JPH03219882A - ハイブリッドプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｅ（産業上の利用分野） 本発明は、大腸菌内で下流（３−側）に連結された遺伝
子を強力に発現させることの可能なハイブリッドプロモ
ーターに関するものである。

（従来の技術） 原核又は真核細胞を宿主としだ組換ＤＮＡ技術による蛋
白質の発現において、蛋白質の生産性は特に蛋白質を暗
号化する構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写効率に大きく影
響される。

転写効率とはＲＮＡポリメラーゼがｍＲＮＡの合成を開
始する効率のことであり、いわゆるｒプロモーター強度
」に依存するものであり、プロモーターの塩基配列によ
り支配されているものである。遺伝子の転写は、遺伝子
の発現（即ち蛋白質の発現）の第１のステップであり、
所望の蛋白質又はペプチドを遺伝子組換技術により大量
に得ようとする場合にはより効率の良い転写を実現でき
る強力なプロモーターを使用することが必要である。

ところで、単にベクター上で構造遺伝子の上流（５−側
）に強力なプロモーターを導入したのみでは、該ベクタ
ーにより形質転換された宿主細胞は所望の蛋白質を製造
し続ける結果、その増殖に悪影響を及ぼし、ひいては蛋
白質の生産性が低下したり、場合によっては継代培養さ
れた宿主において蛋白質の生産性か低下するという事態
が生じる。従って、従来から一定期間プロモーターの発
現を抑制し、ある条件下で抑制を解除する等の操作が行
われている。

（従来技術の課題） 従来から、一定の条件下でのみ発現するプロモーターと
して、大腸菌のトリプトファンブロモター（ｔｒｐ；Ｅ
ｍｔａｇｅ、Ｊ、Ｓ、　　ら、Ｎａｔｕｒｅ　　２８３
巻、１７１頁、１９８３年）、ラクトースプロモーター
（ｌａｃ　；　Ｉ　ｔａｋｕｒａ、に、５ｃｉｅｎｃｅ
　　１９８巻、１０５６頁、１９７７年）又は大腸菌フ
ァージのＰＬジブロモー（ＰＬ−Ｂｅｒｎａｒｄ、Ｈ，
Ｇｅｎｅ５巻、５９頁、１９７９年）が知られている。

例えばｌａｃでは、リプレッサー蛋白質がプロモーター
の一１０領域より下流に位置するＤＮＡ部分（オペレー
ター）に結合することによりその発現が抑制されるから
、抑制を解除しようとする場合には該リプレッサー蛋白
質と前記ＤＮＡ部分の結合を妨害する様な、ラクトース
アナログ等を添加すれば良い。

しかしながら、非常に簡単な操作により発現を制御可能
なｌａｃ等では、その発現力が比較的弱い、という欠点
があり、また発現力の強力なｔｒｐ等ではその発現の制
御が困難であるという課題かある。

一方、特開昭５７−１９４７９０号に記載された様に、
比較的強力な発現力を有するプロモーターの５′フラン
キング領域、−３５コンセンサス領域を有する第１のＤ
ＮＡ断片と、第１のプロモーターよりもその発現力は劣
るものの、発現の制御か比較的容易であるプロモーター
の一１０コンセンサス領域及び該領域の下流を結合させ
た、人工なプロモーターも知られている。

なかでもｒｔａｃＪと呼ばれる、ｔｒｐと１ａｃＵＶ５
プロモーターのハイブリッドプロモーターは、ｔｒｐに
由来する強力な発現力と１ａｃＵｖ５に由来する制御の
容易性を兼ね備えており、遺伝子組換による蛋白質の製
造に際しては特に有効なプロモーターである（前記公報
の他、Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳ
Ａ　　　８０．　２１−２５　１９８３年）。

しかしながら、近年になってｔｒｐを上回る発現力を有
するプロモーターが知られる様になり、ｔａｃを越えた
性能を有するプロモーターの出現か望まれている。また
、プロモーター系等は、発現させようとする蛋白質に応
じて種々の系を保持し、必要に応じて使い分けることが
望ましい。

（発明の構成） 本発明者らは、大腸菌ファージＴ３の初期遺伝子群を誘
導するプロモーターがｔｒｐよりも強力な発現力を有す
ること、また、このプロモータの５′フランキング領域
、−３５領域及からなるＤＮＡ断片を第１のＤＮＡ断片
として他のプロモーターの一１０領域からなる第２のＤ
ＮＡ断片と結合させた後、更にこの第１のＤＮＡ断片と
第２のＤＮＡ断片が結合したプロモーター部分の発現を
制御し得る第３のＤＮＡ断片を結合させることで発現力
を有し、かつその発現を制御し得るハイブリッドプロモ
ーターを調製できることを見出し本発明を完成させた。

すなわち本発明は、従来知られたプロモータと同等又は
より強力な発現力を有する新規のプロモーターを提供す
るものであり、大腸菌Ｔ３ファージ初期遺伝子群の発現
を誘導するプロモータの５′フランキング領域及び−３
５領域からなる第１のＤＮＡ断片、他のプロモーターの
一１０領域からなる第２のＤＮＡ断片及び第１のＤＮＡ
断片と第２のＤＮＡ断片から形成されるプロモーター部
分の発現を制御し得る第３のＤＮＡ断片が結合してなる
ハイブリッドプロモーターである。

以下本発明を更に詳細に説明する。

大腸菌Ｔ３ファージ初期遺伝子群の発現を誘導するプロ
モーターとは、大腸菌ファージ１３群のゲノム中に存在
するプロモーター機能を有するＤＮＡ配列を意味し、例
えば該機能を損なわない範囲で一部の塩基を欠失、置換
、挿入されたものであっても同様である。天然に存在す
るＴ３ファジ初期遺伝子プロモーターとしては、ファー
ジゲノムの左端に位置しクラスターを形成する３個のプ
ロモーター（ＡＩ、Ａ２、Ａ３）が知られている（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　１
４巻　Ｎｏ、１１、第４６９６頁、１９８６年）。

本発明では、これら３個の天然に存在するプロモーター
以外でも、先に説明した様にこれらプロモーターに由来
し、人工的に変異を受けたものの他、天然に変異したも
のであってプロモーターとしての機能を有しているもの
であれば良い。

以下、天然に存在するプロモーター中の、Ａ３と呼ばれ
るプロモーター（以下Ａ３プロモーターとする）を−例
として説明するが、以下の説明はＡ１及びＡ２プロモー
ターにも適用されることは言うまでも無い。

Ａ３プロモーターは、詳しくは次式■で示される塩基配
列からなるものである。

式■。

３−　　　　　ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＧ
ＴＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＧＴＡＡＧＣＡＣＧＧＴＡ
ＣＧＡＴＧＴＡＡＴＴＣＧＴＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＡＴ
ＣＣＡＣＡＡＧＣＴ　　　３− ＧＧＴＧＴＴＣＧＡ　　　５− （ただし、式中の記号は通常の遺伝子学の分野で使用さ
れるものと同じ意味である） 本発明のハイブリッドプロモーターにおいてその強力な
発現力を提供する第１のＤＮＡ断片は以上説明したＴ３
ファージの初期遺伝子群を誘導するプロモーター、例え
ば旧式■で示される塩基配列からなるＡ３プロモーター
に由来する。

第１のＤＮＡ断片は、これらプロモーターの全部を含む
必要はなく、その５−フランキング領域、−３５領域及
び−１０領域からなるものであれば良い。ここで、各領
域について、前記式■中に下線を引いて示す。詳しくは
、５′フランキング領域はｒＴＴＡＡＡｃＡＡＡＧＴＧ
ＧＪであり、−３５領域はｒＴＴＧＡｃＡＪ　である。

本発明では、第１ＤＮＡ断片は天然のＴ３ファージから
実施例に示す様に、既知の方法により極めて容易に取得
することが出来る。また、この配列は人工的に合成して
も良い。

第１のＤＮＡ断片は、その５′フランキング領域上流又
は−３５領域下流側に付加的な塩基を有していても良い
が、特に−３５領域下流の付加的な塩基が多いと結果と
して第２のＤＮＡ断片に由来する一１０領域との距離が
遠くなり、プロモーターの発現力に影響する恐れかある
。このため、３５領域の下流の塩基は、最終的に本発明
のハイブリッドプロモーターが構築された時に、その−
３５領域と一１０領域間の距離が天然のＡ３プロモータ
ーのそれと同一となる様にすることが好ましい。

他のプロモーターの一１０領域からなる第２のＤＮＡ断
片としては、例えば１ａｃＳＰＬＳｔｒｐ、ｒｅｃ　　
Ａ等のプロモーターに由来する断片を使用すれば良い。

これらのプロモーターにおける一１０領域は、一般にコ
ンセンサス領域として公知であり、天然に存在するプロ
モーターから調製しても良いし人工的に合成しても良い
。

第３のＤＮＡ断片は、前記した第１のＤＮＡ断片と第２
のＤＮＡ断片から形成されるプロモーター部分の発現を
制御し得るものであれば同等制限はない。一般に、プロ
モーター部分の発現を制御し得る部分としては、オペレ
ーターが知られている。中でも、ｌａｃに由来するオペ
レーターはプロモーター部分と明確に区別可能な部分に
存在し、しかも例えばＩ　ＰＴＧ等の化学物質の添加に
より簡単に制御状態を解除し得るため、本発明の第３の
ＤＮＡ断片として好ましい。しかも、第２及び第３のＤ
ＮＡ断片をｌａｃから調製する場合には、ｌａｃの一１
０領域及びその下流部分を調製することでこれらが連結
した状態で調整できる。

例えばｌａｃプロモーターは、具体的には次式■で示さ
れる塩基配列からなるものである。

式■ ５−　　　ＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＣＧＡＧＣ
ＡＴＡＴＴＡＣＡＣＡ ＣＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＧ
ＴＧＴＧＴ　　　５ （ただし、式中の記号は前記に同じ） 前記配列■は従来公知の配列であって、その−１０領域
はｒＴＡＴＡＡＴＧＪであり、そのオペレータ一部分は
ｒＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡ
ＣＡＣＡＪである（例えば特開昭５７−１９４７９０号
等参照）。

以上の様な配列以外にも、ｌａｃとしては例えは、Ａ、
Ｓｉｍｏｎｓら　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ％第８１巻、１６２４頁、１９８４年）に報告された
ものがある。従って、これらを参考にすることで前記配
列は調製することが可能であり、又は人工的に合成する
ことによつても調製することが出来る。

本発明のプロモーターは、強力な発現力を有するＴ３プ
ロオーターに由来する第１のＤＮＡ断片及び他のプロモ
ーターに由来する第２のＤＮＡ断片から形成されるプロ
モーター部分とこのプロモーター部分の発現を制御し得
る第３のＤＮＡ断片が結合してなるものである。これま
で説明した様に、第１のＤＮＡ断片としてはＴ３プロモ
ータ（ＡＩ、Ａ２又はＡ３プロモーター）に由来する断
片が使用でき、第２又は第３のＤＮＡ断片としてはｌａ
ｃ、ＰＬ、ｔ　ｒｐ、ｒｅｃ　　Ａに由来する断片が使
用できる。具体的には、Ａ３プロモーターに由来する第
１のＤＮＡ断片と、ｌａｃに由来する第２及び第３のＤ
ＮＡ断片とが結合したプロモーターとして、次式■で示
されるものを例示できる。

式■ ５′　ＴＣＧＡＣＴＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴ３＝　　ＡＧ
ＣＴＧＡＡＴＴＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＧＡＣＡＡＣＡ
ＴＧＡＡＧＴＡＣＣＡＡＣＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＡＴ
ＡＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＣＧＡＧＣ
ＡＴＡＴＴＡＣＡＣＡＣＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡ
ＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＣＡＡ
ＴＴＴＣＡＣＡＣＡ　　　３− ＧＴＴＡＡＡＧＴＧＴＧＴ　　　５＝ （ただし、式中の記号は前記に同じ） 前記式■においては前記式■に由来する５′フランキン
グ領域及び−３５領域からなる第１のＤＮＡ断片が、前
記式■に由来する一１０領域及びその下流に位置するオ
ペレータ一部分からなる第２及び第３のＤＮＡ部分と結
合したものである。

前期式■で示される塩基配列からなる本発明のプロモー
ターは、第３のＤＮＡ断片として１ａＣオペレーター領
域を有することから、その発現は、例えば１ａｃＩ、１
ａｃｌｑ等のリプレッサー蛋白をコードする遺伝子をベ
クターに導入するか、それを宿主のゲノムに導入するか
又は宿主が有する天然の１ａｃｌ　　（ｌａｃｌｑ）を
利用することにより抑制され、ＩＰＴＧ等を添加するこ
とにより解除、即ち発現を開始するようになる。

（発明の効果） 本発明のハイブリッドプロモーターは、下流（３′側）
に接続されたＤＮＡ　（通常は構造遺伝子であるが・・
）を強力に発現させるものである。

従って、遺伝子学的手法を用いて工業的に蛋白質又はペ
プチドを製造する場合には好適なものである。しかも本
発明のプロモーターは、その発現を容易に制御し得ると
いう特徴を有するため、特に発現する蛋白質が宿主の成
育を妨げる様な場合にもａ効である。

本発明は、従来知られていない新規のプロモーターを提
供するものである。種々の蛋白質の発現に際し、最も適
当な発現系を探索し使用することが要求される遺伝子工
学の分野において、発現力においては従来知られたちの
以上に強力であり制御性においても従来のものと同等で
ある本発明のプロモーターは、この様な要求に答えるも
のである。

（実施例） 以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を記
載するか、これらは本発明の一例であって本発明を制限
するものではない。

実施例１ 人工的に合成されたＡ３プロモーターの発現強度（プロ
モーター強度）を検定するためのプラスミド、ｐＡ３−
Ｐｉを構築した。

プラスミドｐＫＫ２３２−８　（クロラムフェニコール
耐性遺伝子（以下ＣＡＴとする）を発現するプロモータ
ー強度検定用ベクター　ファルマシア社製、ｃａｔ　　
ｎｏ、２７−４９２５−０１）のＤＮＡ　２　ｔｔ　ｇ
を５０μｍの緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７，５
，５０ｍＭ　　ＮａＣ１゜１ｍＭジチオスレイトール）
中でＳａｌ　　Ｉ（５ユニツト）、Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ
（５ユニツト）により３７℃で１時間消化した。

反応後、反応液を等量のフェノール／クロロフォルムで
抽出し、２倍量のエタノールを添加して消化されたプラ
スミドＤＮＡを沈殿させ、回収した。回収したプラスミ
ドＤＮＡを１０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩
酸ｐＨ８，０，１ｍ　Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）に溶解
した。以後、この溶解液をＤＮＡ溶液Ａとする。

一方、次式の合成りＮＡ■（１，８μｇ；１００ｐｍ１
００ｐと合成りＮＡ■（１，８μｇ；１００ｐｍ１００
ｐを５０μｍの５ｍＭＭ　ｇ　Ｃ１２溶液中、７０℃で
１０分間加温した後、さらに３７°Ｃで３０分間加温し
てアニーリングさせた。このアニーリングした合成りＮ
Ａ■と■を含む溶液を以後ＤＮＡ溶液Ｂとする。

合成りＮＡ■（−重鎖） ５−　　　ＴＣＧＡＣＴＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴ
ＧＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＧＴＡＡＧＣＡＣＧＧＴＡＣＧ
ＡＴＧＴＡＣＣＡＣＡ　　　３ 合成りＮＡ■（−重鎖） ３−　　ＧＡＡＴＴＴＧＴＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＴ
ＧＴＡＣＴＴＣＡＴＴＣＧＴＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＡＴ
ＧＧＴＧＴＴＧＡ　　５ （ただし、式中の記号は通常の遺伝子学の分野で使用さ
れるものと同じ） ２μｌのＤＮＡ溶液Ａと１０μｌのＤＮＡ溶液Ｂを５０
μｍの緩衝液（６６ｍＭ）リス−塩酸ｐＨ７，６，５ｍ
Ｍ　　ＭｇＣ１５ｍＭジチ第２ゝ スレイトール、０．６ｍＭ　　ＡＴＰ）に添加し、更に
該溶液に７４ＤＮＡリガーゼ（５０ユニツト）を添加し
た後、１６℃で２００時間反応せた。

この反応液１０μｌを使用して、既知の手法に従って大
腸菌（Ｊ　Ｍ　１０９株）を形質転換し、クロラムフェ
ニコールを５０μｇ　／　ｍ　１の濃度で含むＬＢプレ
ートに塗布し、３７℃で一晩放置した。出現した大腸菌
のコロニーをクロラムフェニコールを５０μｇ　／　ｍ
　１の濃度で含むＬＢ培地に接種し、３７°Ｃて一晩振
盪培養した。

得られた菌体溶液からアルカリ溶解法によってプラスミ
ドＤＮＡを回収した。該プラスミドＤＮＡは、Ｓａｌ　
　Ｉ、Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩでの消化によって５５塩基対
のＤＮＡ断片か生じることから目的のプラスミド（ｐＡ
３−Ｐｉ）か得られたことか確認された。

本実施例での手順を図１に示す。

実施例２ Ａ３プロモーターに由来する５′フランキング６頁域及
び−３５領域からなる第１のＤＮＡ断片、とｌａｃに由
来する一１０領域及びその下流のオペレータ一部分から
なる第２及び第３のＤＮＡ断片か結合した本発明のハイ
ブリッドプロモータを含むプラスミドｐＡ３−Ｌｌを構
築した。、２μｇの合成りＮＡ■（２００ｐｍｏ　ｌ　
ｅ）を１００μｍの緩衝液（５０ｍＭ）リス−塩酸ｐＨ
７，６，１０ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２．１０ｍＭメ
ルカプトエタノール、０．３ｍＭ　　ＡＴＰ）に添加し
、更にＴ４ＤＮＡキナーゼ（３０ユニツト）を添加して
３７℃で１時間反応させて５′末端をリン酸化した。こ
の反応液に３μｇの合成りＮＡ■（２００ｐｍｏｌｅ）
を含むＴＥ緩衝液（１０μｌ）を添加し、７０’Ｃで３
０分間加温し、更に３７℃で加温してアニーリングさせ
た。この、アニーリングした合成りＮＡ■と■を含む溶
液を以後ＤＮＡ溶液Ｃとする。

合成りＮＡ■（−重鎖） ＥＭ　　ＴＣＧＡＣＴＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧ
ＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＧＴＡＡＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ　
　３ 合成りＮＡ■（−重鎖） ３−　　ＧＡＡＴＴＴＧＴＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＴ
ＧＴＡＣＴＴＣＡＴＴ−Ｐ　５（たたし、式中の記号は
前記に同じであり、合成りＮＡ■中のｒＰＪはリン酸基
を示すものである）２．４μｇ　（２００ｐｍｏｌｅ）
の合成りＮＡ■を１００μｌの緩衝液（５０ｍＭ）リス
−塩酸ｐ）（７，６，１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ　　、１０
ｍＭメルカプトエタノール、０．３ｍＭ　　ＡＴＰ）に
添加し、更にＴ４ＤＮＡキナーゼ（３０ユニツト）を添
加して３７℃で１時間反応させて５′末端をリン酸化し
た。この反応液に３．３μｇの合成りＮＡ　（２００ｐ
ｍｏ　ｌｅ）を含むＴＥ緩衝液１０μｌを添加し７０℃
で３０分間加温してアニーリングさせた。このアニーリ
ングした合成りＮＡ■と■を含む溶液を以後ＤＮＡ溶液
りとする。

合成りＮＡ■（−重鎖） ５　　　　　　Ｐ−ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡ
ＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡ　　３− 合成りＮＡ■（−重鎖） ３　　ＣＣＧＡＧＣＡＴＡＴＴＡＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡ
ＣＡＣＴＣＣＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＧＴＧＴＧＴＴ
ＣＧＡ　　５−（たたし、式中の記号は前記に同じ） ＤＮＡ溶液Ｃ（１０μｍ）　、ＤＮＡ溶液Ｄ（１０μｌ
）及びＤＮＡ溶液Ａ（２μｌ）を含む１００μｍの緩衝
液（６６ｍＭ）リス−塩酸ｐＨ７，６，５ｍ　Ｍ　　Ｍ
　ｇ　Ｃ１５ｍ　Ｍジチオスレ２ゝ イトール、０　、　６　ｍ　Ｍ　　Ａ　Ｔ　Ｐ　）に、
Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ（５０ユニツト）を添加し、１
６°Ｃで１２時間反応させた。この反応液１０μｍを使
用して、既知の方法により大腸菌（ＪＭＩ　０９株）を
形質転換した後、５０μｇ　／　ｍ　１のクロラムフェ
ニロールを含むＬＢプレートに塗布し、３７°Ｃで一晩
静置して生じたコロニーを５０μｇ　／　ｍ　１のクロ
ラムフェニコールを含むＬＢ培地に接種して一晩振盪培
養した。

得られた菌体溶液からアルカリ溶解法によってプラスミ
ドＤＮＡを回収した。該プラスミドＤＮＡは、Ｓ　ａ　
１　１　％　Ｈｉｎ　ｄ　　Ｉ［での消化によって８１
塩基対のＤＮＡ断片が生じることから目的のプラスミド
（ｐＡ３−Ｌ２）か得られたことか確認された。

本実施例での手順を図２に示す。

実施例　３ ｔａｃプロモーターの制御下でＣＡＴ遺伝子を発現する
プラスミド（ｐＫＫｔａｃ）を構築した。

ｔａｃプロモーターを有するプラスミドｐＫＫ　　２３
３−３　（ファルマシア社製、ｃａｔ、ｎｏ、２７−４
９３５−０１）のＤＮＡ　２　ｔｔ　ｇを５０μｍの緩
衝液（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７，５，５０ｍＭ　　
ＮａＣ１，１ｍＭジチオスレイトール）に添加し、Ｂａ
ｍＨＩ（５ユニツト）により３７℃で１時間消化し、生
じた約３５０塩基対のｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ
断片を電気泳導によって精製した。精製したＤＮＡを１
０μｍのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス−塩酸ｐＨ８，０
，１ｍ　Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）に溶解し、た。コの
ＤＮＡ溶液を以後ＤＮＡ溶液Ｅとする。

一方、プラスミドｐＫＫ２３２−８を発現すプロモータ
ー強度検定用ベクターのＤＮＡ２μｇを、５０μｍの緩
衝液（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７，５，５０ｍＭ　　
ＮａＣ１，１ｍＭジチオスレイトール）中でＢａｍ　　
Ｈｌ　（５ユニツト）により３７℃で１時間消化した。

反応液を等量のフェノール／クロロフォルムで抽出した
後、２倍量のエタノールを添加して消化されたプラスミ
ドＤＮＡを沈殿させ回収した。回収したＤＮＡは１０μ
ｌのＴＥ緩衝液に溶解した。以後、このＤＮＡ溶液をＤ
ＮＡ溶液Ｆとする。

５μｌのＤＮＡ溶液Ｅと５μｍのＤＮＡ溶液Ｆを含む５
０μｍの緩衝液（６６ｍＭ）リス−塩酸ｐＨ７，６，５
ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．５ｍＭジチオスレイトール、０．
６ｍＭ　　ＡＴＰ）にＴ４ＤＮＡリガーゼ（５０ユニツ
ト）を添加し、１６℃で１２時間反応させた。

１０μｍの反応溶液を使用して、既知の方法に従って大
腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌの
クロラムフェニコールを含むＬＢプレートに僧布して３
７°Ｃて一晩静置した。生したコロニーを、５０μｇ　
／　ｍ　１のクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に接
種し、３７°Ｃて一晩振盪培養した。

得られた菌体溶液からアルカリ溶解法によってプラスミ
ドＤＮＡを回収した。該プラスミドＤＮＡの、Ｂａｍ　
　ＩＩ、Ｅｃｏ　　Ｒ１での消化による消化パターンか
ら目的のプラスミド（ｐＫＫｔａｃ）が得られたことが
確認された。

本実施例での手順を図３に示す。

実施例４ 実施例１〜３て構築したプラスミドのブロモター強度を
、ＣＡＴ遺伝子の発現を指標として検定した。

大腸菌（ＪＭ！、０９株）をプラスミドｐＫＫ２３２−
８、ｐＡ３−Ｌ２、ｐＫＫｔａｃによって形質転換した
。

それぞれの形質転換菌を、５０μｇ　／　ｍ　１のアン
ピシリンを含むＬＢ培地（以後、Ｌ　Ｂ−Ａｍｐ”Ｑ地
とする）に接種し、３７°Ｃて一晩振盪培養した。１０
０μｍの培養液を、５ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地か入った
試験官２本に接種し、３７℃て振盪培養した。

培養液の濃度が０Ｄ６００−０．４となったときに、一
方にはＩ　ＰＴＧを最終濃度が０．５ｍＭとなるように
添加し、更に２時間振盪培養を続けた。

培養終了後、ＩＯＤ菌体を遠心分離によって集菌し、５
００μｌのＴＥ緩衝液で洗浄した後、再び１００μｍの
緩衝液（０，２５Ｍトリス−塩酸ｐＨ７，８）に懸濁し
た。懸濁液をドライアイス−エタノール中で急凍結した
後、３７℃の温浴にて解凍する操作を３回行って細胞を
破壊した。

５５μｌの細胞抽出液に７０μｌの１Ｍトリス−塩酸（
ｐＨ７，８）及び０．　１μｃｉ　　ｘｂｂクロラムフ
ェニコール（ＮＥＮ社製）を添加し、３７°Ｃて５分間
加温した後２０μｌの４ｍＭアセチルＣｏＡ・リチウム
塩（シグマ社製）を添加し、３７°Ｃで６０分間反応さ
せた。次に、１ｍｌの酢酸エチルを添加して反応を停止
させた後、有機溶媒層を抽出して乾燥させた。

２０μｌの酢酸エチルに乾燥物を懸濁した後、ＴＬＣ（
薄層クロマトグラフィー）に１μｍずつ５回スポットし
、クロロフォルム／酢酸エチル（ｖ　／　ｖ　＝　７５
　／　２５　）の展開溶媒で展開した。

ＴＬＣペーパーを乾燥後、Ｘ線フィルム（ＫＯＤＡＫ　
　Ｘ−ＲＡＭフィルム）、増感紙を使用して一８０°Ｃ
で一晩オートラジオグラフィーを実施した。結果を図４
に示す。

第４図によれば、プロモーターを有していないプラスミ
ドｐＫＫ２３２−８により形質転換されたＭ２Ｏ３株て
はＣＡＴ活性は検出されず（第２のカラム）、ｔａｃプ
ロモーターを有するＪＭ１０９／ｐＫＫｔａｃてはＩＰ
ＴＧを添加した場合に強いＣＡＴ活性が検出されている
（第３、第４のカラム）。本発明の、Ａ３プロモーター
の５フランキング領域及び−３５領域からなる第１のＤ
ＮＡ断片、ｌａｃの一１０領域からなる第２のＤＮＡ断
片及びｌａｃの一１０領域の下流に位置するオペレータ
一部分からなる第３のＤＮＡ断片が結合したハイブリッ
ドプロモーターを有するＪＭ１０９／ｐＡ３−Ｌｌでは
、Ｉ　ＰＴＧを添加した場合にＪ　Ｐｖｌ　１０９　／
　ｐ　Ｋ　Ｋ　ｔ　ａ　ｃを上回るＣＡＴ活性が検出さ
れた（第５、第６のカラム）。

これらの結果は、ＪＭ１０９／ｐＡ３−Ｌｌかｔａｃプ
ロモーター以上に強い発現力を有し、また、ｔａｃと同
様にＩ　ＰＴＧの添加により制御可能なプロモーターで
あることを示している。

実施例５ １μｇのプラスミドｐＵＫＯ２ｐｍ４　　（ヒト変異型
プロウロキナーゼ）ＤＮＡを５０μｍの緩衝液（１０ｍ
Ｍ）リス−塩酸ｐＨｇ、０，５０ｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｃｌ
　、　　１０　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２）に添加し
、更にＤｒａ　　ＩＩＩ（１０ユニツト）とＡａｔ　　
ｎ（１０ユニツト）を添加して３７℃で２時間反応させ
た。この反応液をフェノール処理した後、エタノール沈
殿を行ってＤＮＡ断片を回収した。

なお、プラスミドｐＵＫＯ２ｐｍ４は、寄託番号ｒＤＳ
Ｍ４２５７号」として西ドイツＤＳＭに寄託されている
。

一方、合成遺伝子■を、それぞれ７４塩基、７３塩基か
らなる２種の−本鎖ＤＮＡオリゴマ−をフォスフォアミ
グイト法により合成し、１μｇずつを１０μｍの反応液
（６，６ｍＭ）リス−塩酸ｐＨ７，６，５ｍ　Ｍ　　Ｍ
　ｇ　ＣＩ　２　）に添加して６５°Ｃて５分間加熱処
理した後室温で放置することでアニーリングさせて調製
した。

合成遺伝子■（二本鎖） ５−　　　　　ＧＴＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣ３−ＧＡＣ
ＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＣ
ＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣＧＧＴＧＣＡＡＡ
ＡＣＡＴＧＡＡＣＴＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＧＴＡＣＴＴ
ＧＡＴＡＣＴＴＣＴＣＧＴＧＡＣＧＴ　　　　３ ＣＡＣＴＧＣＡ　　　５” （たたし、式中の記号は前記に同じ） 合成遺伝子■は、両末端がＤｒａ ■及びＡ ａｔ　　ｎによる消化末端と同一であり、内部にＳａｌ
　　Ｉ及びＨｉｎｄ　　ｍによる認識部位及びメタピロ
力テカーゼ遺伝子のＳＤ配列（以後、Ｃ２３０ＳＤとす
る）を存するものである。

先にｐＵＫＯ２ｐｍ４から調製したＤＮＡ断片と合成遺
伝子■を２０μｌの緩衝液（６６ｍＭトリス−塩酸ｐＨ
７，６，５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．５ｍＭジチオスレイト
ール、０．１ｍＭ　　ＡＴＰ）に添加し、更にＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（１０ユニツト）を添加して１５℃で５時間
反応させて連結した後、この反応液５μｍを使用して大
腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換した。

得られた菌体溶液からアルカリ溶解法によってプラスミ
ドＤＮＡを回収した。該プラスミドＤＮＡについて種々
の制限酵素の消化パターンを調査した結果目的のプラス
ミドが得られたことが確認された。以後、このプラスミ
ドをｐＵＫΔｔａＣとする。

本実施例での手順を図５に示す。

実施例６ 先に調製したプラスミドｐＡ３−Ｌ２を５０μｇ含む２
００μｌの緩衝液（１０ｍＭ）リス塩酸ｐＨ７，６、Ｍ
ｇＣ１６０ｍＭ　　ＮａＣ２ゝ ｌ）にＳ　ａ　１　１　（１００ユ＝ツト）及びＨｉｎ
ｄ　　ＩＩＩ（１００ユニツト）を添加して３７℃で２
時間消化させた。この反応によって生じた８１塩基対の
ＤＮＡ断片を常法に従って単離した。

一方、５μｇのプラスミドｐＵＫΔｔａｃＤＮＡを含む
５０μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７，６、
ＭｇＣ１６０ｍＭ　　ＮａＣ２ゝ ｌ）にＳａｌ　１（１００ユニツト）及びＢｉｎｄ　　
ＩＩＩ（１００ユニツト）を添加して３７９Ｃで２時間
消化させ、反応によって生じた６千塩基対のＤＮＡ断片
をアガロース電気泳導により回収した。

８１塩基対のＤＮＡ断片を各々１μｇ含む２０μｌの緩
衝液（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７６，７ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃ１６０ｍＭ　　ＮａＣ１）２ゝ にＳａｌ　　１及びＨｉｎｄ　　ｍで切断したｐＵＫΔ
ｔａｃＤＮＡ１μｇを添加し、更にＴ４ＤＮＡリガーゼ
（１０ユニツト）を添加して１５℃で１５時間反応させ
て連結した。得られた反応液５μｌを使用して、既知の
方法により大腸菌（Ｊ　Ｍ　１０９株）を形質転換した
。

得られた転換菌からアルカリ溶菌法により本発明のハイ
ブリッドプロモーターを有するプラスミドＤＮＡを単離
した。以後、得られたＤＮＡを各々ｐＵＫＱ２−Ａ２と
する。

本実施例の手順を第５図に示す。

実施例７ 大腸菌によるヒト変異型プロウロキナーゼの生産性を測
定した。

プラスミドｐＵＫ０２　ｐｍ４及びｐＵＫＯ２−Ａ２を
使用して、大腸菌（ＫＹ１４３６株）を既知の方法によ
り形質転換し、得られた形質転換菌をＭ９ｍＥ培地（Ｍ
９ｓａ　ｌ　ｔ、ｏ、１％イストエキストラクト、０．
２％グリセロール、２μｇ　／　ｍ　１チアミン）で３
０分間振盪培養した。

対数増殖期において、最終濃度が１ｍＭとなる様にＩ　
ＰＴＧを添加し、更に４時間培養を行った。培養終了後
、１００Ｄユニツト相当の菌体を遠心分離により回収し
、１ｍｌの１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，０）に懸
濁し、超音波により菌体を破砕した。

破砕液を１ｍｌの５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８，９）
及び４Ｍグアニジン塩酸を含む溶液に懸濁し、５０°Ｃ
で６０分間放置することにより可溶化した。接液に、３
ｍｌの可溶化液（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８，０，０
，２ｍＭグルタチオン（還元型）　、５ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ）を添加し、室温で１６時間放置してリフォールディ
ングを行った。

溶液中のプロウロキナーゼを活性型のウロキナーゼにす
る目的で、９５μｍの活性化液（１０Ｑ　ｍ　Ｍ　トリ
ス−塩酸ｐＨ８，０，０，０１％トリトンＸ−１００，
５μｇプラスミン）を添加し、３７°Ｃにて３０分間放
置した。

プラスミンの反応を停止させるために２５μｇの大豆ト
リプシンインヒビターを添加した後、７００μｍのウロ
キナーゼの基質液（５０ｍＭ）リス−塩酸ｐＨ８，０，
０，２ｍＭ　　ウロキナゼ合成基質（Ｓ−２４４４、第
−化学薬品製）、０．０１％トリトンＸ−１００）を添
加し、３７０Ｃにて３０分間反応させた。

１０００μｌの酢酸を添加して反応を停止させた後、４
０５ｎｍの吸光度を測定して標準ウロキナーゼ（緑十字
（株）社製）の合成基質（Ｓ２４４４）の分解活性と比
較した。

結果を次表に示す。この結果、ｔａｃブロモターを有す
るプラスミド（ｐＵＫ−（１２）に比較して、本発明の
プロモーターを有するプラスミド（ｐＵＫＯ２−Ａ２）
では、約１．２倍のプロウロキナーゼか発現しているこ
とがわかる。

添加することなしに培養を続けたものを示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）大腸菌Ｔ３ファージ初期遺伝子群の発現を誘導す
   るプロモーターの５′フランキング領域及び−３５領域
   からなる第１のＤＮＡ断片、他のプロモーターの−１０
   領域からなる第２のＤＮＡ断片及び第１のＤＮＡ断片と
   第２のＤＮＡ断片から形成されるプロモーター部分の発
   現を制御し得る第３のＤＮＡ断片が結合してなるハイブ
   リッドプロモーター。（２）第１のＤＮＡ断片が次式で
   示される塩基配列からなるプロモーターの少なくとも５
   ′フランキング領域及び−３５領域を含むことを特徴と
   する請求項第（１）項記載のハイブリッドプロモーター
   。 【遺伝子配列があります】 （ただし、式中の記号は通常の遺伝学の分野で使用され
   るものと同じ意味である） （３）第２のＤＮＡ断片と第３のＤＮＡ断片がラクトー
   スプロモーターの−１０領域及び当該領域より下流（３
   ′側）に位置するオペレーター部分であることを特徴と
   する請求項第（１）又は第（２）項記載のハイブリッド
   プロモーター。 （４）第２のＤＮＡ断片が次式で示される塩基配列から
   なるラクトースプロモーターの少なくとも−１０領域及
   び当該領域より下流（３′側）に位置するオペレーター
   部分からなることを特徴とする請求項第（３）項記載の
   ハイブリッドプロモーター。 式 【遺伝子配列があります】 （ただし、式中の記号は前記に同じ） （５）次式で示される塩基配列からなることを特徴とす
   る請求項第（４）項記載のハイブリッドプロモーター。 式 【遺伝子配列があります】 （ただし、式中の記号は前記に同じ）