CN100379685C - 使用硼调节的酶处理水中微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于处理水系统，尤其是用于处理被含有固着微生物的生物膜污染的再循环水系统的方法和组合物。该方法包括步骤：形成硼调节的酶并用所述硼调节的酶接触生物膜，从而使微生物浮游。不管是否存在通常将使酶失活的生物杀伤剂或腐蚀抑制剂，该硼调节的酶在与生物膜接触后保持未被调节的酶的最初活性的至少40%的活性水平至少2小时。在优选的实施方案中，加入生物杀伤剂和被调节的酶。该方法和组合物也可用于微温水系统的补救，其中在所述微温水系统中，生物膜可能含有病原体如固着的军团菌属。

Description

使用硼调节的酶处理水中微生物
技术领域
本发明涉及工业用水处理系统，特别是经过空调系统、热交换器、冷却塔等的再循环水的处理系统。
背景技术
在空调系统中，如用于例如医院、学校、办公室、住宅和其他建筑物中的空调系统中，通常再循环水流过蒸发冷却器的表面。类似设备在许多加工设备中存在，这些设备包括化学、造纸、纺织、采矿和其他工业中的设备。
补偿给水通常含有溶解的化学品，其在再循环水中由于蒸发损失而不断变得更浓。在空调系统和冷却系统中尤其是这样。设备(包括泵、管、槽、热交换器、蒸发冷却器等)的腐蚀是一个主要问题并且通常水的pH升高。通常通过加入各种水处理化学品解决腐蚀问题。腐蚀抑制领域的现状由Hartwick，D在ASHRAE Journal(2001年2月)中概述。主要的腐蚀抑制剂可分类为(1)还原剂，(2)氧化剂，或(3)膜形成剂。还原剂因为它们的缺点现在很少使用。氧化剂(例如铬酸盐、钼酸盐、亚硝酸盐)直接与金属表面反应。虽然铬酸盐和钼酸盐是有效的，它们由于环境和健康问题而很少使用，在许多州它们的使用被禁止。太低浓度的亚硝酸盐可导致严重的点蚀，而太少的亚硝酸盐比无亚硝酸盐更坏，因为其将加速腐蚀过程。细菌暴露于亚硝酸盐有可能将亚硝酸盐氧化成硝酸盐或者将其还原成氨，这都可以降低亚硝酸盐的浓度，导致有害后果。用氧化生物杀伤剂控制生物学活性的尝试为将亚硝酸盐氧化成硝酸盐并且非氧化生物杀伤剂的功效还很不确定。因此，已经不赞成亚硝酸盐的使用。膜形成剂中正磷酸盐和有机膦酸盐是最常用的抑制剂。它们通过在金属表面形成保护膜而发挥作用，但是倾向于与本体水中与金属离子或者硬性盐沉淀。
第二个问题是由于水中存在粘泥、生物膜(biofilm)、细菌和真菌。粘泥和生物膜降低泵的效率并可以严重干扰流速。此外粘泥降低经过热交换表面、闭式过滤器和塞形喷嘴的热交换。粘泥和生物膜的存在促进腐蚀，因为粘泥或生物膜中的固着细菌释放酸，还因为粘泥和生物膜吸附其他水处理化学品并降低其有效性。术语“粘泥”指宽范围的粘液状、粘性的和似革物质。这些物质通常含有或来自各种微生物产生的聚合的，一般为多糖分泌物。
在过去直到现在，包括粘泥和生物膜的所有类型的生物学沉积都通过加入生物杀伤剂处理。当存在粘泥和生物膜时，经常加入生物杀伤剂以破坏可以产生粘泥的细菌或微生物群体。用于该目的的化学品包括氯化合物如氯苯酚盐、有机汞化合物如汞苯基酸、硫代氨基甲酸盐化合物、硫氰酸盐化合物如异硫氰酸盐和亚甲基-二-硫氰酸盐(MBT)、氧化三丁基锡等。然而，这些化学品是昂贵的并且已知需要有效控制微生物群体的量时是高度毒性的。它们释放到环境中的可能性是不可接受的，并且处理前将它们从水中除去是不经济的并且存在引起环境污染的危险。环境和职业健康和安全条例现在防止在水处理系统中使用许多这些生物杀伤剂。此外，似乎细菌群体的大小和粘泥或生物膜的积累之间没有精确相关性。甚至在具有低细菌数的水中也已经观察到大量粘泥积累。类似地，在没有显著的粘泥积累的水中已经观察到高细菌数。因此，使用生物杀伤剂可能不足以控制生物粘泥或生物膜的积累。
另一个问题起因于空调和一些其他系统中存在浮游细菌，特别是对人有害的细菌如军团菌属(Legionella)。军团菌属最先在1976年发现，其具有导致两种疾病：军团病和庞提阿克热的不寻常特征。军团病是一种肺炎，其感染所暴露者的2-5％。感染该疾病者的5-15％死于该疾病。庞提阿克热使所暴露者的95％发病。浮游细菌作为本体水中的悬浮物存在。浮游性军团菌属细菌可被该系统的气生喷雾颗粒携带。当嗜肺军团菌细菌所存在的水被雾化后被吸入时它们是致病的。它们可感染，或者实际上最终杀死，附近的人。因此重要的是保持细菌水平低于可接受的限度。没有一种在空调系统中安全使用的生物杀伤剂可在运转系统中杀死固着和浮游的的军团菌属。
军团菌属在生物膜和粘泥中存在并且广泛认为最好的控制方法是周期性地关闭设备以例如通过物理擦洗除去粘泥和生物膜，然后用次氯酸钠对其表面消毒。事实上，新南威尔士州的法律要求水冷却塔中这种行动的时间间隔不超过3个月，并且许多其他州已经或者建议类似的立法。
在过去十年里，作为用生物杀伤剂处理的备选方案，已经提出通过使用酶控制粘泥和生物膜的积累。对于使用一种或多种酶控制粘泥和生物膜的各种建议可分为两大组。第一组由包括一种或多种蛋白酶的酶处理，第二组酶系统为一种或多种不包括蛋白酶的酶。这些酶特异性攻击固着细菌周围的粘泥层但是对浮游细菌没有效果。用酶进行的大量工作主要针对造纸，其中的条件对于粘泥和生物膜的生长是极好的，而粘泥和生物膜对生产的损害是昂贵的，并且腐蚀是相对的小问题，从而其他水处理化学品不是复杂因素。这些系统中的重点在粘泥和生物膜的清除上。细菌在它们产生更多粘泥的情况下仅仅是造纸中的一个问题，并且由于粘泥产生和浮游细菌的存在没有相关性，防止固着微生物的繁殖就已足够。
相反，本发明人已经发现在冷却塔中，酶的存在可导致浮游军团菌属浓度的增加。认为这部分是因为酶在物理上释放了被生物膜捕获的微生物，并且部分是因为原生动物从粘泥或生物膜释放时许多军团菌属生物体可被原生动物吞噬从而受到保护而不被酶破坏。实验已经表明一些军团菌属中的种可以在某些游离的活原生动物细胞内繁殖。这可能也是造纸工厂和可能地其他地方迄今没有意识到的问题。
在再循环水系统中存在的类似问题在微温水系统中存在，这些微温水系统如在医院、疗养院、学校、监狱和旅馆中用于为淋浴、盥洗池或温泉浴中提供“安全”温度的“热”水的微温水系统。在几乎30年中，已经知道军团菌属可在这些微温水系统中定居。军团菌属已经使它们适应在高达约55℃的温度-杀死许多竞争生物的条件-下生存。嗜肺军团菌细菌是病原性的。至少一例死亡归因于吸入医院微温水系统中淋浴的水喷雾而被军团菌属感染。迄今，关于微温水系统推荐的唯一处理是周期性地用次氯酸钠冲洗。本发明人已经发现氯处理对于微温水系统内部生物膜中所含固着军团菌属是无效的。
整篇说明书中对现有技术的任何讨论不应该被认为是对本领域一般性常识陈述的允许。尽管本发明特别谈及军团菌属，但是应该理解类似的考虑应用于许多其他微生物，包括其他有害细菌、真菌、霉等。在水处理系统中，一般关心的细菌是革兰氏阳性细菌。
已经提出组合酶和生物杀伤剂处理水。US 4,684,469(Pederson)描述了增强工业水流中生物杀伤剂的抗微生物活性的方法，其中所选生物杀伤剂与多糖降解酶组合。Pederson使用通过细菌培养物原位产生的酶，这些细菌培养物自身是病原性的并且不适宜在工业水系统中使用。他优选的生物杀伤剂是MBT和二硫代氨基甲酸盐类，这两种从环境和职业健康的观点看都是不合需要的。优选的酶为果聚糖水解酶。Pederson要求监控酶的浓度以保持至少2ppm的浓度的制剂具有至少500单位/ml的活性。然而，监控不能自动进行并且需要耗时且劳动密集的实验室分析。Pederson所给实例表明在实验室条件下，酶单独对微生物菌落形成具有基本上为0(或负)的效果。当加入酶半小时后加入生物杀伤剂时，该组合对菌落形成的减小比只通过生物杀伤剂所得减小大3log或4log。US 5,324,432(Robertson)指出果聚糖水解酶对带鞘微生物如在造纸厂系统中发现的微生物没有影响并建议用蛋白酶和生物杀伤剂处理。优选的组合为DBNPA和胰蛋白酶。所给唯一实施例是“考虑中”的并且涉及用酶处理水1-15分钟然后加入次氯酸盐。
这些建议优选单独加入生物杀伤剂并在加入酶之后加至造纸机器的水流中。然而，认为同时分开加入是可行的。
本申请人已经发现如在现有技术中提出的生物杀伤剂/酶的组合在冷却塔中不是有效的。刚开始推测这可能是由于生物杀伤剂对酶的失活。本发明人已经发现在Pederson和Robertson所描述类型的系统中，酶在加入生物杀伤剂2小时内实质上是无效的。从而甚至在有利情况中酶必须连续地或反复地在短的(小于2小时，优选小于30分钟)时间间隔内加入。这使得该系统因为在冷却塔环境中监控酶活性的难度还因为低效率和随着时间产生的高成本而不可行。然而，本发明人还发现在存在腐蚀抑制剂时，该酶变性问题被极大地加剧，使得酶/生物杀伤剂组合的使用在冷却塔中是不可行的并且太昂贵。
总之，本发明人已经发现现今冷却塔中实际使用的腐蚀抑制剂或者通过直接氧化或者通过表面吸附而使酶失活。此外，酶与大多数吸附到酶蛋白质表面的生物杀伤剂是不相容的从而有效地使酶活性失活。尽管一些酶生产商声明酶在氯环境中保持它们的活性，该声明涉及洗涤条件和约10-15分钟的暴露时间，而冷却塔维护需要至少24小时。
到此为止还没有处理被证明能够避免以3个月的间隔时间关闭冷却塔进行清理。酶在用优选的现代主要腐蚀抑制剂(例如，氧化剂或膜形成剂)处理的系统中不是有效的。生物杀伤剂在认为安全使用的水平上时不是有效的，因为它们不能穿透生物膜并攻击生物膜中军团菌属或者原生动物中寄生的军团菌属。此外，生物杀伤剂不能在认为安全的水平上将固着和浮游细菌都杀灭。酶和生物杀伤剂的组合导致每一种使另一种失活并且已经被发现在存在现代腐蚀抑制剂时是无效的，该腐蚀抑制剂使酶快速失活。
还没有从现有技术中发现同时满足如下要求的酶系统、生物杀伤剂或酶/生物杀伤剂组合：(1)与腐蚀抑制剂相容，(2)环境可接受性，(3)健康和安全可接受性，(4)能够控制含有军团菌属的生物膜并能够充分控制浮游军团菌属从而可以避免以三个月的时间间隔关闭设备进行清洁。
此外，在现有技术中，当酶和生物杀伤剂已经被组合时，通常需要分开加入它们。这是因为生物杀伤剂倾向于使酶失活或者酶使生物杀伤剂失活。该分开需要两份泵、保存和添加槽，以及用于搅拌、添加控制等的辅助设备。提供满足空调系统或任一其他本体水系统中水处理的所有要求并且可以在单个容器或槽中组合或从该单个容器或槽递送的水处理组合物将是非常有利的。更优选地，该组合物将可作为保存稳定的组合物或浓缩物得到。
本发明的一个目的是提供工业再循环水的处理方法，其避免或改善了至少一些上面讨论的现有技术的缺点。本发明的优选实施方案的一个目的是提供避免对设备关闭的需要，或者至少延长该设备可安全操作而不用关闭后进行清洁的期间的方法和组合物。
另一个目的是提供补救这样的微温水系统的方法和组合物，该微温水系统中生物膜含有微生物如军团菌属。
发明描述
根据第一方面，本发明提供了处理水系统生物膜中固着微生物的方法，所述方法包括步骤：向该系统中加入至少一种在水中具有最初活性的酶；用硼化合物调节所述酶以形成硼调节的酶；所述硼化合物被加入的浓度足够在所述加入后使所述硼调节酶保持所述最初活性至少40％的活性水平至少2小时。
根据第二方面，本发明提供了使生物膜中固着微生物浮游的方法，所述方法包括步骤：将至少一种酶加入水系统中与生物膜接触，所述酶被硼化合物调节以形成硼调节的酶；所述硼化合物被加入的浓度足以在所述接触后使所述硼调节酶保持所述最初活性至少40％的活性水平至少2小时；并且其中所选择的酶为一类并且其浓度足够使所述固着微生物浮游；并且其中所述酶和所述硼化合物在组合中协同有效。
更具体地，本发明提供了含有氧化或膜形成腐蚀抑制剂的再循环水系统的处理方法，所述方法包括步骤：向系统中加入一种或多种处于最初活性水平的酶；每种所述酶被用足够浓度的硼化合物调节以保持存在腐蚀抑制剂时在酶加入后其活性维持大于最初水平的40％2小时以上，并向系统加入一种或多种生物杀伤剂。
在本发明的优选实施方案中，加入足够硼化合物以便在存在腐蚀抑制剂时保持一种或多种酶的活性大于最初水平的约40％4小时以上，更优选地长于8小时。高度优选的实施方案保持酶活性大于最初活性的40％12小时以上。在一些情况下，24小时后保持大于75％以及约100％的活性。
优选地，该方法还包括加入至少一种生物杀伤剂的步骤；其中所述硼调节的酶在加入后保持所述最初活性至少40％活性水平至少2小时。本发明的方法可能尤其适于其中生物膜在再循环水系统中的那些情况。其还适于其中生物膜在非循环微温水系统的情况中使用。
优选地，硼调节的酶保持所述酶的最初活性的至少40％至少12小时，甚至更优选地硼调节的酶保持所述酶的最初活性的至少75％至少24小时。
重要的是注意通过将所述酶和所述化合物在它们加入水之前接触(预调节)形成硼调节的酶，或者备选地通过将所述酶与所述硼化合物在水中接触形成硼调节的酶。
优选地硼调节的酶和所述生物杀伤剂一起、基本同时或分开加入。在一个备选的优选实施方案中，酶、含硼化合物和生物杀伤剂一起、基本同时或者以任一顺序分开加入。
优选地，酶选自蛋白酶、糖酶、酯酶、水化酶、淀粉酶、过氧化氢酶、脂肪酶、纤维素酶、过氧化物酶、转化酶、果聚糖生物水解酶和它们的混合物。最优选地，该酶为蛋白酶、淀粉酶或它们的混合物。在一个优选的实施方案中，该酶为以5×10-4到10×10-3Au/g，更优选地1×10-3到3×10-3Au/g，最优选地约2.5×10-3Au/g活性使用的蛋白酶。在另一个优选的实施方案中，该酶为以浓度等于10到1000Nu/g，更优选地100-500Nu/g，最优选地约300Nu/g使用的淀粉酶。
希望在加入含有腐蚀抑制剂的水之前或者之后不久将酶和硼化合物组合。不希望被理论束缚，硼化合物表观上预调节酶从而保护其免于发生变性。硼化合物在此后有时被简称为“硼”。
优选地，硼化合物选自硼砂、硼酸、氧化硼、原硼酸盐、偏硼酸盐、焦硼酸盐、过硼酸盐、含硼酸或它们的混合物。优选地，硼的重量和酶(干蛋白质)重量的比为3∶1到3∶10。优选地，硼化合物以0.01到10％，更优选地0.1到10％的浓度存在。
优选地，生物杀伤剂选自噻唑和/或咪唑生物杀伤剂、硝基烷生物杀伤剂、噻二嗪、二硫代氨基甲酸盐类、硫氰酸盐或季铵氯化物或它们的混合物，并且优选地以0.1到1000ppm，更优选地1到150ppm，最优选地10到50ppm的浓度使用。生物杀伤剂优选地为一个种类并且浓度为环境可接受的，并且与酶组合对防止系统中军团菌属微生物的生长是有效的。高度优选的生物杀伤剂选自噻唑和/或咪唑生物杀伤剂(尤其是异噻唑啉(isothiazolin)衍生物)和硝基烷生物杀伤剂(如2-溴-2-硝基丙烷-1，3二醇)。
在一个优选的实施方案中，水包括一种或多种腐蚀抑制剂，如氧化腐蚀抑制剂或膜形成腐蚀抑制剂。
优选地，酶以一定速度加入以保持再循环水中有效活性至少12小时，并且选择生物杀伤剂以保持组合的浮游和固着细菌低于1000，更期望地低于10cfu/ml。
优选地，所述水中浮游的和固着细菌总共保持在低于1000cfu/ml，更优选地低于10cfu/ml。
优选地，与所述硼调节的酶组合的生物杀伤剂可有效降低生物的生长，所示生物选自军团菌属微生物、果聚糖气杆菌(Aerobacter levanicum)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、红酵母(Rhodoturula glutinis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。最优选地，与所述硼调节的酶组合的生物杀伤剂在减少系统中军团菌属微生物的生长中是有效的。
发现根据本发明优选的方法长时间(长达24小时)保护酶免受腐蚀抑制剂失活。
根据本发明的第三方面提供了水处理方法，包括步骤：提供至少一种在水中具有最初活性的酶；用足够浓度的硼化合物调节所述酶以形成硼调节的酶；加入至少一种生物杀伤剂并且其中当所述硼调节的酶与所述水接触时其在与所述水接触后保持所述最初活性至少40％的活性水平至少2小时；并且其中所述酶和所述生物杀伤剂在组合中是协同有效的。
根据本发明的第四个方面提供了补救含有军团菌属的微温水系统的方法，包括步骤：用在水中具有最初活性的至少一种酶处理系统；用足够浓度的硼化合物调节所述酶以产生硼调节的酶；并且其中当所述硼调节的酶与所述水接触时其与水接触后保持所述最初活性的至少40％的活性水平至少2小时；并且其中所述酶和所述硼化合物在组合中是协同有效的。
优选地微温水为40到55℃，更优选地45到50℃。
根据本发明的第六方面提供了处理水的组合物，其包括：
至少一种具有最初活性的酶；
足够量的硼化合物以调节并稳定所述酶以形成硼调节的酶，所述硼调节的酶与所述水接触后保持所述最初活性的至少40％至少2小时；和
至少一种生物杀伤剂。
在一些实施方案中，本发明提供了包括一种或多种酶、一种或多种生物杀伤剂和足够的预调节和稳定所述一种或多种酶的硼化合物的组合的组合物，以当加入含有高达预定浓度的氧化或膜形成腐蚀抑制剂时维持2小时后其最初活性至少40％。
硼调节的酶和生物杀伤剂可以一起或分开地或者连续地或间歇地加入。然而强烈优选硼调节的酶、生物杀伤剂基本上同时加入。更优选地，通过从根据第二方面的组合物制备溶液将它们组合一起加入。在本发明的实践中，加入可以是连续的或以短间隔重复，但是优选以长时间间隔例如8、12或24小时间隔重复。如果期望，该组合物还可以含有所选的腐蚀抑制剂。
本申请人已经发现未受保护的酶在约1小时内被生物杀伤剂和腐蚀抑制剂失活。例如，本发明人已经发现蛋白酶当与生物杀伤剂如2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺(DBNPA)组合时在含有现代腐蚀抑制剂的工业再循环水系统中1小时后保留小于其活性的5％以下。本发明人还发现，另一方面，在环境和其他安全使用浓度下的生物杀伤剂几个小时后才变得完全有效并且在存在活性酶时需要12小时才能达到有效。如果酶可以被足够稳定以保留大于其活性的50％例如8或12小时，那么与现有技术相比该组合在含有腐蚀抑制剂的系统中令人惊奇地有效。
优选地酶为一种或多种酶，选自蛋白酶、糖酶、酯酶、水化酶、淀粉酶、过氧化氢酶、脂肪酶、纤维素酶、过氧化物酶、转化酶、果聚糖生物水解酶和它们的混合物。更优选地，该酶为蛋白酶、淀粉酶或它们的混合物。
优选地，该酶为一种或多种酶，选自蛋白酶、糖酶、酯酶、水化酶、淀粉酶、过氧化氢酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、转化酶和它们的混合物。
优选地，蛋白酶以足够提供使用时5×10-4到10×10-3Au/g，更优选地，使用时1×10-3到3×10-3Au/g，最优选地，使用时约2.5×10-3Au/g活性的浓度使用。优选地，淀粉酶以足够提供使用时10到1000Nu/g，更优选地使用时100-500Nu/g，最优选地使用时约300Nu/g的活性的浓度使用。
优选地，硼化合物选自硼砂、硼酸、氧化硼、原硼酸盐、偏硼酸盐、焦硼酸盐、过硼酸盐、含硼酸(boronic acids)或它们的混合物，优选地浓度为0.1到10％。
尽管硼化合物以前已经被加入酶中用以防止自体溶解活性和稳定酶抵抗运输和保存中的变质，但是它们迄今还没有以所选浓度与酶组合以保护酶抵抗腐蚀抑制剂或生物杀伤剂的作用，或者用于在存在这些试剂时保持酶随时间的活性。适宜的硼化合物为硼酸、氧化硼、原-、偏-、或焦-硼酸钠和过硼酸钠。如本领域技术人员将明了的，以前已经以低浓度的硼与酶组合以保护酶防止自溶或者在保存和送货过程中作为保存剂，但是实践中还没有用所选浓度的硼预处理酶以保护酶在存在腐蚀抑制剂等时丧失活性。
在本发明的优选实施方案中，通过加入适宜的溶剂如多元醇或其他胶束不混溶的溶剂增强硼化合物的功效。
在一个优选的实施方案中，多元醇溶剂被加入到所述硼化合物中。多元醇溶剂优选地选自甘油、丙二醇、甘油和丙二醇的混合物，和其他胶束不混溶的溶剂。
生物杀伤剂优选地选自噻唑和/或咪唑生物杀伤剂、硝基烷生物杀伤剂、噻二嗪、二硫代氨基甲酸盐类、硫氰酸盐、季铵氯化物或它们的混合物。优选地，生物杀伤剂以0.1到10％，更优选地1到10％的浓度使用。
如上所陈述的，用于本发明的高度优选的生物杀伤剂选自噻唑和/或咪唑生物杀伤剂(尤其异噻唑啉衍生物)和硝基烷生物杀伤剂(尤其2-溴-2-硝基丙烷-1，3二醇)。其他可用的生物杀伤剂包括，但不限于：噻二嗪，如3，5-二甲基-四氢-2H-1，3，5-噻二嗪-2-硫酮；二硫代氨基甲酸盐类，如二甲基二硫代氨基甲酸钠；乙烯双(二硫代氨基甲酸)二钠；硫氰酸盐，如亚甲基双-硫氰酸盐；季铵氯化物，如烷基二甲基苄基氯化铵；二烷基甲基苄基氯化铵，CHG：氯、次氯酸盐；二氧化氯、过氧化氢、过乙酸、戊二醛；N-4二羟基-α-氧代苯ethanimidoyl盐酸盐；烷基(C16-18)氨基-3-氨基丙烷乙酸盐；双(三氯甲基)砜；5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮；甲基-4-异噻唑啉-3-酮；2-(硫代氰基甲基硫代)-苯并噻唑；双(三氯甲基)砜；三(羟甲基)硝基甲烷(TN)；溴氯二甲基乙内酰脲；2-氯4，6-双(乙基氨基)-s-三嗪；酚的(五氯酚盐)；其他氯酚的钠盐；N，N-二甲基二硫化氨基甲酸钾，50％；氰基硫代亚酰胺碳酸二钠和N-甲基二硫代氨基甲酸盐20.3％的混合物；2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺，20％；羟乙基2，3-二溴丙酸盐，30％；聚(氧乙烯[二甲基亚胺基]乙烯-(二甲基亚胺基)乙烯二氯化物，60％；五氯酚钠；次氯酸钙；氯化二癸基二甲基铵；六氢-1.3.-三(2-羟乙基)-s-三嗪；4-(2-硝基丁基)吗啉；4，4(2-乙基-2-硝基三甲撑)二吗啉；六氢-1.3.5.-三(2-羟乙基)-s-三嗪；胍，如十二烷基-盐酸胍；双(三-N-丁基氧化锡)；邻苯基苯酚和苯氧基乙醇；邻苄基-对-氯酚。
其他生物杀伤剂如《消毒、灭菌和保存》(SE Block，385-389页，Lippincott，Williams & Wilkinson)中所列的那些生物杀伤剂也可用于实施本发明。
不管目前试验的如何，高度优选异噻唑啉衍生物、硝基烷和它们的组合。
本发明的组合物优选还包括腐蚀抑制剂，优选地为氧化抑制剂或膜形成抑制剂。
根据第七个方面，本发明提供了包括酶、生物杀伤剂和硼或含硼化合物的货架稳定组合物，所述组合物与膜形成腐蚀抑制剂相容。
根据第八方面，本发明提供了包括至少一种酶、腐蚀抑制剂、生物杀伤剂和硼或含硼化合物的浓缩物。
根据本发明优选制剂的实例可包括：
                            w/w份
水                          10-35
乙氧基化醇                  0-10
二甲苯磺酸钠，40％          0-20
间-吡咯烷酮                 0-10
二丙二醇甲基醚(DPM)         0-15
CaCl25％溶液                0.1-10
硼砂                        0-5
3，5-二氯苯基硼酸           0-5
Kathon WT                   1-15
2-溴-2硝基丙烷-1，3-二醇    1-6
蛋白酶Alcalase 2.5L         5-25＊
淀粉酶Thermamyl 300DL       1-25＊＊
纤维素酶Carezyme 1000L      1-20＊＊＊
＊其作为干蛋白质的重量为约5.1％
＊＊其作为干蛋白质的重量为约3.6％
＊＊＊其作为干蛋白质的重量为约1％
备选优选的根据本发明的制剂的实例包括：
  w/w份
  水   20-50
  CaCl<sub>2</sub>5％   1-10
  硼酸   1-10
  3，5-二氯苯基硼酸   1-3
  Kathon WT   1-15
  2-溴-2硝基丙烷-1，3-二醇   1-10
  淀粉酶   1-15
  纤维素酶   5-25
  溶菌酶   0.1-5
  蛋白酶(Savinase 16L)   1-7
此外，已经发现一些酶优选地在不同温度范围内消化生物膜。在低温(凉水或室微温水)消化生物膜更佳的酶的实例包括：
蛋白酶：Savinase，糜蛋白酶
纤维素酶：1，4(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-glocano水解酶
脂肪酶：L脂肪酶，takamine脂肪酶
发现在较高温度，如发现在微温水或较温暖的水系统中水解生物膜的酶的实例包括：
蛋白酶：Protinase T，Panazyme
纤维素酶：Promalt，Oloclast
淀粉酶：Nervanase，Sbozzimante SPC
脂肪酶：Lipozyme
实施本发明的最佳模式
现在将通过实施例，仅仅参考附随的数据更具体地阐明本发明。
实施例1多种腐蚀抑制剂和多种生物杀伤剂对多种酶的影响
由本发明人进行的实验已经表明大多数腐蚀抑制剂存在时酶是不稳定的。由于基于铬的腐蚀抑制剂已被放弃并且钼和无机膦酸盐不断被淘汰，完全有机腐蚀抑制剂(如1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸、磺化苯乙烯/马来酸酐共聚物、聚丙烯酸酯)已经成为工业标准。后一组抑制剂对酶活性具有有害影响。
使用下面的进行实验：
腐蚀抑制剂和浓度：
                                ppm
1.钼酸钠                        10和100
2.膦酸盐(如羟基-膦酰基乙酸)     100和1000
3.锌盐(如氯化锌)                      10和100
4.1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸            10和100
5.聚羧酸酯共聚物(Acusol 445)          10和100
6.丁炔二醇聚乙氧基化物(Butyne 497)    10和100
生物杀伤剂和浓度
1.5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮+2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(KathonWT)
2.2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺(Dowicide4)
3.亚乙基双-硫代氨基甲酸二钠(SC-2957)
4.二甲基二硫代氨基甲酸钠(Freshgard40)
5.五氯代peante钠(Dowicide7)
6.2-溴-2-硝基丙烷-1，3二醇(MyacideAS)
所有生物杀伤剂在5、15和100ppm试验。
酶和浓度：
蛋白酶(Alcalase2.5L)2.5Au/g稀释1000倍
淀粉酶(Takatherm300LX)300kNu/g稀释1000倍
pH：
所有样pH调节到8(冷却塔水的通常pH)。
酶分析
在该说明书中(除非另外指出)，蛋白酶的活性根据Novozymes标准试验方法No.B-863-GB(确定酶制剂和洗涤剂中蛋白水解活性的方法手册(偶氮酪蛋白(Azocasein)底物))分析，淀粉酶的活性通过Novozymes标准试验方法No.B 309d-GB(确定酶制剂和洗涤剂中α-淀粉酶活性的方法手册)分析。
步骤：
1.向Schott瓶中的100mL蒸馏水中加入腐蚀抑制剂或生物杀伤剂
2.用少量NaOH和HCl调节pH到8
3.将样品置于30℃水浴中30分钟
4.加入酶
5.充分混合并启动秒表
6.在60分钟、2小时、6小时、24小时、48小时取1ml等分试样并分析酶活性
7.以最初活性的百分数报告。
结果在表1-10中显示。
表1
腐蚀抑制剂(低浓度)对蛋白酶的影响
(掺入2.5×10-3Au/g蛋白酶)
腐蚀抑制剂 浓度   0分钟   60分钟   2小时   3小时   4小时   24小时
  ppm   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  钼酸钠   10   100   13   ＜2   nt   nt   nt
  1-羟基-亚乙基-1，1-二膦酸 100 100 29 7 ＜2 nt nt
  氯化锌   10   100   ＜10   ＜2   ＜2   nt   nt
  苯并三唑   10   100   14   ＜2   ＜2   nt   nt
  聚羧酸酯共聚物(Acusol 445) 10 100 21 8 ＜2 nt nt
  丁炔二醇聚乙氧基化物(Bytyne497) 10 100 26 ＜2 ＜2 nt nt
  对照(蒸馏水)   100   93   86   90   82   72
表中％A°为在所示时间最初活性剩余的百分数。
表2
腐蚀抑制剂(高浓度)对蛋白酶的影响
(掺入2.5×10-3Au/g蛋白酶)
  腐蚀抑制剂 浓度   60分钟   2小时   3小时   4小时   24小时
  ppm   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  钼酸钠   100   ＜2   ＜2   nt   nt   nt
  1-羟基-亚乙基-1，1-二膦酸   1000   ＜2   ＜2   nt   nt   nt
  氯化锌   100   ＜2   ＜2   nt   nt   nt
  苯并三唑   100   ＜2   nt   nt   nt
  聚羧酸酯共聚物(Acusol 445) 100 ＜2 ＜2 nt nt nt
  丁炔二醇聚乙氧基化物(Bytyne 497) 100 ＜2 ＜2 nt nt nt
  对照(蒸馏水)   93   86   90   82   72
表3
腐蚀抑制剂(低浓度)对淀粉酶的影响
(掺入300Nu/g淀粉酶)
  腐蚀抑制剂 浓度   60分钟   2小时   3小时   4小时   24小时
  ppm   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  钼酸钠   10   24   4   ＜1   nt   nt
  1-羟基-亚乙基-1，1-二膦酸 100 22 5 ＜1 nt nt
  氯化锌   10   18   4   ＜1   nt   nt
  苯并三唑   10   31   4   ＜1   nt   nt
  聚羧酸酯共聚物(Acusol 445)   10   33   6   ＜1   nt   nt
  丁炔二醇聚乙氧基化物(Bytyne 497) 10 19 4 ＜1 nt nt
  对照(蒸馏水)   100   100   94   91   80
表4
腐蚀抑制剂(高浓度)对淀粉酶的影响
(掺入300Nu/g淀粉酶)
  腐蚀抑制剂 浓度   60分钟   2小时   3小时   4小时   24小时
 ppm   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  钼酸钠  100   3   ＜1   nt   nt   nt
  1-羟基-亚乙基-1，1-二膦酸 1000ppm 6 ＜1 nt nt nt
  氯化锌  100ppm   4   ＜1   nt   nt   nt
  苯并三唑  100ppm   5   ＜1   nt   nt   nt
  聚羧酸酯共聚物(Acusol 445) 100ppm 6 ＜1 nt nt nt
  丁炔二醇聚乙氧基化物(Bytyne 497) 100ppm 6 ＜1 nt nt nt
  对照(蒸馏水)   100   100   94   91   80
表5
生物杀伤剂(低浓度)对蛋白酶的影响
(掺入2.5×10-3AU/g蛋白酶)
  浓度   60分钟   2小时   3小时   4小时   24小时
  ppm   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  Kathon WT   5   13   ＜2   nt   nt   nt
  Dowicide 4   5   17   ＜2   nt   nt   nt
  SC-2957   5   12   ＜2   nt   nt   nt
  Freshgard 40   5   19   ＜2   nt   nt   nt
  Dowicide 7   5   23   ＜2   nt   nt   nt
  Myacide AS   5   9   ＜2   nt   nt   nt
  对照(蒸馏水)   93   86   90   82   72
表6
生物杀伤剂(高浓度)对蛋白酶的影响
(掺入2.5×10-3AU/g蛋白酶)
  浓度   60分钟   2小时   3小时   4小时   24小时
  ppm   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  Kathon WT   15   10   ＜2   nt   nt   nt
  Dowicide 4   15   11   ＜2   nt   nt   nt
  SC-2957   15   7   ＜2   nt   nt   nt
  Freshgard 40   15   4   ＜2   nt   nt   nt
  Dowicide 7   15   9   ＜2   nt   nt   nt
  Myacide AS   15   11   ＜2   nt   nt   nt
  对照(蒸馏水)   93   86   90   82   72
表7
生物杀伤剂对蛋白酶的影响
(掺入2.5×10-3AU/g蛋白酶)
  浓度   60分钟   2小时   3小时   4小时   24小时
  ppm   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  Kathon WT   100   7   ＜2   nt   nt   nt
  Dowicide 4   100   11   ＜2   nt   nt   nt
  SC-2957   100   ＜2   ＜2   nt   nt   nt
  Freshgard 40   100   7   ＜2   nt   nt   nt
  Dowicide 7   100   ＜2   ＜2   nt   nt   nt
  Myacide AS   100   ＜2   ＜2   nt   nt   nt
  对照(蒸馏水)   93   86   90   82   72
表8
生物杀伤剂对淀粉酶的影响
(掺入300Nu/g淀粉酶)
浓度   60分钟   2小时   3小时   4小时   24小时
  ppm   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  Kathon WT   5   34   4   ＜1   nt   nt
  Dowicide 4   5   19   ＜1   ＜1   nt   nt
  SC-2957   5   29   5   ＜1   nt   nt
  Freshgard 40   5   37   ＜1   ＜1   nt   nt
  Dowicide 7   5   40   5   ＜1   nt   nt
  Myacide AS   5   32   6   ＜1   nt   nt
  对照(蒸馏水)   100   100   89   91   86
表9
生物杀伤剂对淀粉酶的影响
(掺入300Nu/g淀粉酶)
浓度   60分钟   2小时   3小时   4小时   24小时
  ppm   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  Kathon WT   15   35   ＜1   nt   nt   nt
  Dowicide 4   15   13   ＜1   nt   nt   nt
  SC-2957   15   13   ＜1   nt   nt   nt
  Freshgard 40   15   22   ＜1   nt   nt   nt
  Dowicide 7   15   31   3   ＜1   nt   nt
  Myacide AS   15   37   9   ＜1   nt   nt
  对照(蒸馏水)   100   100   89   91   86
表10
生物杀伤剂对淀粉酶的影响
(掺入300Nu/g淀粉酶)
浓度   60分钟   2小时   3小时   4小时   24小时
  ppm   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  Kathon WT   100   ＜1   nt   nt   nt   nt
  Dowicide 4   100   10   ＜1   nt   nt   nt
  SC-2957   100   ＜1   ＜1   nt   nt   nt
  Freshgard 40   100   7   ＜1   nt   nt   nt
  Dowicide 7   100   ＜1   ＜2   nt   nt   nt
  Myacide AS   100   ＜1   ＜2   nt   nt   nt
  对照(蒸馏水)   100   100   89   91   86
注释：
在表1-10中：
％A°为在所示时间时最初活性剩余的百分数。
淀粉酶活性分析的检测限为0.03Nu/g(3Nu/g掺入活性的1％)；
蛋白酶活性分析的检测限为5×10-7Au/g(2.5×10-5Au/g掺入活性的2％)；
Nt-＝“未检测)(当前一时间点的活性低于检测限时)。
实施例2根据本发明的制剂的有效性
下面的实施例显示了根据本发明的制剂的有效性并且在表11到13中所示数据举例说明本发明。
受试腐蚀抑制剂和浓度：
1.钼酸钠                        100ppm
2.膦酸盐(如羟基-膦酰基乙酸)     1000ppm
3.锌盐(如氯化锌)                100ppm
4.1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸      100ppm
5.聚羧酸酯共聚物(Acusol 445)        100ppm
受试酶和浓度
淀粉酶(Termamyl 300)                300Knu/g稀释1000倍
pH：
所有样品pH调节到8(冷却塔水的通常pH)。
步骤：
1.向Schott瓶中的100mL蒸馏水中加入腐蚀抑制剂
2.用少量NaOH调节pH到8
3.在水浴中调节温度到30℃30分钟
4.加入15ppm异噻唑啉(Kathon WT)和15ppm 2-溴-2硝基丙烷-1，3二醇
5.加入酶
6.充分混合并启动秒表
7.在15分钟、60分钟、24小时、48小时取1ml等分试样并分析酶活性
8.以最初活性的百分数报告。
受试的根据本发明的制剂：
1.Termamyl 300L        20＊
丙二醇                 16
硼砂                   2
甘油                   4
Teric164               1
＊作为蛋白的干重约为3.6％的酶重量
2.Termamyl 300L        20
丙二醇                 16
硼砂                   4
甘油                   4
Teric164            1
3.Termamyl 300L     20
丙二醇              16
硼砂                6
甘油                6
甲酸钠              1
结果在表11-13中给出。
表11
腐蚀抑制剂对含有硼的淀粉酶的影响
制剂1(低硼砂)-掺300Nu/g淀粉酶
  腐蚀抑制剂   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  15分钟   60分钟   24小时   48小时
  钼酸钠   79.19   83.84   46.64   39.2
  4.1-羟基-亚乙基-1，1-二膦酸   78.26   64.31   67.1   42.92
  氯化锌   85.7   88.49   61.52   57.8
  苯并三唑   95   95   39.2   43.85
  聚羧酸酯共聚物(Acusol 445)   85.7   74.54   42.92   30.83
  对照(蒸馏水)   100   100   73   44
表12
腐蚀抑制剂对含有硼的淀粉酶的影响
制剂2(高硼砂)-掺入300Nu/g淀粉酶
  腐蚀抑制剂   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  15分钟   60分钟   24小时   48小时
  钼酸钠   90.3   95.7   52.2   43.5
  4.1-羟基-亚乙基-1，1-二膦酸   89.2   72.8   76.1   47.8
  氯化锌   96.0   98.0   69.6   65.2
  苯并三唑   100.0   97.0   43.5   48.9
  聚羧酸酯共聚物(Acusol 445)   89.0   84.8   47.8   33.7
  对照(蒸馏水)   100   100   73   44
表13
腐蚀抑制剂对含有硼的淀粉酶的影响
制剂3(高硼砂+甲酸盐)-掺入300Nu/g淀粉酶
  腐蚀抑制剂   ％A°   ％A°   ％A°   ％A°
  15分钟   60分钟   24小时   48小时
  钼酸钠   90.3   90.0   71.0   49.8
  4.1-羟基-亚乙基-1，1-二膦酸   89.2   72.8   70.0   54.7
  氯化锌   96.0   90.0   93.6   74.2
  苯并三唑   100.0   100.0   59.6   55.9
  聚羧酸酯共聚物(Acusol 445)   89.0   91.0   65.3   38.9
  对照(蒸馏水)   100   100   73   44
实施例3优选实施方案和现有技术的比较
方法：
现今在冷却塔中使用如下非氧化生物杀伤剂：
1.5氯-2甲基4-异噻唑啉-3-酮+2甲基4异噻唑啉-3酮(Kathon WT，Calgon H510，等)
2.2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺(Dowicide4)
3.乙烯基双-硫代氨基甲酸二钠(来自Calgon的SC-2957)
4.二甲基二硫代氨基甲酸钠(Freshard40，alcobamnm；brogdex555；carbon s)
5.五氯代peante钠(Dowicide7)
6.2-溴-2-硝基丙烷-1，3二醇(MyacideAS)
所有生物杀伤剂在100ppm活性下试验
受试酶和浓度
淀粉酶(Alcalase2.5DXL)    2.5Au/g稀释1000倍
pH：
所有样品pH调节到8(冷却塔水的通常pH)。
步骤：
1.向Schott瓶中的100mL蒸馏水中加入生物杀伤剂
2.用少量NaOH调节pH到8
3.在水浴中达到30℃(保持约30分钟)
4.加入酶
5.充分混合并启动秒表
6.在30分钟、2小时、24小时、48小时取1ml等分试样并分析酶活性
7.以最初活性的百分数报告。
受试制剂：
4.Termamyl 300DX      20
丙二醇                16
硼砂                  4
甘油                  4
Teric164              1
5.Termamyl 300DX      20
丙二醇                16
硼砂                  6
甘油                  6
甲酸钠                1
所得结果在表14-15中给出。
表14
淀粉酶(仅具硼砂的制剂4)和生物杀伤剂
  生物杀伤剂   结果
  异噻唑啉(Kathon WT)   较好到良好稳定性，48小时后剩余40％
  次氮基丙酰胺(Dowicide 4)   4小时后无剩余活性
  二甲基二硫代氨基甲酸钠(Freshard40)   4小时后无剩余活性
  五氯代peante钠(Dowicide 7)   2小时后无剩余活性
  2-溴-2-硝基丙烷-1，3二醇(MyacideAS)   良好到极好稳定性，24小时后剩余约67％，48小时后＞45％
  对照(去离子水)   24小时后约70％，48小时后约55％
表15
蛋白酶(具有硼砂+甲酸盐的制剂5)和生物杀伤剂
  生物杀伤剂   结果
  异噻唑啉(Kathon WT)   较好到良好稳定性，48小时后剩余约48％
  次氮基丙酰胺(Dowicide 4)   2小时后无剩余活性
  二甲基二硫代氨基甲酸钠(Freshard40)   2小时后无剩余活性
  五氯代peante钠(Dowicide 7)   2小时后无剩余活性
  2-溴-2-硝基丙烷-1，3二醇(MyacideAS)   良好到极好稳定性，24小时后剩余约65％，48小时后约40％
  对照(去离子水)   24小时后约70％，48小时后约55％
实施例4腐蚀抑制剂对现有技术的影响
用已知水平的酶掺入具有生物杀伤剂和腐蚀抑制剂的人造冷却塔水。
酶暴露于腐蚀抑制剂和/或生物杀伤剂的变性作用预定时间(1、2、6、24小时)后，将已知量的细菌/真菌接种物加入冷却水。这用于模拟冷却塔中典型的条件，此时由于对生物膜的破坏而导入了微生物。
微生物暴露于酶和含有腐蚀抑制剂的冷却水的这一组合1小时。
60分钟后使用标准平板计数技术定量存活细菌/真菌。
培养基
胰蛋白胨水
25ml瓶中盐水(无菌)
受试生物
铜绿假单孢菌ATCC 15442
果聚糖气杆菌ATCC 15552
红酵母ATCC 2527
枯草芽孢杆菌ATCC 19659
制备
将铂环量生物转移到3×10ml胰蛋白胨大豆肉汤中。在36℃生长过夜。将培养物以10×3ml等分试样分至25ml无菌通用瓶中。
酶：
-蛋白酶-Alkalase 2.5DX来自Novozymes
-淀粉酶-Termamyl 300DX来自Novozymes
-果聚糖生物水解酶，来自红酵母细胞培养物，经过0.2微米过滤器过滤的浓缩物，相当于730单位/mL
生物杀伤剂
-亚甲基-双-硫氰酸盐(MBT)来自Merck
-二甲基二硫代氨基甲酸盐(13％)+乙基双-二硫代氨基甲酸盐(15％)(氨基甲酸盐)来自Prentiss
对照
无菌蒸馏水
试验步骤
1.通过加入40ppm膦酸锌腐蚀抑制剂(在表中用“ci”表示)制备模拟冷却塔水。
2.在6×100mL无菌广口瓶中加入200ppm氯离子(以氯化钠加入)和200ppm硫酸根离子(以硫酸钠加入)，以预定水平加入生物杀伤剂。
3.以纯的或配制的形式加入酶以达到对于蛋白酶和淀粉酶的终浓度分别为2.5×10-3Au/g和300Nu/g。
4.将广口瓶置于30℃水浴中。启动秒表。
5.在时间T＝1小时时向第一个广口瓶中加入接种物以实现细菌数为约10×106cfu/mL。
6.消化细菌接种物45分钟。
7.使用连续稀释通过铺板定量存活细菌。
8.报告酶暴露于冷却水1小时的结果。
9.关于2、4、6和24小时的暴露时间重复步骤5-8。
注：为了区分处理方案，以允许实现在45分钟处理中细菌数以2-3log减少的浓度使用生物杀伤剂。
结果：
结果总结在表16中。
表16
协同性酶-生物杀伤剂组合的杀生物功效使用非制剂的酶在冷却塔水中对Cfu log的减小
水中掺入2.3×106cfu/ml果聚糖气杆菌
  Log减小   Log减小   Log减小   Log减小   Log减小   Log减小
生物杀伤剂   生物杀伤剂ppm 1小时 2小时 4小时 6小时 24小时
  实验
  1  MBT+无酶+ci   22   ＞5   3.1   nt   nt   2.7
2  MBT+果聚糖生物水解酶，无ci 22 ＞5 ＞5 nt 4.0 2.9
3  MBT+蛋白酶和淀粉酶+ci 22 4.2 3.0 1.7 ＜2 ＜2
4  MBT+果聚糖生物水解酶+ci 22 3.3 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1
5  氨基甲酸盐+蛋白酶和淀粉酶+ci 25 4.7 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1
实施例5用于与现有技术(实施例4)比较的根据本发明的例子
在该实施例中，方法和材料如实施例4所描述。然而，用根据本发明的下面的酶制剂代替：
6.Acalase 2.5D XL    20
Thermamyl 300DX      20
丙二醇               16
硼砂                 4.5
甘油                 4
7.Alcalase 2.5DXL    20
Thermamyl 300DX      20
丙二醇                16
3，5-二氯苯基硼酸     2
甘油                  4
Teric 164             1
四种不同微生物的结果在表17-20中显示：
表17
协同性酶-生物杀伤剂组合的杀生物功效冷却塔水和配制的酶
掺入2.3×106cfu/ml果聚糖气杆菌
实验   生物杀伤剂浓度   Log减小   Log减小   Log减小   Log减小   Log减小
  生物杀伤剂 ppm 1小时 2小时 4小时 6小时 24小时
1   制剂7+KathonWT+ci 8 ＞5 ＞5 nt ＞5 ＞5
  2   MBT，无酶   22   3.3   nt   nt   nt   3.0
3   MBT+(制剂2)+ci 22 4.4 ＞5 nt 4.4 4.6
4   MBT+果聚糖生物水解酶+0.1％硼砂+ci 22 4.0 3.1 2.3 2.5 2.0
5   氨基甲酸盐+(制剂7)+ci 25 4.7 4.1 3.8 4.5 3.9
表18
协同性酶-生物杀伤剂组合的杀生物功效冷却塔水和配制的酶
掺入1.9×107cfu/ml铜绿假单孢菌
  生物杀伤剂浓度   Log减小   Log减小   Log减小   Log减小   Log减小
  生物杀伤剂   ppm   1小时   2小时   4小时   6小时   24小时
  KathonWT+蛋白酶和淀粉酶-无硼 12 3.6 2.4 2.6 2.6 2.8
  KathonWT+蛋白酶和淀粉酶(制剂7) 12 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5
  MBT，无酶(对照1) 55 3.3 nt nt nt 3.0
  MBT+蛋白酶和淀粉酶(制剂2) 55 ＞5 ＞5 ＞5 4.6 ＞5
  MBT+果聚糖生物水解酶+0.1％硼砂 55 3.5 3.1 2.3 2.5 2.0
  氨基甲酸盐+蛋白酶和淀粉酶(制剂7) 95 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5
  氨基甲酸盐，无酶(对照2) 95 3.2 Nt Nt Nt 3.4
表19
协同性酶-生物杀伤剂组合的杀生物功效冷却塔水和配制的酶
掺入8.7×105cfu/ml红酵母
  生物杀伤剂浓度   Log减小   Log减小   Log减小   Log减小   Log减小
  生物杀伤剂   ppm   1小时   2小时   4小时   6小时   24小时
  KathonWT+蛋白酶和淀粉酶-无硼 10 2.7 2.4 nt nt 2.8
  KathonWT+蛋白酶和淀粉酶(制剂7) 10 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5
  MBT，无酶(对照1) 15 3.0 nt nt nt 2.6
  MBT+蛋白酶和淀粉酶(制剂2) 15 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5
  MBT+果聚糖生物水解酶+0.1％硼砂 15 2.9 nt 2.9 nt 3.1
  氨基甲酸盐+蛋白酶和淀粉酶(制剂7) 35 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5
  氨基甲酸盐，无酶(对照2) 35 2.6 nt nt nt 2.9
枯草芽孢杆菌ATCC 19659
表20
协同性酶-生物杀伤剂组合的杀生物功效冷却塔水
掺入4.3×106cfu/ml枯草芽孢杆菌ATCC 19659
  生物杀伤剂浓度   Log减小  Log减小  Log减小   Log减小   Log减小
  生物杀伤剂   ppm   1小时  2小时  4小时   6小时   24小时
  KathonWT+蛋白酶和淀粉酶-无硼   10   3.0  2.1  nt   nt   2.9
  KathonWT+蛋白酶和淀粉酶(制剂7)   10   ＞5  ＞5  ＞5   ＞5   ＞5
  MBT，无酶(对照1)   25   2.7  nt  nt   nt   2.9
  MBT+蛋白酶和淀粉酶(制剂2)   25   ＞5  ＞5  ＞5   ＞5   ＞5
  氨基甲酸盐+蛋白酶和淀粉酶(制剂7)   35   ＞5  ＞5  ＞5   ＞5   ＞5
  氨基甲酸盐，无酶(对照7)   35   3.8  nt  nt   nt   3.4
实施例6
将根据本发明的水处理剂的抗军团菌属的杀生物功效与腐蚀抑制的水中不根据本发明的酶/生物杀伤剂的组合比较。处理军团菌属需要特别的预防措施，所开发的试验方法在附录1中给出。试验了两种制剂。
配方6(无硼比较)
Alcalase 2.5DXL    20
Thermamyl 300DX    20
配方7(按照本发明含硼砂)：
Alcalase 2.5DXL    20
Thermamyl 300DX    20
丙二醇             16
硼砂               4.5
甘油               4
水                 QC
结果在表21中显示。
表21
根据本发明的配方对军团菌属的作用
Figure C0381818100391
实施例7
下面的制剂代表适于在特定条件下的优选实施方案并且是本发明用于实际应用方法的阐明性实例。这些制剂为浓缩物，其在使用时根据说明或者适当地稀释。
制剂8
制剂8是用于冷却塔最初(定期的，例如一年四次)清洁的清洁溶液。根据冷却塔的条件以100-1000mL/吨冷却水的比率加入。
                          w/w份
水                        11.9
乙氧基化醇                7
二甲苯磺酸钠，40％        15
间-吡咯烷酮               7.3
CaCl25％溶液              6
硼砂                      3
Kathon WT                 8.2
2-溴-2硝基丙烷-1，3醇     4.6
蛋白酶Alcalase 2.5L       17
淀粉酶Thermamyl 300DL     23
纤维素Carezyme 1000L      4
将再循环48-72小时(通常经过周末)。
制剂9
制剂9与制剂8类似但是用于高生物膜含量系统：
                        w/w份
水                      29.9
乙氧基化醇              7
二甲苯磺酸钠，40％      15
二丙二醇甲基醚(DPM)     12
CaCl25％溶液            1
3，5-二氯苯基硼酸       1.5
Kathon WT               11
2-溴-2硝基丙烷-1，3二醇 2
蛋白酶Alcalase 2.5L     11
淀粉酶Thermamyl 300 DL  2
纤维素Carezyme 1000L    14.6
制剂10
制剂10为维持溶液，用于不断加入冷却水(至少每48小时1次)以保持冷却水中2-溴-2-硝基丙烷-1，3二醇的浓度为7-15ppm。
  w/w份
  水   34.6
  CaCl<sub>2</sub>5％   8
  硼酸   6.1
  Kathon WT   13
  2-溴-2-硝基丙烷-1，3二醇   6.5
  淀粉酶   11.3
  纤维素酶   19
  溶菌酶   1.5
制剂11
和10相同但是用于更老的冷却塔(例如敞开于大气的，高有机负荷，木制的等)
  w/w份
  水   40.1
  CaCl<sub>2</sub>5％   8
  硼酸   3.5
  3，5-二氯苯基硼酸   0.6
  Kathon WT   13
  2-溴-2-硝基丙烷-1，3二醇   6.5
  淀粉酶   11.3
  纤维素酶   12
  蛋白酶(Savinase 16L)   5
结果讨论：
实施例1，表1-4表明存在宽范围腐蚀抑制剂时在多数情况中，约2小时内酶(如蛋白酶和淀粉酶)在低浓度和高浓度时都被减小到小于它们最初活性的约2％(即，低于这些实验检测的阈值)，并且在多数提供的浓度下在1小时内基本上无效。3小时后没有浓度高于起始浓度的2％的情况。
实施例1，表5-10表明在低浓度和高浓度加入后约2到3小时内，生物杀伤剂类似地减小酶的功效到小于它们的起始浓度的1或2％。
实施例2，表11-13表明，存在商业上有用浓度的常见腐蚀抑制剂时，用根据本发明的硼化合物预处理酶起保持它们的活性的作用。在每种情况下，酶将至少约40％，在一些情况下高于60％的活性保持24小时。在优选实施方案制剂3中，活性在24小时后剩下约60％到约90％。
优选地，硼化合物与溶剂，更尤其与促进硼溶于水的溶剂，例如多元醇如丙二醇，组合。在表11到13中所示实例中，生物杀伤剂以如通常使用的浓度导入“冷却水”中。本发明的组合物扩大了本体水环境中的酶活性，足以使得可将生物杀伤剂异噻唑啉和/或硝基烷与酶同时加入，这是对只使用生物杀伤剂的商业上可行的备选方案，但是与现有技术单独使用生物杀伤剂相比前者具有低得多的生物杀伤剂浓度。实施例3，表14和15表明在试验的几种常见生物杀伤剂中，根据本发明的制剂(其中选择异噻唑啉生物杀伤剂(KathonKT-5氯-2甲基4异噻唑啉-3-酮+2甲基4异噻唑啉-3-酮)和硝基烷生物杀伤剂(2-溴-2硝基丙烷-1，3-二醇)用作生物杀伤剂)与酶组合时出乎意料地得到令人惊奇的优良结果。该优选的组合长时间保持活性，甚至存在腐蚀抑制剂，并且甚至当生物杀伤剂的浓度超过冷却塔推荐浓度的10-15倍时也是如此。
实施例4(表16-实验1)表明Pederson现有技术优选的生物杀伤剂MBT在22ppm不存在酶时1小时后至少减少5log并且保持24小时后好于50％的有效性。此外，存在优选的酶，但是不存在腐蚀抑制剂(实验2)时，在2小时内但不是24小时内MBT给出与不存在酶时相同或更好的结果。然而，存在腐蚀抑制剂时，MBT加现有技术果聚糖生物水解酶的组合失败(实验4)。腐蚀抑制剂的存在将MBT/果聚糖生物水解酶组合的有效性在1小时内减小到仅有MBT的有效性(实验4)，并且该组合在小于2小时的有效性小于1 log减少量。这意味着实际中将需要连续加入酶或者以约1小时间隔反复加入酶，这将产生严重的酶活性监控问题，并使得该方法在本体水或空调系统中使用是完全不经济的。这些结果与Pederson的数据一致。Pederson的实验(在不含有腐蚀抑制剂的系统中)表明当酶加入2小时后加入生物杀伤剂时，组合相对于仅有生物杀伤剂时提高小于1 log，尽管Pederson没有对此进行评论。实施例5(表17)表明存在腐蚀抑制剂时根据本发明的制剂比现有技术组合明显更有效(如通过表16实验3例证)。表17实验1表明根据本发明配制的优选实施方案甚至在存在变性的腐蚀抑制剂和/或生物杀伤剂时24小时后仍保留它们的有效性。所述组合的杀生物作用比仅有生物杀伤剂明显要好。甚至来自现有技术的MBT/果聚糖生物水解酶组合当用根据本发明的硼化合物调节时(表17-实验4)24小时后仍保留一定活性。然而，在冷却塔中发现的条件下，MBT/果聚糖生物水解酶是根据本发明试验的组合中有效性最差的。
表18表明用果聚糖气杆菌(表17)得到的结果同样可应用于铜绿假单孢菌(表18)。根据本发明的组合(其中酶与硼或硼化合物组合)具有抗腐蚀抑制剂和/或生物杀伤剂的变性作用的增加的稳定性。组合的硼加酶加生物杀伤剂的杀生物作用比单独的生物杀伤剂显著要好，而非制剂的酶与单独的生物杀伤剂相比，1小时后杀生物作用几乎没有提高。注意到因为铜绿假单孢菌对生物杀伤剂抵抗力更强，所有生物杀伤剂的浓度显著增加。
表19，20显示了分别用红酵母和枯草芽孢杆菌进行时具有明显类似的结果。再次，酶加硼抗腐蚀抑制剂和/或生物杀伤剂的变性作用更稳定。组合[硼加酶加生物杀伤剂]的杀真菌作用明显比只用生物杀伤剂好。
表21表明在含有军团菌属的用腐蚀抑制剂处理水中，根据本发明的处理导致4小时后军团菌属减少4log并且持续长达至少24小时。相反，存在腐蚀抑制剂但不用硼化合物预调节的相同酶和生物杀伤剂的简单组合不能保持其活性约2小时以上，导致6小时后几乎检测不到军团菌属减少的log。
实施例8
微温水系统补救试验
在医院中在相关健康部门官员的监督下进行微温水系统补救试验。该机构为微温水系统，其温度范围为46.5到49.1℃。处理过夜进行，在6小时的试验中，微温水出口的所有通路都被封闭。所用产品为两部分产品，第一部分含有被调节的酶，第二部分为生物杀伤剂。两部分以200到250份水比1份产品的比率加入本体水系统中。通过微温水储存槽将产品应用于环路。所有水龙头和淋浴器都稍微打开以确保一定的细流，流出的水被废弃。
已经发现尤其适于在根据本发明的较高温度(如在微温水或更温暖的水系统中)消化生物膜的酶包括下面的蛋白酶，如Protinase T，Panazyme；纤维素酶如Promalt，Oloclast；淀粉酶如Nervanse，Sbozzimante SPC；和脂肪酶如Lipozyme，任何或者所有这些酶都适于微温水系统的补救。
试验前，水样取自用于微生物评定的微温水环路上多个采样点。6小时后，完全打开所有水龙头和淋浴器以消耗施用于系统中的产品。加入食品级染料作为指示剂，肉眼可检测颜色的缺乏表明酶的安全水平(份/百万)。完成水冲洗循环后采集水样。然后微温水系统进入正常服务，并且6天后再次采样。收集技术涉及收集样品30秒。所有水温为上面公开的46.5到49.1℃的范围。
Figure C0381818100441
结果显示了微温水系统补救的显著水平。基于上面的结果，补救应该每月重复。
对于在较低温度的系统，如在凉水或室微温水中使用，发现下面的酶更尤其适合：蛋白酶如Savinase，糜蛋白酶；纤维素酶如1，4(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-glocano水解酶；淀粉酶如amylozyme，highdiastase和脂肪酶如L脂肪酶，takamine脂肪酶。
这两种酶可以联合使用，使用高温酶系统清洁热水系统，用低温酶系统处理冷水系统。备选地，两种酶都可以用于同一系统以使固着的生物膜浮游，如果全水系统的温度特征保证该用法或者是未知的话。
从而，总之，腐蚀是再循环水系统中的一个主要问题。微生物的存在也是那些系统中的一个主要问题。酶被现代可接受的腐蚀抑制剂和生物杀伤剂失活。仅用生物杀伤剂，在使用的安全水平上，对于同时杀死固着和浮游细菌不是有效的。在过去提出的生物杀伤剂和酶的组合在含有腐蚀抑制剂的系统中不是有效的，因为酶在小于1小时内基本失活，还因为在使用的安全水平上，生物杀伤剂达到有效需要更长时间。绝大多数非氧化生物杀伤剂通过吸附到细胞膜上而杀死细菌。生物杀伤剂也可以吸附到酶蛋白质上从而生物杀伤剂也有效地失活酶活性。类似的问题在微温水系统中发生，其中国着微生物存在于生物膜中。迄今，通常用氯试剂如次氯酸盐处理这些系统，但是这些试剂仅仅对浮游的微生物有效，而固着微生物仍然存活于生物膜中。
本发明人已经发现通过充分加入或增加制剂中硼的浓度，可以达到一点，其中酶将保持其活性的至少40％24小时，并且在一些情况中可保持其活性的几乎100％24小时。本领域技术人员将明了根据本发明的组合物可使用与举例说明的酶和生物杀伤剂不同的酶和生物剂，并且可以以其他浓度和其他添加剂制备组合物而不背离此处公开的发明概念。
附录1
试验酶/生物杀伤剂组合对含有军团菌属的冷水的作用的方法
为确定冷却塔消毒剂对用不同酶制剂分离并处理的生物膜形式中存在的嗜肺军团菌生物体的杀细菌功效开发的方法。
不寻常的安全注意事项
下面的实验涉及嗜肺军团菌，其是潜在的病原性细菌。该试验方法涉及到大大超过最小传染剂量的细菌细胞数。试验应该在2类层流柜中进行。
原理
军团菌属细菌可以以三种形式发现，这三种形式是自由流动的浮游形式、作为生物膜生长的形式和与原生动物或藻类结合的形式。
该试验方法概述了证实冷却塔生物杀伤剂抗用酶处理的被生物膜捕获的军团菌属的功效。通过刮擦生物膜从冷却塔除去生物膜并将其重悬浮于磷酸缓冲液稀释水中。以4个100mL等分试样制备酶制剂并将与代表性阴离子组合的腐蚀抑制剂加入。1小时的接触时间后，加入1ml接种物并被酶溶液消化1小时并用10ppm异噻唑啉攻击，1小时的接触时间后，通过平板计数方法确定存活的军团菌属。对于与冷却塔水接触的酶2小时、6小时和24小时重复试验。
材料
培养皿
培养箱36±1℃
移液器和吸头
涡旋混合器
玻璃器皿-
不同大小的烧杯，
25mL通用瓶，
14mL McCartney瓶
广口瓶1L，500mL
带刻度移液器0.1ml，1mL，5mL和10mL
不同体积的注射器
2类层流柜
过滤装置(例如Sartorius SM 16219或SM 16517)
0.2μm过滤器以适合过滤装置
用棉花塞住的无菌巴斯德移液器
解剖刀刀片
玻璃涂布器
McFarland标准
缓冲的活性炭酵母提取物琼脂(BCYE)
Oxoid军团菌属琼脂基    12.5g
水                     到450ml
悬浮12.5g于450mL蒸馏水中并缓慢达到沸腾以完全溶解。分布于1L瓶中，通过121℃高压灭菌15分钟灭菌。冷却到50℃并无菌下加入OxoidBCYE补充物(SR110A)，轻轻混合并倒入无菌培养皿。
洗涤滤板的无菌水
将10.0mL体积的蒸馏水分布于通用广口瓶中，121℃高压灭菌15分钟。
人造冷却塔水
制备1L含有：
200ppm硫酸根离子
200ppm氯离子
100ppm磷酸锌的溶液
转移到2L玻璃烧杯中，用铝箔盖上。121℃高压灭菌20分钟，
对照为将1L磷酸盐缓冲稀释水置于2L玻璃烧杯中，用铝箔盖上。121℃高压灭菌20分钟。
磷酸盐缓冲液母液水
将34.0g KH2PO4溶于500ml蒸馏水中，用1N NaOH调节pH到7.2并稀释到1L。
磷酸盐缓冲液稀释水
将1.25mL磷酸盐缓冲液母液加到1L蒸馏水中。
以9ml的量置于McCartney瓶中，并于121℃灭菌20分钟。
受试生物
嗜肺军团菌(NCTC 11404)
从实验室冷却塔开始生长军团菌。从底层小心刮取生物膜。悬浮于磷酸盐缓冲水中。使用其用于攻击酶溶液。
操作技术
试验下面的酶制剂
T1
Alcalase 2.5DXL    20
Thermamyl 300DX    20
丙二醇             16
硼砂               4.5
甘油               4
水                 QC
T2：-非制剂的酶
向一组8个125ml无菌样品容器中加入蒸馏水，每个容器加入100ml无菌蒸馏水。
标记每个容器。
头四个容器用于T1，另四个用于T2。
T1，1-T1消化1小时后
T1，2-T1消化4小时后
T1，6-T1消化6小时后
T1，24-T1消化24小时后
T2，1-T2消化1小时后
T2，2-T2消化4小时后
T2，6-T2消化6小时后
T2，24-T2消化24小时后
将待试验的酶组合物加到每个容器中以在每个容器中得到浓度为2.5×10-3Au/g蛋白酶和300Nu/g淀粉酶制剂。
加100ppm磷酸锌腐蚀抑制剂。
启动记时器。
在下面的时间间隔：
在1小时加入1mL军团菌属悬浮液到标记为T1，1和T2，1的容器中。立即移出10mL悬浮液用于军团菌属平板计数(处理前)。
消化1小时。1小时消化后加入100ppm异噻唑啉并静置1小时。
移出10mL悬浮液用于军团菌属平板计数(处理后)。
在4小时时用标记为T1，2和T2，2的容器，处理重复上面的试验
在6小时时用标记为T1，6和T2，6的容器，处理重复上面的试验
在24小时时用标记为T1，24和T2，24的容器，处理重复上面的试验
军团菌属平板计数
对所得每个样品进行下面的步骤。
通过0.22μm过滤器过滤10mL样品。用10mL无菌水洗涤过滤器以冲洗任何的杀生物残留。
无菌取出滤板并用烧过的手术刀片将其切成小块并悬浮在10mL无菌蒸馏水中。
涡旋混合30秒以使存活细胞成为悬液。
在9mL无菌蒸馏水中制备一系列10倍稀释液。
对于处理前样品，从10-4、10-3和10-2稀释液一式两份地转移0.1mL到BCYE琼脂板中。
对于处理后样品，从10-4、10-3、10-2和10-1稀释液一式两份地转移0.1mL到BCYE琼脂板中。
计算
对含有25到250个菌落的平板计数菌落。
存活的军团菌属可以从处理前和处理后的计数计算并转化成对数。

Claims (53)

1.处理在水系统中的生物膜中固着微生物的方法，所述方法包括以下步骤：
向该系统中加入至少一种在水中具有最初活性的酶；
用硼化合物调节所述酶以形成硼调节的酶；
向系统中加入至少一种生物杀伤剂；
所述硼化合物被加入的浓度足以使在最后一次加入酶或生物杀伤剂的所述加入后，硼调节的酶保持所述最初活性至少40％的活性水平至少2小时；并且其中所述酶和所述生物杀伤剂在组合中协同有效。
2.使生物膜中固着微生物浮游的方法，所述方法包括步骤：
将至少一种酶加入水系统中与生物膜接触，所述酶被硼化合物调节以形成硼调节的酶；所述硼化合物被加入的浓度足以使硼调节的酶在所述接触后保持所述最初活性至少40％的活性水平至少2小时；并且其中所选择的酶为一类并且其浓度足以使所述固着的微生物浮游；并且其中所述酶和所述硼化合物在组合中协同有效。
3.根据权利要求2的方法，其还包括加入至少一种生物杀伤剂的步骤；并且其中所述硼调节的酶在最后一次加入酶或生物杀伤剂后保留所述最初活性的至少40％的活性水平至少2小时。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中生物膜存在于再循环水系统中。
5.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中生物膜存在于微温水系统中。
6.根据权利要求4的方法，其中再循环水系统是微温水系统。
7.根据权利要求1-3中的方法，其中所述硼调节的酶保留所述酶最初活性的至少40％至少12小时。
8.根据权利要求7的方法，其中所述硼调节的酶保留所述酶最初活性的至少75％至少24小时。
9.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述硼调节的酶通过将所述酶与所述硼化合物在它们加入系统中的水之前接触形成。
10.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述硼调节的酶通过将所述酶与所述硼化合物在系统的水中接触形成。
11.根据权利要求1或3中任一项的方法，其中所述硼调节的酶和所述生物杀伤剂一起、基本同时或者分开加入。
12.根据权利要求1或3的方法，其中所述酶、所述含硼化合物和所述生物杀伤剂基本上连续加入。
13.根据权利要求1或3的方法，其中所述酶和所述生物杀伤剂中的至少一种间断地加到水系统中。
14.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述酶选自蛋白酶、糖酶、酯酶、水化酶、淀粉酶、过氧化氢酶、脂肪酶、纤维素酶、过氧化物酶、转化酶、果聚糖生物水解酶和它们的混合物。
15.根据权利要求14的方法，其中所述酶为蛋白酶、淀粉酶或它们的混合物。
16.根据权利要求14的方法，其中所述酶为以1×10-3到3×10-3Au/g活性使用的蛋白酶。
17.根据权利要求14的方法，其中所述酶为以相当于100-500Nu/g浓度使用的淀粉酶。
18.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述硼化合物选自硼砂、硼酸、氧化硼、原硼酸盐、偏硼酸盐、焦硼酸盐、过硼酸盐、含硼酸或它们的混合物。
19.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述硼化合物以0.1到10％的浓度存在。
20.根据权利要求18的方法，其中所述硼化合物以0.1到10％的浓度存在。
21.根据权利要求1或3的方法，其中所述生物杀伤剂选自噻唑和/或咪唑生物杀伤剂、硝基烷生物杀伤剂、噻二嗪、二硫代氨基甲酸盐类、硫氰酸盐、季铵氯化物或它们的混合物。
22.根据权利要求1或3的方法，其中所述生物杀伤剂的浓度为1到150ppm。
23.根据权利要求21的方法，其中所述生物杀伤剂的浓度为1到150ppm。
24.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述水系统包括一种或多种腐蚀抑制剂。
25.根据权利要求24的方法，其中腐蚀抑制剂为氧化腐蚀抑制剂或膜形成腐蚀抑制剂。
26.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述水中浮游的和固着的细菌总共保持在低于1000cfu/ml。
27.根据权利要求26的方法，其中所述水系统中浮游的和固着的细菌总共保持在低于10cfu/ml。
28.根据权利要求1或3的方法，其中与所述硼调节的酶组合的所述生物杀伤剂有效减少选自军团菌属微生物、果聚糖气杆菌、铜绿假单孢菌、红酵母、枯草芽孢杆菌的生物体的生长。
29.根据权利要求21的方法，其中与所述硼调节的酶组合的所述生物杀伤剂有效减少选自选自军团菌属微生物、果聚糖气杆菌、铜绿假单孢菌、红酵母、枯草芽孢杆菌的生物体的生长。
30.根据权利要求23的方法，其中与所述硼调节的酶组合的所述生物杀伤剂有效减少选自选自军团菌属微生物、果聚糖气杆菌、铜绿假单孢菌、红酵母、枯草芽孢杆菌的生物体的生长。
31.根据权利要求28的方法，其中与所述硼调节的酶组合的所述生物杀伤剂有效减少系统中军团菌属微生物的生长。
32.根据权利要求29的方法，其中与所述硼调节的酶组合的所述生物杀伤剂有效减少系统中军团菌属微生物的生长。
33.根据权利要求30的方法，其中与所述硼调节的酶组合的所述生物杀伤剂有效减少系统中军团菌属微生物的生长。
34.水处理方法，其包括步骤：
提供至少一种在水中具有最初活性的酶；
用足够浓度的硼化合物调节所述酶以形成硼调节的酶；
加入至少一种生物杀伤剂，并且其中当所述硼调节的酶与所述水接触时，其在与所述水接触后保持所述最初活性至少40％的活性水平至少2小时；并且其中所述酶和所述生物杀伤剂在组合中协同有效。
35.补救含有微生物的微温水系统的方法，其包括步骤：
将在水中具有最初活性的至少一种酶导入系统；
用足够浓度的硼化合物调节所述酶以产生硼调节的酶；并且
其中所述硼调节的酶在所述导入后保持所述最初活性的至少40％的活性水平至少2小时；并且其中所述酶和所述硼化合物在组合中协同有效。
36.根据权利要求35的方法，其中微温水为40℃到55℃。
37.根据权利要求35或36的方法，其中微温水为45℃到50℃。
38.用于处理水的组合物，其包含：
至少一种具有最初活性的酶；足够量的硼化合物以调节并稳定所述酶，从而形成硼调节的酶，所述硼调节的酶与所述水接触后保持所述最初活性的至少40％至少2小时；和至少一种生物杀伤剂；并且其中所述酶和所述生物杀伤剂在组合中协同有效。
39.根据权利要求38的组合物，其中所述酶选自蛋白酶、糖酶、酯酶、水化酶、淀粉酶、过氧化氢酶、脂肪酶、纤维素酶、过氧化物酶、转化酶、果聚糖生物水解酶和它们的混合物。
40.根据权利要求38或39的组合物，其中所述酶为蛋白酶、淀粉酶或它们的混合物。
41.根据权利要求40的组合物，其中所述蛋白酶以使用时足以提供1×10-3到3×10-3Au/g活性的浓度使用。
42.根据权利要求40的组合物，其中所述淀粉酶以使用时足以提供100-500 Nu/g活性的浓度使用。
43.根据权利要求41的组合物，其中所述淀粉酶以使用时足以提供100-500 Nu/g活性的浓度使用。
44.根据权利要求38的组合物，其中所述硼化合物选自硼砂、硼酸、氧化硼、原硼酸盐、偏硼酸盐、焦硼酸盐、过硼酸盐、含硼酸或它们的混合物。
45.根据权利要求44的组合物，其中所述硼化合物以0.1到10％的浓度存在。
46.根据权利要求38的组合物，其中多元醇溶剂被加入所述硼化合物。
47.根据权利要求46的组合物，其中多元醇溶剂选自甘油、丙二醇、甘油和丙二醇的混合物、以及其他胶束不混溶的溶剂。
48.根据权利要求38的组合物，其中所述生物杀伤剂选自噻唑和/或咪唑生物杀伤剂、硝基烷生物杀伤剂、噻二嗪、二硫代氨基甲酸盐类、硫氰酸盐、季铵氯化物或它们的混合物。
49.根据权利要求48的组合物，其中所述生物杀伤剂以1到10％的浓度使用。
50.根据权利要求38的组合物，其还包含腐蚀抑制剂。
51.根据权利要求50的组合物，其中所述腐蚀抑制剂为氧化抑制剂或膜形成抑制剂。
52.包含酶、生物杀伤剂和含硼化合物的货架稳定的组合物，所述组合物与膜形成腐蚀抑制剂相容；并且其中所述酶和所述生物杀伤剂在组合中协同有效。
53.包括至少一种酶、腐蚀抑制剂、生物杀伤剂和含硼化合物的浓缩物，并且其中所述酶和所述生物杀伤剂在组合中协同有效。
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