JPH0472567A - 免疫的に活性な物質の測定方法および測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の属する技術分野〕 本発明は、微粒子を用い検体中の抗原、抗体などの免疫
的に活性な物質の測定法および測定装置に関する。さら
に詳しくは、本発明は、免疫的に活性な物質を担持した
固体微粒子を用い、抗原−抗体反応により生ずる凝集の
度合を光学的に測定する方法および装置に関する。

〔従来技術の説明〕

免疫的に活性な物質、たとえば抗体を担持したポリスチ
レン等の微粒子を水などの液体媒体中に分散させた分散
液（ラテックス試薬）に、上記の免疫的に活性な物質に
対し選択的に反応性を有する物質（例えば抗原）を作用
させることにより起こる凝集を観察することにより測定
を行うラテックス凝集イムノアッセイ法（ＬＡＩＡ）が
ジエー・エム・シンガーら（Ｊ、Ｍ、Ｓｉｎｇｅｒ　　
ｅｔ　　ａｌ）により見い出され［Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ、
、　２１８８８　（１９５６）参照〕、その後、該方法
について様々な検討がなされている。そして凝集の度合
を視覚により判定する方法が、定量的な測定は困難では
あるが、簡便でかつ結果が短時間に得られるという利点
があることから実用上広く普及している。

近年になっで、凝集の度合を光学的に測定する試みがな
され、ニー・フエーチュアら（Ａ、Ｆａｔｕｒｅｅｔ　
　ａｔ）は、凝集反応に伴う濁度の変化を光学的に測定
、動力学的解析から定量分析を行う方法を提案している
（Ａ、Ｆａｔｕｒｅ　　ｅｔ、ａｌ、　；　Ｐｒｏｔｉ
ｄｅｓＢｉｏｌ　Ｆｌｕｉｄｓ、　Ｐｒｏｃ、Ｃｏ１１
ｏｑ、、　２５８９　（１９７２））。

しかし、後述するように、ラテックス試薬そのものの不
安定さから測定値の変動が大きく、又、測定感度上も十
分なものとはいえない。すなわち、ラテックス試薬は液
体分散媒中に固体微粒子が分散している状態のものであ
り、本質的に不安定な系であるため、長期間の貯蔵によ
り凝集を起こしたり、感度が低下したりしやすく、又、
凍結することで分散状態が破壊されるため保存に特段の
配慮を要するなど、種々の問題を有している。

これに対して分散媒である液体を除去乾燥させることに
よってラテックス試薬の安定性を改善する方法が提案さ
れている（特開昭５２−１１７４２０号公報、特開昭６
２−４６２６２号公報）。

しかしながら、ラテックス試薬については、乾燥化する
ことで保存安定性は向上させることができるものの、再
分散して得られたラテックス試薬は、凝集反応性の変動
が大きく、その結果測定データがしばしば変動するとい
う問題がある。

従っで、従来技術においてはスライド上での目視による
陰性もしくは陽性の判定など定性的な測定に用いること
ができるが、高精度の定量的測定には不適である。

又、ラテックス試薬などの凝集免疫試薬を毛細管に注入
し、凍結乾燥させ、該毛細管中で検体と混合させること
によって反応させ、凝集状態を観察することにより検体
中の免疫的に活性な物質を検出する方法が提案されてい
る（特開昭５８−７３８６６号公報）。この方法は前述
の提案と同様に試薬の保存安定性が良好であり、さらに
簡便な検査法として魅力あるものではあるが、測定値の
再現性がよくなく、正確な定量ができないという問題が
ある。

〔発明の目的〕

本発明は、上述の従来技術における問題点を解決しで、
測定値の再現性に優れ、正確な定量を可能にする免疫的
測定方法およびそのための測定装置を提供することにあ
る。

Ｃ発明の構成・効果〕 本発明者らは、乾燥試薬を用いる従来の測定法における
問題点について検討したところ、従来法における測定値
の変動の原因が、再分散状態のバラツキによるものであ
るとともに、再分散のための撹拌が長時間に亘り、ある
いは撹拌強度が強過ぎることにより、固体微粒子と免疫
的に活性な物質との結合が破壊されることにより生じる
測定感度の低下にあることが判明した。さらに本発明者
らはこれらの知見をもとに、鋭意検討した結果、乾燥試
薬の再分散時においで、その分散状態を光学的に測定し
ながら撹拌し、好適な分散状態に到達した時点で、次の
反応工程に進むことが、高感度で安定な測定を行うため
に極めて大きな効果をもたらすことを明らかにした。

本発明は、以下の判明した事実に基づいて更なる検討の
結果完成に至ったものであり、下述する測定方法および
該測定方法を実施するに適した装置を包含する。

本発明の測定方法は下述する内容のものである。

すなわち、固体微粒子の表面に、検体中の被測定物質に
対し免疫的に活性な物質を物理的および／又は化学的に
結合させ、この結合された免疫的に活性な物質に検体を
液体媒体中で反応させることにより生ずる反応混合物の
凝集の度合を光学的に測定する方法においで、 （１）表面に、検体中の被測定物質に対し免疫的に活性
な物質を物理的および／又は化学的に結合せしめ乾燥さ
せた固体微粒子（以下“乾燥試薬微粒子”という）を含
む反応セル中に、分散媒を添加する工程、 （ＩＩ）上記反応セル中の分散媒と乾燥試薬微粒子を撹
拌し、上記乾燥試薬微粒子の分散媒体中での分散状態を
光学的に測定する工程、 （Ｉ［［）上記工程（ＩＩ）で得られる光学的な測定デ
ータから分散媒中での乾燥試薬微粒子の分散状態を測定
し、あらかじめ設定した分散状態に到達した時点で、上
記工程（ｎ）の撹拌を停止する工程、 （ＩＶ）上記工程（ｍ）において設定した分散状態に到
達した分散体に、検体を添加混合反応させて凝集状態を
生ぜしめる工程、 （Ｖ）上記工程（ｒＶ）で生じた反応セル中の反応混合
物を測定セルに流す工程、 （ＶＩ）該測定セルに流された反応混合物の凝集の度合
を光学的に測定する工程、 上述の測定方法を実施するに適した本発明の装置は、下
述する内容のものである。すなわち、固体微粒子の表面
に、検体中の被測定物資に対し免疫的に活性な物質を物
理的および／または化学的に結合させ、この結合された
免疫的に活性な物質に検体を液体媒体中で反応させるこ
とにより生ずる反応混合物の凝集の度合を光学的に測定
する装置であっで、 （Ｉ）前記反応セルを固定する手段、 （ＩＩ）上記反応セル中に分散媒を注入する手段、（Ｉ
［［）上記反応セル中に検体を注入する手段、（ＩＶ）
上記反応セル中の内容物を撹拌する第１の手段、 （Ｖ）上記反応セル中の内容物を撹拌する第２の手段、 （ＶＩ）撹拌された反応セル中の、乾燥試薬微粒子の分
散媒体中での分散状態より得られる光学的測定データか
ら、撹拌の継続・停止を制御する手段、 （■）上記反応混合物の凝集の度合を測定する測定セル
を固定する手段、 （■）上記反応混合物を測定セルに流す手段、（ＩＸ）
上記測定セルに流された反応混合物の凝集の度合を光学
的に測定する手段、 を有することを特徴とする免疫的に活性な物質の測定装
置である。

また、反応混合物を測定セルに流す前に反応混合物を希
釈液に希釈する手段を有してもよい。

以下、本発明について具体的に説明する。

本発明に用いられる固体微粒子としては、生物に由来す
る微粒子、無機系微粒子、有機系微粒子を挙げることが
できる。前記生物に由来する微粒子としては、例えば、
赤血球分散処理されたブドウ球菌、連鎖球菌等の細菌類
等が挙げられる。前記無機系微粒子としては、例えば、
ンリカ、アルミナ、ベントナイト等が挙げられる。また
前記有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビ
ニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エス
テル類、メタクリル酸エステル類などのビニル系モノマ
ーの単一重合体および／又はそれらの共重合体、スチレ
ン−ブタジェン共重合体、メチルメタクリレート−ブタ
ジェン共重合体などのブタジェン系共重合体などの微粒
子が挙げられる。

こうした微粒子への免疫的に活性な物質の結合は、後述
するように、物理的および／又は化学的になされるが、
その中で物理的結合は微粒子表面が疎水性であることが
好ましく、スチレン単一重合体微粒子、スチレンを主成
分とするビニル系共重合体微粒子又はスチレンを主成分
とするスチレンブタジェン共重合体が特に好ましい。上
述の微粒子の粒子径は、生物に由来する微粒子、無機系
微粒子、有機系微粒子のいずれの場合にあっても０．０
５μｍ乃至５μｍが好ましく、該測定方法に適用するに
は、０．５μｍ乃至５μｍが特に好ましい。

粒子径が０．０５μｍを上廻ると乾燥試薬の分散が困難
になり、又５μｍを上形ると分散試薬の安定性が不良に
なる。

本発明に用いられる固体微粒子の表面に結合させる免疫
的に活性な物質としては、ＩｇＧ、　　ＩｇＭ。

ＪｇＥなどの免疫グロブリン：補体、ＣＲＰ、フェリチ
ン、α、−マイクログロブリン、β２−マイクログロブ
リンなど血漿蛋白およびそれらの抗体：α−フェトプロ
ティン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺性酸性ホスフ
ァターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ−１９−９、ＣＡ−１２５な
どの腫瘍マーカおよびそれらの抗体：黄体化ホルモン（
ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト繊毛性ゴナ
ドトロピン（ｈＣＧ）、エストロゲン、インスリンなど
のホルモン類およびそれらの抗体：ＨＢＶ関連抗原（Ｈ
Ｂｓ、　ＨＢｅ、　ＨＢｃ）、ＨＩＶ。

ＡＴＬなどウィルス感染関連物質およびそれらの抗体ニ
ジフチリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズマ、梅毒ト
レポネーマなどのバクテリア類およびそれらの抗体：ト
キソプラズマ、トリコモナ・スリーシュマニア、トリパ
ノゾーマ、マラリア原虫などの原虫類およびそれらの抗
体：フェニトイン、フエノバルビタールなどの抗てんか
ん薬、キニジン、ジゴキシニンなどの心血管渠、テオフ
ィリンなどの抗喘息薬、クロラムフェニコール、ゲンタ
マイシンなどの抗生物質などの薬物類およびそれらの抗
体：その他酵素、菌体外毒素およびそれらの抗体などが
あり、検体中の被測定物質と抗原抗体反応を起こす物質
が検体の種類に応じて適宜選択されて使用される。

これらの免疫的に活性な物質の中でも、特にｈＣＧ抗体
、ＣＲＰ抗体、β２−マイクログロブリン抗体もしくは
α−フェトプロティンが好ましい。

微粒子と免疫的に活性な物質の結合は、例えば特開昭５
３−５２６２０号公報、特公昭５３−１２９６６号公報
等に記載の、物理的および／又は化学的結合する公知の
方法により行うことができる。この微粒子と免疫的に活
性な物質との結合反応は、水又は水およびアルコール類
、ケトン類などの水と相溶性のある有機溶媒との混合溶
媒中で行うことが好ましい。又反応系中には微粒子の安
定化、非特異凝集の防止などの目的でリン酸塩緩衝液−
生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液などの緩衝液、牛
血清アルブミンなどの不活性蛋白質、界面活性剤などを
添加することが好ましい。反応溶液のｐＨは通常６〜１
０、好ましくは７〜９である。又、反応溶液中の微粒子
の濃度は通常０．Ｏ１〜２．０（重量）％である。

微粒子と免疫的に活性な物質を化学的に結合させるには
、微粒子表面に例えばアミノ基、カルボキシル基、ヒド
ロキシル基、オキシラン基などを配向させポリアミド化
合物、ポリイミド化合物、ポリアルデヒド化合物、ポリ
オキシラン化合物などを介し免疫的に活性な物質と反応
させる方法、微粒子表面にアルデヒド基、オキシラン基
などを配向させ免疫的に活性な物質と反応させる方法な
どがある。

乾燥免疫試薬は上記免疫的に活性な物質を結合させた微
粒子の分散体に用いられている分散媒を除去することに
より得られる。

分散媒の除去は６０℃以下、好ましくは３０℃以下で行
うのが免疫的に活性な物質の活性度を維持する上で有利
である。分散媒除去についでの特に好ましい態様におい
ては、凍結乾燥による除去であり、その場合、試薬の感
度は定常的に高く維持される。反応セル中に乾燥免疫試
薬を導入するについては、反応セル中に所定量の免疫的
に活性な物質を結合させた微粒子の分散体を入れ上述の
乾燥を行って分散媒を除去してもよいし、又はあらかじ
め分散媒を除去した乾燥免疫試薬の所定量を反応セル中
に入れるようにしてもよい。

反応セルとしては、透明なガラス又はプラスチック（例
えばポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩
化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホンなど）を材
質とするものなどが用いられる。

反応セル中の乾燥免疫試薬を分散する分散媒および反応
混合物を希釈する希釈液はそれぞれ水又は水およびアル
コール類、ケトン類などの水と相溶性のある有機溶媒と
の混合溶媒が使用される。又分散媒および希釈液には適
宜ｐＨ緩衝剤、蛋白質、界面活性剤、水溶性高分子化合
物などが添加される。

ｐＨ緩衝剤は、抗原−抗体反応は一般に溶媒のｐＨの影
響を受けやすいため、最適のｐＨに調節するために添加
され、例えば、リン酸塩やＴｒｉｓ、　ＨＣＩ緩衝剤な
どが使用される。蛋白質は、非特異反応を防止する目的
で添加され、例えば牛血清アルブミン、ゼラチンなどが
使用される。

界面活性剤、水溶性高分子化合物は、乾燥免疫試薬の分
散助剤として有効であり、例えばトウイーン２０などの
非イオン界面活性剤やアニオン系界面活性剤、ポリビニ
ルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸塩
、ヒドロキシエチルセルロースなどが用いられる。しか
し、これらの添加物は抗原−抗体による凝集反応を阻害
しない範囲で使用される。

また、上記分散媒により乾燥免疫試薬は測定対象によっ
て適宜、希釈調整される。その固形分濃度は使用する測
定セルの種類またはサイズにより異なるが、一般的には
好ましくは、０．０１〜５％、より好ましくは０．０５
〜２％の範囲で調整される。

分散媒に乾燥免疫試薬を分散させるには、乾燥免疫試薬
を含む反応セルに所定量の分散媒を注入し、撹拌具を挿
入・撹拌する方法、測定セルを振盪する方法を適宜選択
できる。

なかでも微粒子の分散で最も効果的である超音波撹拌に
よる分散が好ましい。超音波撹拌に使用する超音波につ
いては、反応セルの種類またサイズにより異なるが、一
般的には、振動周波数として１５Ｈｚ乃至５０Ｈｚの超
音波が用いられる。

上記分散工程においで、分散媒体中への免疫試薬の分散
の度合は光学的測定手段を用いて測定され、その光学的
測定手段としては、例えば透過光強度を測定する方法、
散乱光強度を測定する方法、透過光と散乱光強度を組合
わせて測定する方法などが適宜使用される。

例えば、透過光強度で分散の度合を測定した場合、第２
図の模式図に示すように、分散が進むに従って反応セル
を透過する光量が減少し、均一に分散状態でほぼ一定に
なる。

又、好ましい分散状態の判定方法は、後述する実験例の
結果から導き出されたものであり、該判定方法は、あら
かじめ測定した分散媒体中での乾燥試薬微粒子の完全分
散体を含む反応セル中を単色光が通過するときの入射光
の強さをＩ０、透過光および／又は散乱光の強さを■と
し、ｌｏｇＩｏ／１＝Ａ、で示される指数Ａ０に対し、
本発明の上記工程（ＩＩ）で得られた乾燥試薬微粒子分
散体を含む反応セル中を、上記単色光が通過するときの
入射光の強さをＩ０、透過光および／又は散乱光の強さ
をＩとしＩｏｇｌｏ／Ｉ＝Ａで示される指数Ａが次の範
囲であることを確認することにより行う方法である。

Ａ／ＡｏＳ１．１ 次の実験例をもとに、上記分散判定方法について更に詳
細に説明する。

支駁ｊ」 粒径０．７１μｍのポリスチレンラテックス（日本合成
ゴム■製）の１％懸濁液６０ｍｆにｈＣＧ抗体（ウサギ
）　（Ｂ　ｉ　ｏ　　Ｍ　ａ　ｋ　ｏ　ｒ製）８ｍＩ！
を加え、よく撹拌した後４０℃で２時間加温し感作した
。

上記感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％懸濁液となるよ
う１％牛血清アルブミン、３％ショ糖を添加したｐＨ７
，２のリン酸塩緩衝液−生理食塩水（以下ＰＢＳ）を加
え、ｈＣＧ抗体感作ラテックス懸濁液とした。

この感作ラテツクス懸濁液の一部をＰＢＳにより試薬固
形分濃度Ｏ０１％になるように希釈後、ガラス製光学セ
ル（反応セル光路長２ｍｍ）にとり、上記方法により指
数Ａ。を求めたところ１．７１であった（１１１１定波
長λ：　７８０ｎｍ）。

又、上記ｈＣＧ感作ラテックス懸濁液を液体窒素中で凍
結減圧乾燥し、乾燥試薬微粒子−１を得、ＰＢＳを添加
、０．１％濃度に調整後、超音波撹拌装置を用い、分散
を行いサンプリングし、上述の反応セルにとり、同様に
指数Ａを求めた。サンプルＥｘＩ−１〜Ｅｘ　Ｉ　−４
の撹拌時間とＡ／Ａ　ｏを第４図に示す。

これらのサンプルを各々上述と同様の光学セル（反応セ
ル）に０．５ｍＩ！とり、１０１　Ｕ　／　ｍ　ｌの濃
度に調整した標準ｈＣＧ溶液Ｉ００μｌを添加、撹拌し
反応混合物を得た。

次いで、各々反応６０秒後に、希釈セル中で反応混合物
をＰＢＳにより１０００倍に希釈し、希釈液をフローセ
ルに導き、Ａｒレーザー（４８８ｎｍ）を照射し粒子か
らの後方散乱光を検出することにより希釈液中の試薬微
粒子の凝集状態を測定した。この結果と、予め作っであ
る検量線と対比し、検体中のｈＣＧ濃度を算出した結果
を第１表に示す。

Ｋ監ｌ」 実験例１のｈＣＧ抗体（ウサギ）の代りに抗ヒトＣＲＰ
ヤギ血清（Ｂ　ｉ　ｏ　　Ｍ　ａ　ｋ　ｏ　ｒ製）より
精製した免疫グロブリンＧ抗体を用い、実験例１と同様
の方法で分散状態と検体中のＣＲＰ濃度を測定した。

結果を第５図および第２表に示す。

大１１忽」 実験例１と同様の実験を、ポリスチレンラテックスの代
わりにスチレン−メタクリレート共重合体、ポリメチル
メタクリレートなど他の組成の微粒子を用いで、又粒子
径を変えて行った。結果を横軸に撹拌時間、縦軸にＡ／
Ａ　ｏをとり、プロットし、第６図に示す。なお第６図
では各サンプルは被測定物質の標準溶液を用いて実験例
１と同様、濃度測定を行い、その測定結果から感度が良
好なものを○、やや不良なものを△、不良なものを×で
プロットした。また、第６図には実験例１．２の結果も
プロットした。

実験例１乃至３の結果から明らかなように、Ａ／Ａｏが
１．１を越えている場合、測定感度が低（、測定値の変
動が大きい。つまりＡ／Ａ　。＝１．１が測定感度、測
定値の変動の２面から臨界的な値であることを見出した
。

又、第１表、第２表から明らかなようにＡ／Ａ　。

≦１．１を満足させても長時間撹拌を継続させると測定
値の変動は小さいが、測定感度の低下傾向が認められる
ことを見出した。すなわち、乾燥試薬微粒子を分散媒中
に撹拌により分散させる際、光学的測定をしながらＡ／
Ａ　ｏが上述の範囲を満足する時点で分散工程を終了さ
せ、ひき続き次の反応工程に進むことにより、被測定物
質の種類にかかわらず、微量成分であっても測定値の変
動が少ない、安定な測定ができることが判った。

次に、乾燥試薬微粒子の完全分散体の指数Ａ０の求め方
は、通常固体微粒子に免疫的に活性な物質を物理的およ
び／又は化学的に結合させる際、水又は水を主体とする
混合媒体中で行われるため、実験例１で示すように結合
後乾燥する前の感作試薬ラテックス懸濁液の分散媒の組
成を、乾燥試薬微粒子の再分散に用いる分散媒の組成と
合わせた上、光学的な測定を行い定めるのが好ましい。

さらに本発明では乾燥試薬の分散工程においで、上述の
ような光学測定で分散状態をチエツクするとともに、得
られた分散状態の測定結果と、あらかじめ設定した分散
状態を示す光学データと対比し、分散工程の継続、停止
もしくは撹拌強度の制御を行う。

上述の制御により、分散状態が均一で高感度な分散試薬
が得られる。この分散試薬はひき続き検体と混合、反応
させる。

すなわち、検体中に試薬中の微粒子表面に結合された免
疫的に活性な物質と反応性を有する物質（被測定物質）
が含まれる場合は、被測定物質と免疫的に活性な物質が
反応、抗原−抗体反応を起こし、検体中の被測定物質の
濃度に応じ凝集が進行する。反応時の混合は、反応セル
中に撹拌具を挿入したり、反応セルを振盪する方法など
で行われる。

なお、この反応時の撹拌は分散試薬と検体を均一に混合
させることを目的としており、混合により直ちに反応を
開始し凝集が進行する。したがって生じた凝集塊が解離
しない範囲で撹拌を継続するか撹拌を停止する。また、
この撹拌は上述の乾燥試薬の分散化の撹拌に比べ弱い撹
拌力でなされることが好ましい。

凝集反応の進行した反応セル中の反応混合物は希釈セル
中で前述の希釈液により希釈される。希釈濃度はひき続
き行われるフローセルに反応混合希釈物を導くときに、
凝集塊が一つずつ送られる濃度に適宜調整される。

反応混合希釈物の凝集状態は凝集塊を一つずつフローセ
ルに送り込み、光学的な反作用を順次測定することによ
りなされ、例えば、臨床検査３０（１１）１２５９に示
されるような光軸直交型、同一光軸型のフローサイトメ
ーターなどが好適に用いられる。

得られた測定データから検体中の被測定物質の濃度の算
出は、例えば２あらかじめ被測定物質の濃度と反応後の
反応混合希釈物の凝集状態の関係を示す検量線をつくり
、それと検体と試薬の反応混合希釈物の凝集状態を対比
することにより行われる。

本発明による測定方法の基本原理を示すフローチャート
を第３図に示す。

本発明では、上記乾燥試薬の分散化に際しては、超音波
撹拌で、後に行う分散試薬と検体との混合のために行う
撹拌は振盪で行い、２種類の撹拌手段を使い分けて行っ
ても、同種類の撹拌手段で、撹拌能力を変化させ、少な
くとも上記２工程で行う撹拌でそれぞれ撹拌能力を変え
てもよい。

つまり、撹拌力を可変できる撹拌装置を備えることで乾
燥試薬の分散化の撹拌（強い撹拌）と反応時の撹拌（弱
い撹拌）を同じ装置で兼ねることができる。例えば、撹
拌を出力調整できる超音波撹拌で２工程で使い分ける場
合、セルの材質、容量、実効効率にもよるが、乾燥試薬
の分散工程では出力は１０ワツト〜９０ワツト（２０Ｋ
Ｈｚ）、反応工程では出力は０．１〜１０ワツト（２０
ＫＨｚ）で行うことが好ましい。また振盪の能力を可変
してもよい。

本発明を実施するにあたって適宜好適な装置を用いるこ
とができるが、本発明の方法を実施するに適した好まし
い装置の一例を第１図に示す。第１図に示す装置におい
ては、乾燥ラテックス試薬の入ったアクリル樹脂製又は
（石英）ガラス製の反応セル２には、ラテックス試薬の
分散時の光学データおよび反応混合物の凝集の度合から
求めた検量線データをメモリより呼び出すコードを表示
したバーコード１２が上部に貼り付けである。反応セル
２はセルホルダー兼恒温槽１０にセットされる。該恒温
槽には、撹拌機能を付与するため超音波振動子と振盪撹
拌のための振盪機からなる撹拌装置１１が付属している
。反応セル２に貼り付けたバーコードはバーコード読み
取り装置１３でデータを読み取り、データ処理装置１４
に送られる。分散媒は恒温槽７中の分散媒容器８より送
液バルブ１７を通じて反応セル中に一定量注入される。

該反応セル中は恒温槽中１０で超音波撹拌される。その
撹拌工程において光源ｌから放射される光束は反応セル
２に導入される。光源１はコヒーレント光を放射させる
場合、Ｈｅ−Ｎｅガスレーザー（波長６３２．８％ｍ）
もしくは半導体レーザー（波長７８０ｎｍ、８３０ｎｍ
）などが用いられる。

また光源としてインコヒーレント光を放射する場合には
、タングステンランプやハロゲンランプなどが使用でき
、適当な波長をモノクロメータ−やフィルターで選択す
る。反応セル２に導入された光束は分散もしくは吸収さ
れ透過光はフォトダイオードからなる光検出器３で検知
され散乱光は光検出器４で光量検知される。

また光源１の光量変動は光検出器５で検出され、データ
処理装置１４に送られる。光検出器３，４の検出信号も
データ処理装置１４に送られ、Ａ／Ｄ変換回路から比較
演算回路に入り、メモリー回路のラテックス試薬の分散
時の光学データと対比させる。その結果より、信号が超
音波撹拌の制御装置１５に送られ、超音波撹拌の停止、
継続または分散強度を制御する、撹拌工程が終了しで、
検体が検体容器９より送液ポンプ１８を通じて光学セル
２に注入される。反応セル２内は、恒温槽中ｌＯで一定
時間（３〜５秒）振盪撹拌され、反応セル２中では凝集
反応が始まる。

反応混合物は検量線作成時の反応条件に合わせ、適宜送
液バルブ１９を通じて希釈セル２０に送られる。又、併
せて恒温槽２１中の希釈剤容器２２より送液バルブ２３
を通じて希釈剤が所定量送られ、撹拌機２４により均一
に撹拌され、反応混合希釈物を得る。反応混合希釈物は
送液バルブ２５を通じてフローセル２６に導入され、反
応混合希釈物中の凝集粒子が通過する際の散乱光を光検
出器２８で光量検知する。

これらの信号はデータ処理装置１４へ送られ、そのＡ／
Ｄ変換回路から測定演算回路で、あらかじめ入力しであ
る検量線データをもとに濃度データに演算処理され、結
果は表示装置１６に表示される。

〔実施例〕

以下、実施例及び比較例を用いて本発明をより詳細に説
明する。

１−ｈＣＧの 抗体感作ラテックス懸濁液の調製： 粒径０．７１μｍのポリスチレンラテックス（日本合成
ゴム（株）製）を１％懸濁液６０ｍ１にｈＣＧ抗体（ウ
サギ）　（Ｂ　ｉ　ｏ　　Ｍ　ａ　ｋ　ｏ　ｒ製）８ｍ
ｌを加え、よく撹拌した後４０℃で２時間加温し感作し
た。

上記の感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％懸濁液となる
よう１％牛血清アルブミン、５％ショ糖を添加したｐＨ
７，２のリン酸塩綬衝液−生理食塩水（以下ＰＢＳ）を
加え、ｈＣＧ抗体感作ラテックス懸濁液とした。

試薬の乾燥化： 上記で調整したｈＣＧ抗体感作ラテックス懸濁液を液体
窒素中で凍結減圧乾燥し乾燥試薬微粒子−１を得た。

測定／再現性評価・ 上記乾燥試薬微粒子−１１，２ｍｇの入ったガラス製光
学セル（反応セル、光路長２　ｍ　ｍ　）にＰＢＳを添
加し試薬固形分濃度０．１％となるよう調整した。上記
セルを超音波撹拌処理し、その分散過程で入射光の強さ
をＩ０、透過光の強さを■とし、１ｏｇＩ、／Ｔ＝Ａで
示される指数Ａを求める（測定波長７８０ｎｍ）。

一方、あらかじめ上述（抗体感作ラテックス懸濁液の調
整）で得られたｈＣＧ抗体感作ラテックスをＰＢＳを加
え試薬固形分濃度０．１％に調整し、上記と同様の方法
により透過光■を測定しＡ。

（＝ｌＯｇＩｏ／Ｉ）を求めたところ１．７１であった
。

撹拌処理は上記ＡがＡ／Ａｏ≦１．１をみたした時点で
停止させ（撹拌時間５５秒）、上記反応セル中にｌ０Ｉ
Ｕ／ｍｌに調整した標準ｈＣＧ溶液１００μｆを添加、
撹拌し反応混合物を得た。

次いで、反応６０秒後に希釈セル中で反応混合物をＰＢ
Ｓにより１，０００倍に希釈し、希釈液をフローセルに
導き、Ａｒレーザー（４８８ｎｍ）を照射し粒子からの
後方散乱光を検出することにより希釈液中の試薬微粒子
の凝集状態を測定した。この結果と予め作っである検量
線データと対比し、検体中のｈＣＧ濃度を測定、この操
作を１０回行い再現性を評価した。

ル較１」 撹拌工程においで、超音波による分散時間を一定にする
こと以外は実施例１と全く同様に再現性を調べた。

〈結果〉 実施例１ならびに比較例１の結果を表３に示す。

この結果から、乾燥試薬の分散状態をチエツクし、一定
の分散状態に達したときに撹拌を停止した場合、ｈＣＧ
ｆｉ度の測定値が一番真値（ＩＯＴＵ／ｍｌ）に近く、
かつ測定値の変動が小さい。

撹拌処理時間を３０秒に固定した場合、乾燥試薬の分散
が不十分で試薬微粒子が単分散せず、ｈｃＧとの反応前
に凝集状態の粒子が存在し、みかけの測定値を上げてい
るとみられる。

撹拌処理時間を６０秒に固定した場合、実施例１と概ね
撹拌処理時間は同一であるが、分散状態が個々に変動が
ある為、ＣＲＰ濃度の測定値の変動が大きくなっている
。又、撹拌処理時間を３００秒にした場合、乾燥試薬の
分散は十分となるが、撹拌による抗体の活性低下のため
か、感度が低下しｈＣＧ測定値が真値に比べ低くなって
いる。

２−ＣＲＰの 抗体感作ラテックス懸濁液の調製： 実施例１と同様のポリスチレンラテックスの１％懸濁液
６０ｍ１に抗ヒトＣＲＰヤギ血清（Ｂｉｏ　　Ｍａｋｏ
ｒ製）をカラム精製し免疫グロブリンＧ分画からなる抗
体を抽出しその４　ｍ　１２を加え、よく撹拌した後４
５°Ｃで２時間加温し感作した。

上記の感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％懸濁液となる
よう１％牛血清アルブミン、５９６ンヨ糖を添加した０
、０２Ｍ燐酸塩緩衝液に加えＣＲＰ抗体感作ラテックス
懸濁液とした。

試薬の乾燥化： 上記で調製したＣＲＰ抗体感作ラテックス懸濁液を液体
窒素中で凍結し減圧乾燥し乾燥試薬微粒子２を得た。

凝集反応−測定： 標準ＣＲＰ血清（協和油化槽）をＴｒｉｓ　　ＨＣｆ！
緩衝液で希釈し、５μｇ　／　ｍ　！！の濃度とした。

次に乾燥試薬微粒子−２１，２ｍｇの入ったガラス製光
学セル（反応セル、光路長２　ｍ　ｍ　）に試薬固形分
０．１％の濃度になるようＰＢＳを添加した。ひき続き
超音波撹拌処理し実施例１と同様指数Ａを求め（測定波
長６３３ｎｍ）、その撹拌はあらかじめ測定した０、１
％ＣＲＰ抗体感作ラテックス懸濁液の吸光指数Ａ。（１
，６５）に対しＡ／Ａ　。≦１．１をみたす時点進行っ
た（撹拌時間４５秒）。上記反応セル中に上記標準ＣＲ
Ｐ血清希釈液２０ｐｌを添加、振盪撹拌し、反応混合物
を得た。

次いで、反応１２０秒後に希釈セル中で反応混合物をＰ
ＢＳによりｉ、ｏｏｏ倍に希釈し、希釈液をフローセル
に導きＡｒレーザー（４８８ｎｍ）を照射し、粒子から
の後方散乱光を検出することにより希釈液中の試薬微粒
子の凝集状態を測定した。この結果と予め作っである検
量線データと対比し、検体中のＣＲＰ濃度を測定、この
操作を１０回行い再現性を評価した。

匿教主」 乾燥試薬の撹拌工程において超音波撹拌の時間を一定（
４８秒）にすること以外は実施例２と全く同様に再現性
（１０回の繰返し）を調べるために変動係数を算出した
。

３−　−マイクロ　ロブリンの 抗体感作ラテックス懸濁液の調製： 実施例１と同様のポリスチレンラテックスの１％懸濁液
６０ｍ！！に抗ヒトβ２−マイクログロブリン（ウサギ
）（Ｂｉｏ　　Ｍａｋｏｒ製）６ｍｌを加え、よく撹拌
した後４７°Ｃで３時間加温し感作した。

上記の感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％懸濁液となる
よう１％牛血清アルブミン、５％ンヨ糖を添加したｐ　
Ｉ（７、２のＰＢＳを加えβ２−マイクログロブリン抗
体感作ラテックス懸濁液とした。

試薬の乾燥化： 上記で調製したβ２−マイクログロブリン抗体感作ラテ
ックス懸濁液を液体窒素中で凍結し減圧乾燥し乾燥試薬
微粒子−３とした。

凝集反応−測定： 標準β２−マイクログロブリン血清（協和油化製）をＴ
ｒｉｓ　　ＨＣ１緩衝液で希釈し、５μｇ　／　ｍ　７
！の濃度とした。次に乾燥試薬微粒子−３１，２ｍｇの
入ったガラス製光学セル（反応セル、光路長２　ｍ　ｍ
　）に試薬固形分濃度０．２％になるようにＰＢＳで希
釈した後実施例１と同様、光学データをもとに超音波撹
拌を制御した（撹拌時間６５秒）。上記光学セル中に上
記で調製した所定の濃度のβ２−マイクログロブリン溶
液を２０μｌ加え振盪撹拌し反応混合物を得た。

次いで、反応１２０秒後に希釈セル中で反応混合物をＰ
ＢＳによりｌ、０００倍に希釈し、希釈液をフローセル
に導きＡｒレーザー（４８８ｎｍ）を照射し、粒子から
の後方散乱光を検出することにより希釈液中の試薬微粒
子の凝集状態を測定した。この結果と予め作っである検
量線データと対比し、検体中のβ２−マイクログロブリ
ン濃度を測定、この操作を１０回行い再現性を評価した
。

を軟土」 乾燥試薬の撹拌工程において超音波撹拌の時間を一定（
６２秒）にすること以外は実施例２と全く同様に再現性
（１０回の繰返し）を調べるために変動係数を算出した
。

４−ＡＦＰの ＡＦＰ抗体感作ラテックス懸濁液の調製実施例１と同様
のポリスチレンラテックスの１％懸濁液１．５ｍｆに抗
ヒトα２−フェトプロティン（ウマ）（ＡＦＰ）血清（
ミドリ十字社）をカラム精製し免疫グロブリンＧ分画か
らなる抗体を抽出し、その０．１ｍｌを加えよく撹拌し
た後４０℃で３時間加温し感作した。

上記の感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％懸濁液となる
よう１％牛血清アルブミン、５％ノヨ糖を添加した０、
０２Ｍ燐酸塩緩衝液に加えＡＦＰ抗体感作ラテックス懸
濁液とした。

試薬の乾燥化： 上記で調製したＡＦＰ抗体感作ラテックス懸濁液を液体
窒素中で凍結し減圧乾燥し乾燥試薬微粒子４を得た。

凝集反応−測定 標準ＡＦＰ血清（協和油化製）をＴｒｉｓ　　ＨＣＩ緩
衝液で希釈し、１５０ｎｇ／ｍＩ！の濃度とした。

次に乾燥試薬微粒子−４１，２ｍｇの入ったガラス製光
学セル（反応セル、光路長２　ｍ　ｍ　）に試薬固形分
濃度０．１％になるようにＰＢＳで希釈した後、実施例
１と同様、光学データをもとに超音波撹拌を制御した（
撹拌時間４７秒）。

上記光学セル中に上記で調製した所定の濃度のＡＦＰ溶
液を２０μｌ加え振盪撹拌し反応混合物を得た。

次いで、反応１２０秒後に希釈セル中で反応混合物をＰ
ＢＳにより１，０００倍に希釈し、希釈液をフローセル
に導きＡｒレーザー（４８８ｎ　ｍ　）を照射し、粒子
からの後方散乱光を検出することにより希釈液中の試薬
微粒子の凝集状態を測定した。この結果と予め作っであ
る検量線データと対比し、検体中のＡＦＰ濃度を測定、
この操作を１０回行い再現性を評価した。

之軟土」 乾燥試薬の撹拌工程において超音波撹拌の時間を一定（
４４秒）にすること以外は実施例４と全く同様に同時再
現性（１０回の繰返し）を調べるために変動係数を算出
した。

実施例２〜４、比較例２〜４の再現性を示す変動係数に
ついでの測定結果を第４表に示す。

第４表の結果より、被測定物質をＣＲＰ、　　β２マイ
クログロブリン、ＡＦＰに変えても、ラテックス試薬の
撹拌時間を可変に制御した実施例の方が、撹拌時間を固
定した比較例に比べて変動係数が小さくなり、再現性が
向上した。

○・良好、　△：やや不良、Ｘ不良 率みかけの測定値が高くなるが、真の値からの差は大良
好、　△：やや不良、　Ｘ不良 ＊みかけの測定値が高くなるが、真の値からの差は大第 表 Ｄ ＊ ｖ− 〔発明の効果の概要〕 以上説明したように、本発明は抗原−抗体反応を利用し
検体中の抗原、抗体などの免疫的に活性な物質を定量で
きる。

また、本発明では乾燥免疫試薬を使用するため、従来の
水中に分散した試薬に比べ試薬の保管上次のような利点
がある。

■、試薬が乾燥状態であるため水中に分散した試薬のよ
うに経時的な自然凝集が生じない。

２、試薬の保管時の温度管理が緩和される（従来の試薬
は凍結不可で保管に注意が必要）。

３、乾燥試薬は安定でより長期の保管が可能。

以上の利点を有する乾燥免疫試薬を用い、その微粒子の
再分散する工程でその分散状態を光学的に測定し撹拌手
段を制御することで以後の凝集反応がズムーズに取り行
われ、得られたデータの再現性および信頼性を大幅に向
上させることが可能になる。

また試薬分散の工程において最少限の撹拌時間に制御可
能なため感度の低下を防ぐと同時に測定時間の短縮化が
計られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を実施するのに適した装置の典型
的−例を模式的に示す図であり、第２図は各工稈におけ
る透過率変化を示す図であり、第３図は本発明の測定方
法フローチャートである。第４図乃至第６図は、実施例
１乃至３における撹拌時間とＡ／Ａ　ｏの関係を示す図
である。 第１図においで、 １・・・光源 ２・・・反応セル ３〜５．２８・・・光検出器 ６・・・ハーフミラ− ７・・・分散媒用恒温槽 ８・・・分散媒容器 ９・・・検体容器 １０．２１・・・セルホルダー兼恒温槽１１・・・撹拌
装置（超音波振動子と振盪機）１２・・・バーコード １３・・・バーコード読み取り装置 １４・・・データ処理装置 １５・・・撹拌装置の制御装置 １６・・・表示装置 １７．１８．１９．２３．２５・・・送液バルブ２０・
・・希釈セル ２２・・・希釈剤容器 ２４・・・撹拌装置 ２６・・・フローセル ２７・・・レーザー光源 ２９・・・送液チューブ ■２図 Ｏ 璽１トら１糧 時開− 釆４〜つ 苅〔陣的醍 イｂｒ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）固体微粒子の表面に、検体中の被測定物資に対し
   免疫的に活性な物質を物理的および／又は化学的に結合
   させ、この結合された免疫的に活性な物質に検体を液体
   媒体中で反応させることにより生ずる反応混合物の凝集
   の度合を光学的に測定する方法であって、 （ I ）表面に、検体中の被測定物質に対し免疫的に活
   性な物質を物理的および／又は化学的に結合せしめ乾燥
   させた固体微粒子（以下“乾燥試薬微粒子”という）を
   含む反応セル中に、分散媒を添加する工程、 （II）上記反応セル中の分散媒と乾燥試薬微粒子を撹拌
   し、上記乾燥試薬微粒子の分散媒体中での分散状態を光
   学的に測定する工程、 （III）上記工程（II）で得られる光学的な測定データ
   から分散媒中での乾燥試薬微粒子の分散状態を測定し、
   あらかじめ設定した分散状態に到達した時点で、上記工
   程（II）の撹拌を停止する工程、 （IV）上記工程（III）において設定した分散状態に到
   達した分散体に、検体を添加混合反応させて凝集状態を
   生ぜしめる工程、 （Ｖ）上記工程（IV）で生じた反応セル中の反応混合物
   を測定セルに流す工程、 （VI）該測定セルに流された反応混合物の凝集の度合を
   光学的に測定する工程、 を含むことを特徴とする免疫的に活性な物質の測定方法
   。
2. （２）上記工程（III）の分散状態の判定を、分散媒体
   中での乾燥試薬微粒子の分散状態における光学的な測定
   データをあらかじめ作成し、上記工程（II）で得られた
   乾燥試薬微粒子分散体の光学的な測定データと対比し、
   分散を確認することにより行う、請求項１記載の測定方
   法。
3. （３）上記工程（III）の分散状態の判定を、あらかじ
   め測定した分散媒体中での乾燥試薬微粒子の完全分散体
   を含む反応セル中を単色光が通過するときの入射光の強
   さをＩ＿０、透過光および／又は散乱光の強さをＩとし
   、ｌｏｇＩ＿０／Ｉ＝Ａ＿０で示される指数Ａ＿０に対
   し、上記工程（II）で得られた乾燥試薬微粒子分散体を
   含む反応セル中を、上記単色光が通過するときの入射光
   の強さをＩ＿０、透過光および／又は散乱光の強さをＩ
   としｌｏｇＩ＿０／Ｉ＝Ａで示される指数Ａが次の範囲
   であることを確認することにより行う、請求項１記載の
   測定方法。 Ａ／Ａ＿０≦１．１
4. （４）上記工程（VI）の凝集状態の光学的な測定を、上
   記工程（Ｖ）で得られた反応混合物を希釈液で希釈し、
   該希釈液を流しながら行う、請求項１記載の測定方法。
5. （５）固体微粒子の表面に、検体中の被測定物資に対し
   免疫的に活性な物質を物理的および／または化学的に結
   合させ、この結合された免疫的に活性な物質に検体を液
   体媒体中で反応させることにより生ずる反応混合物の凝
   集の度合を光学的に測定する装置であって、（ I ）前
   記反応セルを固定する手段、 （II）上記反応セル中に分散媒を注入する手段、（III
   ）上記反応セル中に検体を注入する手段、（IV）上記反
   応セル中の内容物を撹拌する第１の手段、 （Ｖ）上記反応セル中の内容物を撹拌する第２の手段、 （VI）撹拌された反応セル中の、乾燥試薬微粒子の分散
   媒体中での分散状態より得られる光学的測定データから
   、撹拌の継続・停止を制御する手段、 （VII）上記反応混合物の凝集の度合を測定する測定セ
   ルを固定する手段、 （VIII）上記反応混合物を測定セルに流す手段、（IX）
   上記測定セルに流された反応混合物の凝集の度合を光学
   的に測定する手段、 を有することを特徴とする免疫的に活性な物質の測定装
   置。