JPH03193A

JPH03193A - 産業スライムの防除へのグルカナーゼの利用

Info

Publication number: JPH03193A
Application number: JP3401890A
Authority: JP
Inventors: Christopher L Wiatr; クリストファー　エル．ウィアター
Original assignee: Nalco Chemical Co
Current assignee: ChampionX LLC
Priority date: 1989-03-13
Filing date: 1990-02-16
Publication date: 1991-01-07
Also published as: CA2001538A1; AU622257B2; AU4772490A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、冷却塔の表面に存在又は付着し及び製紙にお
ける損紙水に存在する微生物が生成した細胞外ポリマー
を処理するためのグルカナーゼ酵素系に関する。このよ
うな細胞外ポリマー及び微生物細胞は、バイオフィルム
又は微生物スライムとしても知られている。

〔従来の技術及びその課題〕

微生物的に生成する細胞外ポリマーは、付着し、熱伝達
を妨げ、そして冷却系統を通って水が流れるのを制限す
る。有毒な薬剤を通用してスライム形成細菌を防除する
ことは、環境問題の面からますます受入られなくなって
いる。さらに、微生物を被覆している細胞外多糖類は大
部分不透過性であるので、毒物の効力はスライム自体に
より最少限となってしまう。

毒物は付着した大きな細菌群を十分に防除できず、主に
浮遊している微生物に対して効果的である。スライムに
浸透しばらばらにするのに役立つ界面活性剤及び分散剤
は、毒物の活性を増強できるけれども、非特異的であり
、工業プロセスに悪影響を及ぼすことがある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、特異的及び無毒性である両方の利点を有する
グルカナーゼの使用に関する。

本手法は、（ａ）スライムが生成した場合のスライムの
除去率を高め、（ｂ）スライムの付着を防止し、（ｃ）
固着した細菌に対する殺生物剤の効力を向上させること
を目的としている。グルカナーゼは、細菌を取り囲んで
いるスライム層を特異的に攻撃する。その結果、微生物
は、プランクトン様（即ち、バイオフィルム産生の面で
無害）になり、殺生物剤に対して感受性となる。又、こ
の酵素は、表面を清浄に維持する作用もする（第６図及
び備考参照）。

従来技術にかかる単一酵素製剤としては、例えば、エコ
ノミクス・ラボラトリーズ社（ＥｃｏｎｏｍｉｃｓＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋　Ｉｎｃ、）のバッチャ−（Ｈ
ａ　ｔｃｈｅｒ）による米国特許第３．７７３，６２３
号に記載のものが挙げられる。これらの製剤では、バル
ブ及び製紙工場からの白水等の工業用水中にスライムが
生成するのを、酵素レバンヒドロラーゼの量を調整する
ことにより阻止している。

又、クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｒ＋）　　
（ナルコ社（Ｎａｌｃｏ）　）による米国特許第４，０
５５，４６７号には、スライムと工業プロセスについて
の記載があり、この工業プロセスにより前記スライムを
数ｐｐｍ＋の酵素、ローザイムＨＰ−１５０（ベントサ
ナーゼーヘキソサナーゼ）で処理することによりスライ
ムを分散し防止することができるとしている。さらに、
エコノミクス・ラボラトリーズ社（Ｅｃｏｎｏａ＋ｉｃ
ｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）のハフチ
ャー（Ｈａ　ｔｃｈｅｒ）による米国特許第３．８２４
．１８４号　には、工業用水に酵素レバンヒドロラーゼ
を調整した量で意図的に添加することによりスライムの
生成を抑制することが記載されている。

さらに、ペーダーセン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）等〔アッコ
ラブ社（Ａｃｃｏｌａｂ、　Ｉｎｃ、）による米国特許
第４，６８４，４６９号には、スライムを防除するのに
適当な二成分殺生物組成物法が開示されている。この製
剤は、殺生物剤と多Ｉ！類分解酵素からなっている。

殺生物剤に関しては、−船釣に、メチレン−ビス−チオ
シアネートが好ましいとされてきた。使用可能な他の殺
生物剤としては、ペンタクロロフェネート類及びトリク
ロロフェネート類等のクロロフェネート化合物；フェニ
ル水銀酸等の存機水銀化合物：メチルジチオカルバメー
ト、エチレンビスジチオカルバメート及びジメチルジチ
オカルバメート等のカルバメート化合物；シアノジチオ
イミドカーボネート等のカーボネート化合物；クロロエ
チレンチオシアネート化合物等のチオシアネート類；並
びにプロモーヒドロキシアセトフェノン化合物、ベンゾ
チアゾール化合物、エチレンジアミン化合物、ニトリロ
プロピオンアミド、ブロモプロピオンアミド、プロモー
アセトキシブテン、ブロモプロパツールアルデヒド化合
物、ビス−トリクロロメチルスルホン、ビメチルヒダン
トイン化合物等の他の殺生物剤が挙げられ、同様の殺生
物剤混合物を使用できる。

メチレン−ビス−チオシアネート殺生物剤は、ジメチル
ジチオカルバメートとジソジウムエチレンビスジチオカ
ルバメートの組み合わせを有しているので、本発明にお
いては特に効果的であることが判明した。

細菌の防除に関する殺生物剤の使用に対するグルカナー
ゼ組成物の利点としては、殺生物剤は系に毒物剤を有し
ているので、常に公害問題がつきまとっているのに対し
て、グルカナーゼ組成物の場合はその問題がないことが
挙げられる。単一酵素と殺生物剤からなる製剤に対する
本発明の製剤の利点は、単一酵素は狭い一つの炭水化物
ポリマー群しか攻撃できないのに対して、本発明では、
β−グルカナーゼとα−アミラーゼの活性を塩基性プロ
テアーゼと組み合わせすることにより攻撃範囲を改善し
て、広く炭水化物ポリマー及び細菌を取り囲んでいるタ
ンパク質を攻撃できる０本発明による複数酵素製剤に使
用するための具体的な配合割合としては、例えば、β−
グルカナーゼ２部、α−アミラーゼ１部及びプロテアー
ゼ１部である。この製剤において、α−アミラーゼはの
量は少なくとも１部であり、１部をわずかに超えていて
もよい、プロテアーゼは１部としているが、実際には、
０．５部〜１部でよく、そしてβ−グルカナーゼは２部
である。

好ましい組成物としては、β−グルカナーゼ２部、α−
アミラーゼ１部とプロテアーゼ１部からなるものが挙げ
られる。この組成物において、β−グルカナーゼの代わ
りにセルラーゼを用いてもよい。

一般的に、グルカナーゼの使用量は、２〜１００ｐｐｍ
（１００ｐｐ　ｐｅｒ　ｍ１ｌｌｉｏｎ）であり、２〜
１０　ｐｐｍでもよい。グルカナーゼは、アメリカン・
シアナミド社（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｙａｎａｍｉｄ）
　、ペッツ社（Ｂｅｔｚ）、ベックマン社（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ）　、デアボーン・ケミカル社（Ｄｅａｒｂｏｒｎ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）　、エコノミクスラボラトリー社
（Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｎｃ
、）　、メルク社（Ｍｅｒｃｋ）　、ナルコ社（Ｎａｌ
ｃｏ）　、パインランドケミカル社（Ｖｉｎｅｌａｎｄ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）等の多くの薬品業者から入手でき
る。

本発明の効果を得るのに必要なグルカナーゼの濃度は、
大きく異なり、水の温度及びｐＨ１微生物数及び処理す
る工業用水の種類等の条件により異なっていてもよい。

必要濃度の上限及び下限は、使用する酵素の種類又は酵
素の組み合わせにより実質的に決まる０例えば、本発明
においては、非常に効果的なグルカナーゼの場合には、
工業用水１００００００部に対して主にグルカナーゼ約
１部又は２部の濃度でよいが、最少濃度８０〜１１００
ｐｐが必要なこともある。

従来技術に対して、本発明の製剤は、より特異的で且つ
毒性が低い。本発明自体及び従来技術との比較から、本
発明の組成物は標的ポリマーは同じであるが、α−アミ
ラーゼ及びプロテアーゼとの混合物の形態におけるグル
カナーゼの酵素活性のために、標的ポリマーをより効果
的に消化できることが言える。さらに、β−グルカナー
ゼは、この効果を生じさせる独特の酵素成分である。α
−アミラーゼ及びプロテアーゼは、微生物スライムを損
傷させ、β−グルカナーゼをスライムエキソポリマーに
接近させることにより、スライムエキソポリマーをより
効果的に消化させることができる。

一般的な機構の面から、α−アミラーゼ単独では、スラ
イムの保護もしないし、スライムの除去もしない。α−
アミラーゼは、グルコース分子間のα−結合を攻撃する
。即ち、α−アミラーゼは、スライム分子の外側を損傷
し、その結果、β−グルカナーゼは炭水化物分子中に入
って攻撃できる。

プロテアーゼは、細胞外タンパク質分子を攻撃する。

最近まで、細菌により形成された産業スライム又はスラ
イムポリマーの酵素処理は、単一酵素、例えば、レバナ
ーゼにより行われていた。レバナーゼは、レバンのポリ
マーをそのサブユニット（フルクトース）に分解する。

しかしながら、レバナーゼをスライムレバンに使用した
後も、耐性のある細菌は増殖する。レバナーゼをさらに
適用しても、攻撃するポリマーがもはや存在しないので
効果がない。レバンポリマーはなくなっても、他のスラ
イムポリマーがまだ存在しており、細菌が成長する。他
の酵素製剤、例えば、ＥＤＣ（レバン加水分解剤）〔ス
ノコ社（Ｓｎｏｃｏ）　）が市場において使用されてき
たが、ポリマー中に配列しているグルコース、マンノー
ス及びグロースｔｉ量が多いタレブシェラ（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌａ）　、アシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ）　、フラボバクテリウム（Ｆ　１ａｖｏｂａ
ｃ　ｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ）及びエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）等のフィールド（ｆｉｅｌｄ）におけるシュードモ
ナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂａｃｔｅｒｉａ）
及び他の菌により形成されたポリマーを実際に攻撃する
酵素の組み合わせはいままでなかった。

汎用プロセスと上記の従来技術において、本発明では、
シュードモナス菌の透明培養を採取し、低基質環境でス
ライムポリマーを形成させた。第二に、本発明では、研
究室並びにフィールド条件の両方で、類似の冷却塔水及
びユーティリティー水を用いて、−緒に配合及び成長さ
せたフィールドから微生物の混合物を採取した。

その結果、細菌由来の炭水化物層の最大除去率が得られ
ることが判明した。即ち、グルカナーゼを利用すること
により、特に非常に広く行き渡っているシュードモナス
菌に有効であることが判明した場合、優れた結果が得ら
れる。

シュードモナス菌に対しては、試験において種々の酵素
を用いた。４２種の酵素製剤のうち、３種の酵素が、シ
ュードモナス閑が生成したスライムに対して効果的であ
る事が判明した。第一に、α−アミラーゼが細菌性スラ
イムを攻撃することが判明した。第二に、プロテアーゼ
も細菌性スライムに影響を及ぼすことが判明した。さら
に、酵素とアミラーゼ、グルカナーゼ及びプロテアーゼ
とを組み合わせた処理がバイオフィルムの除去に効果的
であることが判明した。

〔実施例〕

実施■」約４０個の酵素の候補について、スライム化した顕微鏡
スライドを小さな攪拌無菌ビーカー中で酵素の候補で処
理して予備活性スクリーニングを行った。試験スライド
は、シュードモナスのコロニー隔離集団又は工業用水中
で細胞外ポリマーを生成することが知られているフィー
ルド微生物の混合物を用いてスライム発生ボックス中で
調製した。細菌は、トリプシン大豆肉汁（ｔｒｙｐｔｉ
ｃ　ｓｏｙ　ｂｒｏ　ｔｈ　（ＴＳＢ）中で増殖し、ト
リプトングルコース抽出物（ＴＧＥ）について数えた。

ＴＳＢ栄養源を補充するために無水デキストロース（Ｄ
−グルコース）を用いた。

酵素消化率は、１時間、２時間及び４時間の間隔で、ス
ライドからのバイオフィルムの除去を視覚により評価し
て測定した。このスクリーニング試験において有望な活
性を示した酵素候補を、下記に説明するようにしてより
詳細に調査した。

実施］」スクリーニング試験で選択された９個の最も有望な炭水
化物とプロテアーゼを、現場用途での水管汚れをシュミ
レートしたバイオフィルム・リムーバル・リアクター（
Ｂｉｏｆｉｌｍ　Ｒｅｍｏｖａｌ　Ｒｅａｃｔｏｒ）（
ＢＲＲ）を用いてさらに試験した。この反応器の概略を
、第１図に示す。反応管は、最初に、循環最少基質にス
ライム形成細菌を７２時間暴露することによりスライム
化した。

候補酵素の各々を、表１に示した条件下で２４時間、１
１００ｐｐのレベルで反応器中で試験した。ＢＲＲ中に
おけるバイオフィルムの除去率は、汚染系を酵素処理し
て得られるバイオマスの減少率で測定した。混合プロテ
アーゼ−炭水化物に関しての結果を第２図及び表２に示
す。これらの試験の場合、反応管を６０°Ｃで一晩乾燥
秤量後、よごれを落とし、乾燥復興秤量して重量につい
ての記録データを得た。

これらの酵素について、ミクロバイアル・ファウリング
・リアクター（Ｍｆｃｒｏｂｉａｌ　Ｆｏｕｌｉｎｇ　
Ｒｅａｃｔｏｒ）　（ＭＦＲ）中でさらに試験を行った
。このミクロバイアル・ファウリング・リアクターは、
汚れの基準としてスライム化反応管間の圧力効果も提供
する。この装置を第３図に示し、実験条件を表１にに記
載する。バイオマス測定の実験法は、実験の途中でバイ
オマスを数回測定する以外は、上記で使用した方法と概
略同様であった。さらに、酵素処理の有効性を、反応器
のスライム化管間の圧力効果の減少だけでなく、点検窓
部を視覚で観察することにより測定する。第４図及び第
５図に、混合酵素の試験結果を、ポリオールバイオ分散
剤と比較して示す。

バイオフィルム・リムーバル・リアクター中で試験した
酵素製剤のうちの５個は、スライムを防除するのに有効
であった。これらを、相対的な有効性とともに表２に示
す。これらのうち、グルカナーゼは、明らかに最も優れ
た性能を示した。この酵素混合物は、プロテアーゼ１種
とカルボヒドラターゼ２種、即ち、α−アミラーゼとβ
−グルカナーゼを組み合わせたものである。この酵素混
合物は、細菌の純粋株及び混合株の培養により生成した
スライム層を消化するのに効果的であることが判明した
。試験時間で３７％のバイオマス除去率を示した市販の
混合酵素組成物を表に示す。

又、バイオフィルム・リムーバル・リアクター（第１図
）に関する結果を、第２図にも示す。バイオフィルム除
去実験において、酵素セルラーゼにより、２４時間の処
理後、バイオマスの２３％（６２ｍｇ／ｃｍ”）が除去
された（処理前のＢＯｍｇ／　ｃｍ”に対して処理後６
２ｍｇ／　ｃｍ”　）。α−アミラーゼ、β−グルカナ
ーゼ及びプロテアーゼ酵素を１　　：２　　：ｌで組み
合わせたものでは、同じ時間でバイオフィルムの３７％
が除去された。未反応の対照（ブランク）では、バイオ
マスが６５％増加した。比較のために用いた非酵素的化
学バイオ分散剤は、バイオフィルムの発育を実質的に全
体的に抑制したが、バイオマスは少しも除去されなかっ
た。即ち、複数酵素法が最も良い結果を示した（３７％
）。

ＭＦＲ実験におけるバイオマス除去に関する実験は、７
２．５時間と９６．５時間との間で得られた３７％の除
去率（第４図）と実質的に一致した。同様（ＭＦＩ？）
の実験における圧力降下のデータ（第５図）が、この知
見を裏付けている。

ス１１１Ｊ混合酵素に焦点を当てて、さらにＭＦＨの研究を行い、
ｐＨのバイオフィルムの除去に及ぼす影響を測定した。

対照としてポリオールバイオ分散剤を用いて、ｐＨを７
．５．８．５又は９．０に維持して、単一サイクル合成
水道水中でグルカナーゼの試験を行った。結果の概要を
表３に示す。グルカナーゼは、ｐＨ９まで効果的であっ
た。又、中性及びアルカリ性のｐＨでグルカナーゼの効
力を分散剤の効力と比較した結果を、表３に示す。

１旌■」実験をミクロバイアル・ファウリング・リアクターで行
った。得られた結果を第６図に示す。実験は、本発明の
酵素製品が、表面を清浄に保つかどうかについて行った
。実験条件は、基質濃度と処理投与量が異なるようにし
た（表４参照）。基を濃度は、冷却水の基質濃度と同様
に低かった。

殺生物剤のスラグ又は酵素製品を投与した。

第６図において、対照又は未処理（−ム一）曲線は、低
基質条件でどんなバイオフィルムの成長が可能であるか
を示している。この殺生物剤曲線は、６日目、９日目、
１３日目、１６日目、２０日目、２３日目、２８日目及
び３１日目で反応器中にスラグ化した１００ρｐａ＋の
非酸化性殺生物剤が、バイオフィルムの損失（圧力降下
の減少により測定）を生じたことを示している。酵素の
組み合わせの性能を表している曲線も、各処理後にバイ
オフィルムの損失があったことを示している。３１日後
、殺生物剤処理系と未処理対照との間の差は、２．４イ
ンチ（ΔＰ　＝２．４インチ）であるのに対して、酵素
配合物を用いた場合は２．ツイフチであった。第６図は
、処理を停止した後、両方の系においてバイオフィルム
が成長したことを示している。

得られた結果は良好であった。この実験から、酵素が１
か月にわたってバイオフィルムの成長を非常によく抑制
したことを示している。無毒性である酵素配合物は、少
なくとも毒物（非酸化性）殺生物剤と同じ性能を示した
。

尚、本明堵書及び特許請求の範囲に記載のグルカナーゼ
は、β−グルカナーゼと均等であり、同−である。

ｌ」ｄ　：単一サイクル合成シカゴ水道水。

ｅ：ＭＦＨの１０インチのｐは約７２時間で生じた。

ｐＨ８，５７，５，８，５又は９．０１温度（”Ｃ）　
　　３６±１　ｂ３３．０　＋１　’接種源成長期間フィールド　フィールド混合物　　　混合物７２時間　　　２５１０インチ１備考）ａ：ｐＨの設定は実験により異なる。

ｂ：ＢＲＰ温度は、再循環ポンプの操作により３６°Ｃ
±１°Ｃで一定である。

ｃ：ＭＦＲ温度は、サーモスタット制御しである。

中性プロテアーゼ −１０，０アルカリ性プロテアーゼ（１） −５０，０アルカリ性プロテアーゼ（２）宿鎖酵素１８．０ −１９．０アルカリ性 α−アミラーゼ β−グルカナーゼ（１） β−グルカナーゼ（２）セルラーゼａ２１．５１４．０２３．０備考）ａ　：セルラーゼは、糖分子間のβ−結合を攻撃する。

ｂ　；α−アミラーゼ、β−グルカナーゼ及び中性プロ
テアーゼ活性。

−Ｊし土− ７，５８，５９，０３５ゝ１１　ゝ備考）ａ　：性能は、酵素１１００ｐｐ、バイオ分散剤２０　
ｐｐｍの濃度レベルで評価する。

ｂ　：除去率は、３３±１℃での２回の実験の平均であ
る。

（本頁以下余白）ｐＨ温度補給水８．５３３．０　°Ｃ±１．０　　℃ 合成水道水接種源フィールド混合物殺生物剤濃度　　　　　　　　１１００ｐｐ期間　　　
　　　　　　　スラグ投与頻度　　　　　　　　　　　１週間に２回〔発明の効果
〕上記したように、本発明によれば、冷却塔の表面に存在
又は付着し及び製紙における損紙水に存在する微生物的
に生成した細胞外ポリマーを処理するためのグルカナー
ゼ酵素系が提供される。本発明のグルカナーゼ酵素系は
、スライムの除去率を高め、スライムの付着を防止し、
固着した細菌に対する殺生物剤の効力を向上させること
ができるとともに、冷却塔表面を清浄に維持することも
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はバイオフィルム反応器システムの平面図であり
、第２図はバイオ分散剤、セルラーゼ並びにα−アミラ
ーゼとβ−グルカナーゼとプロテアーゼとの１１：１の
比の混合物によるバイオフィルムの除去を示すグラフで
あり、第３図はミクロバイアル・ファルリング・リアク
ターシステム（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｆｏｕｌｉｎｇ　
ｒｅａｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ）の平面図であり、第４
図はバイオフィルムの質量とグルカナーゼ処理時間及び
バイオ分散剤処理時間との関係を示すグラフであり、第
５図は圧力降下とグルカナーゼ処理時間及びバイオ分散
剤処理時間との関係を示すグラフであり、そして第６図
はミクロバイアル・ファルリング・リアクター実験にお
ける、酵素処理と殺生物剤処理との比較の結果を示した
グラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１、スライムに覆われた冷却塔表面からスライムを除去
する方法において、前記表面を有効酵素量の、β−グル
カナーゼと接触させることを特徴とするスライムの除去
方法。２、スライムに覆われた冷却塔表面からスライムを除去
する方法において、前記スライム表面を、β−グルカナ
ーゼ２部、α−アミラーゼ１部及びプロテアーゼ１部か
らなるβ−グルカナーゼ製剤の有効量と接触させ、そし
てスライムのない表面を維持することを特徴とするスラ
イムの除去方法。３、複合酵素系の利用方法であって、β−グルカナーゼ
、α−アミラーゼ及びプロテアーゼからなる複合酵素系
を用いて微生物スライムを消化し且つ微生物の付着とバ
イオフィルムを減少させてスライムのない表面を維持す
ることを特徴とする複合酵素系の利用方法。４、スライムで覆われた表面及び水処理系からスライム
を消化する方法であって、生成スライムを分解する有効
成分が有効量のβ−グルカナーゼである場合に、前記水
を、少なくとも８０ｐｐｍのβ−グルカナーゼで処理す
ることを特徴とするスライムの消化方法。５、スライムで覆われた表面から微生物バイオフィルム
を除去し、排水処理においてスライムのない表面を維持
するのに有効な酵素配合物であって、β−グルカナーゼ
２部、α−アミラーゼ１部及びプロテアーゼ１部からな
ることを特徴とする酵素配合物。６、スライムで覆われた表面から微生物バイオフィルム
を除去し、排水処理においてスライムのない表面を維持
するのに有効な酵素配合物であって、β−グルカナーゼ
２部、α−アミラーゼが少なくとも１部で且つ２部未満
及びプロテアーゼ０．５〜１部からなることを特徴とす
る酵素配合物。