度で存在する。そのようなラクトース加
水分解物は、組換え酵母の発酵に悪影響を及ぼすカラメ
ル化度物を形成することなくオートクレーブによって滅
菌され得る。ホエー加水分解物およびラクトース加水分
解物中に存在するグルコースは、サツカロミセス・セレ
ビシェ［ｐＭＢ３０７］またはサツカロミセス・セレビ
シェ［ｐＭＢ ３３０］によるＦ ＸＩＩＩ ａ合成の
誘導およびＦ ＸＩＩＩ ａの生産をいかようにも損な
わないということが見出された。グルコースは文献にガ
ラクトースオペロンの誘導の阻害物質として記述されて
いることから、これは予期しない発見であった。さらに
、スプレードライ化ラクトース加水分解物もまた、適当
な方法によって滅菌した後に市販のラクトース加水分解
物溶液の代わりに、発酵に使用できる。ここで記述する
Ｆ ＸＩＩＩ ａＯ高収量は、プラスミドｐＭＢ ３０
７またはｐＭＢ ３３０のいずれかを含んだ形質転換体
を用いて達成された。したがって高合成率は特定の対立
形質によるものではないということが考えられ得る。し
たがって、高収量はロイシン８８のフェニールアラニン
８８による置き換え以外のアミノ酸置換を用いてもこの
最適化された生産工程によって保証されることが期待で
きるであろう。 ５００ｍｇ／ ｌまなはそれ以上のＦ ＸＩＩＩ ａ濃
度を、上記の培地およびいわゆるプラスミドｐＭＢ ３
０７またはｐＭＢ ３３０を用いて１００〜５００リツ
トルのファーメンタの規模での変換で達成しな。 精製されたＦＸＩＩＩａは、全ての試、験基準によれば
胎盤からのＦＸＩＩＩａと同一であった。 ［００２４］ 表１ａ パン酵母の種々の株におけるＦ ＸＩＩＩ ａの収量株
欠損遺伝子 Ｆ ＸＩＩＩ ａ 細胞
数（ｍｇ／ｌ） １００万 ７ｍ１ Ｃ１３ＡＢＹ５８６ ｅｐ４−３ ｃ７９ ｃ２５２ ５Ｏ−２Ｂ Ｈ２２ １ｅｕ２． ｕｒａ３． ｈｉｓ ｅｕ２ １ｅｕ２． ｔｒｐＨ ｅｕ２． ｕｒａ３． ａｄｅｌ ｕｒａ３． ｈｉｓ４． ａｄｅ６ １ｅｕ２． ｕｒａ３． ｔｒｐｌ １ｓ３ １ｅｕ２． ｈｉｓ４ ＜０．０１ ６３０ １．５ １０４０ ＜０．０１ ｎ、ｄ。 血漿 （Ｐｌａｓｍ。 ５ｔａｂ、 ） （Ｚ） １００ ３０．４ １００ ２５．４ ｎ、 ｄ、 ７．０ ９１ ２５．８ ＯＤ６００ ｐ Ｈ （Ｚ） ４．１ ４．２ ４．０ ４．８ ４．５ ４．５ ３４．５ ｎ、 ｄ。 ２１５ １ｅｕ２． ｈｉｓ３ ２２５ ｕｒａ３ ２２６ ｕｒａ３ ２２７ ｕｒａ３ ７．５ ＜ｏ、ｏｉ ＜０．０１ ０．１ ３３．３ ５．０ ５．７ １５．７ ４．０ ４．２ ４．５ ｎ、 ｄ。 表１ｂ ｌｅｕ２．ｕｒａ３．ｈｉｓ３ ＜０．０１１ｙ
ｓ２． ｔｒｐＨ ｅｕ２． ｔｒｐｌ ＜０．０１１ｅｕ２
．ｔｒｐｌ、ｈｉｓ３ ＜０．０１１ｅｕ２．
ｕｒａ３． ｔｒｐｌ Ｏ，５ｕｒａ３
０．４ １ｅｕ２． ｕｒａ３． ｈｉｓ４ ０．８ｄｅｌ ｌｅｕ２． ｕｒａ３． ｈｉｓ５ ＜０．０１
ｒｐ５ １ｅｕ２． ｔｒｐｌ、 ｈｉｓ３ ５１ｙｓｌ
、 ａｒｇ４ １ｅｕ２．ｕｒａ３．ｔｒｐｌ ７ｈｉｓ３．
ａｄｅ２ １ｅｕ２． ｕｒａ３． ｔｒｐｌ ６ｈｉｓ
３． ａｄｅｌ、 ａｒｇ４ ｙｓ２ １ｅｕ２．七ｒｐｌ ＜０．０
１ｕｒａ３，１ｅｕ２．ａｄｅ３ ＜０．
０１ｔｒｐｌ、 ｈｉｓ３ ＮＫＹ２９０ ｕｒａ３．ｔｒｐｌｎ、ｄ、：測定
せず。ｆ：綿状の固ま
ｃ Ｉプロモーターの使用、発現ベクター中のＦＸＩ
ＩＩａ ｃＤＮＡの５′非劃」訳領域の欠失および３
′非翻訳領域の切詰め、特異的酵母株の選択およびグル
コースおよびガラクトースを単独でまたは組合せて含む
きわめて適切な増殖培地の使用によって、高収率のＦ
ＸＩＩＩ ａがもたらされることを見出した。バイブリ
ドＧ ａ ｌ ＵＡＳ ／ Ｃｙ ｃ Ｉプロモーター
は、ｐＥＭＢＬｙｅｘ４ （Ｃｅｓａｒｅｎｉ、
Ｇ、 およびＭｕｒｒａｙ、 Ａ、Ｈ，： Ｓｅｔ
ｌｏｗ 、 Ｊ、に、 （編集） Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ 、 Ｖｏｌ、 ９．１３
５−１５４、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１９８７ ）に由来する。 ［００１１］ 〔発明の詳細な説明〕 代表的なベクターは５′非観訳および３′非翻訳ｃＤＮ
Ａ領域のないＦ ＸＩＩＩ ｃＤＮＡを含み、後者は好
ましくは４１９塩基対（ｂｐ）から僅かの１２０ｂｐに
と短縮される。特異的ベクターｐＭＢ ３０７およびｐ
ＭＢ ３３０の合成は図および諸例に示される通りであ
る。基本的な基礎的ベクターは、そのポリリンカーに上
記の切り詰められたＦＸＩＩＩａ ｃＤＮＡが連結し
ている、上記のベクターｐ ＥＭＢＬｙ ｅ ｘ ４で
ある。 ［００１２］ ｐＥＭＢＬｙｅｘ４は、エピソームとして酵母中で約５
０個／細胞のコピー数で存在しており、選択マーカーＬ
ｅｕ２ｄおよびＵｒａ３を有しており、したがって、遺
伝子型１ｅｕ２およびｕｒａ３を有する酵母株の補完が
可能である。 Ｔｒｐ１株の補完もまた、ｐＭＢ ３０７におけるＴｒ
ｐｌ遺伝子の挿入（例２を参照されたい）で起きて、ｐ
ＭＢ３０７Ｔをもならす。 ［００１３］ ｐＭＢ３０７（７）ためにはサツカロミセス・セレビシ
ェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） ＡＨ２２および
Ｃ１３ＡＢＹＳ８６株が、ｐＭＢ３０７Ｔのためには同
１５０−２Ｂ株が、最も適していた。ＡＨ２２はＨｉ
ｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 ＵＳＡ、７５１９２９−１９３３、１９７８
）によって記述されており、Ｃ１３ＡＢＹＳ８３は欧州
特許第ＥＰ−Ａｌ−０，３２７，７９７号明細書に開示
されており、１５０−２ＢはＣ，Ｂａ１ｄａｒｉら（Ｅ
ＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、６．２２９−２３４Ｌ 、１９
８３）によって記述されている。 ［００１４］ 培地中のグルコースの存在は、ガラクトースによるＧａ
ｌまたはＧａｌ／ＵＡｓプロモーターの誘導を抑制する
。驚いたことに、発酵の開始時からグルコースに加えて
ガラクトースも培地中に存在する場合に、合成速度が著
しく増加する。加水分解されたホエー粉末は特に適して
おり、さらに、純ガラクトースと比較して安価に入手で
きる。これに代わるものとしては、β−ガラクトシダー
ゼまなはラクトースを切断する微生物を加えたホエー粉
末がある。 ［００１５］ したがって、本発明は、ガラクトースで誘導可能なブロ
ーモーターの調節下における酵母発現プラスミドと共の
加水分解ホエー粉末の使用（１）に関し、好ましくはバ
イブリドＧａＩＵＡｓ／Ｃｙｃ■プロモーター（２）
および好ましくは５′非翻訳領域が欠失されて３′非翻
訳領域が切り詰められたＦＸＩＩＩａ ｃＤＮＡを挿
入したｐＥＭＢＬｙｅｘ４ベクター構造（３）を用いる
。発現のための好ましい株は、ＬｅｕまたはＵｒａ選択
のためにはＡＨ２２株（４）およびＣ１３ＡＢＹＳ８６
（５） Ｔｒｐ選択のためには１５０−２Ｂ株（６
）である。 ［００１６］ 上記の特徴（１） （２） （３） （５
）および（６）の組合せは、ＦＸＩＩＩａ発現の最適化
に特に好ましい。１００リツトルまたはそれ以上の大き
さのファーメンタ中での工業的規模の実施においては、
５００ｍｇ／ １またはそれ以上のＦＸＩＩＩ ａ濃度
が上記の方法で達成された。 ［００１７］ ７暑開平３−２ｂｌ１８ｔ：ｉ （７）【実施例】 本発明は、以下の諸例および特許請求の範囲に更に示さ
れる通りである。 例： ココテ用いられる分子生物学的技術は、主にＭａｎｉａ
ｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 １９８
２ ）による記述、および酵母に関連しては、特にＲｏ
ｄｒｉｇｕｅｚら（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、 Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅ
ｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ 、 Ｌｏ
ｎｄｏｎ１９８３）による記述に基づいている。ＦＸＩ
ＩＩａの合成のために用いる宿主は、一つまたはそれ以
上の生合成酵素に欠陥を有する一般に入手可能なパン酵
母サツカロミセス・セレビシェの実、験室株であった。 これらの欠陥は、それぞれの場合にベクター上で対応し
て機能する遺伝子によって補完される。酵母株を、分裂
酵母のために最適にするために熱ショックを４６℃では
なく４２℃で行うように修飾したＬｉＣ１法（Ｂｒｏｅ
ｋｅｒ： 、 Ｍ、 ： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
５．５１６−５１８．１９８７）によって形質転換し
た。単一のクローンをＹＮＢ最少最少上地上ラスミドＤ
ＮＡによる形質転換の３〜４日後に選択することができ
る。Ｆ ＸＩＩＩ ａを得るための液体培養中での形質
転換体の培養を次のようにして行った。バッフルを側面
に備えた２ ５０ｍｌのエルシンマイエルフラスコ中の
５０ｍ１のＹＮＢ培地に単一コロニーを接種して、３０
℃で２日間振盪した。遺伝学的欠陥の全体がベクターに
よって補完されない酵母株を用いた場合には、０．０２
〜０．０４ｍｇ／ｌの適当なアミノ酸または塩基を培地
に加えた。そのような前培養の１０ｍ１を用いて１００
ｍ１の複合ＹＰＤ培地に接種した。これらの非選択的条
件下でのプラスミドの損失は、用いるプラスミドおよび
酵母株で異なった。Ｇａｌプロモーターを誘導するため
に、Ｆ ＸＩＩＩ ａ合成がガラクトースによって調節
し得るＧａ ｌ １またはＧ ａ Ｉ ＵＡＳ ／ Ｃ
ｙ ｃ １ハイブリドプロモーターの調節下である培養
物を、接種後２４時間に２％ガラクトースと混合した。 パン酵母は、ガラクトースを唯一の炭素源として含む培
地上で増殖することができる。ガラクトースは特異的な
ガラクトースパーミアーゼを介して細胞中に輸送されて
、最後にグルコース１−ホスフェートとして解糖系に入
る。次の酵素がこれに関与する。ガラクトキナーゼ（Ｇ
ａｌｌ） Ｄ−ガラクトース−１−ホスフェートウリ
ジルトランスフェラーゼ（Ｇａ１７）およびウリジンー
ジホスフオグルコース４−エピメラーゼ（ＧａｌｌＯ）
。これらの酵素の遺伝子は隣接しており、同等の調節の
支配を受ける。炭素源がグリセロールまたはグルコース
からガラクトースに代わると、これら遺伝子の転写は１
０００倍に増強される。ガラクトースが存在しないと、
Ｇａ ｌ １、Ｇａ１７およびＧａｌ１０はＧａ１８０
遺伝子によってコードされる負の調節タンパク質によっ
て抑制される。Ｇａ１４遺伝子によってコードされる正
の調節タンパク質はＧａ １１、Ｇａ１７およびＧａ１
１０の発現に必要とされる。少量のＧａ１８０およびＧ
ａ１４タンパク質の構成的合成がある。Ｇａ１８０タン
パク質はＧａ１４タンパク質に結合して、このようにし
て、Ｇａ１４タンパク質による遺伝子の活性化を阻害す
る。誘導物質（ガラクトースまたはこの糖の誘導体）は
、おそら（Ｇａ１８０上の部位に結合して、それによっ
てＧａ１８０タンパク質のＧａ１４タンパク質への親和
性が低減されて、Ｇａ１４が遊離するようになると考え
られる。ここでＧａ１４はおそらくそのアミノ末端とと
もにＧａ ｌ １、Ｇａ１７およびＧａｌ１０の５′領
域に結合して、遺伝子の増強された転写を引き起こす。 酵母遺伝子のこれら末端のＤＮＡ調節要素は、上流活性
化配列（ＵＡＳ）と称される。 ［００１８］ 例１ニブラスミドｐＭＢ ３０７の合成出発材料はｐ
ＦＸＩＩＩ−１０４（Ａｍａｎｎら： Ｂｅｈｒｉｎｇ
Ｉｎ５ｔ、 Ｍｉｔｔ、 ８２．３５−４２．１９８
８、図１）およびｐＥＭＢＬｙｅｘ４である。プラスミ
ドｐＥＭＢＬｙｅｘ４は大腸菌シャトルベクターである
。ベクターの必須の関連の性質は、これらが大腸菌にお
いてアンピシリン耐性遺伝子に基づいて選択され得ると
いうことである。酵母においては、選択は、ロイシンお
よび／またはウラシル栄養要求株においてＵｒａ３また
はＬｅｕ２遺伝子を介して行われる。酵母における安定
した複製は２μＤＮＡの含有によって確実となる。ベク
ターの特殊な性質はＧａ ｌ−ＣｙＣハイブリドプロモ
ーターである。遺伝子をこの要素のポリリンカー中の３
′末端に挿入することができ、それによって、この型の
組換えプラスミドを有する酵母において外来性遺伝子の
発現は調節し得るＧａ１−Ｃｙｃプロモーターの調節下
となる。効率的な転写終結は、ポリリンカーの３′末端
に位置する適当なりＮＡ単位によって確実となる。ｐＭ
Ｂ ３０７の構築は、図面に模式的に示される通りであ
る。 １２０ｂｐを越える３′非翻訳領域の欠失を有するプラ
スミドは、発現においてさらなる増加を達成しなかった
。 ［００１９］ 例２ニブラスミドｐＭＢ３０７Ｔの合成プラスミドｐＭ
Ｂ ３０７は、選択マーカーとして、遺伝子Ｌｅｕ２−
ｄおよびＵｒａ３を有しており、遺伝子型１ｅｕ２およ
びｕｒａ３を有する株を補完するために用いる。Ｔｒ
ｐ １遺伝子を有する修飾されたｐＭＢ ３０７を用い
ての形質転換は、酸加水分解タンパク質を窒素源として
含む複合培地における遺伝子型ｔｒｐｌを有する株にお
いて起きるプラスミド損失がきわめて少ないという利点
を有する。アミノ酸トリプトファンは酸によって容易に
分解されて、もはやそのような培地に存在しない。した
がって、複合培地自体がＴｒ ｐ １マーカーに関して
選択培地となる。 ベクターｐＭＢ ３０７をＢｓｔＥＩＩで線状にして、
８３０ｂｐの大きさでＴｒｐ１遺伝子を有する、プラス
ミドｐＧＬ２ （Ｄａｓ 、 Ｓ、、 Ｋｅｌｌｅｒ
ｍａｎｎ 、 Ｅ、およびＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、
Ｃ，： Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １５８．１１
６５−１１６７．１９８４ ）からの、５ｔｕＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ ＤＮＡ断片を、連結して入れた。新たなプラ
スミドｐＭＢ ３０７Ｔはまた、ここでｔｒｐ１株を補
完することができる。種々の株をｐＭＢ ３０７Ｔで形
質転換させて、Ｆ ＸＩＩＩ ａ収量を測定した。試験
株中で最高のＦ ＸＩＩＩ ａ合成率を有する株は、１
５０−２Ｂであった。 ［００２０］ 例４ニブラスミドｐＭＢ ３３０の合成欧州特許第ＥＰ
Ｏ，２３６，９７８号明細書に記載のＦＸＩＩＩａ
ｃＤＮＡは、位置８８（ＣＴＣ）でアミノ酸ロイシン
をコードする。Ｉｃｈｉｎｏｓｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ２５．６９００−６９０６．１９８６ ）は
、これに対して、この位置でフェニールアラニンをコー
ドするＴＴＣトリプレットを見出した。Ｔａｋａｈａｓ
ｈ ｉ ら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８３ ８０１９−８０２３．１９
８６ ）によって決定されたＦ ＸＩＩＩ ａのアミノ
酸配列も同様に位置８８にフェニールアラニンを見出し
た。したがって、欧州特許第ＥＰ Ｏ，２３６，９７
８号明細書に記載されている位置８８で推定されたアミ
ノ酸ロイシンはフェニールアラニンに比べると比較的ま
れな対立形質であることが可能である。プラスミドｐＭ
Ｂ ３０７と完全に同じ構造であってＣＴＣコドンがＴ
ＴＣコドン、すなわち位置８８のフェニールアラニンを
コードするコドン、で置換されている点のみが異なるＦ
ＸＩＩＩ ａ発現ベクター（ｐＭＢ ３３０）が、し
たがって構築された。 ［００２１］ 例５ニブラスミドｐＭＢ ３０７またはｐＭＢ３０７Ｔ
を用いての、Ｆ ＸＩＩＩ ａ合成率に及ぼす種々の株
の影響プラスミドｐＭＢ ３０７により、サツカロミセ
ス・セレビシェ２５２において最適培養条件下で約５ｍ
ｇ／ｌのＦ ＸＩＩＩ ａ合成が確実となる。ＨＤ株に
おけるＦＸＩＩＩ ａの収量は、かなり低かった。これ
は、高いＦ ＸＩＩＩ ａ合成率がプラスミドおよび培
地に依存することだけでなく、細胞性因子もまた収量に
影響を及ぼし得ることを示す。したがって、いくつかの
株をベクターｐＭＢ ３０７で別々に形質転換させて、
振盪培養におけるＦ ＸＩＩＩ ａの合成能を分析した
。結果は表１にまとめられた通りである。各々の株で広
範囲に異なるＦＸＩＩＩａ収量を達成することが可能で
あることが判明した。高収量のＦ ＸＩＩＩ ａ合或は
、高細胞密度に達しておりプラスミド損失が小さい株に
おいてのみ達成することが可能であった。一方、よく増
殖してプラスミド損失が少ない株は、Ｆ ＸＩＩＩ ａ
の充分な収量を必ずしも保証しない。驚いたことに、そ
の能力はほとんどの栄養要求性マーカーとも関連しない
。これは生合成酵素に三つまたは五つもの欠陥を有する
株でさえも５〜７ｍｇ／ｌのかなりのＦ ＸＩＩＩ ａ
収率を達成するからである。試験株中で注目されるもの
は、１０ｍｇ／ｌを越えるＦ ＸＩＩＩ ａの収量を示
すＡＨ２２およびＣ１３ＡＢＹＳ８６株である。プラス
ミドｐＭＢ ３０７は選択マーカーとして遺伝子Ｌｅｕ
２−ｄおよびＵｒａ３を有し、これは遺伝子型１ｅｕ２
およびｕｒａ３を有する株の補完に用いられる。Ｔｒｐ
ｌ遺伝子を有する修飾されたｐＭＢ ３０７による形質
転換は酸加水分解タンパク質を窒素源として含む複合培
地における遺伝子型ｔｒｐｌを有する株において起きる
プラスミド損失がきわめて少ないという利点を有する。 アミノ酸トリプトファンは酸によって容易に分解されて
、もはやそのような培地に存在しない。したがって、複
合培地自体がＴｒ ｐ １マーカーに関して選択培地と
なる。 ベクターｐＭＢ ３０７をＢｓｔＥＩＩで線状にして、
８３０ｂｐの大きさでＴｒｐ１遺伝子を有する、プラス
ミドｐＧＬ２ （Ｄａｓ 、 Ｓ、、 Ｋｅｌｌｅｒ
ｍａｎｎ 、 Ｅ、およびＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ 、
Ｃ，： Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １５８．１
１６５−１１６７．１９８４ ）からの、５ｔｕＩ／Ｅ
ｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を、連結して入れた。新たなプ
ラスミドｐＭＢ ３０７Ｔもまた、ここでｔｒｐ１株を
補完することができる。種々の株をｐＭＢ ３０７Ｔで
形質転換させて、Ｆ ＸＩＩＩ ａ収量を決定した。試
験株中で最高のＦ ＸＩＩＩ ａ合成率を有する株は１
５０−２Ｂで、Ｆ ＸＩＩＩ ａの収量は８ｍｇ／ｌで
あった。 ［００２２］ 例６：ｐＭＢ３０７形質転換体におけるＦ ＸＩＩＩ
ａ収量に及ぼす培地の影響通常の培地中での振盪培養で
プラスミドｐＭＢ ３０７を用いて達成された収量から
出発して、培地の組成を変えることによって合成率を高
める試みがなされた。プラスミドｐＭＢ ３０７を有す
る酵母細胞におけるＦ ＸＩＩＩ ａ特異性ｃＤＮＡの
転写は、炭素源によって調節される。グルコースのみを
含む培地ではＦ ＸＩＩＩ ａは産生されない。試験は
また、Ｆ ＸＩＩＩ ａ特異性転写の誘導のタイミング
がＦ ＸＩＩＩ ａ収量に影響するかどうかおよび増殖
期中にＦ ＸＩＩＩ ａの収率を低減させることなくエ
ネルギー源のグルコースを他の炭素源で置換され得るか
どうかを知るために行われた。 ＹＰＤ培地中のグルコースをマルトースまたはグリセロ
ールで置換し、２４時間後に培地に２％ガラクトースを
加える場合には、再び収量は約２．５〜３ｍｇ／ｌであ
る。これに対して、培地中のグルコースを最初からガラ
クトースで置換する場合には、Ｆ ＸＩＩＩ ａの収量
は僅かに約１ｍｇ／ｌである。細胞数がグルコースのみ
を含むまたは２４時間後にガラクトースを加えた培養物
と全く同じく約５×１０８７ｍ１と高いことから、この
比較的低い収量は低減された増殖に起因するものではな
い。おそら（ＦＸＩＩＩａ合成は増殖期の間でさえも細
胞代謝に悪影響を及ぼし、このようにして、イディオ期
中のＦ ＸＩＩＩ ａ合成を害するものと考えられる。 Ｆ ＸＩＩＩ ａ合成が強力ではあるが構成的なＡＤＣ
プロモーターの調節下にある振盪培養においてＦ ＸＩ
ＩＩ ａの収量が同様に１ｍｇ／ｌを越えないという事
実によって、この観察は支持される。 酵母におけるＦ ＸＩＩＩ ａの収量は、グルコースが
培地にもはや存在しない場合には２４時間後にガラクト
ースを加えることによってＦ ＸＩＩＩ ａ合成を誘導
するだけではなく、さらに２４時間および４８時間後に
ガラクトースを再度加えることによって、４ｍｇ／ｌに
まで増加し得る。各々の場合、ガラクトースの最終濃度
は２％である。発酵の開始時に複合培地がグルコースの
みならずさらにガラクトースをも含む場合およびガラク
トースの添加を各日付う場合には、生産率は５ｍｇ／１
以上に増加さえする。このＹＰＤ培地へのグルコースお
よびガラクトース添加を以下ＹＰＤＧ培地と称する。Ｆ
ＸＩＩＩ ａ合或は、培地にグルコースが存在する限
りはガラクトースによっては誘導されないようである。 一方、これらの条件下でグルコース消費後の代謝転換が
直ちに起き得て、後期増殖期においてガラクトースはエ
ネルギー源および誘導物質の双方として作用する。した
がって、培地の適当な組成を用いることによってＦ Ｘ
ＩＩＩ ａの収量を通常の標準培地に較べて約２倍にす
ることが可能であった。 ［００２３］ 例７：ガラクトース源としてのホエーおよびホエー加水
分解物ヘクターｐＭＢ ３０７およびｐＭＢ３３０のた
めに、Ｆ ＸＩＩＩ ａ合或は培地中のグルコースによ
って厳しく抑制され、ガラクトースによって誘導される
。グルコースが培地に存在する限り、ガラクトースの存
在下でさえも誘導は防止されることは明かである。ガラ
クトースは高価な糖であることから、純ガラクトースに
よらず、ガラクトースを特に含む手ごろな価格の培地に
よって誘導を起こさせる試みがなされた。Ｍｏ１ｋｅｒ
ｅｉ−Ｚｅｎｔｒａｌｅ Ｗｅｓｔｆａｌｅｎ−Ｌｉｐ
ｐｅ ｅＧ （Ｍｕｅｎｓｔｅｒ）からの加水分解ホエ
ー粉末をこの目的のために試験した。このホエー粉末は
、タンパク質、脂質およびミネラルの他に、約１８％の
グルコース、１３％のガラクトースおよび約２３％のラ
クトースをも含む。 ２０ｇの加水分解ホエー粉末を１００ｍ１の水中で撹拌
して、６０℃に加熱してから溶解した。この調製物を１
０，０００ｇで３０分間遠心分離して、次いで上清を濾
過滅菌した。この溶液を、滅菌水で１：１に（Ａ）また
は濃縮したＹＰＤで１：１に（Ｂ）希釈した。サツカロ
ミセス・セレビシェＣ１３ＡＢＹＳ８６ ［ｐＭＢ ３
０７またはｐＭＢ ３３０］にょるＦ ＸＩＩＩ ａの
収率は、培地Ａにおイテ僅かに約５ｍｇ／ｌであった。 これに対して、１００ｍｇ／ １以上のＦ ＸＩＩＩ
ａが培地Ｂにおいて検出された。したがって、酪農業に
おいて過剰に生産されるためにきわめて手ごろな価格と
なるホエー粉末カミ含有ラクトースをグルコースおよび
ガラクトースに加水分解した後にＦ ＸＩＩＩ ａの組
換え合成のための適切な物質として、使用され得ること
を示すことが可能であった。事実、まだ同定されていな
い物質によって、純ガラクトースを用いて誘導された培
養物に較べてがなり高いＦＸＩＩＩａ合成がもたらされ
る。Ｄｅ Ｍｅｌｋ−ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ Ｂｅｇｈｅ
ｌ （ＢＡ Ｂｅｇｈｅｌ 、 ＮＬ ）からの部分
的に脱塩した濃縮チーズホエーを用いた場合に高いＦ
ＸＩＩＩ ａ収量を達成することも可能であった。代替
物としての他の適当なガラクトース源としては、未処理
状態で、ラクトースを含むがガラクトースを含まないホ
エー粉末がある。ホエー粉末に存在するこのラクトース
を、その粉末をＹＰＤ中に懸濁しておいた後に大腸菌か
らのβ−ガラクトシダーゼを用いてグルコースおよびガ
ラクトースに加水分解した。この型の調製もまた、酵母
における高Ｆ ＸＩＩＩ ａ合成をももたらした。大腸
菌またはクルベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ １ａｃｔｉｓ）からのβガラクトシダー
ゼ（遊離型または固定化されたもの）をホエー粉末添加
酵母培養物に加えることによって、発酵中にだけガラク
トースが切断によって遊離させることもさらに可能であ
った。 さらにＦ ＸＩＩＩ ａ生産のために適しているガラク
トース源としてホエー加水分解物の代わりになるものは
ラクトース加水分解物である。市販のラクトース加水分
解物（例えばＢｉｏｌａｃ ＧｍｂＨ、Ｄ−３２２１Ｈ
ａｒｂｅｒｎｓｅｎ またはＩＭＡ ＧｍｂＨｌＤ−
６０７８Ｚｅｐｐｅｌｉｎｈｅｉｍ ）は、全糖含有量
的５０％でグルコースとガラクトースノ割合は約１：１
で、単糖類の他に、切断されていないラクトースもまた
５〜１５％の濃度で存在する。そのようなラクトース加
水分解物は、組換え酵母の発酵に悪影響を及ぼすカラメ
ル化度物を形成することなくオートクレーブによって滅
菌され得る。ホエー加水分解物およびラクトース加水分
解物中に存在するグルコースは、サツカロミセス・セレ
ビシェ［ｐＭＢ３０７］またはサツカロミセス・セレビ
シェ［ｐＭＢ ３３０］によるＦ ＸＩＩＩ ａ合成の
誘導およびＦ ＸＩＩＩ ａの生産をいかようにも損な
わないということが見出された。グルコースは文献にガ
ラクトースオペロンの誘導の阻害物質として記述されて
いることから、これは予期しない発見であった。さらに
、スプレードライ化ラクトース加水分解物もまた、適当
な方法によって滅菌した後に市販のラクトース加水分解
物溶液の代わりに、発酵に使用できる。ここで記述する
Ｆ ＸＩＩＩ ａＯ高収量は、プラスミドｐＭＢ ３０
７またはｐＭＢ ３３０のいずれかを含んだ形質転換体
を用いて達成された。したがって高合成率は特定の対立
形質によるものではないということが考えられ得る。し
たがって、高収量はロイシン８８のフェニールアラニン
８８による置き換え以外のアミノ酸置換を用いてもこの
最適化された生産工程によって保証されることが期待で
きるであろう。 ５００ｍｇ／ ｌまなはそれ以上のＦ ＸＩＩＩ ａ濃
度を、上記の培地およびいわゆるプラスミドｐＭＢ ３
０７またはｐＭＢ ３３０を用いて１００〜５００リツ
トルのファーメンタの規模での変換で達成しな。 精製されたＦＸＩＩＩａは、全ての試、験基準によれば
胎盤からのＦＸＩＩＩａと同一であった。 ［００２４］ 表１ａ パン酵母の種々の株におけるＦ ＸＩＩＩ ａの収量株
欠損遺伝子 Ｆ ＸＩＩＩ ａ 細胞
数（ｍｇ／ｌ） １００万 ７ｍ１ Ｃ１３ＡＢＹ５８６ ｅｐ４−３ ｃ７９ ｃ２５２ ５Ｏ−２Ｂ Ｈ２２ １ｅｕ２． ｕｒａ３． ｈｉｓ ｅｕ２ １ｅｕ２． ｔｒｐＨ ｅｕ２． ｕｒａ３． ａｄｅｌ ｕｒａ３． ｈｉｓ４． ａｄｅ６ １ｅｕ２． ｕｒａ３． ｔｒｐｌ １ｓ３ １ｅｕ２． ｈｉｓ４ ＜０．０１ ６３０ １．５ １０４０ ＜０．０１ ｎ、ｄ。 血漿 （Ｐｌａｓｍ。 ５ｔａｂ、 ） （Ｚ） １００ ３０．４ １００ ２５．４ ｎ、 ｄ、 ７．０ ９１ ２５．８ ＯＤ６００ ｐ Ｈ （Ｚ） ４．１ ４．２ ４．０ ４．８ ４．５ ４．５ ３４．５ ｎ、 ｄ。 ２１５ １ｅｕ２． ｈｉｓ３ ２２５ ｕｒａ３ ２２６ ｕｒａ３ ２２７ ｕｒａ３ ７．５ ＜ｏ、ｏｉ ＜０．０１ ０．１ ３３．３ ５．０ ５．７ １５．７ ４．０ ４．２ ４．５ ｎ、 ｄ。 表１ｂ ｌｅｕ２．ｕｒａ３．ｈｉｓ３ ＜０．０１１ｙ
ｓ２． ｔｒｐＨ ｅｕ２． ｔｒｐｌ ＜０．０１１ｅｕ２
．ｔｒｐｌ、ｈｉｓ３ ＜０．０１１ｅｕ２．
ｕｒａ３． ｔｒｐｌ Ｏ，５ｕｒａ３
０．４ １ｅｕ２． ｕｒａ３． ｈｉｓ４ ０．８ｄｅｌ ｌｅｕ２． ｕｒａ３． ｈｉｓ５ ＜０．０１
ｒｐ５ １ｅｕ２． ｔｒｐｌ、 ｈｉｓ３ ５１ｙｓｌ
、 ａｒｇ４ １ｅｕ２．ｕｒａ３．ｔｒｐｌ ７ｈｉｓ３．
ａｄｅ２ １ｅｕ２． ｕｒａ３． ｔｒｐｌ ６ｈｉｓ
３． ａｄｅｌ、 ａｒｇ４ ｙｓ２ １ｅｕ２．七ｒｐｌ ＜０．０
１ｕｒａ３，１ｅｕ２．ａｄｅ３ ＜０．
０１ｔｒｐｌ、 ｈｉｓ３ ＮＫＹ２９０ ｕｒａ３．ｔｒｐｌｎ、ｄ、：測定
せず。ｆ：綿状の固ま
【図１】
０．０８ ５５０
っで、測定不能。
Ｎ７９
Ａ７４４−９Ａ
Ｎ３０３−ＩＡ
ＴＤ１０３．１
ＢＹ９１３
ＢＹ８７４
ＴＤ７１．８
Ａ３１
Ａ１１６．６
ＧＡ３
ｎ、 ｄ。
ｎ、 ｄ。
ｎ、 ｄ。
ｎ、 ｄ。
ｎ、 ｄ。
ｎ、 ｄ。
ｎ、 ｄ。
ｎ、 ｄ。
３６．１
２６．２
２４．５
３３．５
４６．５
２５、２５
３７、２５
２．５
３．７
３．８
４．３
４．４
４．５
４．５
３．８
４．４
４．３
４．０
４．５
４．６
ｐＭＢ ３０７の構築を示す、説明図である。
Ｆ ＸＩＩＩ ａ特異性ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
ｃＤＮＡ断片をｐＥＭＢＬｙｅｘ４のポリリンカー中に
連結した。既述のＦ ＸＩＩＩ ａのｃ Ｄ Ｎ Ａ
（Ａｍａｎｎ ら：前出）と比較して、内部のＥｃｏ
ＲＩ部位およびシャインーダルガルノ様配列は、アミノ
ｐＭＢ ３３０は、 ＦＸＩＩＩａ配列中のＬｅｕ８８ （ΩＴＣ） がＰｈｅ８８ （工Ｔ
ｃＤＮＡ断片をｐＥＭＢＬｙｅｘ４のポリリンカー中に
連結した。既述のＦ ＸＩＩＩ ａのｃ Ｄ Ｎ Ａ
（Ａｍａｎｎ ら：前出）と比較して、内部のＥｃｏ
ＲＩ部位およびシャインーダルガルノ様配列は、アミノ
ｐＭＢ ３３０は、 ＦＸＩＩＩａ配列中のＬｅｕ８８ （ΩＴＣ） がＰｈｅ８８ （工Ｔ
【図１】
Claims (8)
- 【請求項１】 ガラクトース−誘導可能プロモーターを用い、ラクトー
ス加水分解物、加水分解されたホエー粉末またはβ−ガ
ラクトシダーゼもしくはラクトースを切断する微生物を
添加したホエー粉末を用いることを特徴とする、酵母に
おける外来性遺伝子の発現方法。 - 【請求項２】 部分的に脱塩した濃縮チーズホエーを用いる、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】 Ｇａｌ／Ｃｙｃ I ハイブリドプロモーターを用いる、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 Ｇａｌ／Ｃｙｃ I ハイブリドプロモーターおよび欠失
した５′非翻訳領域および４１９から１２０塩基対に低
減された３′非翻訳領域を有する因子ＸIIIａ遺伝子の
ｃＤＮＡを用いる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 選択マーカーＬｅｕ２ｄ、Ｕｒａ３および／またはＴｒ
ｐ１を有する発現プラスミドを用いる、請求項４に記載
の方法。 - 【請求項６】 酵母ＡＨ２２、Ｃ１３ＡＢＹＳ８６または１５０−２Ｂ
株を用いる、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 ガラクトースの分解に関与する酵母遺伝子のプロモータ
ーを用いることを特徴とする、酵母における因子ＸIII
ａの発現方法。 - 【請求項８】 Ｇａｌ１またはＧａｌ１０遺伝子のプロモーターまたは
それらのプロモーター活性部分を用いる、請求項７に記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3940651A DE3940651A1 (de) | 1989-12-08 | 1989-12-08 | Verfahren zur expression von fremdgenen in hefen |
| DE3940651.2 | 1989-12-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03251186A true JPH03251186A (ja) | 1991-11-08 |
Family
ID=6395101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2407305A Pending JPH03251186A (ja) | 1989-12-08 | 1990-12-07 | 酵母における外来性遺伝子の発現方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0431543A1 (ja) |
| JP (1) | JPH03251186A (ja) |
| KR (1) | KR910012247A (ja) |
| AU (1) | AU6781890A (ja) |
| CA (1) | CA2031810A1 (ja) |
| DE (1) | DE3940651A1 (ja) |
| IE (1) | IE904425A1 (ja) |
| PT (1) | PT96122A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20010023688A (ko) | 1997-09-05 | 2001-03-26 | 카스파르 스튀름, 아를레테 슐레퍼 | 효모에서 폴리펩티드를 생산하는 발현 벡터 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| NZ216353A (en) * | 1985-06-05 | 1988-05-30 | Univ Kentucky Res Found | Manufacture of lac + fungi |
| DE3751269T2 (de) * | 1986-09-19 | 1995-09-14 | Univ Washington | Expression des biologisch aktiven Faktors XIII. |
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1990
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- 1990-12-07 KR KR1019900020081A patent/KR910012247A/ko not_active Application Discontinuation
- 1990-12-07 IE IE442590A patent/IE904425A1/en unknown
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| PT96122A (pt) | 1991-09-30 |
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