JPH03156371A - 免疫的に活性な物質の測定方法および測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の属する技術分野〕 本発明は、微粒子を用い検体中の抗原、抗体などの免疫
的に活性な物質の測定法および測定装置に関する。さら
に詳しくは、本発明は、免疫的に活性な物質を担持した
固体微粒子を用い、抗原−抗体反応により生ずる凝集の
度合を光学的に測定する方法および装置に関する。

〔従来技術の説明〕

免疫的に活性な物質、例えば抗体を担持したポリスチレ
ン等の微粒子を水などの液体媒体中に分散させた分散液
（ラテックス試薬ンに、上記の免疫的に活性な物質に対
し選択的に反応性を有する物質（例えば抗原）を作用さ
せることにより起こる凝集を観察することにより測定を
行うラテックス凝集イムノアッセイ法（ＬＡＩＡ）がジ
ェー・エム・シンガーら（Ｊ、　Ｍ、　Ｓｉｎｇｅｒ　
ｅｔ　ａｌ）により見い出され（Ａｍ、Ｊ、　Ｍｅｄ、
、２１　８８８（１９５６）参照】、その後、様々な検
討がなされている。その中でも凝集の度合を視覚により
判定する方法が、定置的な測定は困難だが、簡便でかつ
結果が短時間に得られるという利点があることから実用
上広く普及している。

近年になって、凝集の度合を光学的に測定する試みがな
され、ニー・フェーチェアら（Ａ。

Ｆａｔｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ　）は、凝集反応に伴う濁度
の変化を光学的に測定、動力学的解析から定量分析を行
う方法を１）１案している（Ａ、　Ｆａｔｕｒｅ　ｅｔ
、ａｌ、；Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　Ｂｉｏｌ　Ｆｌｕｉｄｓ
＋Ｐｒｏｃ、Ｃｏ１）ｏｑ、＋　２０ｒ５８９　（１９
７２））、Ｌかし、後述するように、ラテックス試薬そ
のものの不安定さから測定値の変動が大きく、又、測定
感度上も十分なものとはいえない、すなわち、ラテック
ス試薬は液体分散媒中に固体微粒子が分散している状態
のものであり、本質的に不安定な系であるため、長期間
の貯蔵により凝集を起こしたり、感度が低下したりしや
すく、又、凍結することで分散状態が破壊されるため保
存に特段の配慮を要するなど問題を有している。

これに対して分散媒である液体を除去乾燥させることに
よってラテックス試薬の安定性を改善する方法が提案さ
れている（特開昭５２１）７４２０号公報、特開昭６２
−４６２６２号公報）。

しかしながら、ラテックス試薬については、乾燥化する
ことで保存安定性は向上させることができるものの、再
分散して得られたラテックス試薬の凝集反応性の変動が
大きく、その結果測定データがしばしば変動するという
問題がある。

従って、従来技術においてはスライド上での目視による
陰性もしくは陽性の判定など定性的な測定に用いること
ができるが、高精度の定量には不通である。

又、ラテックス試薬などの凝集免疫試薬を毛細管に注入
・凍結乾燥させた毛細管中で検体と混合させることによ
って反応させ、凝集状態を観察することにより検体中の
免疫的に活性な物質を検出する方法が提案されている（
特開昭５８７３８６６号公報）、この方法は前述の提案
と同様に試薬の保存安定性が良好であり、さらに簡便な
検査法として魅力あるものではあるが、測定値の再現性
がよくなく、正確な定置ができないという問題点がある
。

〔発明の目的〕

本発明は、上述の従来技術における問題点を解決して、
測定値の再現性に優れ、正確な定量を可能にする免疫的
測定方法および測定装置を提供することにある。

〔発明の構成・効果〕

本発明者らは、乾燥試薬を用いる従来の測定法における
問題点について検討したところ、従来法における測定値
の変動の原因が、再分散状態のバラツキによるものであ
るとともに、再分散のための撹拌が長時間に亘り、ある
いは撹拌強度が強過ぎることにより、固体微粒子と免疫
的に活性な物質との結合が破壊されることによるとみら
れる測定感度の低下にあることを明らかした。さらに本
発明者らはこれらの現象をもとに、鋭意検討した結果、
乾燥試薬の再分散時、分散状態を光学的に測定しながら
撹拌し、好適な分散状態に到達した時点で、次の反応工
程に進むことが、高感度で安定な測定を行うために極め
て大きな効果をもたらすことが判明した。

本発明は、以上の判明した事実に基づいて更なる検討の
結果完成に至ったものであり、下述する測定方法および
該測定方法を実施するに適した装置を包含する。

本発明の測定方法は下述する内容のものである。

すなわち、固体微粒子の表面に、検体中の被測定物質に
対し免疫的に活性な物質を化学的に結合させ、この結合
された免疫的に活性な物質に検体を液体媒体中で反応さ
せることにより生ずる反応混合物の凝集の度合を光学的
に測定する方法において、 （ｉ）表面に、検体中の被測定物質に対し免疫的に活性
な物質を化学的に結合せしめ乾燥させた固体微粒子（以
下乾燥試薬微粒子）を含む測定セル中に、分散媒および
検体を添加する工程、（ｉｉ　）上記測定セル中の分散
媒と乾燥試薬微粒子および検体を撹拌し、上記乾燥試薬
微粒子の分散媒体中での分散状態を光学的に測定する工
程、（ｉｉｉ　）上記工程（−１）で得られる光学的な
測定データから分散媒中での乾燥試薬微粒子の分散状態
を測定し、あらかじめ設定した分散状態に到達した時点
で、上記工程（ｉｉ　）の撹拌を停止する工程、 （ｉｖ　）上記工程（ｉｉｉ　）において設定した分散
状態に到達した検体を含む分散体を反応させて凝集状態
を生ぜしめる工程、 （ｖ）上記工程（ｉｖ）で生じた反応混合物の凝集状態
を光学的に測定する工程、 を含むことを特徴とする測定方法。

上述の測定方法を実施するに適した本発明の装置は、下
述する内容のものである。すなわち、固体微粒子の表面
に、検体中の被測定物質に対し免疫的に活性な物質を化
学的に結合させ、この結合された免疫的に活性な物質に
検体を液体媒体中で反応させることにより生ずる測定セ
ル中の反応混合物の凝集の度合を光学的に測定する装置
において、 （ｉ）前記測定セルを固定する手段、 （ｉｉ　）上記測定セル中に分散媒を注入する手段、（
ｉｉ　）上記測定セル中に検体を注入する手段、（ｉｖ
）上記測定セルの内容物を撹拌する手段、（ｖ）上記測
定セル中の内容物の凝集の度合を光学的に測定する手段
、 （ｖｉ）撹拌された測定セル中の、乾燥試薬微粒子、分
散媒および検体混合物の光学的測定データから該乾燥試
薬微粒子の分散媒への分散状態を判定し、攪拌のｗＩ続
・停止を制御する手段を有することを特徴とする測定装
置である。

以下、本発明について具体的に説明する。

本発明に用いられる固体微粒子には、生物に由来する微
粒子、無機系微粒子、有機系微粒子を挙げることができ
る。前記生物に由来する微粒子としては、例えば、赤血
球分散処理されたブドウ球菌、連鎖球菌等の細菌類等が
挙げられる。前記無機系微粒子としては、例えば、シリ
カ、アルミナ、ベントナイト等が挙げられる。また前記
有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル
、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル
類、メタクリル酸エステル類などのビニル糸上ツマ−の
単一重合体および／又は共重合体、スチレン−ブタジェ
ン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジェン共重合
体などのブタジェン系共重合体などの微粒子が挙げられ
る。上述の微粒子の粒子径は、生物に由来する微粒子、
無機系微粒子、有機系微粒子のいずれの場合にあっても
０．０５μｍ乃至５μｍが好ましく、０．１μｍ乃至２
μｍが特に好ましい０粒子径が０．０５μｍを下田ると
乾燥試薬の分散が困難になり、又ｌＯμｍを上層ると分
散！ＩＩ′薬の安定性が不良になる。

固体微粒子の表面に結合させる免疫的に活性な物質とし
ては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥなどの免疫グロブリン：
補体、ＣＲＰ、フェリチン、α１マイクログロブリン、
β８マイクログロブリンなど血漿蛋白およびそれらの抗
体：α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）　
、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）　、ＣＡＩ　
９−９、ＣＡ−１２５などの腫瘍マーカおよびそれらの
抗体：黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（Ｆ
　Ｓ　Ｈ）、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、エ
ストロゲン、インスリンなどのホルモン類およびそれら
の抗体：　ＨＢＶ関連抗原（ＨＢ０、ＨＢｅ。

ＨＢｃ）、ＨＩＶ、ＡＴＬなどウィルス感染関連物質お
よびそれらの抗体ニジフチリア菌、ボツリヌス菌、マイ
コプラズマ、梅毒トレポネーマなどのバクテリア類およ
びそれらの抗体：トキソプラズマ、トリコモナス・リー
シュマニア、トリパノゾーマ、マラリア原虫などの原虫
類およびそれらの抗体：フェニトイン、フェノバルビタ
ールなどの抗てんかん薬、キニジン、ジゴキシニンなど
の心血膏薬、テオフィリンなどの抗喘息薬、クロラムフ
ェニコール、ゲンタマイシンなどの抗生物質などの薬物
類およびそれらの抗体：その他酵素、菌体外毒素（スト
レリジンＯなど）およびそれらの抗体などがあり、検体
中の被測定物質と抗原−抗体反応を起こす物質が検体の
種類に応じて適宜選択されて使用される。

これらの免疫的に活性な物質の中でも、特にｈＣＧ抗体
、ＣＲＰ抗体、β、−マイクログロブリン抗体もしくは
α−フェトプロテインが好ましい。

固体微粒子への免疫的に活性な物質の固定化方法として
は、物理吸着と化学結合があるが、本発明においては化
学結合が好ましい、すなわち、本発明では分散媒中に免
疫的に活性な物質を担持させた乾燥固体微粒子と凝集因
子である検体を同時に強い撹拌により分散させるために
結合力の物理吸着による固定化法では固体微粒子から免
疫活性物質が遊離する場合があることによる。化学結合
による固定化方法については、免疫的に活性な物質は、
その構成成分として蛋白質部分を含んでいることから、
該蛋白質を担体に化学結合させる公知の方法により行う
ことができる（固定化酵素、講談社（１９７５）、千畑
一部編参照）、また、アミノ基やカルボキシル基が官能
基として存在する固体微粒子に対しては、カルボジイミ
ドを縮合剤に使用して免疫的に活性な物質を固定化する
ことができる（特公昭５３−１２９６６号公報又は特開
昭５３−５２６２０号公報参照）。

更に１．カルバモイル基やアミノ基を有するラテックス
粒子に対しては、グルタルアルデヒドなどのポリアルデ
ヒドを使用して免疫的に活性な物質をそれに共有結合を
介して固定化することができる。更にまた、ヒドロキシ
ル基を有する固体微粒子に封しては、臭化シアンを使用
して免疫的に活性な物質をそれに共有結合を介して固定
化することができる。また、エポキシ基やアルデヒド基
を有する固体微粒子に対しては、免疫的に活性な物質を
直接それと反応せしめ共有結合を介して固定化すること
ができる。

免疫的に活性な物質を微粒子に固定化せしめるについて
の上述の結合反応については、いずれの場合にあっても
、水又は水およびアルコール類、ケトン類などの水と相
溶性のある有機溶媒との混合溶媒中で行うことが好まし
い、また、反応系中には微粒子の安定化、非特異凝集の
生起を防止する等の目的でリン酸塩緩衝液−生理食塩水
、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌｌ街液などの緩衝液、牛血清アル
ブミンなどの不活性蛋白質、界面活性剤などを添加する
ことが好ましい、上述の結合反応の際の反応溶液のｐ　
Ｈは通常６〜１０、好ましくは７〜９である。また該反
応溶液中の微粒子の濃度は通常０、Ｏ１〜２．０（重量
）％である。

乾燥免疫試薬は上記免疫的に活性な物質を結合させた微
粒子の分散体に用いられている分散媒を除去することに
より得られる。

分散媒の除去は６０℃以下、好ましくは３０℃以下で行
うのが免疫的に活性な物質の活性度を維持する上で有利
である０分散媒除去についての特に好ましい態様におい
ては、凍結乾燥による除去であり、その場合試薬の感度
は定常的に高く維持される。測定セル中に乾燥免疫試薬
を導入するについては、測定セル中に所定量の免疫的に
活性な物質を結合させた微粒子の分散体を入れ、上述の
乾燥を行って分散媒を除去してもよいし、又は、あらか
じめ分散媒を除去した乾燥免疫試薬の所定量を測定セル
中に入れるようにしてもよい。

測定セルとしては、透明なガラス又はプラスチック（例
えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ
塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホンなど）を
材質とするものなどが用いられる。

測定セル中の乾燥免疫試薬を分散する分散媒は水又は水
およびアルコール類、ケトン類などの水と相溶性のある
有機溶媒との混合溶媒が使用される。また分散媒には適
宜ｐＨｌ１街剤、蛋白質、界面活性剤、水溶性高分子化
合物などが添加される。

ｐＨ１）街剤は、抗原−抗体反応は一般に溶媒のｐ）（
の影響を受けやすいため、最適のｐｔ−ｔに調節するた
めに添加され、例えば、リン酸塩やＴｒｉｓＨＣＪ緩衝
剖などが使用される。蛋白質は、非特異反応を防止する
目的で添加され、例えば、牛血清アルブミン、ゼラチン
などが使用される。

界面活性剤、水溶性高分子化合物は、乾燥免疫試薬の分
散助削として有効であり、例えば、トゥイーン２０など
の非イオン界面活性剤やアニオン系界面活性側、ポリビ
ニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸
塩、ヒドロキシエチルセルロースなどが用いられる。し
かし、これらの添加物は抗原−抗体による凝集反応を阻
害しない範囲で使用される。

また、上記分散媒により乾燥免疫試薬は測定対象によっ
て適宜、希釈調整される。その固形分濃度は使用する測
定セルの種類またサイズにより異なるが、−船釣には、
好ましくは０．０１〜５％、より好ましくは０．０５〜
２％の範囲で調整される。

検体、分散媒および乾燥免疫試薬を撹拌処理するには、
検体および乾燥免疫試薬を含む測定セルに所定量の分散
媒を注入し、撹拌具を挿入・攪拌する方法、測定セルを
振盪する方法などを適宜選択できる。

なかでも微粒子の分散で最も効果的である超音波撹拌に
よる攪拌処理が好ましい、超音波撹拌に使用する超音波
については、測定セルの種類またサイズにより異なるが
、−船釣には振動周波数として１５ｋＨｚ７に＋至５０
ｋＨｚの超音波が用いられる。

上記分散工程において、分散媒体中への免疫試薬の分散
の度合は光学的測定手段を用いて測定され、その光学的
測定手段としては、例えば透過光強度を測定する方法、
散乱光強度を測定する方法、透過光と散乱光強度を組合
わせて測定する方法が適宜使用される。

例えば、透過光強度で分散の度合を測定した場合、第２
図の模式図に示すように、分散が進むに従って測定セル
を透過する光量が減少し、均一に分散状態でほぼ一定に
なる。

又、好ましい分散状態の判定方法は、後述する実験例の
結果から導き出されたものであり、該判定方法は、あら
かじめ測定した分散媒体中での乾燥試薬微粒子の完全分
散体を含む測定セル中を単色光が通過するときの入射光
の強さを■。、透過光および／又は散乱光の強さを１と
し、Ｊｏｇｌ。

／　Ｉ　＝　Ａ　＊で示される指数Ａ、に対し、上記工
程（ｉｉ）で得られた乾燥試薬微粒子分散体を含む測定
セル中を、上記単色光が通過するときの入射光の強さを
！０、透過光および／又は散乱光の強さを１としｊｏｇ
ｆ＊／Ｉ−Ａで示される指数Ａが次の範囲であることを
確認することにより行う方法である。但し、Ａ／Ａ、≦
１．１ 次の実験例をもとに上記分散判定方法について詳細に説
明する。

スＪＬＬＬ 後述する実施例１と同様の方法により得られたＣＲＰ感
作ラテックスの一部を１％牛血清アルブミン、５％シ！
ＩＩ！を添加したｐ　Ｈ７，２のリン酸緩衝液−生理食
塩水（以下ＰＢＳ）により、試薬固形分濃度０．２％に
調整後、ガラス製光学セル（光路長２ｍｍ）にとり、上
記方法により指数Ａ、を求めたところ１．０２であった
（測定波長６３３ｎｍ）ａ又、同じく後述する実施例１
と同様の方法により得られたＣＲＰ検出用乾燥試薬微粒
子にＰＢＳを添加、試薬固形分濃度０．２％濃度に調整
後、ＣＲＰＩ準血清（２ｍｇ／ｄｊ）を加え、超音波撹
拌を行い上記方法により指数Ａを求めた。又、撹拌停止
後、後述するレート方式によりＣＲＰの濃度測定を行っ
た。結果を表４及び第４図に示す。

大腋舊ｌ 実験例１と同様の実験をカルボキシル化ポリスチレンの
代わりに、ポリスチレン、スチレン−メタクリレート共
重合体、ポリメチルメタクリレートなど他の組成の微粒
子を用いて、又粒子径を変えて行った。結果を横軸に撹
拌処理時間、縦軸にＡ　／　Ａ　６としてプロットシ、
第５図に示す、なお測定感度不良の部分を実線で、やや
不良の部分を破線で、感度良好な部分を太い実線で結ん
だ。

実験例１．２の結果から明らかなように、Ａ／八へが１
．１を越えている場合、測定感度が不良である。又、同
一の実験を繰り返し実施したところ、Ａ／Ａｏが１．１
を越えている場合、測定値の変動が大きいことが明らか
になった。つまり、Ａ／Ａ＠−１，ｉが測定感度、測定
値の変動の２面から臨界的な値であることを見出した。

又、表−４からもみられるように長時間攪拌処理を行う
につれ測定感度の低下傾向がみられることを見出した。

すなわち、乾燥試薬微粒子を検体を含む分散媒中に攪拌
処理する際、光学的測定をしながらＡ／Ａ、が上述の範
囲を満足する時点で撹拌処理を終了させ、ひき続き次の
工程に進むことにより、被測定物質の種類にかかわらず
、微量成分であっても測定値の変動が少ない、安定な測
定ができるようになった０次に、乾燥試薬微粒子の完全
分散体の指数Ａ０の求め方は、通常、固体微粒子に免疫
的に活性な物質を物理的および／又は化学的に結合させ
る際、水又は水を主体とする混合媒体中で行われるため
、実験例１で示すように結合後乾燥する前の感作試薬ラ
テックス懸濁液の分散媒の組成を乾燥試薬微粒子の再分
散に用いる分散媒の組成と合わせた上、光学的な測定を
行い定めるのが好ましい。

さらに本発明では乾燥試薬および検体を含む攪拌工程に
おいて、上述のような光学測定で分散状態をチエツクす
るとともに、得られた分散状態の測定結果とあらかじめ
設定した分散状態を示す光学データと対比し、攪拌工程
のｍ続、停止もしくは攪拌強度の制御を行う。

攪拌終了後、検体中に試薬中の微粒子表面に結合された
免疫的に堆性な物質と反応性を有する物質（被測定物質
）が含まれる場合は、被測定物質と免疫的に活性な物質
が反応、抗原−抗体反応を起こし、検体中の被測定物質
の濃度に応じ凝集が進行する。

なお、生じた凝集塊が解離しない範囲で測定セル中に攪
拌具を挿入し攪拌したり、測定セルを振盪するなどの方
法により攪拌することもできる。

また、この撹拌は上述の乾燥試薬および検体を含む分散
媒の攪拌処理に比べ弱い撹拌力でなされることが好まし
い。

上記測定セル中の反応混合物に光を照射し凝集状態を測
定する方法としては、例えば透過光強度を測定する方法
、散乱光強度を測定する方法、これらを組み合わせた方
法、積分球濁度を測定する方法などがある。

得られた測定データから検体中の被測定物質の濃度の算
出は、例えば公知のレートアッセイ法、エンドポイント
法など〔免疫操作法■、文光！２４０１　　（１９７９
））でデータ処理されて行われる。

本発明による測定方法の基本原理を示すフローチャート
を第３図に示す。

本発明による測定装置は、前記のとおり、測定セルを固
定する手段、 上記測定セル中に、分散媒を注入する手段、上記測定セ
ル中に、検体を注入する手段、攪拌力が可変である、上
記測定セルの内容物を攪拌する手段、 上記測定セル中の反応混合物の凝集の度合を光学的に測
定する手段、 を少なくとも有する。さらに、検体を自動希釈する手段
、抗原過剰（プロゾーン現象）をチエツクする手段を付
加してもよい。

本発明を実施するにあたって適宜好適な装置を用いるこ
とができるが、本発明の方法を実施するに適した好まし
い装置の一例を第１図に示す。

第１図に示す装置においては、乾燥ラテックス試薬の入
ったアクリル樹脂製又は（石英）ガラス製の光学セル２
には、ラテックス試薬の分散時の光学データを表示した
バーコード１２が上部に貼り付けである。光学セル２は
セルホルダー兼恒温槽１０にセントされる該恒温槽１０
には、攪拌機能を付与するための超音波振動子からなる
撹拌装置１）が付属している。光学セル２に貼り付けた
バーコードはバーコード読み取り装置１３でデータを読
み取り、データ処理装置１４に送られメモリーされる０
分散媒は恒温槽７中の分散媒容器８より送液パルプ１７
を通じて光学セル中に一定量注入される。又、検体は検
体容器９より送液バルブＩ８を通じて光学セル２に一定
量注入される。

該光学セル中はただちに恒温槽ｌＯ中で超音波攪拌され
る。その撹拌工程において光源ｌから放射される光束は
光学セル２に導入される。光源ｌはコヒーレント光を放
射させる場合、Ｈｅ−Ｎ。

ガスレーザー（波長６３２．８ｎｍ）もしくは半導体レ
ーザー（波長７８０ｎｍ、８３０ｎｍ）が用いられる。

また光源としてインコヒーレント光を放射する場合には
、タングステンランプやハロゲンランプが使用でき、適
当な波長をモノクロメータ−やフィルターで選択する。

光学セル２に導入された光束は分散もしくは吸収され透
過光はフォトダイオードからなる光検出器３で検知され
散乱光は光検出器４で光量検知される。

また、光源ｌの光量変動は光検出器５で検出され、デー
タ処理装置１４に送られる。

光検出器３．４の検出信号もデータ処理装置１４に送ら
れ、Ａ／Ｄ変換回路から比較演算回路に入り、メモリー
回路のラテックス試薬の分散時の光学データと対比させ
る。

その結果より、信号が超音波攪拌の制御装置１５に送ら
れ、超音波攪拌の停止、継続又は分散強度を制御する。

攪拌工程が終了すると光学セル２中では凝集反応が始ま
る。攪拌工程が終了後５秒〜３０秒後光学測定が行われ
る。さらに一定時間（２０秒〜５分）経過後、再び光学
測定され、これらの信号は、データ処理装置１４へ送ら
れ、そのＡ／Ｄ変換回路から測定演算回路で、あらかじ
め入力しである検量線データをもとに濃度データに演算
処理され、結果は表示装置１６に表示される。

以下の実施例と比較例において、本発明の詳細な説明す
る。

スｆ 抗体感作懸濁液の調製： 抗ヒトＣＲＰヤギ血清（Ｂｉｏ　　Ｍａｋｏｒ製）をＰ
　ｒｏｔｅｉｎ　−Ａ　　Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ（ファ
ルマシア製）のカラムクロマトグラフィーによりＩｇＧ
分画に精製し１．８５．５の０．１　Ｍリン酸塩緩衝液
に１０ｍｇ／ｍｊの濃度となるように希釈した。

粒径０．３７ｎｍのカルボキシル化ポリスチレン（日本
合成ゴム■製ＧＯ３０３）１０％水−懸濁液ＩＱｍ＆に
縮合剤としてｌ−シクロへキシル−３−〔２−モルホリ
ニル−（４）−エチル〕カルボジイミド　メト−ｐ−ト
ルエンスルホネート（以下カルボジイミドＴｓ）の１％
水溶液２５ｍ１を加え、さらに上述のＩｇＧ分画抗体２
０ｍｍ！を加え、室温で３時間攪拌し、感作ラテツクス
を得た。

上記感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％牛血清アルブミ
ン３％シｇ糖となるよう調製したｐ　Ｈ７，２のリン酸
塩緩衝液−生理食塩水（以下ＰＢＳ）を加え、ＣＲＰ抗
体感作ラテックス懸濁液とした。

試薬の乾燥化： 上記で調製したＣＲＰ感作ラテックス懸濁液を液体窒素
中で凍結減圧乾燥し、ＣＲＰ検出用乾燥試薬微粒子を得
た。

測定−再現性評価： 標準ＣＲＰ血清（協和油化製）をＴｒｉｓＨＣ１緩衝液
で希釈し、０．５　ｍ　ｇ　／　ｄ　ｊの濃度とした。

上記乾燥試薬微粒子１．２　ｍ　ｇの入ったガラス製光
学セル（光路長２ｍｍ）に試薬固形分濃度が０．２％と
なるようにＰＢＳを添加する。

さらに、上記セル中にＣＲＰ標準血清（２ｍｇ／し０を
１０μｌ加えた。直ちに上記セル中を超音波撹拌処理を
行い、その攪拌過程で入射光の強さをｔｏ、ｉ３過光を
夏とし、ｊｏｇｌｏ／Ｉ＝Ａで示される指数Ａを求める
（測定波長λ＝６３３ｎｍ）。

一方、あらかじめ上述〔抗体感作ラテンクス懸濁液の調
整〕で得られたＣＲＰ抗体感作ラテックスを０．２％の
濃度に調整し、上記と同様の方法により透過光測定をし
、ｊｏｇｌ＠、ｚＮを求めたところ１．０２　（＝　Ａ
、）であった、撹拌工程は上記で求めたＡがＡ　／　Ａ
　ｏ≦１．１（Ａ≦１．１）を満足した時点で停止させ
、停止後２０秒後と２００秒後の吸光度変化ΔＡを波長
６３３ｎｍの光を照射して測定した。同時再現性を調べ
るため上記測定を連続して１０回行った。また乾燥試薬
の製造ロフト間の変動を調べるため、異なる日に作製し
た試薬ロフトＡ、Ｂ、Ｃにつき各１０回づつ測定しロフ
ト間の同時再現性を調べた。

を較■１ 撹拌工程において、超音波による分散時間を一定にする
こと以外は実施例１と全く同様に同時再現性およびロフ
ト間の同時再現性を調べた。

く結果〉 実施例１ならびに比較例１で行ったＣＲＰに対する同時
再現性テストの結果を表１に試薬製造ロフト間の同時再
現性テストの結果を表２に示す。

表１の結果よりラテックス試薬の攪拌時間を可変に制御
した実施例１の方が攪拌時間をそれぞれ１００秒、２０
０秒、３００秒に固定した場合に比べ、データの変動が
少ない、また、比較例１で明らかなように攪拌時間が長
くなるにつれ吸光度変化ΔＡが小さくなり、すなわち感
度が低下する。

表２の結果より比較例１に比べて実施例１の方が乾燥試
薬製造ロフト間のΔＡの変動が大巾に小さくなっている
。

２−ｈＣＧの 抗体感作ラテックス懸濁液の調製： 抗ｈＣＧ抗体（ウサギ）　　（Ｂｉｏ　　Ｍａｋｏｒ製
）をＰ　ｒｏｔｅｉｎ　　Ａ　−Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ
　（ファルマシア製）のカラムクロマトグラフィーによ
りＩｇＧ分画に精製し、そのＩｇＧ分画１０ｍｇ／ｍ＆
をｐ　Ｈ７，２の０．１　Ｍリン酸塩緩衝液に希釈した
。

粒径０．３７ｐｍのカルボキシル化ポリスチレン（日本
合成ゴム■製ＧＯ３０３）１０％水−懸濁液４ｍｊにカ
ルボジイミドＴｓの１％水溶液２０ｍｊを加え、さらに
ＩｇＧ分画抗体２　ＱｍＪを加え室温で２時間攪拌し、
固定化した抗体感作ラテックスを得た。

上記の感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％生血清アルブ
ミン３％シｇｌ！、２％カルボキシメチルセルロースナ
トリウム塩となるよう添加し、ＰＢＳを加え再分散しｈ
ＣＧ抗体感作ラテックス懸濁液とした。

試薬の乾燥化： 上記で調製したｈｃｃ感作ラテックス懸濁液を液体窒素
中で凍結減圧乾燥しｈＣＧ検出用乾燥試薬微粒子を得た
。

測定−再現性評価： ｈＣＧ乾燥試薬微粒子１．２　ｍ　ｇの入ったガラス製
光学セル（光路長２ｍｍ）に試薬固形分０．２％の濃度
となるようにＰＢＳを添加する。

さらに、上記セル中にｈｃｃｌ準液（日本ケミカルリサ
ーチ製を１０１０７ｍ１の濃度に調製したもの）を１０
０μ！加えた。直ちに上記セル中を超音波攪拌処理し、
その攪拌はあらかじめ測定した０、２％ｈＣＧ感作ラテ
ックス懸濁液の波長６３３　ｎｍでの吸光指数Ａ、（０
，９４）に対し、攪拌中の吸光指数ＡとするとＡ　／　
Ａ　ｏ　≦１．１（すなわちＡｓ２．０３）を満足した
時点で停止する。

その工程での攪拌時間は１）０秒であった。停止後２０
秒後と２００秒後の吸光度変化ΔＡを波長６３３　ｎｍ
の光を照射して測定した。また同時再現性を調べる目的
で上記測定を計１０回繰返し行った。

また実施例１と同様に変動係数Ｃ，Ｖ、（％）を算出し
た。

ル較桝Ｉ 攪拌工程において超音波撹拌の時間を一定（１００秒、
２００秒）にすること以外は実施例２と全く同様に同時
再現性（１０回の測定繰返し）を調べるために変動係数
を算出した。

３−ＡＦＰの゛ 抗体感作ラテックス懸濁液の調製： 抗ヒトα−フェトプロテイン（ウマ）　　（ＡＦＰ）血
清（ミドリ十字製）をＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ　　５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ（ファルマシア製）のカラムクロマトグロフ
ィーによりＩｇＧ分画に精製し、さらにｐＨ７，２の０
．１Ｍリン酸塩１）街液で１０ｍｇ／ｎｕの濃度に希釈
し、ＩｇＧ分画抗体とした。

粒径０．３７μｍのカルボキシル化ポリスチレン（日本
合成ゴム側型ＧＯ３０３）１０％水−懸濁液５ｍｌにカ
ルボジイミドＴｓの１％水溶液２０ｍ１ｌを加え、さら
にＩｇＧ分西抗体２０ｍｊを加え、室温で２時間攪拌し
、抗体感作ラテックスを得た。

上記の感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％濃度の牛血清
アルブミン、３％濃度となるようにシラ糖を添加しｐ　
Ｈ７，２のＰＢＳを加え、ＡＦＰ抗体感作ラテックス懸
濁液とした。

試薬の乾燥化； 上記で調製したＡＦＰ抗体感作ラテックス懸濁液を液体
窒素中で凍結し減圧乾燥し、ＡＦＰ検出用乾燥試ｔｉ微
粒子とした。

測定−再現性評価： ＡＦＰ検出用乾燥試薬微粒子１．２　ｍ　ｇの入ったガ
ラス製光学セル（光路長２ｍｍ）に試薬固形分濃度が０
．２％となるようにＰＢＳを添加する。

さらに、上記セル中に１５０μｇ　／　ｍ　ＪのＡＦＰ
ｔｌ準液を２０μｌ加える（ＡＦＰ標準液は標準ＡＦＰ
血清（協和油化製）をＴｒｉｓＨＣｊ緩衝液で希釈し所
定の濃度にしたもの）、直ちに上記セル中を超音波攪拌
処理し、その攪拌はあらかじめ測定した０、２％ＡＦＰ
感作ラテックス懸濁液の波長６３３ｎｍでの吸光指数Ａ
ｏ（０，９８）に対し、攪拌中の吸光指数ＡとするとＡ
　／　Ａ　ｏ≦１．１（すなわちＡｓ２．０８）を満足
した時点で停止する。

その工程での攪拌時間は１６０秒であった。停止後２０
秒後と２００秒後の吸光度変化ΔＡを波長６３３ｎｍの
光を照射して測定した。また同時再現性を調べる目的で
上記測定を計１０回繰返し行った。

また実施例１と同様に変動係数Ｃ０■、（％）を算出し
た。

ｌ較班ユ 攪拌工程において超音波撹拌の時間を一定（１００秒、
２００秒）にすること以外は実施例３と全く同様に同時
再現性（１０回の測定繰返し）を調べるために変動係数
を算出した。

４−β雪マイクログロブリンの 抗体感作ラテックス懸濁液の調製： 抗β８−マイクログロブリン（ウサギ）　　（Ｂｉ。

Ｍａｋｏｒ製）をＰｒｏｔｅｉｎ　　Ａ　−５ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ　（ファルマシア製）のカラムクロマトグラフ
ィーによりＩｇＧ分百に精製し、さらにｐ　Ｈ７，２の
Ｏ，ｌ　Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝液で１０ｍｇ／ｍｊの濃度
に希釈し、ＩｇＧ分画抗体とした。

粒径０，３７μｍのカルボキシル化ポリスチレン（日本
合成ゴム■製ＧＯ３０３）１０％水−懸濁液４ｍｌにカ
ルボジイミドＴｓの１％水溶液２０ｍ１を加え、さらに
ＩｇＧ分画抗体２０ｍｆｆ１を加え室温で３時間撹拌し
、抗体感作ラテックスを得た。

上記の感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％濃度の牛血清
アルブミン、３％濃度となるようにシリ糖を添加しｐ　
Ｈ７，２のＰＢＳを加えβ、−マイクログロブリン抗体
感作ラテックス懸濁液とした。

試薬の乾燥化： 上記で調製したβ８−マイクログロブリン抗体感作ラテ
ックス懸濁液を液体窒素中で凍結し減圧乾燥しβ８−マ
イクログロブリン検出用乾燥試薬微粒子とした。

測定−再現性評価： β２−マイクログロブリン検出用乾燥試薬微粒子１．２
　ｍ　ｇの入ったガラス製光学セル（光路長２ｍｍ）に
試薬固形分濃度が０．２％となるようにＰＢＳを添加す
る。

さらに、上記セル中に５μｇ　／　ｍ　ｌのβ８−マイ
クログロブリン標準液を２０μ！加える（β２マイクロ
グロブリン標準液は標準β２−マイクログロブリン血清
（協和油化型）をＴｒｉｓＨＣ１ａ街液で希釈し所定の
濃度にしたもの）、直ちに上記セル中を超音波攪拌処理
し、その攪拌はあらかじめ測定した０、２％β３−マイ
クログロブリン感作ラテツクス懸濁液の波長６３３ｎｍ
での吸光指数Ａｏ　　（１，０４）に対し、攪拌中の吸
光指数ＡとするとＡ　／　Ａ　ｏ　≦１．１（すなわち
Ａｓ２．１４）を満足した時点で停止する。その工程で
の攪拌時間は１９０秒であった。停止後２０秒後と２０
０秒後の吸光度変化ΔＡを波長６３３ｎｍの光を照射し
て測定した。また同時再現性を調べる目的で上記測定を
計１０回繰返し行った。

また実施例１と同様に変動係数Ｃ，Ｖ、（％）を算出し
た。

ル較■土 攪拌工程において超音波攪拌の時間を一定（１００秒、
２００秒）にすること以外は実施例４と全く同様に同時
再現性（１０回の測定繰返し）を調べるために変動係数
を算出した。

実施例２〜４、比較例２〜４の同時再現性を示す変動係
数についての測定結果を表３に示す。

表３の結果より、被測定物質をｈＣＧ、　β諺マイクロ
グロブリン、ＡＦＰに変えても撹拌処理時間を可変に制
御する実施例の方が攪拌時間を固定した比較例に比べて
変動係数が小さくなり、同時再現性が向上した。

（以下余白） 表　　　４ ０：測定感度良好Δ：やや不良×：不良〔発明の効果の
概要〕 以上説明したように、本発明は抗原−抗体反応を利用し
検体中の抗原、抗体などの免疫的に活性な物質を定量で
きる。

また、本発明では乾燥免疫試薬を使用するため、従来の
水中に分散した試薬に比べ試薬の保管上次のような利点
がある。

１、試薬が乾燥状態であるため水中に分散した試薬のよ
うに経時的な自然凝集が生じない。

２、試薬の保管時の温度管理が緩和される。（従来の試
薬は凍結不可で保管に注意が必要）３、乾燥試薬は安定
でより長期の保管が可能。

以上の利点を有する乾燥免疫試薬を用いその微粒子と検
体を含む分散媒の攪拌処理工程でその分散状態を光学的
に測定し、攪拌力を制御することで以後のひき続き生ず
る凝集反応がスムーズに進み、得られたデータの再現性
および信鎖性を大幅に向上させることが可能になる。

また試薬攪拌処理工程において最少限の攪拌時間に制御
可能なため感度の低下を防ぐと同時に測定時間の短縮化
が計られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法を実施するのに適した装置の典
型的１例を模式的に示す図であり、第２図は、各工程に
おける透過率変化を示す図であり、第３図は、本発明の
測定方法フローチャートである。第４図および第５図は
、実験例１および２における攪拌時間とＡ／Ａ＠の関係
を示す図である。 第１図において、ｌ・・・光源、２・・・光学セル、３
〜５・・・光検出器、６・・・ハーフミラ−１７・・・
分散媒用恒温槽、８・・・分散媒容器、９・・・検体容
器、ｌＯ・・・セルホルダー兼恒温槽、１）・・・攪拌
装置（超音波振動子と振盪機）、１２−・・バーコード
、１３・・・バーコード読み取り装置、１４・・・デー
タ処理装置、ｌ５・・・撹拌装置の制御装置、 １ ６・・・表示装置、 １７゜ １８・・・送液パルプ、 １９・・・送液チューブ。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）固体微粒子の表面に、検体中の被測定物質に対し
   免疫的に活性な物質を化学的に結合させ、この結合され
   た免疫的に活性な物質に検体を液体媒体中で反応させる
   ことにより生ずる反応混合物の凝集の度合を光学的に測
   定する方法であって、 （ｉ）表面に、検体中の被測定物質に対し免疫的に活性
   な物質を化学的に結合せしめ乾燥させた固体微粒子（以
   下“乾燥試薬微粒子”という。）を含む測定セル中に、
   分散媒および検体を添加する工程、 （ｉｉ）上記測定セル中の分散媒と乾燥試薬微粒子およ
   び検体を撹拌し、上記乾燥試薬微粒子の分散媒体中での
   分散状態を光学的に測定する工程、 （ｉｉｉ）上記工程（ｉｉ）で得られる光学的な測定デ
   ータから分散媒中での乾燥試薬微粒子の分散状態を測定
   し、あらかじめ設定した分散状態に到達した時点で、上
   記工程（ｉｉ）の撹拌を停止する工程、 （ｉｖ）上記工程（ｉｉｉ）において設定した分散状態
   に到達した検体を含む分散体を反応させて凝集状態を生
   ぜしめる工程、 （ｖ）上記工程（ｉｖ）で生じた反応混合物の凝集状態
   を光学的に測定する工程 を含むことを特徴とする免疫的に活性な物質の測定方法
   。
2. （２）上記工程（ｉｉｉ）の分散状態の判定を、分散媒
   体中での乾燥試薬微粒子の分散状態における光学的な測
   定データをあらかじめ作成し、上記工程（ｉｉ）で得ら
   れた乾燥試薬微粒子分散体の光学的な測定データと対比
   し、分散を確認することにより行う、請求項１記載の測
   定方法。
3. （３）上記工程（ｉｉｉ）の分散状態の判定を、あらか
   じめ測定した分散媒体中での乾燥試薬微粒子の完全分散
   体を含む測定セル中を単色光が遭遇するときの入射光の
   強さをＩ＿０、透過光および／又は散乱光の強さをＩと
   し、ｌｏｇＩ＿０／Ｉ＝Ａ＿０で示される指数Ａ＿０に
   対し、上記工程（ｉｉ）で得られた乾燥試薬微粒子分散
   体を含む測定セル中を、上記単色光が通過するときの入
   射光の強さをＩ＿０、透過光および／又は散乱光の強さ
   をＩとしｌｏｇＩ＿０／Ｉ＝Ａで示される指数Ａが次の
   範囲であることを確認することにより行う、請求項１記
   載の測定方法。 Ａ／Ａ＿０≦１．１
4. （４）被測定物質がＣＲＰである請求項１記載の測定方
   法。
5. （５）被測定物質がｈＣＧである請求項１記載の測定方
   法。
6. （６）被測定物質がα−フェトプロテインである請求項
   １記載の測定方法。
7. （７）被測定物質がβ＿２−マイクログロブリンである
   請求項１記載の測定方法。
8. （８）固体微粒子の表面に、検体中の被測定物質に対し
   免疫的に活性な物質を化学的に結合させ、この結合され
   た免疫的に活性な物質に検体を液体媒体中で反応させる
   ことにより生ずる測定セル中の反応混合物の凝集の度合
   を光学的に測定する装置であって、 （ｉ）前記測定セルを固定する手段、 （ｉｉ）上記測定セル中に分散媒を注入する手段、（ｉ
   ｉｉ）上記測定セル中に検体を注入する手段、（ｉｖ）
   上記測定セルの内容物を撹拌する手段、（ｖ）上記測定
   セル中に内容物の凝集の度合を光学的に測定する手段、 （ｖｉ）攪拌された測定セル中の、乾燥試薬微粒子の分
   散媒中での分散状態より得られる光学的測定データから
   、撹拌の継続・停止を制御する手段、 を有することを特徴とする免疫的に活性な物質の測定装
   置。