JPH03115848A - 固定化酵素膜の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 は、固定化酵素膜と試料溶液とを接触させてその酵素反
応に伴う電極検知可能物質の増減をその電極で計測する
ことにより、試料溶液中の被測定物質の濃度あるいは被
測定物質の関与する酵素反応［喪主の千灸η行８よ゛ひ
”名りＲ？ｐＹＭ’ｌシナ２しざうヒす３悶１Δ］近年
様々な分野において、生化学物質を選択的に測定するた
めに、固定化酵素膜とポーラログラフィ電極とを組合わ
せた酵素電極が用いられるようになった。たとえば、臨
床検査の分野において、血液や尿中の生化学物質（酵素
活性も含む）の測定は、病態を把握し診断を行なうため
には不可欠である。現在このような生化学物質の測定に
は、分光光度計を用いた比色法が使われているが、上述
の酵素電極法は比色法に比べて次のような利点を有して
いる。（１）測定時間が短く測定精度が優れている。（
２）測定操作が簡便で容易である。

（３）固定化酵素を利用するため測定コストが非常に低
廉である。（４）微量な試料で測定可能である。（５）
測定装置が小形でまた安価に製造できる。（６）発色試
薬などが不要である。

このような利点が理解され、酵素電極は様々な分野にお
いて注目されてはいるが、未だ広く普及するには至って
いない。その原因の１つは固定化酵素膜にある。現在の
ところ酵素電極用として利用されている固定化酵素膜は
、次の２種に限定される。

１）　　高分子の均質物質からなる膜厚２μｍ以下の第
１層と、高分子排除のための１〜２０μ朧の第２層と、
両者を接着する（固定化酵素を含む）接着層とから構成
される酵素膜。

（ｉｉ）　　電極対向側が緻密なスキン層で、試料溶液
側が酵素を固定化したスポンジ層からなる酵素膜。

上記（ｉ）の膜は、第１層が電極検知可能物質を選択的
に透過する膜であり、第２層が高分子排除のための膜で
あり、それらの２層の間の酵素層により両者を接着する
ものである。しかしながら、このような接着は必ずしも
強固ではなく、水溶液中で、あるいは電極への装着を繰
返すことによって、第１層と第２層とが剥離する。また
、上記（百）の膜では、試料溶液側の高分子排除のため
の膜がないため、実用上、たとえば臨床検査において血
液試料や尿が直接酵素層に接触するので、酵素の失活や
解離が生じ、極めて短時間しか使用できない。なお、こ
の（１１）の膜に高分子排除のための多孔性高分子膜を
被覆すれば、このような問題点は解決できるが、この場
合にも酵素膜と多孔性高分子膜とが積極的に接着されて
いないため、容易に剥離を生じる。

そこで、 この焚口りは、 上述のような従来の固定 （以千零〇） ［課題を解決するための手段〕 この発明は、酵素反応に伴う電極検知可能物質の増減を
電極で電気化学的に吐δｐ［することにより試料溶液中
の被７１１１１定物質の濃度あるいは被測定物質の関与
する酵素反応の酵素活性をＡＰ１定するような酵素電極
に用いられる固定化酵素膜の製造方法であり、電極に而
して用いられ、電極検知可能物質を選択的に透過させる
膜となるべき高分子何科を含む高分子溶液を基板上に塗
布するステップと、該基板を回転させることにより、高
分子溶液の膜を薄膜化して高分子膜を得るステップと、
該高分子膜から溶媒が消散する前に、高分子膜よりも小
さくかつ電極面に対応した酵素固定化膜を高分子膜に接
着させるステップと、高分子膜から溶媒が消散する前に
、試料溶液と接触する股として用いられ、高分子物質を
排除し、かつ被ＤＩ定物質を通過可能な多孔性高分子膜
を、酵素固定化膜をおおうようにして、その周辺の高分
子膜に接着させるステップとを備えて構成される。

Ｃ作用］ この発明では、電極に面して用いられ、電極検知物質を
選択的に透過させる膜となるべき高分子材料を含む高分
子溶液が基板上に塗布され、次に、基板を回転すること
によって、上記高分子溶液の膜は薄膜化され、当該高分
子膜から溶媒が消散する前に、該高分子膜よりも小さ（
かつ電極面に対応した酵素固定化膜が高分子膜に接着さ
れるとともに、試料溶液と接触する膜として用いられ、
高分子物質を排除し、かつ被測定物質を通過可能な多孔
性高分子膜が、上記酵素固定化膜をおおうようにして、
その周辺の高分子膜に接着される。

以下にこのＭを図面に示す実施例とともにより詳細に説
明する。

である。この実施例の固定化酵素膜１は、電極に対向す
る側の膜であって電極で検知可能な物質を選択的に透過
させる高分子薄膜１１と、酵素を固定化するための膜（
以下「固定化膜」）１２と、試料溶液側の膜であって高
分子物質は排除するが被測定物質は通過可能な多孔性高
分子膜１３とを含む。このように、固定化酵素膜１は、
部分的３層構造である。

この固定化酵素膜１は、寸法的には、たとえば、全体の
大きさは直径１０〜２５　ｆｉｌｌ、固定化膜は直径４
〜８ＩＩｌ１１１程度であり、膜厚は、３層構造部分が
２０〜５０μｍ１そして２層構造部分が５〜２０μ口で
ある。なお、３層構造部分の大きさは、この実施例では
、第２図に示す作用電極２と対照電極３の占める面積に
対応している。

また、実施例において、高分子薄膜１１の材料としては
、セルロース誘導体（たとえばアセチルセルロースやニ
トロセルロースなど）、ポリエチレンイミン、ポリアミ
ド、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、イソシアヌ
ル酸などの単独重合体または共重合体が利用可能である
。また、固定化膜１２としては、ポリビニルアルコール
、セルロース誘導体（たとえばアセチルセルロース、ニ
トロセルロースあるいは再生セルロース）、ポリ塩化ビ
ニルなどが利用可能である。多孔性高分子膜としては、
透析膜、ポリカーボネイト膜、ポリ塩化ビニル膜あるい
はポリビニルアルコール膜などが利用可能である。なお
、固定化膜１２への酵素の固定化法は、既によく知られ
ているところであり、任意の方法を採用することができ
る。

第２図は第１図に示す固定化酵素膜を装着した酵素電極
の断面図解図である。酵素電極は、ハウジング６を含み
、このハウジング６内には作用電極２と対照電極３とが
設けられ、これら２つの電極２および３は所定の間隔を
隔てて、たとえばエポキシ樹脂のような樹脂層４によっ
てモールドされている。電極材料としては、金２白金、
銀あるいは鉛などが用いられ得る。電極２および３には
そこから電気信号を取出すためのリード線５が接続され
る。この作用電極２および対照電極３の端面は、樹脂層
４から露出するように形成され、この端面は○リング７
によって保持された固定化酵素膜１で覆われる。すなわ
ち、固定化酵素膜１の高分子薄膜１１とこれらの電極２
および３の端面とが密に接触する。そして、この第２図
実施例では、固定化酵素１２は作用電極２および対照電
極３を含む面積に対応して設けられ、０リング７によっ
て固定される部分には、酵素は含まれない。

したがって、従来のもののように固定化酵素膜全面にわ
たって固定化酵素を含むものに比べて、使用する酵素の
量が少なくて済み、固定化酵素膜の製作コストの低減を
もたらし、実用上非常に有用である。また、０リングに
よって保持される部分は、高分子薄膜１１と多孔性高分
子膜１３との２層構造であり、したがってその厚みが３
層構造部分に比べて薄く、ｏリング７による保持が一層
確実になされ得る。

さらに、電極面に対応する部分にのみ形成される固定化
酵素は、第１図に示すように、その周辺の２層構造によ
って完全に封止され、そして２層構造部分では２つの膜
１１および１３の接着性は極めて良好であるため、従来
のもののように剥離図である。この実施例は、固定化酵
素が設けられる面積が一層小さくされていることを除い
て、第１図実施例と同様である。すなわち、この実施例
は、第４図に示すように、作用電極２の面に対応する部
分にのみ固定化酵素を設けたものである。

第５図は÷ｍ→好ましい実施例としての、実際の測定装
置で用いられる酵素電極の一例を示す断面図解図である
。この実施例では、ハウジング６には、試料流路９を有
する膜ホルダ８が設けられる。この膜ホルダ８にはＯリ
ング７によって固定化酵素膜１が装着され、したがって
固定化酵素膜１が電極２および３と接触することになる
。

第６図は第５図実施例の膜ホルダを電極側から見た図で
ある。試料溶液が固定化酵素膜１と接触するのは試料流
路９の部分だけである。また、作用電極２はこの試料流
路９の全部または一部に重なるように設けられる。した
がって、この第５図実施例では、固定化酵素は、第６図
の斜線で示す部分、すなわち作用電極２の面に対応しか
つ試料流路９に対応する部分にのみ形成すればよい。

上記第３図（第４図）および第５図（第６図）の実施例
によれば、第１図（第２図）実施例に比べて、さらに使
用する酵素の量を減じることができ、したがって固定化
酵素膜をより安価に製作す示すシステムダイヤグラムで
ある。−例として、酵素グルコースオキシダーゼ（ＣＯ
Ｄ）を固定化した固定化酵素膜を用い、電極検知可能物
質として過酸化水素（Ｈ２０２）を計測することにより
、グルコースの定量を行なう測定装置として説明する。

緩衝液槽２１には、ＣＯＤの酵素反応に必要な０．１モ
ルのりん酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）が入れられており、
この緩衝液はポンプ２３によって試料流路９中を通って
酵素電極１００に導かれる。

試料槽２２には、被測定物質であるグルコースを含む試
料溶液が入れられていて、同様に、ポンプ２３によって
試料流路９を経て酵素電極１００に導かれる。試料流路
９はポンプ２３を介して廃液槽２４につながっていて、
したがってこの槽２４には測定を終了した試料溶液が溜
められる。

グルコースは固定化されている酵素ＣＯＤによこの酵素
反応において生成されるＨ２０□を、作用電極２および
対照電極３によって測定することにより、化学量論的に
グルコースの濃度を知ることができる。すなわち、酵素
電極１００の作用電極２と対照電極３との間に、たとえ
ば０．６５ボルトを印加し、作用電極２の電極面でＨ２
Ｏ２は酸化し、その酸化電流を電流検出器２５によって
検出すれば、記録装置２６によってグルコース濃度を測
定ないし記録することができる。

なお、この発明に利用できる酵素としては、ＧＯＤ以外
にウリカーゼ、アミノ酸アキシダーゼ。

コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ。

ピルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼある
いはＮＡＤＨオキシダーゼなどを挙げることができる。

また、次式のような酵素反応を共役させることによって
酵素活性を測定することもできる。

被測定酵素 なお、被測定酵素の例としてアミラーゼあるいはβ−ガ
ラクトシダーゼが、オキシダーゼ類の例としてＮＡＤ依
存性酵素等が挙げられる。

なお、上記具体例では、電極検知可能物質とし酸素。

アンモニア。

炭酸ガス。

などのそれぞ れの電極にも適用可能である。したがって、この９定化
酵素膜を利用し得る酵素は上記オキシダーゼ類以外のも
のも多数あることは言うまでカ〕ムを示す図解図である
。まず、第８図（Ａ）に示すように、硝子板１０上に電
極側の高分子薄膜１１（第１図）の材料溶液いわゆるキ
ャスト液１１′を流延する。そして、この硝子板１ｏを
高速回転たとえば１０００〜４０００ｒ＋ｖ、回転時間
２〜８秒で回転させることにより、第８図（Ｂ）に示す
ように、硝子板１０上に電極側の高分子薄膜１１を形成
する。次に直ちに、第８図（Ｃ）および（Ｄ）に示すよ
うに、酵素固定化膜１２および試料溶液側の多孔性高分
子膜１３を積層する。

このようにして、揮散しないで残存しているキャスト液
の溶媒によって酵素固定化膜１２と多孔性高分子膜１３
の一方面を一部溶解することにより、高分子薄膜１１と
酵素固定化膜１２および多孔性高分子膜１３とを接着す
る。そして、第８図（Ｅ）に示すように、最後に、硝子
板を水溶液中に浸漬し、水中で固定化酵素膜１をその硝
子板より剥離する。

なお、第８図（Ｄ）の工程に代えて次のようにしてもよ
い。すなわち、酵素固定化膜１２のみをあらかじめ高分
子薄膜１１に同じような方法で接着し、次いで酵素を固
定化しその後にキャスト液の溶媒を多孔性高分子膜１３
の一面に塗布することにより、同じような部分的３層構
造の固定化酵素膜を形成することもできる。

このような方法で製作した固定化酵素膜は、固定化され
た有効な酵素が多量であるため、酵素電極から得られる
電流変化値が大きい。また、高分子薄膜１１と酵素固定
化膜１２および多孔性高分子膜１３の接着は、キャスト
液の溶媒によってそれらの一部を溶解させることにより
接着するようにしたので、強固な接着性を有する。しか
も、部分的３層構造とし、酵素固定化膜１２の周辺は２
層構造として膜１１と１３とを直接融合接着させるよう
にしたので、さらに接着性が強固なものとなり、剥離性
などの機械的強度が一層増強される。

次に、実施例によってこの製造方法をより詳細に説明す
る。なお、この超ｇ目に利用される膜材料の組合せおよ
び利用可能な酵素は、非常に多数あり、したがってＸこ
の、怖明はこのような実施例の膜材料等に限定されるも
のではないことを予め指摘しておく。

実施例１ アセチルセルロースの２〜６重量％のアセトン−シクロ
ヘキサノン混合液（アセトン８０部およびシクロへキサ
ノン２０部）によってキャスト液を調製し第８図（Ａ）
に示すような硝子板上に分取する。次に、この硝子板を
４〜６秒間高速回転（２０００〜４０００ｒｐｍ）させ
、高分子薄膜としてのアセチルセルロース薄膜を得る。

さらに、キャスト液の有機溶剤が揮発している間にすな
わち揮散してしまわないうちに、直ちに酵素固定化膜と
、試料溶液側の多孔性高分子膜としてのポリカーボネイ
ト膜（商品名：ニュークリボアー）を順次接着させる。

酵素固定化膜はセルロースフィルタ（商品名二ミリポア
フィルタ、ＴＨタイプ）をＧＯＤ　１０ｉ　ｇ　／ｍ　
Ｌおよび牛血清アルブミン１０ｍｇ／ｍｌと０．５％グ
ルタルアルデヒドの混合溶液に浸漬することにより製作
した。最後に固定化酵素膜のできた硝子板を水溶液中に
浸漬しそれを硝子板から剥離した。この方法によって得
られた膜は、その大きさは直径２５ｍｍ、酵素固定化膜
の直径６Ｉｎｆｆｉであり、膜厚は、２層構造部分は１
２μｍ、３層構造部分は３７μｍであった。

そして、この固定化酵素膜をＨ２０□電極に装着した。

Ｈ２Ｏ２電極は、作用電極として白金（０，８ａ＋ｍφ
）を、対照電極として銀（８，５ａａ＋φ）とした。こ
のようにして作成した酵素電極を第７図に示したような
測定装置に配置し、グルコースを測定した。その評価実
験の結果を表に比較例とともに示す。

比較例 アセチルセルロースの４重量％のアセトン−シクロヘキ
サノン混合液（アセトン３０部およびシクロへキサノン
２０部）を調製し、硝子板上に流延した後、しばらく放
置し、その後ｎ−ヘキサン中に浸漬する。次にこの膜を
水洗いして上記実施例と同様な酵素液を塗布し、その上
にポリカーボネイト膜を被覆した。最後に硝子膜から剥
離し、上記実施例と同様のＨ２Ｏ。電極に装着した。こ
の比較例の評価実験の結果は吹製のとおりである。

（通人Ｔｌ≧白） グルコース 接着性 応答速度 比較例 ５ｎ 水溶液中 １０秒 で剥離 （ＸＡんＦ命い） ［発明の効果］ 以上のように、この発明によれば、高分子膜の溶媒が消
散する前に、固定化酵素膜を電極面に対応する部分にの
み接若し、その周辺においては、高分子膜と多孔性高分
子膜とを直接接着するようにして、部分的三層構造の固
定化酵素膜を得ることができる。この発明による固定化
酵素膜は、各膜がｉ分４溶解により接着しているため、
接着性が非常によく剥離が生じることがない。しかも、
酵素は電極面に対応する部分にのみ固定化されているの
で、制作上必要な酵素量が非常に少なくてすみ、制作コ
ストが一層低減される。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明による固定化酵素膜の一実施例を示す
断面図解図である。第２図は第１図実施例を利用した酵
素電極の一例を示す断面図解図である。第３図はこの発
明による固定化酵素膜の他の実施例を示す断面図解図で
ある。第４図は第３図の実施例を利用した酵素電極の一
例を示す断面図解図である。第５図はこの発明による固
定化酵素膜が有利に利用され得る具体的な測定装置のた
めの酵素電極の好ましい例を示す断面図解図である。第
６図は第５図において膜ホルダを電極側から見た平面的
図解図である。第７図はこの発明による固定化酵素膜を
装着した酵素電極が利用され得る測定装置のシステムダ
イヤグラムである。第８図はこの発明の一実施例の固定
化酵素膜の製造方法を工程順次に示す図解図である。 図において、１は固定化酵素膜、１０は硝子板、１１は
高分子薄膜、１２は酵素固定化膜、１３は多孔性高分子
膜を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 酵素反応に伴う電極検知可能物質の増減を電極で電気化
   学的に計測することにより試料溶液中の被測定物質の濃
   度あるいは被測定物質の関与する酵素反応の酵素活性を
   測定するような酵素電極に用いられる固定化酵素膜の製
   造方法であって、前記電極に面して用いられ、前記電極
   検知可能物質を選択的に透過させる膜となるべき高分子
   材料を含む高分子溶液を基板上に塗布するステップと、 前記基板を回転することにより、前記高分子溶液の膜を
   薄膜化して高分子膜を得るステップと、前記高分子膜か
   ら溶媒が消散する前に、前記高分子膜よりも小さくかつ
   前記電極面に対応した酵素固定化膜を前記高分子膜に接
   着させるステップと、 前記高分子膜から溶媒が消散する前に、前記試料溶液と
   接触する膜として用いられ、高分子物質を排除し、かつ
   前記被測定物質を通過可能な多孔性高分子膜を、前記酵
   素固定化膜をおおうようにして、その周辺の前記高分子
   膜に接着させるステップとを備えた、固定化酵素膜の製
   造方法。