JPH0311021A

JPH0311021A - 免疫増強剤

Info

Publication number: JPH0311021A
Application number: JP1142320A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Fujiwara; 茂藤原; Yukio Kadooka; 幸男門岡; Tetsuji Hirota; 廣田　哲二
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1989-06-05
Filing date: 1989-06-05
Publication date: 1991-01-18
Anticipated expiration: 2009-06-15
Also published as: JPH0645547B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】皮呈上東肌■光互本発明は、アスペルギルス属に属するマイトジェン活性
物質の生産能を有する微生物を培養して得られる培養上
清、或いは、該培養上清を分画して得られる活性画分を
有効成分とする免疫増強剤に関する。

且１１１え量病原微生物を始めとして、種々の非自己が生体に侵入し
ようとする場合、生体はそれを排除して自己の恒常性を
維持しようとする機能、すなわち免疫機能を有している
。しかし、腫瘍を始めとして各種の疾病罹患時やその回
復時、外科的手術後の回復期、低栄養状態、あるいは人
の老化した段階においては各種の免疫機能、感染防御機
能が著しく低下し、重篤なる感染症、合併症、さらには
ＩＩ瘍の進行や高頻度発生が起きる。

このため、従来よりレンチナン、クレスチン、酵母細胞
壁のグルコマンナン等を主体とする多糖類や、ＢＣＧ、
ビシバニール等の微生物製剤、さらには各種合成ペプチ
ド剤が開発されている。しかしこれらは消化器疾患時に
おける低栄養状態下では必ずしも効果が発現されず、ま
た、製剤によっては治療量として継続投与すると各種の
副作用を呈することも知られている。

日が”′　しようとする１本発明は、上述のような状況に鑑みなされたものであっ
て、工業的な生産が容易であって、副作用がなく安全性
が高く、かつそれ自体が栄養源として利用し得る免疫増
強剤を提供することを課題とする。

量　を解°するための本発明者は、日常の食生活で広く利用されている乳成分
を、それの利用可能な微生物で発酵させた場合に、その
培養上清中に生成される物質にっいて、リンパ球分裂促
進作用（マイ（・ジエン活性）を指標にスクリーニング
を行った結果、市１］［１発酵食品から分離したアスペ
ルギルス属に属する微生物に乳成分を含む半合成培地中
に強いマイトジェン活性物質を生産する菌株を見出し、
本発明をなすに至った。

すなわち、本発明の特徴は、アスペルギルス属に属する
マイトジェン活性物質生産菌を、乳成分を含む培地中で
培養した後、菌体を除去して得られる培養上清もしくは
該培養上清を分画して得られる活性画分を有効成分とす
る免疫増強剤にある。

本発明で利用するアスペルギルス属に属するマイトジェ
ン活性物質生産菌は、市販麹発酵食品から分離されるも
のであって、下記手順に従って培養を行い、その培養上
清についてマイトジェン活性を測定し、その活性の強い
ものを選択することにより得られる。

■マイトジェン活性測定用試料の調製：食品由来のアス
ペルギルス属に属する菌株について、無脂乳固形分８％
、酵母エキス０．３％、グルコース１．０％から成る半
合成培地に供試菌の前培養物を１％接種し、２７℃の温
度で７２時間振盪培養し、培養終了後、菌体を濾別し、
ｐｉを４．６に調整して蛋白質を除いた後、再びｐＨを
７．０に調整したものを０．２μ−のミリポアフィルタ
−で濾過滅菌してマイトジェン活性測定用の試料どした
。なお、参考としてアスペルギルス属以外の糸状菌につ
いても同様にしてマイトジェン活性を測定した。

■マイトジェン活性の測定：マイトジェン活性は次のようにして測定した。

Ｃ３Ｈ／Ｈｅ　Ｎマウス牌細胞を採取、洗浄した後、牛
胎児血清１０％を含むＩＩＰＭＩ　１６４０培地に浮遊
させた。

５ＸｌＯ’／ウエルになるように９６穴マイクロプレー
トに分注し、これに上記により調製した各試料を１／１
０量づつ添加し、対照ウェルにはコンカナバリンＡ（終
濃度１μｇ／−）、リポポリサンカライド（終濃度１０
０μｇ／−）を加え、３７℃、４８時間、５％Ｃｏｔ条
件下でそれぞれ培養した。培養終了後、３−（４，５−
ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニール−
２Ｈテトラゾリウムブロマイド（以下、肘↑と略記）液
１０μｌ添加し、更に３時間培養、生ずるＮＴＴフォル
マザンをＥＬＩＳＡリーダーを用い５６２〜５９５ｎ−
で吸光度を測定した〔メディカル・イムノロジ！２（３
）、４１１−４１５（１９８６））　、マイトジェン活
性比（Ｓ、　ｆ、）は次のようにして求めた。

結果は第１表に示すとおりである。

第１表注）　　（−）＝　Ｓ、、１．１．００以下、　（±）
−５，ｆ、１．００−１．１９（＋）＝　　Ｓ、ｌ　　
１．２０−１．３９、（＋　＋）＝Ｓ、１．　１．４０
−１．５９をそれぞれ表わす。

第１表にみられるように、供試微生物中アスペルギルス
属に属する菌株に強いマイトジェン活性が認められた。

上記の強いマイトジェン活性を示すアスペルギルス属に
属する菌株についての菌学的性質を示すと次のとおりで
ある。

生育麦芽エキス寒天培地−２５℃での生育は速く、５日以内
に直径３〜５０■に達する。基底菌糸層は白色、細毛状
、密で、長い分生子柄の菌糸層を成す。

コロニー表面は緑黄色、裏面は白色を呈し、裏面は平滑
で開裂を呈しない。

ツアペック寒天培地−麦芽エキス寒天培地とほとんど同
じ生育性状を示すが、２５℃での生育は麦芽エキス寒天
培地に比較して遅く、分生子の形成も遅れる。

皿分生子柄は淡褐色、透明で先端は細球形の頂のうを成し
、その先端よりフィアライドが一層形成されるが、メト
μは形成されない。分生子柄は長さ４００〜８００μで
表面は粗である。分生子はフィアライド先端より数条な
いし士数条に分かれて放射状に並び、分生子頭を形成す
る０分生子頭は淡い青緑色を呈し、大きさは１００〜２
００μである。

分生子は５〜６μの球状を呈し、表面は粗状である。

上記の菌学的性質に基いて、宇田用俊−１椿啓介他著“
石類図鑑”（講談社１９８２年）を参照して分類した結
果、本菌株はアスペルギルス属に属するものと判断され
る。なお、本菌株は、ＡＳｐｉｔｒｇ（１）ｕＳｓｐ、
ＥＦ８株として微生物工業技術研究所に「徽工研寄託第
１０６５９号（Ｆｆ！ＲＭ　Ｐ−１０６５９）　Ｊの番
号で寄託しである。したがって、本菌株を以下ＥＦＢ株
と略記する。

本発明では、アスペルギルス属に属するマイトジェン活
性物質生産菌としてＥＦＢ株を利用して、前記有効成分
としての培養上清並びにそれを分画して得られる活性画
分を下記により調製し得る。

■培養上清の調製乳成分を含む培地、例えば下記組成の培地にＥＦＢ株を
接種し、２７℃で７２時間程度振盪培養した培養液から
菌体を濾別して得られる。

匝生組底（重量）無脂乳固形分　　　　８　％酵母エキス　　　　　０，３％グルコース　　　　　　１．０％上記割合の成分を水に溶解しｐｕを７．０に調整した後
殺菌する。

■活性画分の調製：上述のようにして得られた培養上滑をｐＨ４，６に調整
して等電点沈澱によって蛋白質を除去した後、下記によ
り分画を行って活性画分を得る。

（１）ゲル濾過法による分画上記により培養上清から蛋白質を除去した液をｐｉ！　
７．０に調整して凍結乾燥した後、セファデックスＧ−
５０カラムで分画し、カラムボリュウム付近に溶出して
（る画分を採取する。

（ｉｉ）＠着りロマトグラフィーによる分画上記除蛋白
した濾液をｐＨ７，０に調整した後、オクタデシルシラ
ン逆相カラムを通し、次いでメタノールの５０〜１００
％濃度で溶出してくる両分を採取する。

これらの両分について溶媒を除去した後、凍結乾燥して
得られる物質は下記に示す性状を有する。

分子量：１２％濃度のゲルを用いた尿素５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動およびセフアゾ、７クス（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０を用いたゲル濾過により、約
３０００と推定される。

溶解性：水および５０％メタノールに可溶であるが、エ
ーテル、クロロホルム、アセトンは不溶。

呈色反応：ｆ１層クロマトグラフィーおよび電気泳動に
おける呈色反応では、硝酸銀染色、クーマシーブリリア
ントブルー染色およびニンヒドリン染色で発色し、ＰＡ
Ｓ染色では呈色しない。

本画分は上記の性状および脂質成分を含まないことから
、その主体がペプチドであると言える。

次に、本発明に係る上記画分についてアジュバント活性
および抗腫瘍活性の試験結果を説明する。

ヱ之土バヱエ亘快上記のオクタデシルシラン逆相カラムに通して得られた
吸着画分（以下［！Ｐ　８−００３画分と略記）から凍
結乾燥物を調製し、下記手順に従って試験を行った。因
に、アジュバント活性は抗原とともに主体に投与した場
合、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強させる能力
をいう。

試験方法：ＢＡＬＢ／ｃ、雌、６週令マウス、１群１６匹に対し抗
原としてのジニトロフェニールオボアルブミン（ＤＮＰ
−ＯＶＡ）　１００　ｕ　ｇ、無脂乳固形分８％の脱脂
乳のオクタデシルシラン逆相カラム吸着画分（ＳＭ−０
０Ｓ画分）１００μｇ（比較例）、および、ＥＦ　８−
００Ｓ画分１００μｇ（本発明による百分）をフロイン
ト不完全アジュバント（ＦＩＡ）と共に腹腔内投与し、
１０日後に血清中の抗ＤＮＰ−０νＡ　ＩｇＭ抗体価を
ＥＬＩＳＡ法で測定した。

抗体価は３７℃、６０分間反応後、４０５０■の吸光度
が０．１以下になる時の血清希釈率で求めた。結果を第
２表に示す。

第２表坑ｌ団敷配性率　各群は抗原としてＤＮＰ−ＯＶＡ　１００μｇを含
む。

＊本４０５ｎｍの吸光度が０．１以下になる時の血清希
釈倍数。

第２表にみられるとおり、ＥＦ　８−００５画分を１１
００ｕ接種した場合、１ｇＭクラスにおいて明らかに血
清抗体応答促進効果のあることが認められた。この効果
はＰＩＡ単独投与群との間では有意水準５％で、５Ｍ−
００Ｓ画分投与群との間では有意水準１％で有意差が認
められた。なお、シリーズを変えて行った場合、接種後
の時間が経過するにつれて血清抗体種のクラススイッチ
の結果としてＩｇＭからＩｇＧにおいてこの血清抗体促
進効果が認められた。

ＩＣＲマウス、雄、６週令、１群８匹に対し、腫瘍接種
４日前、１日前にＰＢＳ緩衝液、５Ｍ−０ＤＳ画分およ
びＥＦ　８−００３画分を各１００μｇづつ腹腔内に接
種した。腫瘍細胞接種当日５ａｒｃｏ＊ａ１８０を５Ｘ
１０’個腹腔内に接種した。引き続き１日後から４日間
、１日１回、同量の各試料を腹腔内に接種し、各群の生
残曲線をもとめた。結果を第１図に示す。

この図から明らかなように、５Ｍ−０ＤＳ画分接種群は
ほとんど変わらない生残性を示したのに対し、ＥＦ　８
−ＯＤＳ画分接種群は対照群に比較して著しい生残性の
効果が認められた。一般に、低分子物質を直接生体に接
種した場合、生体によって速やかなに代謝、分解される
ことが知られている。しかし、上述の結果のように零Ｅ
Ｆ　８−００３画分は腹水型Ｉ１１ｆＩｇにおける生残
性を著しく改善する効果の認められたことから、本発明
で用いるＥＦＢ株は明らかに免疫応答の修飾活性物質を
培養上清中に生産しているものといえる。

（ｂｌ　　　　　　に　するＢＡＬＢ／Ｃマウス、雄、６週令、１群８匹を用い、対
照群にはＰＢＳ緩衝液１００μｌを、試験群には５Ｍ−
０ＯＳ画分１０００μｇまたは、ＥＦ　８−０ＯＳ画分
１０００μｇをＭｅｔｈＡ細胞Ｉ　Ｘ　１０’個と同時
に背部皮下に接種した。１７日後に背部腫瘍を摘出し、
腫瘍生着の有無およびその重量を測定した。操り返し３
回行った時の生着率を第３表に示した。

第、３表注）各群全例２４匹の内、皮下腫瘍が生着した割合を示
す。

ＥＰ　８−００５画分画分群ではＭｅｔｈＡ細胞は１例
（４，２％）しか生着しなかったのに対し、対照群およ
び５Ｍ−０ＯＳ画分接種群では９１．７％が生着した。

この結果は、三元表による解析ならびにブロック間に差
がないことから、データをプールした均一性の検定なら
びに多重比較を行ったが、０．５％以下で有意差が認め
られた。さらに、後二者では増殖した腫瘤は０．３〜０
．８ｇであったのに対し、ＥＦ　８−ＯＤＳ画分画分群
では０．０５ｇ以下とはるかに小さかった。

ｔｃ＋　　ＥＦ　８−ＯＤＳ　　　の　　　胞に　する
上述した皮下ＩＬ１瘍抑側抑制効果Ｆ　８−．００３画
分の腫瘍細胞に対する細胞毒性に由来するのか否かを確
認するために、以下の方法によってＭＴＴアンセイ系を
用いて検討した。すなわち、ＢＡＬ８／ｃマウス腹腔内
で継代したＭｅｔｈＡ細胞を採取し、試験管内で２代継
代した細胞を１×１０Ｓ／ウエルになるように９６穴マ
イクロプレートに分注した。各ウェルに５Ｍ−０ＯＳ画
分とＢＦ　Ｂ−ＯＤＳＭ分をそれぞれ０．ＯＬ　Ｏ，１
，１，０および１０．０ｇｇ／ＭＩｌになるように添加
し、５％Ｃ（ｈ条件下で３７℃、１２時間培養した。そ
の後、１時間ＭＴＴアッセイを行って、それぞれの細胞
障害性を評価した。結果を第２図に示す。

本図から明らかなように、５Ｍ−００５画分およびＥＦ
　８−ＯＯＳ画分ともほとんど細胞障害性を示さなかっ
た。

高濃度添加区分（１０ｍｇ／Ｍ１）では時間の経過につ
れて細胞障害性が認められたが、両試料とも同様の傾向
を示すことから実際の抗腫瘍試験において対照群に５Ｍ
−０ＯＳ画分を用いる限りその抑制効果の判定には何ら
影響をおよぼさないものといえる。

したがって、前述した腹水腫瘍および皮下腫瘍に対する
ＥＦ　８−００３画分の抑制効果は細胞毒性に由来する
ものではなく、全身系の免疫能が賦活されたことによる
効果であるといえる。

本発明に係る免疫抑制剤は経口または非経口的に投与さ
れる。培養上清を有効成分とする場合には培養終了後、
菌体を濾別した上清のｐＨを７．０に調整し、必要に応
じて凍結乾燥したものを調製する。また、培養上清を分
画して得られる活性成分を有効成分とする場合は、培養
終了後、菌体を濾別し、等電点沈澱により蛋白を除去し
、再びｐＨを７．０に調整した後、吸着クロマトグラフ
ィにかけ、メタノール５０乃至１００％濃度で溶出して
くる両分を採取し、凍結乾燥粉末を調製する。

これらを経口投与するに当ってはそのままの状態でもよ
く、また、常法に従って錠剤、カプセル、ドリンク剤等
の製剤化して用いる。さらに、この免疫増強剤を各種栄
養剤や通常の食品に混ぜ、免疫機能の低下した罹病者、
病後者、術後者あるいは高齢者に与える事ができる。

投与量は年齢、体重、治療効果、病態等によって異なる
が、通常成人−人当り１回に１０〜１００ｓ＋ｇの範囲
で１日１回から数回経口投与される。

非経口投与のための注射剤としては無菌の注射用蒸留水
、生理食塩水、その他の注射用溶剤に溶解し、１回１０
０μｇ〜１０−ｇの範囲で１日１回乃至数回静脈注射に
より投与する。

以下実施例により本発明による免疫増強剤の調製を具体
的に示す。

実施例１無脂乳固形分８％、酵母エキス０．３％、グルコ−ス１
％から成る半合成培地にアスペルギルスＥＦ８株の前培
養物を１％接種し、２７℃で７２時間振盪培養した。培
養終了後、６０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離により菌
体を除去し、培養上清を得た。等電点沈澱によりｐｉ（
４，６で除蛋白後、再びｐＨを７．０に調整し凍結乾燥
した。培地１（［当り凍結乾燥粉末２５ｇが得られた。

実施例２実施例１で得られた凍結乾燥粉末をギ酸緩衝液（ｐＨ６
，０）に溶解し、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０カラムでゲ
ル濾過を行った。同上の緩衝液で溶出し、トータルボリ
ューム付近の両分を分取し、凍結乾燥を行った。

培地ｌＯＥより凍結乾燥粉末８ｇが得られた。

実施例３実施例１で得られた凍結乾燥粉末を水に熔解しオクタデ
シルシラン逆相カラムに通し、次いでメタノール濃度を
順次高めながら溶出し、メタツル５０〜１００％濃度で
溶出してくる百分を採取し、凍結乾燥を行った。培地１
０１より凍結乾燥粉末２ｇが得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係る有効成分としてのＥＦ　ＢＯＯ
Ｓ画分の腹水型腫瘍に対する抑制効果を示したものであ
り、第２図は、上記画分の細胞毒性作用を示したもので
ある。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アスペルギルス属に属するマイトジェン活性物質
の生産能を有する微生物を、乳成分を含む培地で培養し
た後、菌体を除去して得られる培養上清を有効成分とす
る免疫増強剤。
（２）アスペルギルス属に属するマイトジェン活性物質
の生産能を有する微生物を、乳成分を含む培地で培養し
た後、菌体を除去した培養上清を分画して得られる活性
画分を有効成分とする免疫増強剤。
（３）活性画分は、培養上清から蛋白質を除去した後、
ゲル濾過法により得られるものである請求項（２）に記
載の免疫増強剤。
（４）活性画分は、培養上清から蛋白質を除去した後、
吸着クロマトグラフィに付して得られるものである請求
項（２）に記載の免疫増強剤。
（５）上記微生物がアスペルギルスｓｐＥＦ８株（微工
研寄託第１０６５９号）である請求項（１）乃至（４）
のいずれかに記載の免疫増強剤。