JPH03198776A

JPH03198776A - 新規ｄｎａ作製方法

Info

Publication number: JPH03198776A
Application number: JP34395889A
Authority: JP
Inventors: Aizo Matsushiro; 松代　愛三; Takashi Morita; 隆森田
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-12-27
Filing date: 1989-12-27
Publication date: 1991-08-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はＤＮＡの作製方法に関し、特に長鎖のＤＮＡ作
製方法に関する。

（従来の技術）近年の遺伝子操作技術の発展に伴い、未知の有用ＤＮＡ
の探索、及び人工的にＤＮＡを作製することが盛んに行
われるようになった。

このうち、人工的にＤＮＡを作製する手段としては、従
来デオキシリボヌクレオチド−分子ずつを連結試薬を用
いて連結することにより、鎖状ＤＮＡを作製する方法等
が知られていた。

（発明が解決しようとする課題）しかしながら、上述した従来のＤＮＡ作製方法では、そ
の使用する機器の構成から下記の如く欠点が指摘されて
いる。

（１）作製した鎖状ＤＮＡを複製する手段を備えていな
いので、該長鎖ＤＮＡを別途複製機器にかける必要があ
り、該機器を保有していない場合には限られた量の該長
ＭＤ　Ｎ　Ａ　Ｌか使用できなかったため用途も限定せ
ざるを得なく、その調製量、使用用途においてかなりの
拘束があった。

（２）デオキシリボヌクレオチド−分子ずつの連結反応
における目的物質の収率に限界があるため、長鎖になる
ほど累積的に該目的物質の収率が低下し、結果として所
望の塩基配列を備えた鎖状ＤＮＡの取得が長鎖になるほ
ど難しくなる。

（３）上記欠点（１）　（２）の結果、比較的長鎖の鎖
状ＤＮＡを適当量作製する場合には、相当量の試薬を要
することとなり、その収率の限界が故に該鎖状ＤＮＡの
作製後には使用した試薬の大部分が無駄に廃棄処分され
ることになり、高価な試薬コストの負担だけが残る。

（４）また、−ヌクレオチドの連結には約１０程度度要
するため、比較的長鎖のＤＮＡを作製する場合には長時
間を要し、かなりの人的負担及び人的ロスを強いるもの
である。

（５）さらに、従来のＤＮＡ作成機器のみでは一本鎖Ｄ
ＮＡＬか合成できない。

これら諸欠点が故、従来のＤＮＡ作製機器では、比較的
短鎖（３０〜５ｏｂｐ程度）の鎖状ｒｌＮＡを作製する
にあたっては簡便なものであったが、現在、研究現場が
必要としている自然界に存在する遺伝子程度の（数百塩
基単位以上の）鎖状ＤＮＡを従来のＤＮＡ作製機器のみ
で作製しようとすれば、上述したような作製作業に要す
る時間及び人的労力、目的とする鎖状ＤＮＡの収率の限
界、及び作製作業に要した試薬の大部分が無駄になる等
の経済的な問題があったため、その実現は困難なもので
あった。

（課題を解決するための手段）本発明は、上述した課題に鑑みて発明されたものであっ
て、従来の構築工程のみから構成されていたＤＮＡ作製
方法に新たに複製工程を組み合わせることにより、構築
工程で作製された微量の長鎖のＤＮＡを従来よりも短時
間に、しかも大量に不純物の中から選択的に複製して提
供することを目的としている。

その要旨とするところは、複数のデオキシリボヌクレオチドを結合剤を用いて結合
してなる鎖状ＤＮＡ及び前記鎖状ＤＮＡのプライマーを
作製する構築工程、及び熱変性処理された前記鎖状ＤＮ
Ａに該鎖状ＤＮＡのプライマーをアニールし、該プライ
マーをアニールされた鎖状ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼ
を用いて相補鎖を合成する一連の操作を反覆してＤＮＡ
断片を複製し、二本鎖ＤＮＡを得る複製工程を特徴とす
るＤＮＡ作製方法である。

また、前述のＤＮＡ作製方法において、鎖状ＤＮＡが一
本鎖ＤＮＡであることを特徴とするものである。

さらに、前記一本鎖ＤＮＡが１００塩基以上のＤＮＡ分
子からなるＤＮＡ作製方法である。

以下、本発明のＤＮＡ作製方法につき、一本鎖ＤＮＡの
場合を例にとり、添付した図面を参照しつつ詳細に説明
する。

まず、一本鎖ＤＮＡ及び該一本鎖ＤＮＡのプライマーを
作製する構築工程を説明する。

■　目的とする一本鎖ＤＮＡを構成する塩基配列をＤＮ
Ａ作製機器（商品名ｒＭｏｄｅｌ　３８１八ＤＮ八シン
セサイザー」アプライドバイオシステム社製）のプログ
ラム部に入力した後、ＤＮＡ作製を開始する。

■　上記操作により、ＤＮＡを構成する各種塩基を含ん
だホスフォ・アミダイド・ボトル及びＤＮＡ分子を連結
するところの（トリクロロ酢酸、テトラゾール及び＋１
２０．＃Ｚからなる）結合剤が入力されたプログラムに
従って、経時的に該ＤＮＡ作製機器に備え付けの合成カ
ラムに放出されて−ヌクレオチドずつを化学反応により
連結し、目的とする一本鎖ＤＮＡを構築する。

■　また、前記手法に従って該一本鎖ＤＮＡのプライマ
ーも構築する。

次に、上記構築過程を経て得られた一本鎖ＤＮＡの複製
過程を第１図に沿って説明する。

■　上記構築過程で得られた一本鎖ＤＮＡ　（斜線部は
必要とするＤＮＡ部分を示す）（Ａ）をチューブに採り
、そして該チューブをＤＮＡ複製機器（商品名ｒＢｉＧ
ｅｎｅ　ＰＩＩＣ−Ｉ　Ｊ　Ｔｅｃｈｎｅ社製）に装着
し、温度（水温）を３７〜５５°Ｃに２分間維持して、
前記−本積ＤＮＡの一端にプライマーをアニールする。

■　該アニールされた一本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を温度を７０
〜７２°Ｃに３分間維持して、耐熱性ポリメラーゼを用
いて相補鎖（Ｃ）を合成する。

■　該相補鎖（Ｃ）を温度を９０〜９４°Ｃに１分間維
持して、熱変性させて一本鎖ＤＮＡ　（Ｄ）に復元する
。

■　次いで、温度を３７〜５５°Ｃに２分間維持して、
該熱変性により得られた一本鎖ＤＮＡ　（Ｄ）の両端に
プライマーをアニールする。

■　該アニールされた一本鎖ＤＮＡ　（Ｅ）を温度を７
０〜７２°Ｃに３分間維持して、耐熱性ポリメラーゼを
用いて相補鎖（Ｆ）を合成する。

■　以下、■〜■の操作を適宜反覆するごとにより選択
的複製（増幅）が行われ、所望のＤＮＡ断片（Ｘ）が相
当量得られる。

また、上記複製過程の各反応（熱変性（１）、プライマ
ーのアニーリング（■）、及び相補鎖の合成（■））を
円滑に行うための時間・温度関係を第２図に示した。す
なわち、・熱変性（Ｉ）は、９０〜９４°Ｃで１分間、・プライ
マーのアニーリング（ＩＩ）は、３７〜５５°Ｃで２分
間、そして、・相補鎖の合成（ＩＩＩ）は、７０〜７２°Ｃで３分間
という温度・時間設定が各反応を完了する上で好ましい
ことが判明している。

（実施例）に　　工　に　いる゛　の下記の試薬を調製した。

（１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＴａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　　（Ｃｅｔｕｓ社製）
（２）　ｄ−八ＴＰ　　、　　ｄ−ＣＴＰ　　、　　ｄ
−ＧＴＰ　　、　　ｄ−ＴＴＰ（３）緩衝液１０倍程度に希釈して用いるように濃縮したもの。

（４）２種類のｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｒ
ｉｍｅｒ　（オリゴヌクレオチド・プライマー、　２５
ｍａｒ）従来法の構築工程で作製されたオリゴヌクレオ
チド・プライマー目的とする部分のＤＮＡの二本鎖のそれぞれ３゛側に相
補的なもの。

（５）　　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　　ＤＮＡ従来法の構築工
程で作製された一本鎖ＤＮ　Ａ　　（１４０ｂａｓｅｓ
）目的とするＤＮＡが数分子でも存在すれば、それを認識
し、選択的に複製するので使用するＴｅｍｐｌａｔｅ　
ＩＩＮＡは微量でよい。

寛　１２：「Ｉ５ゝの：Ａ− 上記実施例１で調製した試薬を以下の順で混合する。こ
の際、試薬の混合順序に注意を払う必要がある。

（１）蒸溜水　　　　　　　　　　　　７０μＰ（２）
　１０倍希釈緩衝液　　　　　　　　１０μ！（３）　
ｄ−ＮＴＰ　（２００μＭ）（２μ２×４種類）　　　８μ！（４）　　　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　　ｐｒ
ｉｍｅｒ　　　（１７７Ｍ）（５μ！×２種類）１０μ
！（５）　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＩＩＮＡ　（微量）１１１
Ｉ！。

（６）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＴａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（５０００ｕ／ｍｌ）
　　　１μ！合　　　計　　　　　　　　　　１００μ
！尚、反応液の蒸発により、反応液の組成が変化するこ
とを防ぐため、鉱物油または流動パラフィンでシールし
た。

実尤１ＬしＤＵ監附Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　（１４０塩基：第４図にそ
の塩基配列を示した）及び２５　ｍｅｒのｏｌｉｇｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｒｉｍｅｒ２種ｇ（Ｍ旧（第５
図にその塩基配列を示した）及びＭＭ２　（第６図にそ
の塩基配列を示した）　）　、１０倍希釈緩衝液、ｄ−
ＡＴＰ、ｄ−ＣＴＰ　、　ｄ−ＧＴＰ　、　ｄ−ＴＴＰ
及びＴａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、ＤＮＡ複製
機器（商品名’ＢｉＧｅｎｅＰＩＩＣ−Ｉ　Ｊ　Ｔｅｃ
ｈｎｅ社製）によりＤＮＡの複製実験を行った。

（１）試薬の混合５本のチューブを用意し、以下の試薬を記載した順に添
加した。

但し、Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ以外は全ヂプ、−ブ同
一の試薬を同一量添加した。

蒸溜水　　　　　　　　　　　　　７０μ１１０倍希釈
緩衝液　　　　　　　　　１０μｌｄ−八ＴＰ　　（１
０ｍＭ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２　　μ　Ｉｄ−ＣＴＰ　（１０ｍＭ）　　　　　　
　　　　　２μ！ｄ−ＧＴＰ　（１０ｍＭ）　　　　　
　　　　　　２　／／　Ｉ−ｄ−ＴＴＰ　（１０ｍＭ）
　　　　　　　　　　　２　ｔｔ　Ｅｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ＭＭＩ（２５ｍｅｒ、
　２０μＭ）　　　　　　　５　／／　Ｒ９ｏ１ｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ＭＭ２（２５ｍ
ａｒ、　２０μＭ）　　　　　　　５　ｔｔ　Ｉ！・Ｔ
ｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡチューブ（Ｎｏ、１）Ｔｅｍｐｌａｔｅ　　ＤＮＡ　　　（１ｕｇ／ｕ　　ｆ
ｆ１）　　　　　Ｉ　　ＩＩ　　ｌ−チューブ（Ｎｏ、
２）Ｔｅｍｐｌａｔｅ　　ＤＮＡ　　　（５０ｎｇ／ＩＩ　
　ｆ）　　　　　１　　μ　！チューブ（Ｎｏ、３）Ｔｅｍｐｌａｔｅ　　ＤＮＡ　　　（１ｎｇ／ＩＩ　　
ρ）　　　　　１μｆｆチユーブ（Ｎｏ、４）Ｔｅｍｐｌａｔｅ　　ＤＮＡ　　　（５０ｐｇ／Ｉｔ　
　４２）　　　　　Ｉ　　ＩＩ　　ｌ−チューブ（Ｎｏ
、５）Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　　（１ｐｇ／ｐ　４２）　
　　１　ｔｌ　ｉ！−Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　
（５０００ｕ／ｍｌ）　　　　　１７／　ｊ２・流動パ
ラフィン　　　　　　　　　２０μ！合　　　計　　　
　　　　　　　１２０μ！（２）温度コントロール前記反応温度変化の調整には１程度度を要するので、熱
変性を９４°Ｃ・２分間、プライマーのアニーリングを
３７°Ｃ・３分間、及び相補鎖の合成を７２゛Ｃ・４分
間に設定した。

（３）結果２０サイクルの反応後、反応液１００／Ｉｆ中２０μＡ
　（１１５１）を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
した。

その電気泳動図を第３図に示した。

該電気泳動図からも明らかなように、既成の各種濃度Ｔ
ｅｍｐｌａｔｅ　ＩＩＮＡを用いたレーン（第３図：奇
数番レーン）においては、該１２既成のＴｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ含有濃度が最も大きい
１μｇ　　（１μｇ／１ｌｆｆｉ）のレーン（第３図：
レーン９）においてさえ該ＤＮＡの存在が確認できなか
ったのに対して、本発明の方法で作製した各種濃度Ｔｅ
ｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡを用いたレーン（第３図：偶数番
レーン）においては、５０ｐｇ　（５０ｐｇ／μりとい
う希薄な濃度のＴｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　（第３図：
レーン４）においても複製された（１４０塩基対の）Ｄ
ＮＡのｂａｎｄが認められ（第３図白抜矢印参照）、こ
れより本発明の複製工程が微量のＤＮＡであってもそれ
を認識し、選択的に複製するということが確認できた。

（効果）本発明は、従来の構築工程のみから構成されていたＤＮ
Ａ作製方法に新たに複製工程を組み合わせることにより
、構築工程で作製された微量の長鎖のＤＮＡから、従来
よりも短時間に、しかも大量に複製して提供するもので
ある。

これにより、従来自然界に存在する動植物から直接入手
するしか方法のなかった数百塩基を越える長鎖のＤＮＡ
でも、本発明の構築工程により極微量の該長鎖のＤＮＡ
を構築することにより、新たに組み合わされた本発明の
複製工程において容易にまとまった量の該二本鎖ＤＮＡ
を人工的に合成、あるいは既知の（塩基配列等の）情報
を基に所望の鎖状ＤＮＡを復元・複製゛することを可能
にした。

また、本発明の複製工程は原理的には塩基間の相補性を
利用したものなので、ＤＮＡに限らすＲＮＡについても
適用可能である。

さらに、本発明により作製された長鎖のＤＮＡの有用な
使用方法として、該ＤＮＡを大腸菌等の細菌に導入して
、新規のペプチドあるいは酵素等を産生させることが考
えられる。

これまで述べたように、本発明によるＤＮＡの作製方法
によれば、自然界に存在する動植物が保持しているのと
同程度の長さの遺伝子ＤＮＡを人工的に合成、あるいは
復元・複製することが可能となり、今後、自由自在に新
規物質あるいは新規生物を創造するだめの手段として産
業面、学術面等において大いに貢献することが期待でき
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の複製工程を示す図、第２図は、本発
明の複製工程における温度コトロール状態（温度・時間
）を示す図、第３図は、分子量マーカーφＸ　１７４１１ａｅｌｌｌ断片（レー
ンＹ）１　　ｐｇ／ＩＩ　ｆｆｉ　　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｉ）
Ｎ＾（レーン１）、本発明の方法で作製した１　ｐｇ／
μ（！　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　（レーン２）、５０　ｐｇ／ｐ　Ｉ　　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　（
レーン３）、本発明の方法で作製した５０　ｐｇ／μＩ
　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　（レーン４）、Ｉ　　ｎｇ／ｇ　Ｉ　　ＴｅｍｐＩａｔｅ　ＤＮＡ　（
レーン５）、本発明の方法で作製した１　ｎｇ／μＩ　
Ｔｅｍｐ−１ａｔｅ　ＤＮ＾（レーン６）、５０　ｎｇ／ｐ　Ｉ！、Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　（
レーン７）、本発明の方法で作製した５０　ｎｇ／μＩ
　Ｔｅｍｐ−１ａｔｅ　ＤＮＡ　（レーン８）、１　ｔｔｇ／ｕ　Ｉ！　　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　
（レーン９）、及び本発明の方法で作製した１μｇ／μ
ｌＴｅｍｐｌａｔｅ　ＩＩＮＡ　（レーン１０）を用い
て電気泳動した結果を示す図、第４図は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＩＩＮＡの塩基配列を示
す図、第５図は、ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐ
ｒｉｍｅｒ　ＭＭＩ　（２５ｍｅｒ）の塩基配列を示す
図、第６図は、ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｒｉｍ
ｅｒ　ＭＭ２　（２５ｍａｒ）の塩基配列を示す図であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）複数のデオキシリボヌクレオチドを結合剤を用い
て結合してなる鎖状ＤＮＡ及び前記鎖状ＤＮＡのプライ
マーを作製する構築工程、及び熱変性処理された前記鎖状ＤＮＡに該鎖状ＤＮＡの
プライマーをアニールし、該プライマーをアニールされ
た鎖状ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合
成する一連の操作を反覆してＤＮＡ断片を複製し、二本
鎖ＤＮＡを得る複製工程を特徴とするＤＮＡ作製方法。
（２）前記鎖状ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである請求項１に
記載のＤＮＡ作製方法。
（３）前記一本鎖ＤＮＡが１００塩基以上のＤＮＡ分子
からなる請求項２に記載のＤＮＡ作製方法。