JPH03181415A - リポソーム表面の修飾方法および修飾装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、リポソームの表面を修飾する方法並びに該方
法に使用する装置に関する。

さらに詳しくは、本発明は、リポソーム表面修飾剤を添
加したリポソーム懸濁液を急速に加熱し、次いて冷却す
ることからなるリポソーム表面の修飾方法並びに該方法
に使用する装置に関する。

本発明によれば、リポソーム内層の温度を高めることな
く、リポソーム表面修飾剤をリポソームの表面に堅固に
固定することができるので、島により変性しやすい物質
を内層に含ａするリポソームの表面処理に好適に利用さ
れる。

〔従来の技術〕

生理活性物質や薬物の水溶ｄｋをリポソームによりマイ
クロカプセル化してドラッグ　デリバリ−システムなど
に応用する試みか広＜ｆ」なイっれており、その際、種
々の「１的で、リポソームの表面を修飾することも行な
われている。

例えば、リポソームの脂質層をガレグリオシトで処理し
て循環血中ての消失速度を減少させた人工赤血球（特開
昭６３−２７５５２２号）、リポソームの表面を多糖質
と脂肪酸とのエステルて肢覆して機械的強度を向上させ
たリポソーム（特開昭５８４９３１１号および同５ｇ　
−２０１７１１号）などが知られている。さらに本発明
者は、リポソーム表面を蛋白質吸着抑制剤で修飾して循
環血中での凝巣を防止した人工赤血球を提案している（
特願平１−６３５０７号）。

これらのリポソームにおいて、いずれの場合もリポソー
ム表面修飾剤は、リポソーム膜中に固定される疎水性ア
ンカ一部と、リポソーム表面に露出して修飾の目的を達
成する機能をもつ親水性部からなる分子構造を有する。

リポソーム表面の修飾方法としては、修飾剤を当初より
リポソーム膜形成脂質と混合してリポソームを作成する
方法と、予めリポソームを形成し、その懸濁液に修飾剤
を添加する方法とがある。修飾剤は、前述したト１的か
らみてリポソーム外層の表面にのみイＨＥすれば十分で
あり、またその方が修飾剤の無駄を無くし、さらには修
飾剤に起因する副作用を低減できる。

そのため従来上としてリポソーム懸濁液に修飾剤を添加
する方法が行なわれており、修飾処理はリポソーム内層
の物質の熱変質を防止するため室温以下の温度で実施さ
れている。

ところが、室温以下の温度で十分表１．ｆＩｊ修飾てき
るのは、リポソーム膜形成物質として相転移温度（Ｔｃ
）の低いリン脂質を用い、修飾剤として臨昇ミセル濃度
（ＣＭＣ）の高いものを用いる場合に限られ、相転移温
度の低いリン脂質を用いたリポソームは、バリアー能が
低く不安定であり、また、ＣＭＣの高い修飾剤は低いも
のに比べて屓血心性が高いという難点がある。

本発明者は相転移温度の高いリン脂質を用いて作成され
た安定リポソームをＣ〜ＩＣがσ（く溶血毒性の代い修
飾剤で表面修飾することができる方法ならびにその方法
の実施に好適に利用できる装置について鋭意研究を重ね
た。

〔発明が解決しようとする問題点〕

￥温以下の修飾操作では十分な表面修飾が施せないある
いは修飾に非常に長時間を要するリポソームと修飾剤の
組合せ、例えばリポソーム膜の主成分リン脂質が水素添
加大豆レシチンであり、修飾剤が水素添加卵質ホスファ
チジルエタノールアミンと平均分子ｆ１２．ｏｏＯのモ
ノメｌ−キシポリエチレングリコールを結合したちのに
ついて神々の修飾方法を検討したところ、このリポソー
ムの懸濁液に修飾剤を添加し、水素添加大豆レシチンの
相転移温度（約５５℃）以上に加熱することで短時間で
十分な表面修飾が可能であることを見出した。

蓚飾剤は水中で大部分ミセル状態で分散している。

ここにリポソームが共！！すれば、修飾剤の疎水部が疎
水的相互作用を介してリポソーム膜中の疎水性領域に取
り込まれ固定される。このようにリポソーム表面に固定
される修飾剤はミセル状態ではなく単分子状態で水中に
溶解しているものだけである。従って上記の修飾剤のよ
うにＣＭＣの代い修飾剤による修飾速度は著しく遅い。

一方、修飾剤が入り込むリポソーム膜の疎水性領域の流
動性は相転移点（Ｔｃ）を境にして大きく変わる。Ｔｃ
以下では固いゲル状態、Ｔｃ以上では流動性に富む液晶
状態となることが知られている。このためＴｃ以上に加
熱したことでリポソーム膜が修飾剤を取り込み易い状態
となり、上記のごとき系でち修飾が容易に行なえたもの
と４えられる。

しかしながら、リポソームの内層に薬物や生理活性物質
が含有されている場合、短■１間であっても高温にさら
されることによってこれらの６効成分が変性し機能を果
たさなくなる場合がある。表面修飾を容易にするため加
熱しなければならないのはリポソーム表面のみである。

そこでリポソーム懸濁液を急速にＴｃ以上に加熱し、次
いで急速に冷却する操作の繰り返し、すなわち微小時間
の加熱・冷却を繰り返すことによってこの問題を解決し
た。本発明者はこの知見に基いて本発明を完成した。

〔問題点を解決するための手段〕

上記の目的を達成するため、本発明は次の構成を有する
。

１）内層に熱により変性しやすい物質を含むリポソーム
を水に懸濁し、該懸濁液に、分子の一端に疎水性部を有
し他端に親水性部を有する化合物からなるリポソーム表
面修飾剤を添加し、該懸濁液を混合することからなるリ
ポソーム表面の修飾方法において、リポソーム表面がリ
ポソーム膜形成脂質の相転移温度以上になるように前記
懸濁液を加熱し、次いで該リポソームの内層が、前記熱
により変性しやすい物質の変性する温度に上昇する前に
該懸濁液を冷却することを特徴とする方法。

２）前記加熱および冷却を微小時間繰り返すことを特徴
とする１項に記載の方法。

３）リポソーム表面修飾剤を添加したリポソーム懸濁液
を加熱し、リポソーム表面を、リポソーム膜形成脂質の
相転移温度以上に加熱するための加熱手段と、加熱後の
前記リポソーム懸濁液を冷却し、リポソーム内層の温度
を、該内層に含まれる物質の熱変性温度以下に保つため
の冷。

却手段と、これらを連結して前記リポソーム懸濁液を循
環させる循環装置とを備え、リポソーム内層の温度が該
内層に含まれる物質の熱変性温度に達する前に加熱後の
リポソーム懸濁液を冷却可能な位置に前記加熱手段と冷
却手段とを設置し、微小時間の加熱・冷却の繰り返しに
よってリポソーム表面のみを前記相転移温度以上に加熱
し得るように構成したことを特徴とするリポソーム表面
修飾装置。

４）前記加熱手段および冷却手段内はリポソーム懸濁液
を乱流状態で流すことを特徴とする３項に記載の装置。

本発明の方法は、内層に熱により変性しやすい物質を含
むリポソームを水に懸濁し、この懸濁液にリポソーム表
面修飾剤を添加し、該懸濁液を急速に加熱し、次いで冷
却することによって実施される。

本発明におけるリポソーム膜形成脂質には特に制限はな
く、リポソームを形成するものであれば天然または合成
の脂質が使用可能である。特にリン脂質が好適に使用さ
れ、その例として、レシチン、ホスファチジルエタノー
ルアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、
ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、
ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、カ
ルシオリピンおよびこれらを常法に従って水素添加した
ものがあげられ、これらを組合せて用いることもできる
。さらにリポソーム膜の形成脂質には所望によりステロ
ール等の膜構造強化剤、電荷付与物質（例えばステアリ
ン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、リノール酸、リルン
酸等）またはビタミンＥ等の抗酸化剤を添加することが
できる。

本発明の方性においては、上記リポソーム膜形成脂質あ
るいはこれに上記膜構造強化剤、電荷付与物質および（
または）抗酸化剤を加えた混合物をクロロホルム等の適
当な有機溶媒に溶角ｌし、均一に混合した後、凍結乾燥
し、粉末化したもの（例えばプレソーム、日本粘化社製
）がリポソーム膜形成脂質原料として用いられる。

リポソームの内部に取り込まれる溶液には特に制限はな
く、任意の種類の化学物質の水溶液が使用され得るが、
熱に不安定な生理活性物質、例えば種々の酵素、ヘモグ
ロビン等が特に好適に用いられる。酵素の例としては、
β−グルクロンダーゼ、ヘキソサミンダーゼ、アミノグ
ルコシダーゼ等があげられる。

リポソーム表面修飾剤としては、分子の一端に疎水性部
を有し、他端に親水性部を有する化合物が使用される。

このような化合物の例としては、リポソーム表面への蛋
白質吸着抑制剤（特願平１−１３３５０７号）、多糖質
と脂肪酸とのエステル（特開昭５８−４９３１１号およ
び同５８−２０１７１１号）、ガングリオシド（特開昭
８３−２７５５２２号）等があげられる。

前記蛋白質吸着抑制剤は、長鎖脂肪族アルコール、ステ
ロール、ポリオキシプロピレンアルキルまたはグリセリ
ン脂肪酸エステルのアルコール性残基またはリン脂質に
親水性高分子項部（例えばポリエチレングリコール）が
結合してなるものである。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と上記疎水性部アル
コール性残基とがエーテル結合したＰＥＧ付加型非イオ
ン界面活性剤、ＰＥＧとリン脂質とが共有結合したＰＥ
Ｇ結合リン脂質が特に好ましい。

多糖質と脂肪酸とのエステルからなる表面修飾剤として
は、多糖質がデキストラン、アミロペクチン、プルラン
、デキストラン硫酸、キト酸またはプルラン硫酸であり
、脂肪酸がラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸ま
たはステアリン酸からなるものが好ましい。表面修飾剤
がガングリオシドである場合は、ＧＭＩ、０Ｍ２，０Ｍ
３゜Ｇ　Ｄ　１　ａ、　　Ｇ　Ｄ　１　ｂ、　　Ｇ　Ｔ
　１　ｂまたはＧＱｌｂが好ましい。

リポソーム懸濁液は、リポソーム膜形成脂質の相転移温
度以上に加熱される。

前に説明したように、リポソーム表面の温度が相転移温
度以下である場合には、表面修飾剤の固定が不十分であ
るか、または固定に長時間を勺゛する。上記の如くして
加熱されたリポソーム懸濁液は、リポソーム内層に含ま
れる物質の温度が熱変性を受ける温度に上昇する前に急
速に冷却される。

上記の如きリポソーム懸濁液の加熱・冷却を微小時間で
繰り返すことにより、リポソーム内層に含まれる物質が
変性を受けることなく表ｔｆｉ［飾剤をリポソーム表面
に堅固に固定することができる。

上記リポソーム表面の修飾方法は、本発明のリポソーム
表面修飾装置を使用することによって好適に実施される
。

以下、図面を参照して本発明のリポソーム表面修飾装置
を説明する。

第１図は本発明のリポソーム表面修飾装置を概念的に示
した図であり、加熱手段１と冷却手段２とこれらを連結
してリポソーム懸濁液を循環する循環手段３とからなる
。加熱手段１は、リポソーム懸濁液が内部を流れるコイ
ル状の管４（好ましくはステンレス管）と鎖管４を外部
から加熱する温浴槽５からなる。管４には、リポソーム
懸濁液の温度を感知し、加熱を調節するための温度感知
器６（例えば熱電対温度計）がとりつけられている。

冷却手段２は、リポソーム懸濁液が内部を流れるコイル
状の管７と鎖管７を外部から冷却する氷水浴槽８とから
なる。

循環手段３は、加熱手段１と冷却手段２を連結するため
の管９（例えばビニルチューブ）とこれらにリポソーム
懸濁液を一定量給液するためのポンプ１０（好ましくは
ローラーポンプ）と、リポソーム懸濁液の取り入れ口１
１および取り出し口１２とからなる。前記加熱手段１と
冷却手段２は、リポソーム内層の温度が該内層に含まれ
る物質の熱変性温度に達する前にリポソーム懸濁液を冷
却可能な位置に設置されている。また加熱手段と冷却手
段はループにして循環させてもよいし、複数の組を直列
に配してもよい。

取り入れ口１１から取り入れられた表面修飾剤を含むリ
ポソーム懸濁液は加熱手段１でリポソーム表面温度がリ
ポソーム膜形成脂質の相転移温度以上にまで加熱され、
次いで該リポソーム懸濁液は冷却手段２で、リポソーム
内層が該内層に含まれる物質の熱変性温度に達しないよ
うに冷却される。

加熱および冷却手段内のリポソーム懸濁液の流動状態は
乱流状態（レイノルズ数２，０００以上）となるように
設計されていることが望ましい。加熱手段内の流動が乱
流であればリポソーム外表面の温度は全てのリポソーム
について均一に、懸濁液の温度と等しく急速に上昇しＴ
ｃ以上に違する。

一方、この時リポソームの膜によって隔てられたリポソ
ームの内部の相は外部の相が乱流であっても静的な状態
にあり、膜表面からリポソーム中心へ向かっての温度勾
配は非常に大きく、内部に保持された生理活性物質の変
性が著しく促進される温度には達しない。この状態から
急速に懸濁液を冷却することにより、リポソーム表面は
修飾剤による修飾が著しく促進される温度に達する一方
、リポソーム内部の生理活性物質は変性が促進される温
度に到らないという条件が達成される。

〔実　施　例〕

以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明する。

（修飾剤の合成）。

モノメトキシポリエチレングリコール２，０００（ユニ
オンカーバイド社製）５０ｇを１．２−ジクロロメタン
２５０ｍ１に溶解し、無水コハク酸１２ｇとピリジン１
０ｍ１を加えて３日間沸点還流した。濾過およびエバポ
レーション後、１．００ｍ１の蒸留水に溶解し、水相を
エーテルで洗浄後、クロロホルム１００ｍ１で抽出した
。エバポレーション後、酢酸エチルで再結晶して片末端
カルボキシＰＥＧを？また。これの１２．６ｇと水素添
加卵黄ホスファチジルエタノールアミン５ｇ１さらにジ
シクロへキシルカルボジイミド６ｇを５０ｍ１のクロロ
ホルムに溶解し、５０℃で終夜反応させた。反応液を濾
過後、ヘキサン５ｉ）に再沈して、アミド粘合を介する
ＰＥＧ結合リン脂質を得た。このＰＥＧ結合リン脂質の
ＣＭＣは蛍光法による測定限界以下（１０−７Ｍ以下）
であった。

（ヘモグロビン（Ｈｂ）含有リポソームの調製）水素添
加大豆レシチンｅ、ａｇ、コレステロール３．２ｇ、　
　ミリスチン酸０．５ｇをジクロロメタン２００ｍ１に
溶解し、エバポレーションにより有機溶媒を除去した。

得られた混合脂質に４５％Ｈｂ水溶液２００ｍ１を加え
、振盪後、５００ｋｇ／ｃ−の圧力でフレンチプレス処
理を１０回繰り返した。得られたフレンチプレス処理液
を生理食塩水により１０倍に希釈して遠心分離処理（１
７，００Ｏｒ、ｐ、ｍ、、　３０分）し、沈澱リポソー
ムを生理食塩水でさらに２回遠心洗浄を繰り返した。洗
浄後の沈澱リポソームをＨｂ′ａ度で５％となるように
生理食塩水中に懸濁させた。得られたリポソームの平均
粒径は０．２血であった（また、内部のＨｂのメト化率
は３％であった）。このリポソーム懸濁液０．１ｍｌと
クエン酸油ヒト血漿０．５ｍｌを混合し、光学顕微鏡（
４００倍）により観察したところ、リポソームは完全に
凝集し、その凝集物の大きさは５０如を越えるものであ
った。

〔比　較　例〕

上記Ｈｂ５％のリポソーム懸濁液にＰＥＧ結合リン脂質
をその濃度が０．２％となるように加えた（混合液１）
。この混合液１を室温で１特開放置した後、生理食塩水
により遠心洗浄し、沈澱リポソームをＨｂ濃度５％とな
るように生理食塩水に再分散した。このリポソーム懸濁
液０．１ｍｌとクエン酸油ヒト血漿０．５ｍｌを混合し
、リポソームの凝集を観察したところ、上記未修飾リポ
ソームと同様の結果であった。

〔実施例１〕 混合液１を６０℃で２分間放置した後、比較例と同様の
操作でリポソームの血漿中凝果の様子を観察したところ
、１血を越えるリポソーム凝集物はほとんど認められな
かった。このリポソーム内部のＨｂのメト化率は１３％
であった。

〔実施例２〕 混合液１を第１図の設置回路内をｌ００ｍ１／＋ｉｎの
流速で１００回循環させた。加熱手段入口、出口におけ
る混合液１の温度はそれぞれ１５℃、５８℃であった。

循環後の混合液について比較例と同様の操作でリポソー
ムの血漿中凝集を観察したところ実施例１と同様の結果
であった。このリポソーム内部のＨｂのメト化率は４％
であった。

上記実施例で用いた装置において、ＩＣＧ　（内径１．
４５＋＋ｓ）のステンレス管内に水溶液を１００ｍ１／
ｗｉｎの流速で流すとレイノルズ数は２．０００以上と
なり内部の流体の流動は乱流となる。加熱手段内のステ
ンレス管の長さは２ｍ、冷却手段との連絡部分の内部容
量は０．５ｍｌであった。

〔発明の効果〕

以上の実施例ではリポソームの血漿中凝集防１ヒ能を持
つ修飾剤によるリポソーム表面修飾について詳しく説明
した。この修飾剤はＣＭＣが小さく溶血毒性が低い特徴
を持つが、比較例のように従来の室温以下での修飾では
十分な表面修飾が行なえず、リポソームの血漿中凝集防
止効果が発裡できない。

しかしながら、本発明の修飾方法では、リポソームを構
成するリン脂質の相転移４度以上に加熱すること、実施
例では水素添加大豆レシチンのＴｃ５５℃以上に加熱す
ることで、ご＜奥１１４ｊ間でリポソームの表面修飾を
施すことができ、実施例では目的の血漿中凝集防止効果
が付与できた。

さらに本発明の修飾装置を用いて、微小１４７１１の加
熱を繰り返すことにより、修飾剤による十分な表面修飾
を施すと同時に、リポソーム山部に保持された生理活性
物質の熱による変性を非常に低く抑えることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のリポソーム表面の修飾装置の説明図で
ある。 第１図において １・・・加熱手段 ２・・・冷却手段 ３・・・循環手段

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）内層に熱により変性しやすい物質を含むリポソーム
   を水に懸濁し、該懸濁液に、分子の一端に疎水性部を有
   し他端に親水性部を有する化合物からなるリポソーム表
   面修飾剤を添加し、該懸濁液を混合することからなるリ
   ポソーム表面の修飾方法において、リポソーム表面がリ
   ポソーム膜形成脂質の相転移温度以上になるように前記
   懸濁液を加熱し、次いで該リポソームの内層が、前記熱
   により変性しやすい物質の変性する温度に上昇する前に
   該懸濁液を冷却することを特徴とする方法。 ２）前記加熱および冷却を微小時間繰り返すことを特徴
   とする請求項１に記載の方法。 ３）リポソーム表面修飾剤を添加したリポソーム懸濁液
   を加熱し、リポソーム表面を、リポソーム膜形成脂質の
   相転移温度以上に加熱するための加熱手段と、加熱後の
   前記リポソーム懸濁液を冷却し、リポソーム内層の温度
   を、該内層に含まれる物質の熱変性温度以下に保つため
   の冷却手段と、これらを連結して前記リポソーム懸濁液
   を循環させる循環装置とを備え、リポソーム内層の温度
   が該内層に含まれる物質の熱変性温度に達する前に加熱
   後のリポソーム懸濁液を冷却可能な位置に前記加熱手段
   と冷却手段とを設置し、微小時間の加熱・冷却の繰り返
   しによってリポソーム表面のみを前記相転移温度以上に
   加熱し得るように構成したことを特徴とするリポソーム
   表面修飾装置。 ４）前記加熱手段および冷却手段内はリポソーム懸濁液
   を乱流状態で流すことを特徴とする請求項３に記載の装
   置。