JPH03162670A - 抗原又は抗体の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は．抗原又は抗体の定量法に関する。更に詳しく
は，本発明は抗原抗体反応混合物に光を照射して，光学
的強度を測定し抗原又は抗体を定量する方法に関する。

（従来の技術） 近年，医療分野にかいて．免疫の診断のため，検体中の
微量物質，特に抗体及び／又は抗原を迅速，簡便にしか
も精度よ〈定量することが非常に重要と麿ってきた。こ
のため抗体又は抗原などを不溶性担体粒子に支持（感作
）シ，これと抗原又は抗体を反応させて体液戒分中の抗
原又は抗体の存在を検査する．免疫血清学的検査が広く
利用されている。従来は．抗体又は抗原が支持（感作）
されたラテックス粒子（感作ラテックス）と検体とをガ
ラス板上で混合し，検体中の抗原又は抗体と抗原抗体反
応を起こさせ，この凝集状態を肉眼で観察することによ
り検体中の抗原又は抗体を半定量的に測定する方法がと
られていた。この方法を改善するものとして抗体又は抗
原を感作したラテックス粒子を使用し，ラテックスと検
体中の抗原又は抗体との反応凝集物を光学的に測定する
方法が提案されている（％公昭５８−１１５７５号公報
，特公昭６２−４３１３８号公報，特公昭６２−５５１
０３号公報等）。この方法により，最近では，専用の分
析装置を用いて抗原又は抗体を定量的に測定することも
行われるようになってきている。

（発明が解決しようとする課題） しかし上記の方法は．専用分析装置を用いるため高価と
なり，検体数の比較的少ない免疫血清検査室等で使用す
るには不向きであった。このため，一般の生化学分析装
置に適応できる試薬も最近研究されている。しかしなが
ら，生化学検査用に開発された自動分析装置への適応に
は種々の問題がある。例えば，通常の生化学項目と同時
に測定するため，セルや分注ノズル等からの試薬汚染（
キャリーオバ〉によって測定値が変動すること，光学的
．！気的ノイズ及び攪拌効率め影響を受けやすく測定精
度が悪くなること等の問題があった。

かくして．本発明の目的は，免疫ラテックス凝集法を利
用するが特殊な専用装置を必要とせずに安定かつ良好な
精度が得られる抗原又は抗体の定量法を提供することに
ある。

（ｌ！題を解決するための手段） すなわち本発明は，抗原又は抗体を含有する試料と不溶
性担体粒子に感作された該抗原又は抗体と免疫学的反応
を生じる抗体又は抗原を混合して光学的強度Ａ．を測定
し，次いで，凝集反応を促進する物質を添加し，免疫学
的反応による凝集をさせた後，光学的強度Ａ２を測定し
，この光学的強度Ａｚと光学的強度ＡＩの値から試料中
の抗原又は抗体を定量することを特徴とする抗原又は抗
体の定量法に関する。

本発明において．不溶性担体粒子としては，ポリスチレ
ン，スチレンープタジエン共重合体のような有機高分子
のラテックスやシリカ，アルミナのような無機酸化物等
が用いられる。その平均粒径は，０．０５〜０．５μｍ
の範囲が好ましい。担体の粒径が大きすぎると免疫学的
反応前の試薬自体の光学的強度が高すぎて測定が困難と
なりやすく，小さすぎると志度が低くなる傾向にある。

ｌた，これらの不溶性担体粒子の媒体としては，リン酸
緩衝液．グリシン緩衝液，トリス緩衝液，グッド緩衝液
等を使用するのが好ましい。

本発明に釦いて，不溶性担体粒子に支持（感作）する，
測定しようとする抗体と免疫学的反応を生じる抗原とし
ては，蛋白質，ポリペブチド，多糖類，脂質等があシ特
に制限はなく．測定しようとする抗原と免疫学的反応を
生じる抗体としては通常は免疫グロプリンが用いられる
が．場合によっては，そのＦａｂ断片，　Ｆａｂ′断片
，　Ｆ（ａｂ）”断片，Ｆｃ断片等を用いることもでき
る。これらを不溶性担体上に感作する方法としては，通
常行われているように，物理的に吸着させてもよいし，
化学的に結合させてもよいし，両者を併用してもよい。

感作された不溶性担体粒子は，免疫学的反応時まで媒体
分散液として保持されるが．その際は．媒体中に０．１
〜１．０重量蝿の濃度になるように分散してを〈のが保
存の面で好ましく，一般的に使用しやすい。１たこの媒
体中に適宜，牛血清アルプミン，ＮａＣｌ等を溶解させ
てもよい。

また，感作された不溶性担体粒子は，免疫学的反応時に
は，媒体中に適宜の濃度で分散され，使用されるが光学
的強度測定の容易さから濃度が０．５重量嘔以下になる
ようにして使用されるのが好１しく，感作量の点から０
．０１重量多以上が好１しい。この際には，必要に応じ
て牛血清アルプミン，　ＮａＣｌ等を溶解した液（希釈
液）を液量調整のために使用してもよい。

本発明において免疫学的反応（凝集反応）の反応性を調
節するため．反応を抑制する物質や反応を促進する物質
が使用される。使用される凝集反応を抑制する物質とし
ては，トリアルキルアミン．その塩類，第４級アンモニ
ウム塩及び糖類等が使用できる。トリアルキルアミンと
してはトリエチルアミン等，トリアルキルアミンの塩類
としてはトリエチルアミンの塩酸塩等，第４級アンモニ
ウム塩としては塩化コリン，臭化コリン，塩化アセチル
コリン，臭化アセチルコリン，塩酸ペタイン等，糖類と
してはシヨ糖等がある。これらの化合物は一種又は二種
以上使用される。

凝集反応を抑制する物質は上記の不溶性担体粒子の分散
液中に溶解させるか又は，分散液の液量調整用の希釈液
中に溶解し使用時に分散液と混合して用いるのが好筐し
い。ここで，検体試料と．不活性担体粒子の分散液の混
合の際に．凝集反応を抑制する物質を加えないと，光学
的強度ＡＩを測定する時に反応がほとんど逆行してし筐
い，精度のよい測定を行うことが困難となる場合がある
。

なお，感作した抗原又は抗体と試料中の抗体又は抗原と
の反応性が低い場合には，このような凝集反応を抑制す
る物質を入れることなく測定を行うことができる。

本発明で必須成分として使用される凝集反応を促進する
物質としては．ポリエチレングリコール等があげられ，
ポリエチレ／グリコールの平均分子量としては１，００
０以上のものが好筐しい。分子量が大きくなると凝集反
応の促進効果が大きくなるが，小さすぎると効果が小さ
い。凝集反応を促進する物質は最終反応液中の濃度で０
．１〜５．０重量多の範囲で存在させるのが好１しい。

凝集反応を促進する物質の濃度が高くなシすぎると感作
された不溶性担体の非特異的な凝集が起こシやすくなり
．少なすぎると反応促進の効果が小さい。

凝集反応を促進する物質は，不溶性担体粒子と同様に，
リン酸緩衝液．グリシン緩衝液，トリス緩衝液，グッド
緩衝液等の媒体に分散させて使用するのが好１しい。筐
た，この媒体中に適宜，牛血清アルフミン，　ＮａＣｌ
等を溶解させてもよい。このように凝集反応を促進する
物質を含有する溶液を，以下反応開始液と呼ぶ。

次に，実際の本発明の定量の方法について詳述する。１
ず，検体試料と感作された不溶性担体粒子の媒体分散液
，さらに必要に応じて凝集反応を抑制する物質を反応容
器に加えて混合攪拌し，混合後５秒〜１５分間インキユ
ペーションした後．光学的強度ＡＩを測定する。この段
階ではほとんど抗原一抗体反応は進行しない。次に上記
の凝集反応を促進する物質の入った反応開始液を混合攪
拌して反応を促進し，混合後５秒〜１５分間インキユベ
ーションした後光学的強度Ａ１を測定する。

このような方法で測定することによシ，定量の精度が大
幅に向上する。この反応は２０〜４０℃で行うのが好壕
しく，反応は恒温にするのが好プしい。

反応時の温度がこの範囲を外れると抗原一抗体反応が不
安定になりやすい。更に，この反応はそれそれ混合後５
秒〜１５分間行われるのが好１しいが，特に１０秒〜５
分間行われるのが好１しい。

５秒未満では上記反応が不十分となジやすく，１５分を
越えると迅速測定に不向きとなる。

ここで，本発明でいう光学的強度とは，吸光度又は散乱
光強度を意味する。測定波長は，４００〜１　２　０　
０　ｎｍの範囲から適宜選択されるのが好筐しい。測定
波長が１　２　０　０　ｎｍを越えると，感度が低下す
る傾向にあシ，測定波長が４　０　０　ｎｍ以下では媒
体分散液自体の光学的強度が大きくなり，測定範囲が狭
くなる。筐た，感度の面から，散乱光強度より，吸光度
を測定する方法が好１しい。

次に，測定した光学的強度から，不溶性担体粒子の媒体
分散液に起因する光学的強度を差し引く補正をするため
に，前記の検体試料の代わりに精製水，緩衝液又は生理
食塩水を用いて同様に操作して求めた，光学的強度Ａ．
及びＡ，に対応した測定値八１′及びん′を求める。

検体試料を用いて測定した光学的強度Ａ１及びＡ２と不
溶性担体粒子の媒体分散液に起因する光学的強度ＡＩ’
及びＡ２’から算出光学的強度ＡＸを式（１）Ａｘ＝Ａ
ｚ　　Ａ＋　　（Ａ２’　　Ａａ′）−−−（１）によ
って光学的強度の差の値を算出する。

一方，検体試料として，既知濃度の試料（既欠ｉＣｓの
抗原又は抗体を含む試料）を用い，前記と同様にして算
出光学的強度Ａｓを求め，これを例えば下式（２）に当
てはめることにより，検体試料中の未知量の抗原又は抗
体のｉｔ（Ｃｘ）を求めることができる。

Ｃｘ＝ＡＸｘＣｓ／Ａｓ　　　　　　　山…・・・（２
）（但し，式中，　ＡＸぱ未知量の抗原又は抗体を含む
試料の算出光学的強度＋　ＣＳは既知量の抗原又は抗体
を含む試料の抗原又は抗体の量及びＡ，はその詞料の算
出光学的強度である。） 以上のようにして求めたＣ．は，凝集反応を促進する物
質の添加によシ抗原一抗体反応を行った時の光学的強度
んから検体の濁りゃ蕉作された担体粒子の分注誤差等に
由来する光学的強度Ａ．を差し引いた値ＡＸを用して求
めてあるため，従来の方法に比較して測定精度が高い。

特に本発明の方法は？濃度領域の測定値の信頼性に優れ
ている。

壕た．低濃度から高濃度１で広い領域で信頼性のある測
定値を算出するために，次のように測定し，計算するこ
とも可能である。

前記光学的強度ＡＩの測定を１度筐たは２度行う（２度
行った場合，各々の光学的強度をＡ１２　，　ＡＨとす
る冫。光学的強度Ａ２は前記と同様に測定する。

さらに，前記と同様に，検体試料のかわりに精製水，緩
衝液又は生理食塩水を用いてＡＩ’　（又は，Ａ１，′
及びＡＩ２’　）並びに４’を測定し，ＡＩの測定回数
に応じて，次の式（３）及び（４）によって２つの光学
的強度を算出する。

ｈｌを１度のみ測定した場合は， Ａ　＝　Ａｔ　　Ａｔ　　（　Ａｔ’　　ＡＩ’　）　
　　・・・・・・・・・（３）Ｂ　＝　Ａ．　−　Ａ．
’　　　　　　　　　・・・・・・・・・（４）Ａ＋を
２度測定した場合（人、ｌ及びＡＨ　２を測定した場合
）は， Ａ　＝　Ａｔ　　Ａｔｚ　　（　Ａｔ’　　Ａｔ■′）
　・・・・・・・・・（３）Ｂ　＝　Ａｔｔ　　Ａｎ’
　　　　　　　　　・・・−−（４）一方，検体試料と
して，既知濃度の試料（既知量Ｃｓの抗原又は抗体を含
む試料）を用い前記と同様にして算出光学的強度Ａ８及
びＢ３を求め，これを各々下式（５）及び（６）に当て
はめることによシ，検体試料中の未知量の抗原又は抗体
（Ｃｔ，Ｃｚ）を求めることができる。

Ｃｌ＝　Ａ　Ｘ　Ｃｓ　／　Ａｓ　　　　　　　−＋・
・・＋・（ｓｌＣ２　＝　Ｂ　Ｘ　Ｃｓ　／　Ｂｓ　　
　　　　　−−−（６）（但し，式中，Ａ及びＢは未知
量の抗原又は抗体を含む試料の算出光学的強度．　Ｃｓ
は既知量の抗原又は抗体を含む試料の抗原又は抗体の量
並びにＡ８及びＢｓはその試料の算出光学的強度である
。）以上のようにして求めた２つの濃度のうち，Ｃ１は
前述のＣｘと同じであり，測定精度が良く，％に低濃度
領域の測定値の信頼性に優れている。しかし＋　ＣＩは
感度がよいため測定範囲が狭くなる傾向にある。一方＋
　Ｃ２は抗原一抗体反応の起こシにくい条件で測定した
光学的強度ＡＩから求めた抗原又は抗体量なので，低濃
度領域の測定値の信頼性は乏しいが，測定範囲が広く高
濃度領域の測定値の信頼性に優れている。従って，定量
にシいて．低濃度の場合は，Ｃ！のデータを使用し，高
濃度の場合はＣ，のデータを使用することによって，よ
ｂ信頼性の高いデータを定量値とすることができる。こ
のように，一つの試薬で二つの測定値を算出することに
より，低濃度から高濃度１での広い領域で信頼性のある
測定値を算出することが可能となう，さらにこの２つの
データを比較することにより地帯現象をチェックするこ
とも可能である。

なか，以上の測定方法にかいて，既知濃度の試料を多種
類の濃度で調整して前記と同様に測定し，その値から検
量線を作成して会き，この検量線を用いて検体試料の定
量をすることもできる。

さらに，本発明では，よｂ精度を上げるために，光学的
強度を前述の方法で同時に２波長の光で測定して求め，
その２波長間の光学的強度の差から，検体試料中の未知
量の抗原又は抗体の量を求めることもできる。

（実施例） 次に，実施例によって，本発明を詳細に説明する。以下
，％は重量悌を意味する。

実施例１ １）試薬の調製 ａ）ラテックス試薬 ０．１　５Ｍ　　ＮａＣｌ．　　１．０％牛血清アルプ
ミンＥび１．５多塩化コリンを含有する０．０５Ｍリン
酸趙衝液（ｐＨ６．５０）を調製し，ラテックスの分距
溶媒液とする。この溶液に，抗ヒトα−７エトフロテイ
ン（以下ＡＦＰと略す）抗体を感作した叶均粒径約０．
２６μｍの診断薬用ポリステレン系ラテックス粒子をラ
テックス濃度０．０５％となるように分散させ，ラテッ
クス試薬を調製した。

ｂ）反応開始液 ０．　１　５　Ｍ　　ＮａＣｌ及び１．０簀牛血清アル
ブミンを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５
０）にポリエチレングリコール（平均分子量７５００を
３．０％溶解し，反応開始液とした。

２）測定方法 反応キュペットに試料ｌ４μｌ及びラテツク２試液２５
０μｌを加え，混合攪拌後，３７℃でξ分間加温した後
，波長５７０ｎｍＶＣｋける吸光膣（Ａｌ）を求める。

次に，反応開始液２５０μｌを添加攪拌後，３７℃で５
分間保持した後，波長５　７　０　ｎｍにかける吸光度
（Ａ２）を求める。求めた吸光度の差から，式（Ａｘ　
　Ａ＋Ｘ２　６　４／５　１　４　）（２６４／５１４
は反応開始液添加前後の容量差を補生ずる為の係数，係
数＝（検体量＋ラテックス試液量）／全体量〕によって
求めた値をその試料の吸光度とする。

３）実測結果 検体試料として生理食塩水及び既知濃度のＡＦＰ含有血
清（１０，４０，１００，２００ｎｇ／ｎ！！）を用い
て前記測定方法によう測定した。生理食塩水を用いたと
きの測定値を試薬フランクとして各試料の測定値からマ
イナスして検量線を作成した。第１図のように良好な検
量線が得られた。

１た，同様の検体を用いて反応の時間変化（タイムコー
ス）を求めた結果．第２図のように検体とラテックス試
液を混合しただけでは．ほとんど反応が進行せず，反応
開始液の添加により反応が促進されることが確認できた
。

実施例２ 実施例ｌと同様の試薬を用い，同様に操作し同時再現性
を検討した。試料として生理食塩水を用いたときの上記
吸光度差をＡＢとし，ＡＦＰ濃度１　０　０　ｎｇ／ｒ
ｎｌの試料を用いたときの吸光度差をＡ８とした。ＡＦ
Ｐ濃度未知の試料を同様の操作で１０回繰ｂ返し吸光度
を測定し求めた吸光度差Ａｘを下左に当てはめ濃度Ｃｘ
を算出して同時再現性をみた。一方，従来行われている
測定法．すなわち，ラテックス試薬と反応開始液の添加
順序を逆にした以外は同様に測定した場合の同時再現性
をとり本発明の方法と比較した。結果を表１に示す。

Ｃｘ＝　（ＡＸ　　ＡＢ）　Ｘ　１　０　０　／　（Ａ
ｓ−Ａｓ　）表１のように本発明の測定方法による同時
再現性は通常の測定方法に比較し変動係数（　Ｃ．Ｖ．
　）で約３倍良かった。

実施例３ ｌ） 試薬の調製 ａ） ラテックス試薬 ０．１　　５Ｍ Ｎタｒｌ び５．　０　Ｍ塩化コリンを含有する０．　０　５　Ｍ
　’Ｊン酸緩衝液（　ｐＨ　６．５　０　）を調製し，
ラテックスの分散溶媒液とする。この溶液に，抗Ｃ反応
性蛋白（以下ＣＲＰと略す）抗体を感作した平均粒径約
０．１μｍの診断薬用ポリスチレン系ラテックス粒子を
ラテックス濃度ｏ．　ｏ　ｓ　ｓとなるように分散させ
，ラテックス試薬を調製した。

ｂ）反応開始液 ０．　１　５　Ｍ　　ＮａＣｌ及び１．０％牛血清アル
ブミンを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５
０）にポリエチレングリコール（平均分子量７５００）
を３．　Ｏ　％溶解し，反応開始液とした。

２）測定方法 反応キュペットに試料３μｌ及びラテックス試液２５０
μｌを加え，混合攪拌後，３７℃で４分３０秒間加温し
た後．波長５７０ｎｍＫ釦ける吸光度（Ａｌｔ）を求め
引き続き，５分後の吸光度（Ａｔｚ）を求める。次に．
反応開始液２５０μｅを添加攪拌後，３７℃で５分間保
持した後，波長５７０ｎｍに釦ける吸光度（Ａ２）を求
める。求めた吸光度（Ａ１２）をその試料の第１反応の
吸光度とし，吸光度の差（Ａｘ　　Ａ＋２Ｘ２５３／５
０３）（２５３／５０３は反応開始液添加前後の容量差
を補正する為の係数．係数＝（検体量＋ラテックス試液
ｔ）／全体量〕をその試料の第２反応の吸光度とする。

３）実測結果 試料として生理食塩水及び既知濃度のＣＲＰ含有血清（
３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７．３
０ｍｇ／ｄ（）の１０系列を用いて前記測定方法により
測定した。生理食塩水を用いたときの測定値を試薬ブラ
ンクとして各試料の測定値からマイナスして検量線を作
成した。第３図のように第ｌ反応による測定値は高値域
筐での直線性を示し，第２反応による測定値は低値域で
良好な検量線が得られた。

１た，同様の試薬を用い．同様に操作し同時再現性を検
討した。試料として生理食塩水を用いたときの第１反応
の吸光度ＡＩＢ及び第２反応の吸光度差をＡ２Ｂとし，
ＣＲ，Ｐ濃度５．０■／ｄ！．の試料を用いたときの第
１反応の吸光度Ａ　ｓ　ｓ及び第２反応の吸光度差をｋ
２ｓとし求めた。ＣＲ，Ｐ濃度未知の試料を２０回繰り
返し測定し求めた第１反応の吸光度ＡＩＸ及び第２反応
の吸光度差Ａ２Ｘを下式に当てはめ第１反応によるＣＲ
Ｐ濃度Ｃｌｘ及び第２反応によるＣＲＰ濃度Ｃ２Ｘを算
出して同時再現性をみた。

Ｃｌｘ＝（Ａｔｘ　　ＡＩＢ）Ｘ５．Ｏ／　（Ａ１ｓ　
　ＡＩＢ）　　−（５）Ｃ２Ｘ＝（Ａ２Ｘ−Ａ２ｎ）Ｘ
５．Ｏ／（Ａｚｓ−Ａ２Ｂ）　　・・・（６）表２のよ
うに第１反応による測定値に比し第２反応による測定値
は低値域での再現性が優れていることがわかる。

な釦，本実施例における測定は，全て日立自動分析装置
７１５０形（■日立製作所製）を用いた。

本装置では分析プログラムにより上記演算を自動的に行
−，測定結果を算出することができる。

（発明の効果） 以上のように，本発明の定量法によれば，％殊な専用装
置を必要とせずに，安定かつ良好な精度の抗原又は抗体
の定量を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は，本発明の実施例１の測定結果である吸光度と
ＡＦＰ濃度の関係を示すグラフであり，第２図は，本発
明の実施例１の測定結果である吸光度と反応時間の関係
を示すグラフであう，第３図は，本発明の実施例３の測
定結果である吸光度とＣＲＰ濃度の関係を示すグラフで
ある。 第 １ 図 ｔ応開始液の添加 第 ２ 図 第 ３ 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗原又は抗体を含有する試料と、不溶性担体粒子に
   感作された該抗原又は抗体と免疫学的反応を生じる抗体
   又は抗原を混合して光学的強度Ａ＿１を測定し、次いで
   、凝集反応を促進する物質を添加し、免疫学的反応によ
   る凝集をさせた後、光学的強度Ａ＿２を測定し、この光
   学的強度Ａ＿２と光学的強度Ａ＿１の値から試料中の抗
   原又は抗体を定量することを特徴とする抗原又は抗体の
   定量法。 ２、光学的強度Ａ＿２と光学的強度Ａ＿１の差から試料
   中の抗原又は抗体を定量する請求項１記載の抗原又は抗
   体の定量法。 ３、光学的強度Ａ＿２と光学的強度Ａ＿１の差、及び、
   光学的強度Ａ＿１の各々の値から各々試料中の抗原又は
   抗体を定量し、より信頼性の高い値を選択して定量値と
   する請求項１記載の抗原又は抗体の定量法。 ４、光学的強度Ａ＿１を、Ａ＿１＿１とＡ＿１＿２の２
   回測定し、光学的強度Ａ＿２と光学的強度Ａ＿１＿２の
   差及び、光学的強度Ａ＿１＿１の各々の値から試料中の
   抗原又は抗体を定量し、より信頼性の高い値を選択して
   定量値とする請求項１記載の抗原又は抗体の定量法。 ５、抗原又は抗体を含有する試料と不溶性担体粒子に感
   作された該抗原又は抗体と免疫学的反応を生じる抗体又
   は抗原を混合するに際し、凝集反応を抑制する物質を一
   緒に混合する請求項１、２、３又は４記載の抗原又は抗
   体の定量法。 ６、光学的強度が吸光度である請求項１、２、３、４又
   は５記載の抗原又は抗体の定量法。