JPH0317021A - 骨髄異形成症候群治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト単球一マクロファージコロニー刺激因子
（以下ヒ｝　Ｍ−Ｃ　Ｓ　Ｆとする．）を有効成分とす
る骨％ｉｆ％形成症候群治療剤に間する．〔技術の背景
及び従来の技術〕 骨髄異形成症候群は赤血球系、顆粒球及び単球系、並び
に血小板系の三つの造血系の一つまたはそれ以上におい
て、質的量的異常が認められる疾患である．質的量的異
常としては大赤血球症、輪状鉄芽球、巨赤芽球性赤ｍ球
性造直、好中球造血と巨核球の障害、染色体異常など骨
髄および末梢血に広範囲に認められる。臨床経過は、貧
血、貧食細胞の産生及び機能′Ａ常ζこよる感場、並び
に血小板減少及び直小板機能障害による出血などが特徴
的である，骨髄異形成症候群は病態により１）不反応性
食血（ＲＡ）、２）不反応性貧血及び輪状鉄芽球増加、
３）不反応性貧血並びに芽球増加（ＲＡＥＢ）、４）慢
性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、５）急性転化Ｒ　Ａ
　ＥＢの５種項の病型に分けられるが、いずれの病型の
患者も数カ月、数年のｌｌ過観察後には結局は致命的な
疾患である骨髄性白血病に転化する。骨髄異形成症候群
は同型による差異も大きく、Ａｒａ−Ｃ少量療法、ＶＤ
３療法が行われているが、その治療成績は必ずしも良い
とはいえず、有用な治療法の確立が望まれている．　　
造血因子の一種であるコロニー刺激因子中で単球一マク
ロファージ系幹細胞に作用する因子（Ｍ−ＣＳＦ）があ
り、その蛋白質及び遺伝子構造について明らかにされて
いる（特開昭６４−２２０９９公報号）．このヒトＭ−
Ｃ　Ｓ　Ｆは成熟ヒト単球一マクロファージにも作用し
その機能活性１ヒ及び各種サイト力インの産生を促進す
ること（　Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ　Ｋ　ｅｔａｌ　　Ｅｘ
ｐ　．ｌｌｅｓａｔｏ１．１７：６８−７１（１９８９
））、また臨床的に顆粒球減少症（Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ
κら　，　Ｅｘｐｅｒｉｓｅｎｔａｌ　　Ｈｅｍａｔｏ
ｌｏｇｙ　　１４巻、　１０６９−１０７５．１９８６
年）や骨髄移植（Ｍａｓａｏｋａ　Ｔ　ｅｔａｌ　Ｂｏ
ｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　ＴｒａｎｓｐＩａｎｔａｔｉｏｎ
．３：１２１−１２７（１９８８））に対する有用性が
明らかにされ、医薬としての期待が大きい．このヒトＭ
−Ｃ　Ｓ　Ｆは既に臨床試験の上で、その安全性が確認
されており副作用がほとんどないことが明らかにされて
いるｓ　　（　Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉκら　Ｉ＋＋ｎｕｎ
ｏｂｉｏｌｇｙ　　１７２巻、２０５−２１２．１９８
６年〉．シかし、　ヒトＭ−ＣＳＦの骨髄異形成症候群
治療剤への利用可能性については未検討のまま置かれて
いた． ［発明の目的及び要約］ 骨髄異形成症候群は上記のように数カ月、数年のうちに
致命的な骨髄性白血病に転化する悪性かつ重篤な疾患で
あり、現在臨床的に有用な治療法及び薬剤はない．本発
明は骨髄異形成症候群に対して、ヒ｝Ｍ−ＣＳＦを用い
，その治療剤としての検討を行った結果、ヒ｝Ｍ−ＣＳ
Ｆの投与により骨Ｎ異形成症候群において最も問題とな
る芽球細胞の減少及び、消失並びに正常白血球及び赤血
球数の回復が起こることを見いだし本発明を完成した。

本発明はヒトＭ−ＣＳＦを有効成分とする骨髄異形成ｒ
ＬＮ群治療剤である．ヒ｝Ｍ−ＣＳＦとしてはヒト尿、
ヒ｝Ｍ−ＣＳＦ産生細胞培！Ｉ液又はヒ｝Ｍ−　Ｃ　Ｓ
　Ｆ　ｉｌＩ伝子組換え細胞の培養液より調製されるヒ
トＭ−Ｃ　Ｓ　Ｆを用いることが可能である．［発明の
技術構成］ 本発明に係わるヒ｝Ｍ−ＣＳＦは、公知の方法（特開昭
８４−２２８９９号公輯）、によって精製したものを凍
結乾燥してＨａした。すなわち純化したヒ｝　Ｍ−Ｃ　
Ｓ　Ｆをウサギに免疫して得た抗ヒトＭ−ＣＳＦ抗体を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７。Ｏ）中で透析し、２０
ｍｇ／ｍｌ濃度にＩＡ製した．該抗体ｉ８液２００ｍｌ
を、あらかじめ蒸留水及び０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄
した１００ｇのフォルミルーセルロファインへ加え、室
温で２時問攪拌しｋ後、水素化シアノホウ素ナトリウム
７００ｍｇを加えて、更に１６時間攪拌し、フオルミル
ーセル口ファインと抗ヒ｝Ｍ−ＣＳＦ抗体を結合させ抗
体結合支持体を調製した．結合後、０．２Ｍ｝’リスー
塩酸！１衡液で洗浄し、更に水素化シアノホウ素ナトリ
ウム５００　ｍ　ｇを含むトリス１ａ衝液２００ｍｌを
加え、室温で４時間攪拌して、未反応基を不活化した．
次いで抗体結合支持体を０．５ＭＮａＣｌを含有する０
．０２Ｍリン酸ｌｌ衝ｔαで十分洗浄した．抗体結合支
持体は支持体１ｇ当り２９．５ｍｇの抗ＣＳＦ抗体を結
合していた．次にヒト尿１０００Ｌを限外炉過濃總機で
濃縮し、脱塩した後、ＤＥＡＥ−セルロースに吸着させ
、非吸着の夾雑物質を除去し、０．３ＭＮａＣｌ溶液で
溶出し、該溶出液に０．５ＭＩ１度になるように塩化ナ
トリウムを加えてヒトＭ−ＣＳＦを含有する溶液をｖ４
％！した．このヒトＭ−ＣＳＦの比活性は、２Ｘ１０’
単位／　ｍ　ｇであった．上記抗体結合支持体１００ｇ
に対し、このヒトＭ−ＣＳＦを含有する溶液（全ｆｉ　
５　０　０　ｍ　ｌ　）を加え、１０℃以下で一夜撹拌
しバッチ式クロマトグラフィー処理を行った．攪拌後、
ガラスフィルターで炉遇して、抗体結合支持体を集め、
０．５ＭＮａＣ＋を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液で
該抗体結合支持体を十分；こ洗浄した。洗浄後、０．２
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２．５）５００ｍｌを加え、１０℃
、１時間攪拌して、ヒトＭ−ＣＳＦを溶出した。溶出液
のｐＨを７．０にした後、限外法過膜で濃縮・脱塩して
、ヒトＭ−ＣＳＦ分画を得た．この分画をＨｉ−Ｐｏｕ
ｒ２１４ＴＰ（バイダック社、径２．２ｘ２５ｃｍ）の
逆相カラムで０．　　１％トリフルオロ酢酸を含むアセ
トニトリル０〜１　００　（ｐｉ１２．　　０）の直線
濃度勾配による高速液体クロマトグラフィー（こかけヒ
｝Ｍ−ＣＳＦｔｔ集めｉ詰乾燥しヒトＭ−ＣＳＦ３．２
ｍｇを得ｋ．精製ヒトＭ−ＣＳＦの比活性は１．４ｘ１
０＠単位／ｍｇ，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による純度は９６
％以上であった．得られたヒトＭ−Ｃ　Ｓ　Ｆの理化学
的性質は次の通りである． ａ）分子量 同一のサブユニットから成るホモ２ｆｆｉ体であって、
ドデシル硫酸ナトリウムボリアクリルアミドゲル電気泳
動で測定した分子量が７０，０００〜９０，０００ダル
トンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させた
サブユニットについてドデシル＠酸ナトリウムボリアク
リルアミドゲル電ス泳動て測定した分子量は３５，００
０−４３，０００ダルトンである． ｂ）サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２ｆｆｉ体を構成するサブユニット蛋白質は、次に
示す２１４内至２３８個のアミノ酸配列を有し、１２２
番目及び１４０番目のアスパラギンはそれぞれアスパラ
ギン（Ａｓｎ）−ｘ−スレオニン（Ｔｈｒ）／セリン（
Ｓｅｔ）で表される典型的なＮ−グリコシド結合部位を
有する．ここでＸは任意のアミノ酸を示す． Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｖａ　Ｉ　−Ｓｅｒ−Ｇ　ｌ　
ｕ−Ｔｙ　ｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−　Ｉｆ　ｉｓ−Ｍｅｔ
−　１　１ｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇ　ｌ　ｙ−１ｆ　ｉ
　ｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅａ−Ｇ　ｌ　ｎ
−Ａｒ３−Ｌｅｕ−　ｌ　Ｉｅ−　Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇ
　Ｉｎ−Ｍｅｔ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−
Ｇ　Ｉ　ｎ−　ｌ　１ｅ−Ｔｈｒ−　Ｐｈｅ−Ｇ　ｌ　
ｕ−Ｐｉｋｅ−Ｖａ　ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇ　Ｉｕ−
　Ｇｌ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ一＾ｓｐ−１’ｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ！ａ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−しｅｕ−Ｖａｔ−Ｇｌｎ−八ｓｐ−
１１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−八ｓｐ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａ
ｒ３−ｔ’ｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔ！＋ｒ−
Ｐｒｏ−＾ｓｎ−Ａｌａ−１１ｅ−＾ｌａ−ｌｌｅ−ｖ
ａＩ　−Ｇｌ　ｎ−Ｌｅｕ−ｃ　ｌ　ｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｓｅｒ−　１ｅｕ−Ａｒｇ−　Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓ
ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙ
ｒ−ＧＩｕ−ＧＩｕ−　Ｉｔ　ｉ　ｓ−Ａｓｐ−ｌ．ｙ
ｓ−＾ｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａ．Ｉ−＾ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−
＾ｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｂｅ一＾ｓｎ−ＧＩｕ−Ｔｂｒ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｎ−　ｌ　ｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−
Ａｓｐ−Ｔｒｐ−八ｓｎ−　ｆ　ｌｅ−Ｐｂｅ−Ｓｅｒ
−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−＾ｓｎ一八ｓｎ−Ｓｅｒ−
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｎ−＾ｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−ＴＩ＋ｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−＾ｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−１　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅ
ｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ
−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｉｆｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−ＡＩａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−八ｌａ−１’ｒｏ
−Ｖａｔ−＾１ａＧｌｙ−Ｌｅｕ−ＴＩ＋ｒ−Ｔｒｐ−
Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−ＧＩｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇ
Ｉｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌ　ｙ−ＧＩｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｉ
ｔｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ−＾１ａ−１−ｙｓ−Ｇｌｎ一人ｒｇ・Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ
−Ｐｈｅ−ＧＩｕ−Ｐｒｏ−Ｆ’ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点泳勤法で測定した等電点（ｐ＋）は
３．１〜３．７である．ｄ）円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部ＣＤスペクトルは波長２
　０　８　ｎ　ｍ及び２２２ｎｍにそれぞれ極小ピーク
がありα−へワックス構造を含んでいる。

ｅ）熱安定性 ６０±０．５℃で６０分間加熱しても生物活性は失なわ
れない． ｆ）赤外線吸収スペクトル 波数１６８０ｃｍ−’　　　１２００ｃｍ−’及び１１
３０ｃｍ−’　に強度吸収、波数１５４０ｃｍ−’１　
４　３　０　ｃ　ｍ−’および１０７０ｃｍ−’に中度
吸収を示す赤外線吸収スベクトラムを有する．この様な
物理化学的性質を示すヒトＭ−Ｃ　Ｓ　Ｆは通常、静脈
内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内などの１１−経口投
与に上り投与することができる．投与用の製剤としては
、注射剤、注入剤などが挙げられ、これら製削はそれ自
体公知の方法によってｉＩＩＩ製することができる．例
えば、ヒトＭ−ＣＳＦを適当な緩１！ｉ液に加えて、興
菌炉過し、ガラスバイアル中に無菌的に充填して密封し
、必要に応じて凍結乾燥して製剤を調製することができ
る． ヒトＭ−ＣＳＦはガラス、プラスチック、無菌炉過膜等
に吸着する性質有している．この吸着は界面活性剤、ヒ
ト血清アルブミン又はゼラチンζこより防ぐことができ
、これらと共に製剤化することによりその安定性も著し
く向上する．界面活性剤の製剤化時におけるａ度は０．
２μｇ　／　ｍ　１以上、ヒト血清アルプミン、ゼラチ
ンの濃度は、ｌｍｇ／ｍｌ以上が望ましい． ヒ｝　Ｍ−Ｃ　Ｓ　Ｆの骨ｆｌｉＪ％形成症候群に対す
る投与量は、患者の年齢症状によって変動し得るが、通
常０．４７ｚｇ−１６μｇ　／　ｋ　ｇ休重７日、通常
１．６７ｚｇ〜８μｇ／ｋｇ１本重７日である。

以上の方法で得られたヒ｝Ｍ−ＣＳＦを使用した本発明
の実ｍ例を次に示す。

実施例−１、骨ｌ！具形成症候群患者に対するヒトＭ−
ＣＳＦの治療効果 （１）本発明の骨髄異形成症候群治療剤（以下、本剤と
いう）の調製法 ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸緩衝液に、ヒトＭ一ＣＳＦ
及び表１に示す安定剤を添加し、ヒトＭ−ＣＳＦを濃度
１００μｇ／ｍｌにｉｌ！ｉ！！シた．ニトロセルロー
ス系無Ｍ炉過膜にて無菌炉過し、ガラスバイアル中に無
菌的にｌｍｌ充填する．凍結乾燥後密到し本剤を調製し
た． （２）本剤の安定性 木剤の安定性はＭ−ＣＳＦ活性をマウス骨髄細胞を用い
た軟寒天法にて測定した．その結果は表１に示す如く界
面活性剤であるツウイーン８０を濃度ｌＯμｇ／ｍ１以
上、ヒト血清アルブミン又はゼラチンを１　ｍ　ｇ　／
　ｍ　１以上の濃度で１１４ｕ＋，，た本剤の生物活性
は、４０℃３カ月保存後で試験間始時（Ｉ！造直後）の
７０％以上維持されており安定であった．（３）本剤の
骨Ｕ異形成症候ｎ患者に対する治療効果（１） 骨Ｕ異形成症候群患者に対する本剤の治療効果を末梢血
の骨髄芽球細胞数、正常白血球数、赤血球数の変動を測
定し検討した．４０才の骨髄異形成症候詳患者にヒト血
清アルブミン５ｍｇ／ｍｌを含む緩ｉ！ｊ液にて調製し
ｋ本剤を有効成分ヒ｝Ｍ−ＣＳＦとして１．６７１ｇ／
ｋｇ・体重７日にて連続１４日間点滴静脈内投与した．
投与後末梢血の芽球細胞数及び白血球を経時的に測定し
本剤の骨髄異形成症候群患者に対する治療効果を検討し
た． 図ｌに示す如く末梢血液中の芽球細胞数は本剤投与前が
１００／ｎｍ’であったが木剤投与後減少し、投与後１
０日目で約４０／ａｍ３となり、投与後３０日目でＩＯ
／ｆｆｉＩＩ１３となった．その後１００日目までの観
察；こおいても骨髄芽球細胞数は０／ｍ−であった．又
本剤投与後の末梢血中の正常白血球数及び好中球数は投
与前が７００／ｎｖ３及び５００／ｍｍ”となり白血球
減少状態であったが、投与後１０日目で７５０７調−３
及び５００／ａｍ’　，　３０日目テ９００ｌｌｌｌＩ
ｌｚ及び６００／ａｍ３＋　９　０日目１？　１８００
／１１１１３及び９００／ｇ＋ｍ’となりほぼ正常値ま
で回復した．図１において、横軸は日で表した期間を、
縦軸は末梢血ｉ夜中の芽球細胞数（●−●）、白血球数
（Ｏ−○）、好中球数（Δ一Δ）を表す．この結果から
本剤が骨髄異形戒症候群治療剤として有用であることが
明かとなった． 実施例−２　小児骨髄異形成症候群患者にたいするヒト
Ｍ−ＣＳＦの治療効果 実施例−１と同様にして得ｋ木剤を用い小児骨髄異形成
症候ｎ！！−．者に対する木剤の治療効果を検討した．
３才の骨ｆＩ１異形成症ｖｃ群患者に本剤を有効成分と
して２、４μｇ／ｋ　ｇ・体重／日にて９日間連続点滴
静脈内投与した．投与後末梢白血球数、好中球数、赤血
球数及び本剤投与前後における骨髄細胞中の芽球キ田胞
の比率を測定し木剤の治療効果を検討した． 図２に示す如く本剤投与前赤血球数＋８４ｘｌｏ’／ｍ
ｍ３，白血球数２０００／＋ｗｍ３及び好中球数１８０
／ｍ−であったが投与開始後５日目に赤血球数２０８ｘ
ｌＯ’／ｍｓ＋３，白血球数２０００／ｗ＋一及び顆粒
球数２９０／＋ａｍ’に増加し、投与開始後１０日目に
は赤血球数３０８ｘｌＯ’／ｍｎ’，白血球数３１００
／１３及び顆粒球数５３０／ａｍ３に増加した．また投
与開始前の骨髄細胞中の芽球縞胞が２３％であったのが
投与後においては７％と芽球細胞の割合が著しく減少し
た． 図２において、横軸は日で表した期間を、縦軸は末梢直
液中の白血球数（０−０）、好中球数（Δ一Δ），赤血
球数（ロー口）を表す．この結果から本剤が骨髄式形成
症候群治療剤として有用であることが明かとなった． 〔発明の効果〕 （１）難治性疾患である骨Ｉ！異形成症候群の芽球細胞
数を減少・消失させると共にその末梢血１α中に正常細
胞を増加させ、その疾患に有効な治療効果を有する薬剤
を提供し得る．

【図面の簡単な説明】

図１は本剤役与による骨髄異形成症候群患者の末棺血白
血球数、好中球数、及び骨髄芽球数の変化を示すグラフ
であり、図２は本剤投与による小児骨髄異形成症候ｎ患
者の末梢血赤血球数、白血球数，好中球数及び骨髄中芽
球細胞の割合を示すグラフである． 特　許　出　願　人　　森永乳業株式会社代　　　理　
　　人　　　工　藤　　力観察期間（日）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有
   効成分とする骨髄異形成症候群治療剤