JPH03239928A - マルチチャネル蛍光分光装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、蛍光性物質の発光分光測定をする装置、より
詳しくは、単色化した励起光源で蛍光性物質の試料を照
射し、試料から発する蛍光を回折格子により分光し、こ
の分光光をリニアセンサ（フォトダイオードアレイ）に
よりマルチチャネル検出するマルチチャネル蛍光分光装
置に関する。

（発明の背り 蛍光分光分析法の１つに、蛍光励起−発光マトリックス
分光法（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ−Ｅｍｉｓｓｉｏｎ　Ｍ
ａｔｒｉｘ；以下ＥＥＭと略称する）がある。この手法
は、蛍光強度を蛍光励起波長（λｅｘ）と蛍光発光波長
くλｅｍ）の２つのパラメータで表わされるので、多成
分蛍光試料の定性分析に有効である。

例えば、ＥＥＭ分光法の特徴の一つである、１つの蛍光
性物質には固有のＥＥＭスペクトル領域が存在するとい
う特徴を生かした例として、Ｓｉｅｇｅｔによる文献が
ある（Ｊ、Ａ、５ｉｅＨｅｌｙＡｎａ１．Ｃｈｅ＋＊。

５７．９３４Ａ　（１９８５））。この文献中において
、ＥＥＭは犯罪現場に残されていたガソリンの同定に利
用されていることが示されている。文献によれば、市販
の種々のガソリンはその組成がわずかに異なるだけなの
で、従来のスペクトル表示では、その違いを見い出だす
ことができない。これに対して、予め取得しておいた各
種ガソリンのＥＥＭスペクトルのライブラリと、現場に
残されていたガソリンのＥＥＭとの差を取ることにより
、きわめて類似したスペクトル（組成がごく微小異なる
だけであるから）でも、その違いを見い出だすことがで
き、極めて正確にガソリン種を同定したことが報告され
ている。

（従来の技術とその問題点） 第１図に従来用いられているＥＥＭスペクトル計測シス
テムの基本構成を示す。

光源（ＬＳ）は紫外〜可視域の光を放射するランプであ
る。励起側分光器はモノクロメータ（Ｍ）、蛍光側分光
器は、１．１　ニアセンサ（Ｐ　Ｄ　Ａ　）を備え測定
波長域が固定されているマルチチャネル分光器（ｓｐｅ
ｃｔｒｏＦｌｒａｐｈ；スペクトログラフ）（ＳＧ）で
ある。

光源（ＬＳ）からの放射光を励起側分光器（Ｍ）を通し
て励起波長を選択し、試料（Ｓ）に照射する。その結果
生ずる蛍光を蛍光側分光器（ＳＧ）で分光し、蛍光発光
スペクトルをリニアセンサ（ＰＤＡ）でマルチチャネル
検出する。次に、励起側分光器（Ｍ）を波長走査し、異
なる蛍光励起波長で試料（Ｓ）を照射し、発する蛍光を
再び蛍光側分光器（ＳＧ）で分光する。収ｉされた各励
起波長に対する蛍光発光スペクトルを、励起波長類に配
列することにより、試料のＥＥＭスペクトルを得る。

従って、従来のＥＥＭ計測システムにおいては、次のよ
うな問題点があった。

■独立した２台の分光器を必要とするためシステム全体
が大型なものとなっている。

■（蛍光励起波長：λｅｘ）≧（蛍光励起波長二λｅｍ
）の領域（第２図の斜線部）、即ち蛍光測定に不要な領
域を測定している。

（問題点を解決するための手段） そこで、本発明は、上記問題点を解決することを目的と
し、本発明のマルチチャネル蛍光分光装置は、単色化し
た励起光源で蛍光性物質の試料を照射し、前記試料から
発する蛍光を回折格子により分光し、この分光光をリニ
アセンサによりマルチチャネル検出するマルチチャネル
蛍光分光装置において、前記リニアセンサの短波長側の
端縁に近接する位置に、白色光を入射させるための口を
設け、前記回折格子によりこの口から入射された白色光
を分光するとともに、前記試料から発する蛍光を受け入
れる口を通してこの分光された励起光を前記試料に照射
するように構成し、回折格子の相反性を利用して励起光
を蛍光側分光器内で生成したことを基本的な特徴として
いる。

（作用） リニアセンサに近接して設けた口から白色光を入射する
と、上記回折格子はこの白色光を分光し、分光光は、上
記蛍光量は入れ口のところに結像して分布するが、この
蛍光量は入れ口からは、白色光入射位置での波長と同じ
波長の光が射出する。

この射出された単色光が試料に照射され、試料から発す
る蛍光は蛍光量は入れ口に入射すると、上記回折格子が
この蛍光光を分光する。そして分光された蛍光発光スペ
クトルは、上記リニアセンサによりマルチチャネル検出
される。励起光と同一波長のレーリー散乱光は白色先入
射口を通り白色光源に戻る。

また、蛍光励起波長は、上記回折格子を回転させること
により走査することができる。各励起波長で収集された
蛍光発光スペクトルを励起波長類に配列すると、第２図
の平行四辺形で示される領域のＥＥＭスペクトルを得る
ことができる。

（＊施例） 第３図（Ａ）、（Ｂ）に平面回折格子を用いた本発明に
係るマルチチャネル蛍光分光装置の第１実施例の基本構
成を示す。第３図（Ａ）には光学系を示し、同図（Ｂ）
には励起波長を走査する場合の波長の走査機構を示す。

第３図（Ａ）において、（５）は平面回折格子であり、
凹面鏡（４）と凹面鏡（６）を備えたツエルニターナ−
型配置を形成している。（９）は蛍光性物質の入った試
料セル、（８）は結像レンズ、（７）は蛍光入射スリッ
ト、（１０）は凹面鏡（４）の焦７克面上に配置された
１次元ＣＯＤ素子でなるリニアセンサである。

リニアセンサ（１０）で受光する蛍光光のスペクトルの
短波長側にスリット（３）が設けられている。

スリット（３）はリニアセンサ（１０）の受光面と同一
の平面上でかつ受光面の素子列の延長線上に開口してい
る。このスリット（３）にはキャノンランプ等の白色光
！（１）から白色光を入射する。

第４図は蛍光試料を励起する励起光の光線図を示してい
る。白色光源（１）より放射される白色光は、結像レン
ズ（２）により入射スリット（３）上に結像される。入
射スリット（３）より発散する白色光は、凹面鏡（４）
により平行光となり、平面回折格子（５）に向かう。白
色光は平面回折格子（５）により波長別に回折され、凹
面鏡（６）に向かう、凹面鏡（６）で反射された白色光
は、凹面鏡（６）の焦点面上に結像され、ここに白色光
のスペクトル分布くＳｌ）を作る。四面鏡（６）の焦点
面上に設けられている蛍光入射スリット（７）に結像す
る波長の光のみが、結像レンズ（８）により試料セル（
９）中の蛍光試料を照射する。

蛍光試料より発する蛍光は、第５図に示すように、結像
レンズ（８）によりスリット（７）上に結像される。ス
リット（７）より発散する蛍光は、凹面鏡（６）により
平行光となり、平面回折格子（５）に向かう。蛍光は平
面回折格子（５）により分散され、凹面鏡（４）に向か
う。凹面鏡（４）で反射された蛍光は、凹面鏡（４）の
焦点面上に配設されたりニアセンサ（１０）上に、その
スペクトル像（Ｓ２）を形成する。この蛍光発光スペク
トルをリニアセンサ（１０）でマルチチャネル検出する
。励起光と同−波長のレーリー散乱光は、白色光入射ス
リット（３）を通って光源（１）に戻る。励起光の波長
を変えたい場合には、平面回折格子（５）を回転させ、
第４図のスペクトル（Ｓｌ）を光軸に直交する方向にシ
フトさせることにより波長選択を行うことができる。

ＥＥＭスペクトルを得る場合には、波長を連続的に変え
る、すなわち波長走査をする。

本実施例では、第３図（Ｂ）に示したように、波長走査
撮構にサインバ一方式を採用している。図示の波長送り
ダイヤル（１１）を回転させることにより、これに連動
して、サインバー送りネジ（１２）も回転する。サイン
バー送すネノ（１２）の回転により、サインバー（１３
）が図中、左右に移動する。サインバー７−ム（１４）
は、サインバーアーム制御バネ（１５）により常にサイ
ンバー（１３）に接触している。サインバー（１３）の
移動により、サインバーアーム（１４）は、平面回折格
子（５）の中心を中心として回転する。サインバーアー
ム（１４）と平面回折格子（５）の支持台（１６）は連
結され、サインバーアーム（１４）の回転とともに、平
面回折格子（５）の支持台（１６）も回転し、平面回折
格子（５）が回転する。

次に、第２の実施例、凹面回折格子を用いたマルチチャ
ネル蛍光分光装置を説明する。第６図はその基本構成図
である。

第６図において、（２０）は凹面回折格子である。

この凹面回折格子（２０）の焦点面にリニアセンサ（２
４）が配設されている。リニアセンサ（２４）によりマ
ルチチャネル検出される波長域の短波長側の端縁にほと
んど接するかまたは近接して白色光を入射させるスリ７
）　（１９）を設けている。励起光の波長選択は、凹面
回折格子（２０）に取付けたアーム（２５）を、ネジ（
２６）により固定された点を中心として回転させること
により行うことができる。なおここでは、凹面回折格子
（２０）はアーム（２５）に、ネジ（２７）により固定
されている。

第６図、第７図において５、蛍光試料を励起するための
毛色光源（１７）から放射される白色光は、結像レンズ
（１８）により入射スリ７）　（１９）に結像される。

入射スリ７）　（１９）より発散する白色光は、凹面回
折格子（２０）に向かう。白色光はこの凹面回折格子（
２０）により波長別に回折される。回折された光のうち
、蛍光入射スリ７）　（２１）に結像する波長の光だけ
が、結像レン、ｌ’（２２）により試料セル（２３）中
の蛍光試料を照射する。

蛍光試料より発する蛍光は、結像レンズ（２２）により
、スリ７）（２１）上に結像される。ス１ル７ト（２１
）より発散する蛍光は、凹面回折格子（２０）に向かう
。蛍光は、この凹面回折格子（２０）により分散され、
リニアセンサ（２４）上にそのスペクトル像を形成する
。この蛍光発光スペクトルをリニアセンサ（２４）でマ
ルチチャネル検出する。

凹面回折格子型の分光器は、光学素子が回折格子だけで
あるので、システムの小型化の点で先に示したチェルニ
ーターナ型のものより勝れる。また、後述する迷光の点
においても、チェルニーターナ型のものよりも優れてい
ると考えられる。更に、大きな観点からすれば、蛍光測
定において試料のおよその発光波長域が分かっている場
合など、必要な波長域だけを簡単に選択することができ
、リニアセンサをより有効に利用できるという長所があ
る。

実施例の装置において波長走査をしで、収集された各励
起波長域での蛍光発光スペクトルを励起波長類に配列す
ることにより、試料のＥＥＭスペクトルを得ることがで
きる。先に示した第２図には、破線により従来システム
で得られる波長領域を示し、本発明によるシステムで得
られる波長領域は実線の平行四辺形で示されている。こ
れから明らかなように、従来では測定していた蛍光測定
には不要な無意味な領域、λｅＩＩｌ≧λｅｘの領域を
測定することなく、蛍光測定に必要で有用なｇＩｉ域を
より広く測定できるようになった。なお、レーリー散乱
光のλｅｘ＝λｅｍの線との一定の幅のギャップＧは、
リニアセンサがケーシングされていることから、その物
理的な障害の距離に対応するものであり、また破線の矩
形の下辺と実線の平行四辺形の下辺は合致しており、こ
こでは説明のためにこれらを離間して示している。

マルチチャネル分光器の射出口の短波長側の端に励起白
色光を入射すると、励起光は回折格子によって分散され
蛍光入射スリットからは励起光入射位置での波長と同じ
波長の光が選択される。これは、回折格子の式、 ５ｉｎａ＋ｓｉｎβ＝Ｎｍλ　　　　・・・・−（１）
但し、Ｎ：回折格子の溝本数ＨＴａ　＊回折次数、λ：
波長が、α：入射角、β：回折角の場合、ａ：回折角、
β：入射角の場合のいずれでも成立すること（本明細書
では、これを回折格子の相反性と称している）を利用し
たことに基づいている。

また、回折効率の相反性も成立し、これを正弦波回折格
子について示せば、入射角ａで光源光が入射した場合の
回折角βの回折光の回折効率ηは、（２）式のようにな
り、 ヮ＋＝Ｉ（１＋ｃｏｓ（α−β））２／４＾、′）×（
ｋａ＾、−（ｋａΔ１）’／８−（ｋａＡｌ）５／１９
２１　　＝１２　）但し、＾＋＝ｃｏｓα＋ｃｏｓβ、 ｋ＝２π／λ、 ｓｉｎα十ｓｉｎβ＝Ｎａａλ、 Ｎ：ｍ本数ｙ　ｌ　＋回折次数、λ：波長ｙａ：２１１
の振幅。

また、入射角βで光源光が入射した場合の回折角αの回
折光の回折効率１２は次のようになる。

η２＝１＜１＋ｃｏｓ＜β−α））２／４＾２′）×（
ｋａ＾２−（ｋａ＾２）コ／８−（ｋａ＾２）５／１９
２１　　−（４Ｊ（旦し、＾２”ｅＯ９β＋ｃｏｓα、 ｋ＝２π／λ、 ｓｉｎβ十ｓｉｎα＝Ｎｍλ、 Ｎ：溝本数１ｍ：回折次数、λ：波長、ａ：溝の振幅。

上記の（２）式と（３）式より、１＋＝η２が成立する
。従って、正弦波回折格子では、回折効率においても相
反性が成立し、溝（ブレーズ）状のもの６１に近い、た
とえば０．８とか０．９の値をもち、光量の点で何ら不
都合を生じない。

第９図は、第１の実施例において、迷光を除去する工夫
を施したより好ましい実施例の要部を示している。同図
（Ａ）はその光学系の断面を同図（Ｂ）は側面を示して
いる。

第９図（Ａ）において、白色光源からの白色光（２９）
は、凹面鏡（３１）により反射され、光線（３０）とな
リ、平面回折格子（３２）に向かう。光線（３０）は、
平面回折格子（３２）によりあらゆる方向に分散される
。

このうち、凹面鏡（３１）に向かう回折光（３３）が存
在する。この回折光（３３）は、凹面鏡（３１）により
反射され、光線（３４）となり、リニアセンサ（２８）
が配置されている方向に向かう。白色光源の高さと、リ
ニアセンサ（２８）の高さは、同じでなければならない
。従って、白色光源の高さ方向の中心と、凹面鏡（３１
）、平面回折格子（３２）の高さ方向の中心が一致して
いれば、光＃！（３４）はりニアセンサ（２８）の受光
面に達し、迷光としてリニアセンサ（２８）により検知
されてしまうおそれがある。

光線（３４）をリニアセンサ（２８）に受光されないよ
うに、第９図（Ｂ）に示すような工夫を施している。

この図において、凹面鏡（３１）と平面回折格子（３２
）の高さ方向の中心＃１（３５）に対して、白色光源の
位置及びリニアセンサ（２８）の位置を、軸外しくｏｆ
ｆ−ａｘｉｓ）の関係に設定した。このとき、白色光（
２９）は、凹面Ｍ（３１）により反射され光線（３０）
となり、平面回折格子（３２）に向かう。平面回折格子
（３２）は溝が刻まれている方向においては、平面鏡と
等価であり、このため光線（３０）は、平面回折格子（
３２）により、高さ方向において正反射を起こし、回折
光（３３）となる。光線（３３）は、凹面鏡（３１）へ
向かい、反射され、光４！（３４）となる。光線（３４
）は、高さ方向１ヰおいて、中心軸（３５）についてリ
ニアセンサ（２８）と反対側に存在する。このため、光
線（３４）がリニアセンサ（２８）に入射することを回
避できる。

第１０図は、実施例に用いた、リニアセンサからコンピ
ュータまでの電気系のブロック図である。

リニアセンサ（５０）には浜松ホトニクス社製の５１２
素子７オトダイオードアレイ・５２３０１−５１２Ｑを
使用し、センサ駆動回路（５１）により駆動し、７オト
グイオードアレイ（５０）の各素子からの出力は、シェ
ーディング補正回路Ｓ／Ｈ（５３）により処理し、１２
ビツトのＡ／Ｄ変換器（５３）によりデイノタル化した
あと、パラレルのインターフェイス（５４）を介してパ
ーソナルコンピュータ（５５）のメモリに格納している
。回路（５１）、（５２）、（５３）、（５４）を統括
して制御するために制御回路（５６）を設けている。な
お、露光時間は、リニアセンサ（５０）に与えるタロツ
ク信号により決めている。

チェルニーターナ型の実施例を用いて蛍光試料のＥＥＭ
スペクトルの測定を行った。用いた平面回折格子はホロ
グラフィックグレーティングで、溝数は１６１０本／ｍ
ｍのもの、波長範囲は、２００〜９００ｎ−のものであ
る。励起用白色光源は１５０Ｗのキセノンランプを、リ
ニアセンサには素子数５１２の上記７オトダイオードア
レイを用いた。

試料は、エタノール溶媒のローダミン−Ｂ、ａ１度５１
１ｇ／ｌを用いた。１つの蛍光発光スペクトルを得るた
めに要した露光時間は、約５．３秒であった。蛍光励起
波長には３００ｎｍ〜５５５ｎｍの範囲において１５ｒ
＋ｍずつ計１８点を選んだ。これにより得られたローグ
ミンーＢのＥＥＭスペクトルを第１１図に示す。得られ
たデータを１６階調の濃淡で表示している。蛍光励起波
長の５００ｎｍ前後、蛍光発光波長６００ｎａ＋前後の
領域に見られるパターンがローグミンーＢ特有のパター
ンである。

小型化された本発明に係るマルチチャネル蛍光分光装置
を適用した一例として、落射型顕微システムに組み込ん
だもの、蛍光・励起−発光マトリックス顕微鏡（Ｅｘｃ
ｉｔａｔｉｏｎ−ＥｍｉｓｓｉｏｎＭａｔｒｉｘＭ　１
ｃｒｏｓｃｏｐｅ：　Ｅ　Ｅ　Ｍ　Ｅ　）を第１２図に
示す。

このＥＥＭＥのシステム全体が直線状になることが望ま
しいので、分光器は非対称クロスチェルニーターナ型の
ものを採用している。

第１２図において、白色光源（３６）より放射される白
色光は、結像レンズ（３７）により、入射スリ７）　（
３８）上に結像される。入射スリ７）　（３８）より発
散する白色光は、凹面鏡（３９）により反射され、平面
回折格子（４０）に向かう。平面回折格子（４０）によ
り分散された回折光は、凹面鏡（４１）に向かい、ここ
で反射される。凹面鏡（４１）により反射された回折光
のうち、平面鏡（４２）に向かい、反射されスリン）（
４３）上に結像される回折光は、結像レンズ（４４）及
び分光光度計と顕微システムのＦ値を合わせるためのリ
レーレンズ（４５）を通して、顕微鏡の絞り（４６）へ
導かれる。この回折光は、対物レンズ（４７）により、
ステージ（４８）上にある試料を照射する。

試料より発する蛍光は、対物レンズ（４７）、顕微鏡の
紋り（４６）、リレーレン７：（４５）、結像レンズ（
４４）を通して、スリット（４３）上に結像される。ス
ワン）　（４３）を通して分光器へ導かれた蛍光は、平
面鏡（４２）、凹面［（４１）により、平面回折格子（
４０）へ向かう。蛍光は、平面回折格子（４０）により
分散され、凹面ｆｉ（３９）によりリニアセンサ（４９
）の受光面上に、そのスペクトル像を形成する。この蛍
光発光スペクトルをリニアセンサ（４９）でマルチチャ
ネル検出する。励起光の波長選択は、平面回折格子（４
０）を回転させることにより行う。そしてステージ（４
８）を２次元（Ｘ、Ｙ）走査させることにより、試料に
ついて、４つの情報（Ｘ、Ｙ、＾ｅｘ、＾ｅｍ）を得る
ことができる。これは、生物試料などの蛍光分析に極め
て有用な手段を与えるものである。

（発明の効果） 以上のように、本発明は、蛍光光を分光する回折格子の
相反性を利用して単色の励起光を得る構成としたので、
マルチチャネル蛍光分光計測において分光器は１台だけ
でよく、全体として小型でシンプルな構成となり、従来
では不可能であった例えば顕微鏡に組み込めるなどの優
れた効果を奏するとともに、第２図から明らかなように
、λｅｘ≧λｅｍの領域すなわち蛍光測定において不要
な領域を測定せずに済むうえ、従来のシステムに比べ蛍
光測定において必要、有用な′ｔＬ長領域をより広く測
定できる効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は従来例の基本システム構成図である。 第２図は従来例と本発明によって得られるＥＥＭスペク
トルの波長領域を対比して示した説明図である。 第３図（Ａ）はツエルニ−ターナ−型分光器に係る本発
明の第１実施例の基本構成図である。 第３図（Ｂ）は第３図（Ａ）の構成の裏面を示すもので
サインバー機構を示す図である。 第４図は第１実施例における励起光の光線図である。 ＠５図は第１実施例における励起された蛍光光の光線図
である。 第６図は凹面回折格子型分光器に係る本発明の第２実施
例をの基本構成図である。 第７図は第２実施例における励起光及び励起蛍光光の光
線図である。 第８図は第２実施例における波長走査の説明図である。 第９図（Ａ）は第１実施例における迷光回避のための説
明図である。 第９図（Ｂ）は＄９図＜Ａ）を側方から見た迷光回避の
ための光線による説明図である。 第１０図はスペクトルデータを得るための電気的基本構
成を示すブロック図である。 ＄１１図は実施例によって得られた結果の一例を示すグ
ラフである。 第１２図は本発明を適用した顕微鏡システムの基本構成
図である。 １．１７・・・白色光源、３，１９・・・白色入射スリ
ット、５・・・平面回折格子、２０・・・凹面回折格子
、７゜２１・・・蛍光入射スリット、９．２３・・・試
料セル、１０．２４・−・７オトダイオードアレイ、リ
ニアセンサ。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）単色化した励起光源で蛍光性物質の試料を照射し
   、前記試料から発する蛍光を回折格子により分光し、こ
   の分光光をリニアセンサによりマルチチャネル検出する
   マルチチャネル蛍光分光装置において、 前記リニアセンサの短波長側の端縁に近接する位置に、
   白色光を入射させるための口を設け、前記回折格子によ
   りこの口から入射された白色光を分光するとともに、前
   記試料から発する蛍光を受け入れる口を通してこの分光
   された励起光を前記試料に照射するように構成したこと
   を特徴とするマルチチャネル蛍光分光装置。
2. （２）前記回折格子は、回動可能な平面回折格子からな
   り、この平面回折格子をサインバー機構により回動させ
   ることにより前記励起光の波長を選択するように構成し
   た特許請求の範囲第（１）項記載のマルチチャネル蛍光
   分光装置。
3. （３）前記回折格子は、凹面回折格子である特許請求の
   範囲第（１）項記載のマルチチャネル蛍光分光装置。
4. （４）前記白色光を入射させる口は、その光軸が、装置
   内の光反射集光の働きをなす凹面鏡の光軸に対し軸外し
   の位置に設定され、これにより前記リニアセンサへ迷光
   が入るのを回避した、特許請求の範囲第（１）項ないし
   第（３）項のいずれかに記載のマルチチャネル蛍光分光
   装置。