JPH03103179A - ヒト糖タンパク質抗原に対するキメラ抗体 - Google Patents
ヒト糖タンパク質抗原に対するキメラ抗体Info
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Classifications
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
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- C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、モノクローナル抗体９． ２． ２ ７から
誘導されるマウス／ヒトの牛メラ抗体をコードしている
新規ＤＮＡ化合物、および組換えＤＮＡクローニングベ
クターに関する。本発明のベクターは真核生物細胞にお
いてこの新規ＤＮＡ化合物を発現させる。さらに、本発
明はこれら新規クローニングベクターで形質転換された
宿主細胞にも関する。この形質転換された宿主細胞はキ
メラの９．２．２７抗体、またはそれらの誘導体を発現
する。
誘導されるマウス／ヒトの牛メラ抗体をコードしている
新規ＤＮＡ化合物、および組換えＤＮＡクローニングベ
クターに関する。本発明のベクターは真核生物細胞にお
いてこの新規ＤＮＡ化合物を発現させる。さらに、本発
明はこれら新規クローニングベクターで形質転換された
宿主細胞にも関する。この形質転換された宿主細胞はキ
メラの９．２．２７抗体、またはそれらの誘導体を発現
する。
多数の本発明ＤＮＡ化合物を使用すれば、天然または実
験室においてもこれまでに合成されたことのない９．２
．２７の誘導体を製造することができ、本発明はさらに
、これまでに例のないこれら分子をも包含するものであ
る。
験室においてもこれまでに合成されたことのない９．２
．２７の誘導体を製造することができ、本発明はさらに
、これまでに例のないこれら分子をも包含するものであ
る。
モノクローナル抗体９．２．２７は、黒色腫細胞におい
て高い密度で見いだされ、また血管平滑筋を包含する幾
つかの正常組織にも見い出されるコンドロイチン硫酸プ
ロテオグリカンのコアタンパク質として役立つ〜２５０
，０００ダルトンの糖タンパク質に特異的に結合するネ
ズミ抗体である。
て高い密度で見いだされ、また血管平滑筋を包含する幾
つかの正常組織にも見い出されるコンドロイチン硫酸プ
ロテオグリカンのコアタンパク質として役立つ〜２５０
，０００ダルトンの糖タンパク質に特異的に結合するネ
ズミ抗体である。
この抗体は、疾患のインビトロ検出、ならびに黒色腫の
インビボ検出およびその処置に有用である。
インビボ検出およびその処置に有用である。
癌患者の免疫系においてネズミ免疫グロブリンに対する
抗体が創製される場合、ヒト対象にネズミ抗体を使用す
ることに付随する１つの問題が生じる。この免疫応答は
すべての患者で起こるとは限らないが、それが起こると
きには、多数回投与処方の間に治療効率が徐々に低下す
ることになる。
抗体が創製される場合、ヒト対象にネズミ抗体を使用す
ることに付随する１つの問題が生じる。この免疫応答は
すべての患者で起こるとは限らないが、それが起こると
きには、多数回投与処方の間に治療効率が徐々に低下す
ることになる。
この患者の免疫応答は、患者の血流からネズミ抗体を急
速にクリアランス（浄化）させ得るのである。
速にクリアランス（浄化）させ得るのである。
また、このような応答はアナフィラキシーまたは血清病
に類似したさらに重篤な反応を導くこともあろう。この
免疫原性は抗体の多数回投与を不可能にし、したがって
上記処置の臨床的な価値を減少させる。
に類似したさらに重篤な反応を導くこともあろう。この
免疫原性は抗体の多数回投与を不可能にし、したがって
上記処置の臨床的な価値を減少させる。
ヒトモノクローナル抗体は製造するのが困難であるので
、キメラ抗体を構築して免疫学的な問題を回避している
。キメラ抗体とは、ある種由来の抗原特異的な領域、す
なわち可変領域と、これに結合した別の種由来の定常領
域とからなるものである。オイおよびモリソン（Ｏｉ
ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）のＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ４ ： ２１４−２２１（１９８６）を参照のこ
と。
、キメラ抗体を構築して免疫学的な問題を回避している
。キメラ抗体とは、ある種由来の抗原特異的な領域、す
なわち可変領域と、これに結合した別の種由来の定常領
域とからなるものである。オイおよびモリソン（Ｏｉ
ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）のＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ４ ： ２１４−２２１（１９８６）を参照のこ
と。
免疫応答は定常領域に指向していることが多いので、ネ
ズミ定常領域をヒト定常領域に置換すれば、患者の免疫
学的反応は大きく減少することになる。
ズミ定常領域をヒト定常領域に置換すれば、患者の免疫
学的反応は大きく減少することになる。
したがって、キメラ抗体は疾患の処置に極めて望ましい
ものである。
ものである。
キメラ抗体の一般的な概念は文献公知であるが、ある種
の特異性を有する新規なキメラ抗体を開発することが今
なお必要とされている。本発明は、９． ２． ２ ７
モノクローナル抗体分子の可変領域からなる組換えＤＮ
Ａ，およびアミノ酸配列を開示するものである。これら
の配列を操作し、９．２．２７と同じ組織特異性を有し
ているがヒト供給源由来の定常領域を含有するキメラ抗
体を発現させた。したがって、本発明は、モノクローナ
ル抗体９．２．２７と同じ組織特異性を有するが免疫学
的な副作用が大きく減少された治療法を可能にするもの
である。
の特異性を有する新規なキメラ抗体を開発することが今
なお必要とされている。本発明は、９． ２． ２ ７
モノクローナル抗体分子の可変領域からなる組換えＤＮ
Ａ，およびアミノ酸配列を開示するものである。これら
の配列を操作し、９．２．２７と同じ組織特異性を有し
ているがヒト供給源由来の定常領域を含有するキメラ抗
体を発現させた。したがって、本発明は、モノクローナ
ル抗体９．２．２７と同じ組織特異性を有するが免疫学
的な副作用が大きく減少された治療法を可能にするもの
である。
本明細書中に開示し、特許請求している発明のため、以
下のように用語を定義する。
下のように用語を定義する。
Ａ：デオキシアデノシン。
Ａｌａ：アラニン残基。
ＡＰＩｌ＝アンピシリン耐性の表現型またはそれを付与
する遺伝子。
する遺伝子。
Ａｒｇ：アルギニン残基。
Ａｓｎ：アスパラギン残基。
Ａｓｐ：アスパラギン酸残基。
Ｃ：デオ牛シシトシン。
キメラ抗体：ある種（代表的にはマウス）由来の可変領
域と、これに結合した第２の別の種（代表的にはヒト）
由来の定常領域からなる抗体。
域と、これに結合した第２の別の種（代表的にはヒト）
由来の定常領域からなる抗体。
ＣＳＰ：コンドロイチン硫酸プロテオグリカンＣｙｓ：
システイン残基。
システイン残基。
ｄｈｆｒ：ジヒドロ葉酸還元酵素の表現型またはそれを
付与する遺伝子。
付与する遺伝子。
Ｇ：デオキシグアノシン。
Ｇｉｎ：グルタミン残基。
Ｇｌｕ：グルタミン酸残基。
Ｇｌｙ：グリシン残基。
０４１８”：Ｇ４１８耐性の表現型またはそれを付与す
る遺伝子であり、ＫＩｌ１″と記載されることもある。
る遺伝子であり、ＫＩｌ１″と記載されることもある。
Ｈｉｓ：ヒスチジン残基。
ＨｍＲ：ハイグロマイシン耐性の表現型またはそれを付
与する遺伝子。
与する遺伝子。
１１ｅ：イソロイシン残基。
ＩＶＳ：介在配列とも呼ばれる、イントロンをコードし
ているＤＮＡ０ Ｌｅｕ：ロイシン残基。
ているＤＮＡ０ Ｌｅｕ：ロイシン残基。
Ｌｙｓ：リジン残基。
Ｍｅｔ：メチオニン残基。
ＭｏＡＢ：モノクローナル抗体。
９． ２． ２ ７抗原二Ｍ２１ヒト黒色腫セルライン
ならびに他のヒト黒色腫セルラインおよびヒト黒色腫腫
瘍組織上に見いだされるフンドロイチン硫酸プロテオグ
リカンのコア糖タンパク質である、約２５０．ＯＯＯダ
ルトンの糖タンパク質。
ならびに他のヒト黒色腫セルラインおよびヒト黒色腫腫
瘍組織上に見いだされるフンドロイチン硫酸プロテオグ
リカンのコア糖タンパク質である、約２５０．ＯＯＯダ
ルトンの糖タンパク質。
９．２．２７：ハイブリドーマセルライン由来の不ズミ
モノクローナル抗体であって、Ｍ２ｌヒト黒色腫セルラ
イン上に見いだされるコンドロイチン硫酸プロテオグリ
カンのコア糖夕冫パク質である約２５０．０００ダルト
ンの糖タンパク質を認識する該抗体。
モノクローナル抗体であって、Ｍ２ｌヒト黒色腫セルラ
イン上に見いだされるコンドロイチン硫酸プロテオグリ
カンのコア糖夕冫パク質である約２５０．０００ダルト
ンの糖タンパク質を認識する該抗体。
形或期タンパク質：ｓＲＮＡ転写物の翻訳の際に生或さ
れるポリペブチドであって、翻訳後の修飾を受ける前の
もの。
れるポリペブチドであって、翻訳後の修飾を受ける前の
もの。
Ｐｈｅ：７ｚニルアラニン残基。
Ｐ ｒｏ ：プロリン残基。
プロモーター： ＤＮＡＧＲＮＡに転写させるＤＮＡ配
列。
列。
組換えＤＮＡクローニングベクター：１またはそれ以上
の別のＤＮＡセグメントが既に付加されているか、また
は付加することができる、自律的に複製するあらゆる物
質であって、これにはブラスミドおよびファージがある
がこれらに限定されない。
の別のＤＮＡセグメントが既に付加されているか、また
は付加することができる、自律的に複製するあらゆる物
質であって、これにはブラスミドおよびファージがある
がこれらに限定されない。
組換えＤＮＡ発現ベクター：プロモーターが導入されて
いるあらゆる組換えＤＮＡクローニングベクター レブリコン：プラスミドまたはその他のベクターの自律
的な複製を可能にし、それを制御するＤＮＡ配列。
いるあらゆる組換えＤＮＡクローニングベクター レブリコン：プラスミドまたはその他のベクターの自律
的な複製を可能にし、それを制御するＤＮＡ配列。
制限フラグメント：ｌまたはそれ以上の制限エンドヌク
レアーゼ酵素の作用によって生成されるあらゆる線状の
ＤＮＡ配列。
レアーゼ酵素の作用によって生成されるあらゆる線状の
ＤＮＡ配列。
感受性宿主細胞：ある抗生物質またはその他の毒性化合
物に対する耐性を付与するＤＮＡセグメントがなければ
、それらの存在下で生育することができない宿主細胞。
物に対する耐性を付与するＤＮＡセグメントがなければ
、それらの存在下で生育することができない宿主細胞。
Ｓ ｅｒ ：セリン残基。
構造遺伝子：機能的なポリペブチドをコードしているあ
らゆるＤＮＡ配列であって、翻訳開始および停止シグナ
ルをも含む配列。
らゆるＤＮＡ配列であって、翻訳開始および停止シグナ
ルをも含む配列。
Ｔ：デオキシチミジン。
Ｔｃ”：テトラサイクリン耐性の表現型またはそれを付
与する遺伝子。
与する遺伝子。
Ｔｈｒ：スレオニン残基。
Ｔｒｐ： トリプトファン残基。
Ｔｙｒ：チロシン残基。
Ｖａｌ：バリン残基。
第１図は、プラスミドｐＭＬＣＥ−１０の制限部位およ
び機能地図である。本発明を開示するためのこの第１図
および以下のすべての図面はいずれも正確な尺度で描か
れていない。
び機能地図である。本発明を開示するためのこの第１図
および以下のすべての図面はいずれも正確な尺度で描か
れていない。
第２図は、プラスミドｐＨＫＦ−１の制限部位および機
能地図である。
能地図である。
第３図は、ブラスミドｐＨＫＣＥ−１０の制限部位およ
び機能地図である。
び機能地図である。
第４図は、ブラスミドｐＧＣＥＭＫの制限部位および機
能地図である。
能地図である。
第５図は、プラスミドｐＭＨＣＥ−３０の制限部位およ
び機能地図である。
び機能地図である。
第６図は、プラスミドｐＨＧＩＺの制限部位および機能
地図である。
地図である。
第７図は、プラスミドｐＨＧＯＥＭ〜３０の制限部位お
よび機能地図である。
よび機能地図である。
第８図は、プラスミドｐＮｃＥＭＧｌの制限部位および
機能地図である。
機能地図である。
第９図は、ブラスミドｐＴＫＺＫ９１０の制限部位およ
び機能地図である。
び機能地図である。
第１Ｏ図は、ブラスミドｐＧ９．２．２７Ｋの制限部位
および機能地図である。
および機能地図である。
第１１図は、ブラスミドｐＧ４Ｇ２１の制限部位および
機能地図である。
機能地図である。
第１２図は、ブラスミドｐＮ９．２．２７Ｇ１の制限部
位および機能地図である。
位および機能地図である。
本発明は、第１の補乳動物種由来の抗原特異的な可変領
域と第２の別の啼乳動物種由来の定常領域とからなるキ
メラ抗体Ｌ鎖（軽鎖）をコードしているＤＮＡを含有す
る組換えＤＮＡ化合物であって、該Ｌ鎖可変領域が以下
のアミノ酸配列を有している組換えＤＮＡ化合物である
： ようである： Ｌ７ｆＳ−ＡＸｑ− ＤＮＡ塩基対の相補性故に、２本鎖ＤＮＡ分子の一方の
鎖の配列は、他方の鎖の配列を決定するうえで十分であ
る。モノクローナル抗体９． ２． ２７のＬ鎖可変領
域のヌクレオチド配列は、以下のさらに、本発明は、第
１の噛乳動物種由来のキメラ抗体Ｈ鎖（重鎖）可変領域
と第２の別の噛乳動物種由来の定常領域とをコードして
いるＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ化合物であって、該
Ｈ鎖可変領域が以下のアミノ酸配列を有している組換え
ＤＮＡ化合物をも包含している： ａｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−ムａｕ−Ｇエｎべ２１ｎ−５
＠ｚ”−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＧｌｕＬ！ｕ−Ｖｄ−Ｌｙ！
ｌ−Ｐｒｏ−０１７−ＡＩＪＩ−Ｓ＠ｒ−Ｖａｌ−Ｌｙ
ｉｌ−Ｚｌｅｌ！−＾１ａ−Ａｓｐ−Ｌｙｇ−８ｅｒ−
Ｓａｒ−Ｓａｒ−τｈｒ−Ａｌａ−ＴｙｒＭａｔ−Ｇｉ
ｎ−Ｖａ１−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−１．＋＊ｕ−τｈｒ−ｓ
＠ｒ−ｖａｌ−Ａｓｐモノクローナル抗体９． ２．
２ ７のＨ鎖可変領域のヌクレオチド配列は、以下のよ
うである二τＣ入． 本発明のＬ鎖およびＨ鎖分子の両者には、別個のシグナ
ルベプチドが付随している。Ｌ鎖シグナルベブチドのア
ミノ酸配列は、次のようである：Ｍｅｔ−Ｇ ｌｕ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ｔ ｈｒ−Ｌ ｅｕ−Ｌ ｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｔ ｒｐ−Ｖ ａｌＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙａ列は、次のようである： ＡＴＧ−ＧＡＧ−＾ＣＡ−ＧＡＣ−ＡＣ＾一ＣＴＣ−Ｃ
ＴＧ−ＣＴＡ−ＴＧＧ−ＧＴＧＣＴＧ−ＣＴＧ−ＣＴＣ
−ＴＧＧ−ＧＴＴ−ＣＣ＾一ＧＧＴ−ＴＣＣ−ＡＣＡ−
ＧＧＴ０Ｈ鎖シグナルペプチドのアミノ酸配列は、次の
ようである： Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−１ １ｅ−
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＬｅｕＬ ｅｕ−Ｓ ｅｒ−
１ １ｅ−Ｔ ｈｒ−Ａ ｌａ−Ｇ ｌｙ−Ｖ ａｌ
Ｈ ｉｓ−Ｃ ｙｓ０Ｈ鎖シグナルペプチド遺伝子のヌ
クレオチド配列は、次のようである： ＾ＴＧ−ＧＧＡ−ＴＧＧ−ＡＧＣ−ＣＧＧ−ＡＴＣ−Ｔ
ＴＴ−ＣＴＣ−ＴＴＣ−ＣＴＣＣＴＧ−ＴＣ＾一ＡＴＡ
−ＡＣＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＧＴＣ−ＣＡＴ−ＴＧＣ０
本発明の新規ＤＮＡ化合物は、モノクローナル抗体９．
２． ２ ７を産生ずるハイブリドーマセルライン由
来のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡクローンから誘導さ
れる。ブラスミドｐＴＺＫ９１０は、モノクローナル抗
体９．２．２７のし鎖の完全な暗号（コード化）配列、
このＬ鎖に随伴されたシグナルペブチドのコード化配列
、ならびにこの分子のＬ鎖シグナルペプチド遺伝子のヌ
クレオチド配５゛および３゜非翻訳領域を含んでいる。
域と第２の別の啼乳動物種由来の定常領域とからなるキ
メラ抗体Ｌ鎖（軽鎖）をコードしているＤＮＡを含有す
る組換えＤＮＡ化合物であって、該Ｌ鎖可変領域が以下
のアミノ酸配列を有している組換えＤＮＡ化合物である
： ようである： Ｌ７ｆＳ−ＡＸｑ− ＤＮＡ塩基対の相補性故に、２本鎖ＤＮＡ分子の一方の
鎖の配列は、他方の鎖の配列を決定するうえで十分であ
る。モノクローナル抗体９． ２． ２７のＬ鎖可変領
域のヌクレオチド配列は、以下のさらに、本発明は、第
１の噛乳動物種由来のキメラ抗体Ｈ鎖（重鎖）可変領域
と第２の別の噛乳動物種由来の定常領域とをコードして
いるＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ化合物であって、該
Ｈ鎖可変領域が以下のアミノ酸配列を有している組換え
ＤＮＡ化合物をも包含している： ａｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−ムａｕ−Ｇエｎべ２１ｎ−５
＠ｚ”−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＧｌｕＬ！ｕ−Ｖｄ−Ｌｙ！
ｌ−Ｐｒｏ−０１７−ＡＩＪＩ−Ｓ＠ｒ−Ｖａｌ−Ｌｙ
ｉｌ−Ｚｌｅｌ！−＾１ａ−Ａｓｐ−Ｌｙｇ−８ｅｒ−
Ｓａｒ−Ｓａｒ−τｈｒ−Ａｌａ−ＴｙｒＭａｔ−Ｇｉ
ｎ−Ｖａ１−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−１．＋＊ｕ−τｈｒ−ｓ
＠ｒ−ｖａｌ−Ａｓｐモノクローナル抗体９． ２．
２ ７のＨ鎖可変領域のヌクレオチド配列は、以下のよ
うである二τＣ入． 本発明のＬ鎖およびＨ鎖分子の両者には、別個のシグナ
ルベプチドが付随している。Ｌ鎖シグナルベブチドのア
ミノ酸配列は、次のようである：Ｍｅｔ−Ｇ ｌｕ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ｔ ｈｒ−Ｌ ｅｕ−Ｌ ｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｔ ｒｐ−Ｖ ａｌＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙａ列は、次のようである： ＡＴＧ−ＧＡＧ−＾ＣＡ−ＧＡＣ−ＡＣ＾一ＣＴＣ−Ｃ
ＴＧ−ＣＴＡ−ＴＧＧ−ＧＴＧＣＴＧ−ＣＴＧ−ＣＴＣ
−ＴＧＧ−ＧＴＴ−ＣＣ＾一ＧＧＴ−ＴＣＣ−ＡＣＡ−
ＧＧＴ０Ｈ鎖シグナルペプチドのアミノ酸配列は、次の
ようである： Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−１ １ｅ−
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＬｅｕＬ ｅｕ−Ｓ ｅｒ−
１ １ｅ−Ｔ ｈｒ−Ａ ｌａ−Ｇ ｌｙ−Ｖ ａｌ
Ｈ ｉｓ−Ｃ ｙｓ０Ｈ鎖シグナルペプチド遺伝子のヌ
クレオチド配列は、次のようである： ＾ＴＧ−ＧＧＡ−ＴＧＧ−ＡＧＣ−ＣＧＧ−ＡＴＣ−Ｔ
ＴＴ−ＣＴＣ−ＴＴＣ−ＣＴＣＣＴＧ−ＴＣ＾一ＡＴＡ
−ＡＣＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＧＴＣ−ＣＡＴ−ＴＧＣ０
本発明の新規ＤＮＡ化合物は、モノクローナル抗体９．
２． ２ ７を産生ずるハイブリドーマセルライン由
来のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡクローンから誘導さ
れる。ブラスミドｐＴＺＫ９１０は、モノクローナル抗
体９．２．２７のし鎖の完全な暗号（コード化）配列、
このＬ鎖に随伴されたシグナルペブチドのコード化配列
、ならびにこの分子のＬ鎖シグナルペプチド遺伝子のヌ
クレオチド配５゛および３゜非翻訳領域を含んでいる。
この５′非翻訳領域は次のＤＮＡ配列を有している：５
゜−ＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＧＧＧＣＴＡＴ
ＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＧ ＡＡＡＡＡ
ＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴ
ＣＡＧＡＧ−３″。
゜−ＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＧＧＧＣＴＡＴ
ＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＧ ＡＡＡＡＡ
ＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴ
ＣＡＧＡＧ−３″。
ブラスミドｐＴＺＫ９１０は、１９８９年４月７日に７
ーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー［Ｎｏ
ｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ＮＲＲＬ）， Ｐｅｏｒｉａ
．Ｉｌ１ｉｎｏｉｓ］に寄託され、その永久保存培養物
コレクションの一部をなしている菌株である大腸閑（Ｅ
．ｃｏｌｉ）Ｋ １ ２ Ｊ Ｍ １ ０ ９／ｐＴ
ＺＫ９１０から常法によって単離することができる。大
腸菌Ｋ１２ ＪＭ１０９／ｐＴＺＫ９１０の培養物は
、ＮＲＲＬから受託番号Ｂ−１８４７８のもとで入手す
ることができる。プラスミドｐＴＺＫ９１０の制限部位
および機能地図を添付の第９図に示す。
ーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー［Ｎｏ
ｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ＮＲＲＬ）， Ｐｅｏｒｉａ
．Ｉｌ１ｉｎｏｉｓ］に寄託され、その永久保存培養物
コレクションの一部をなしている菌株である大腸閑（Ｅ
．ｃｏｌｉ）Ｋ １ ２ Ｊ Ｍ １ ０ ９／ｐＴ
ＺＫ９１０から常法によって単離することができる。大
腸菌Ｋ１２ ＪＭ１０９／ｐＴＺＫ９１０の培養物は
、ＮＲＲＬから受託番号Ｂ−１８４７８のもとで入手す
ることができる。プラスミドｐＴＺＫ９１０の制限部位
および機能地図を添付の第９図に示す。
ブラスミドｐＧ４Ｇ２１は、モノクローナル抗体９．２
．２７のＨ鎖の完全なコード化配列、Ｈ鎖に付随するシ
グナルペブチドのコード化配列、ならびにこの分子の５
′および３゜非翻訳領域を含んでいる。この５゜非翻訳
領域は次のＤＮＡ配列を有している： ５’ −ＴＣＣＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＴＧＡＣＧ
ＡＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＡＡＣＣ−３゜プラスミドｐＧ
４Ｇ２１は、１９８９年４月７日にＮＲＲＬに寄託され
、その永久保存培養物コレクションの一部をなしている
大腸ｍＫ ｌ ２ ＤＨ ５／ｐＧ４Ｇ２ １から常
法によって単離することができる。
．２７のＨ鎖の完全なコード化配列、Ｈ鎖に付随するシ
グナルペブチドのコード化配列、ならびにこの分子の５
′および３゜非翻訳領域を含んでいる。この５゜非翻訳
領域は次のＤＮＡ配列を有している： ５’ −ＴＣＣＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＴＧＡＣＧ
ＡＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＡＡＣＣ−３゜プラスミドｐＧ
４Ｇ２１は、１９８９年４月７日にＮＲＲＬに寄託され
、その永久保存培養物コレクションの一部をなしている
大腸ｍＫ ｌ ２ ＤＨ ５／ｐＧ４Ｇ２ １から常
法によって単離することができる。
大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５／ｐＧ４Ｇ２ １の培養物は、Ｎ
ＲＲＬから受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８４７９のもとで
入手することができる。ブラスミドｐＧ４Ｇ２１の制限
部位および機能地図を添付の第１１図に示す。
ＲＲＬから受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８４７９のもとで
入手することができる。ブラスミドｐＧ４Ｇ２１の制限
部位および機能地図を添付の第１１図に示す。
９． ２． ２ ７キメラＬ鎖の真核生物発現のための
ベクターを作或するには、有効な真核生物プロモーター
およびヒトＬ鎖定常領域をコードしている遺伝子を含有
するベクターに、９．２．２７Ｌ鎖可変領域をコードし
ている遺伝子を挿入する必要がある。ブラスミドｐＧＣ
ＥＭＫは、有効なプロモ−夕一に結合したヒト癌胎児性
抗原（ＣＥＡ）を認識するネズミ可変領域をコードして
いる遺伝子およびヒトＬ鎖定常領域遺伝子を含有してい
る。プラスミドｐＧＣＥＭＫのこのＬ鎖可変領域遺伝子
をモノクローナル抗体９． ２． ２ ７のＬ鎖可変領
域遺伝子と置き換えると、発現ベクターｐＧ９．２．２
７Ｋが得られる。プラスミドｐＧＣＥＭＫは、バイドラ
ーらの欧州特許出願第ＥＰ０ ３３２ ４２４号（１９
８８年１１月１７日出願）、「ヒト癌胎児性抗原に対す
るキメラ抗体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｕｍａｎ
Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）
Ｊに記載されているように、ブラスミドｐＭＬＣＥ−１
０、ｐＨＫＦ−１およびｐＳ Ｖ ２−ｇｐｔから構築
した。
ベクターを作或するには、有効な真核生物プロモーター
およびヒトＬ鎖定常領域をコードしている遺伝子を含有
するベクターに、９．２．２７Ｌ鎖可変領域をコードし
ている遺伝子を挿入する必要がある。ブラスミドｐＧＣ
ＥＭＫは、有効なプロモ−夕一に結合したヒト癌胎児性
抗原（ＣＥＡ）を認識するネズミ可変領域をコードして
いる遺伝子およびヒトＬ鎖定常領域遺伝子を含有してい
る。プラスミドｐＧＣＥＭＫのこのＬ鎖可変領域遺伝子
をモノクローナル抗体９． ２． ２ ７のＬ鎖可変領
域遺伝子と置き換えると、発現ベクターｐＧ９．２．２
７Ｋが得られる。プラスミドｐＧＣＥＭＫは、バイドラ
ーらの欧州特許出願第ＥＰ０ ３３２ ４２４号（１９
８８年１１月１７日出願）、「ヒト癌胎児性抗原に対す
るキメラ抗体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｕｍａｎ
Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）
Ｊに記載されているように、ブラスミドｐＭＬＣＥ−１
０、ｐＨＫＦ−１およびｐＳ Ｖ ２−ｇｐｔから構築
した。
プラスミドｐＭＬＣＥ−１０は、ヒト癌胎児性抗原を認
識する、モノクローナル抗体ＣＥＭのＬ鎖可変領域のゲ
ノム配列を含有している。プラスミドｐＭＬＣＥ−１０
は、アメリカン・タイプ・カルチャー●フレシゴン、ロ
ックビレ、メリーランド（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ， ＭＤ）の永久コレクションの一部を構戊
しており（１９８８年３月１日寄託）、受託番号ＡＴＣ
Ｃ６７６３９のもとで入手することができる。プラスミ
ドｐＨＫＦ−１は、ヒト抗体のし鎖定常領域のゲノム配
列を含有している。プラスミドｐＨＫＦ１は、ＡＴＣＣ
永久コレクションの一部を構戊しており（１９８８年３
月１日寄託）、受託番号ＡＴＣＣ６７６３７のもとで入
手することができる。ブラスミドｐＭＬＣＥ−１０およ
びｐＨＫＦ−１の制限部位および機能地図をそれぞれ添
付の第１図および第２図に示す。
識する、モノクローナル抗体ＣＥＭのＬ鎖可変領域のゲ
ノム配列を含有している。プラスミドｐＭＬＣＥ−１０
は、アメリカン・タイプ・カルチャー●フレシゴン、ロ
ックビレ、メリーランド（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ， ＭＤ）の永久コレクションの一部を構戊
しており（１９８８年３月１日寄託）、受託番号ＡＴＣ
Ｃ６７６３９のもとで入手することができる。プラスミ
ドｐＨＫＦ−１は、ヒト抗体のし鎖定常領域のゲノム配
列を含有している。プラスミドｐＨＫＦ１は、ＡＴＣＣ
永久コレクションの一部を構戊しており（１９８８年３
月１日寄託）、受託番号ＡＴＣＣ６７６３７のもとで入
手することができる。ブラスミドｐＭＬＣＥ−１０およ
びｐＨＫＦ−１の制限部位および機能地図をそれぞれ添
付の第１図および第２図に示す。
プラスミドｐＭＬＣＥ−１０由来のＣＥＭ Ｌ鎖可変領
域遺伝子を含有する約３． ８ ｋｂ Ｈ ｉｎｄＩＩ
Ｉフラグメントを単離し、このフラグメントをＨｉｎｄ
■消化したプラスミドｐＨＫＦ−１内に連結することに
よって、ブラスミドｐＨＫＣＥ−１０を構築した。プラ
スミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ（これは、受託番号ＡＴＣ
Ｃ３７１４５のもとてＡＴＣＣから入手することができ
る）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、０１ａｌリンカー
（配列：ｄＣＡＴＣＣＧＡＴＧ）をそのＥｃｏＲ１部位
に連結してプラスミドｐｓＶ２ｇｐｔＣｌａを作成した
。次に、ブラスミドｐＨＫＣＥ−１０を制限酵素Ｃｌａ
ｌおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒトＬ鎖定常領域遺伝子
に連結したＣＥＭＬ鎖可変領域遺伝子を含有する約９．
０ｋｂ Ｃｌａｌ／ＢａｎＨｌ制限フラグメントを単離
した。また、プラスミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ−Ｃ Ｉ
ａも制限酵素ＣｌａｌおよびＢａｍＨｒで消化し、約４
．５ｋｂのＣｌａｌ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを単
離した。ブラスミドｐＨＫＣＥ−１０由来の約９．Ｏｋ
ｂフラグメントをプラスミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ−Ｃ
Ｉａ由来の上記約４．５ｋｂベクターフラグメント内
に連結し、発現ブラスミドｐＧＣＥＭＫを作戊した。ブ
ラスミドｐＨＫＣＥ−１０およびｐＧＣＥＭＫの制限部
位および機能地図をそれぞれ添付の第３図および第４図
に示す。
域遺伝子を含有する約３． ８ ｋｂ Ｈ ｉｎｄＩＩ
Ｉフラグメントを単離し、このフラグメントをＨｉｎｄ
■消化したプラスミドｐＨＫＦ−１内に連結することに
よって、ブラスミドｐＨＫＣＥ−１０を構築した。プラ
スミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ（これは、受託番号ＡＴＣ
Ｃ３７１４５のもとてＡＴＣＣから入手することができ
る）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、０１ａｌリンカー
（配列：ｄＣＡＴＣＣＧＡＴＧ）をそのＥｃｏＲ１部位
に連結してプラスミドｐｓＶ２ｇｐｔＣｌａを作成した
。次に、ブラスミドｐＨＫＣＥ−１０を制限酵素Ｃｌａ
ｌおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒトＬ鎖定常領域遺伝子
に連結したＣＥＭＬ鎖可変領域遺伝子を含有する約９．
０ｋｂ Ｃｌａｌ／ＢａｎＨｌ制限フラグメントを単離
した。また、プラスミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ−Ｃ Ｉ
ａも制限酵素ＣｌａｌおよびＢａｍＨｒで消化し、約４
．５ｋｂのＣｌａｌ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを単
離した。ブラスミドｐＨＫＣＥ−１０由来の約９．Ｏｋ
ｂフラグメントをプラスミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ−Ｃ
Ｉａ由来の上記約４．５ｋｂベクターフラグメント内
に連結し、発現ブラスミドｐＧＣＥＭＫを作戊した。ブ
ラスミドｐＨＫＣＥ−１０およびｐＧＣＥＭＫの制限部
位および機能地図をそれぞれ添付の第３図および第４図
に示す。
次いで、ブラスミドｐＴＺＫ９１０を制限酵素Ｄｄｅ！
およびＢａｍＨＩで消化し、９．２．２７カッパ（κ）
可変領域をコードしている遺伝子を殆ど含有する、約３
５７塩基対のＤｄｅ（／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを
単離する。次ぎに、以下の配列を有するＢｇｌＩＩ−Ｄ
ｄｅ＋リンカーを合成する：５’ＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴ
ＣＣ −３’次いで、９．２。２７カッパ可変領
域のＮＨ，末端における１５個のアミノ酸のコード化配
列および真核生物スプライス部位を含有するＢａｍＨＩ
−Ｓｓｔｎリンカーを合成する。このリンカーの配列は
次のようである： 次に、上記２つのリンカーをブラスミドｐＴＺ Ｋ９１
０の約３ ５ ７ｂｐ Ｄｄｅｌ／ＢａｍＨ Ｉ制限フ
ラグメントに連結する。制限酵素ＢｇｌＩ［およびＳｓ
ｔＩｌで消化した後、約４２０ｂｐの７ラグメントを単
離して精製する。ブラスミドｐＧＣＥＭＫを制限酵素Ｂ
．ｇｌＩＩおよびＳｓｔＩＩで消化し、抗一ＣＥＡ Ｌ
鎖可変領域をコードしている遺伝子を除去する。
およびＢａｍＨＩで消化し、９．２．２７カッパ（κ）
可変領域をコードしている遺伝子を殆ど含有する、約３
５７塩基対のＤｄｅ（／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを
単離する。次ぎに、以下の配列を有するＢｇｌＩＩ−Ｄ
ｄｅ＋リンカーを合成する：５’ＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴ
ＣＣ −３’次いで、９．２。２７カッパ可変領
域のＮＨ，末端における１５個のアミノ酸のコード化配
列および真核生物スプライス部位を含有するＢａｍＨＩ
−Ｓｓｔｎリンカーを合成する。このリンカーの配列は
次のようである： 次に、上記２つのリンカーをブラスミドｐＴＺ Ｋ９１
０の約３ ５ ７ｂｐ Ｄｄｅｌ／ＢａｍＨ Ｉ制限フ
ラグメントに連結する。制限酵素ＢｇｌＩ［およびＳｓ
ｔＩｌで消化した後、約４２０ｂｐの７ラグメントを単
離して精製する。ブラスミドｐＧＣＥＭＫを制限酵素Ｂ
．ｇｌＩＩおよびＳｓｔＩＩで消化し、抗一ＣＥＡ Ｌ
鎖可変領域をコードしている遺伝子を除去する。
次イテ、プラスミＦｌ）ＴＺＫ９ １０（７）約４２０
ｂｐＢｇｌｆｆ／Ｓｓｔｌｌ制限フラグメントをブラス
ミドｐＧＣ ＥＭＫｃ７）Ｂｇｌｌｌ／Ｓｓｔｕ消化し
た、大きなベクターフラグメント内に連結し、ブラスミ
ドｐＧ９．２． ２ ７ Ｋを作成する。このブラスミ
ドは、ブラスミドｐＧＣＥＭＫのカッパプロモーター、
９．２．２７抗体のＬ鎖可変領域をコードしている遺伝
子、ヒトカッパ鎖定常領域をコードしている遺伝子、お
よびｇｐｔ耐性付与遺伝子を含有している。ブラスミド
ｐＧ９．２．２７Ｋの制限部位および機能地図を添付の
第１０図に示す。
ｂｐＢｇｌｆｆ／Ｓｓｔｌｌ制限フラグメントをブラス
ミドｐＧＣ ＥＭＫｃ７）Ｂｇｌｌｌ／Ｓｓｔｕ消化し
た、大きなベクターフラグメント内に連結し、ブラスミ
ドｐＧ９．２． ２ ７ Ｋを作成する。このブラスミ
ドは、ブラスミドｐＧＣＥＭＫのカッパプロモーター、
９．２．２７抗体のＬ鎖可変領域をコードしている遺伝
子、ヒトカッパ鎖定常領域をコードしている遺伝子、お
よびｇｐｔ耐性付与遺伝子を含有している。ブラスミド
ｐＧ９．２．２７Ｋの制限部位および機能地図を添付の
第１０図に示す。
同様にして、９．２．２７Ｈ鎖可変領域の真核生物発現
用のベクターを作戊するに当たり、９．２．２ ７ Ｈ
鎖可変領域遺伝子を、真核生物プロモーターおよびヒｌ
−Ｈ鎖（ガンマ１）（γ１）定常領域をコードしている
遺伝子を含有するベクター内に挿入する。ブラスミドｐ
ＮｃＥＭＧ１は、真核生物プロモーターに結合したヒト
ＣＥＡを認識するネズミ可変領域をコードしている遺伝
子およびヒトＨ鎖定常領域遺伝子を含有している。ブラ
スミドｐＮＣＥＭＧＩのこのＨ鎖可変領域遺伝子をモノ
クローナル抗体９． ２． ２ ７のＨ鎖可変領域遺伝
子と置き換えると、発現ベクターｐＮ９．２．２．２７
Ｇｌが得られる。プラスミドｐＮｃＥＭＧｌは、バイド
ラーらの欧州特許出願第ＥＰ０ ３３２ ４２４号（１
９８８年ｉｔ月ｌ７日出願）に記載されているように、
ブラスミドｐＭＨｃＥ−３０、ｐＨＧＩＺおよびｐＳＶ
２ｒｌｅＯから構築した。
用のベクターを作戊するに当たり、９．２．２ ７ Ｈ
鎖可変領域遺伝子を、真核生物プロモーターおよびヒｌ
−Ｈ鎖（ガンマ１）（γ１）定常領域をコードしている
遺伝子を含有するベクター内に挿入する。ブラスミドｐ
ＮｃＥＭＧ１は、真核生物プロモーターに結合したヒト
ＣＥＡを認識するネズミ可変領域をコードしている遺伝
子およびヒトＨ鎖定常領域遺伝子を含有している。ブラ
スミドｐＮＣＥＭＧＩのこのＨ鎖可変領域遺伝子をモノ
クローナル抗体９． ２． ２ ７のＨ鎖可変領域遺伝
子と置き換えると、発現ベクターｐＮ９．２．２．２７
Ｇｌが得られる。プラスミドｐＮｃＥＭＧｌは、バイド
ラーらの欧州特許出願第ＥＰ０ ３３２ ４２４号（１
９８８年ｉｔ月ｌ７日出願）に記載されているように、
ブラスミドｐＭＨｃＥ−３０、ｐＨＧＩＺおよびｐＳＶ
２ｒｌｅＯから構築した。
プラスミドｐＭＨＣＥ−３０は、ヒト癌胎児性抗原を認
識する、モノクローナル抗体ＣＥＭのＨ鎖可変領域のゲ
ノム配列（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含有
している。ブラスミドｐＭＨＣＥ−３０はＡＴＣＣコレ
クション（１９８８年３月１日に寄託）の一部を構戊し
ており、受託番号ＡＴＣＣ６７６４０のもとに入手する
ことができる。ブラスミドｐＨＧＩＺはヒト抗体のＨ鎖
司変領域のゲノム配列を含有している。ブラスミドｐＨ
ＧＩＺは受託番号ＡＴＣＣ６７６３８の下、ＡＴＣＣに
寄託されている（１９８８年３月ｌ日寄託〉。プラスミ
ドｐＭＨＣＥ−３０およびｐｉ−ＩＧＩＺの制限部位お
よび機能地図をそれぞれ添付の第５図および第６図に示
す。
識する、モノクローナル抗体ＣＥＭのＨ鎖可変領域のゲ
ノム配列（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含有
している。ブラスミドｐＭＨＣＥ−３０はＡＴＣＣコレ
クション（１９８８年３月１日に寄託）の一部を構戊し
ており、受託番号ＡＴＣＣ６７６４０のもとに入手する
ことができる。ブラスミドｐＨＧＩＺはヒト抗体のＨ鎖
司変領域のゲノム配列を含有している。ブラスミドｐＨ
ＧＩＺは受託番号ＡＴＣＣ６７６３８の下、ＡＴＣＣに
寄託されている（１９８８年３月ｌ日寄託〉。プラスミ
ドｐＭＨＣＥ−３０およびｐｉ−ＩＧＩＺの制限部位お
よび機能地図をそれぞれ添付の第５図および第６図に示
す。
ブラスミドｐＨＧＯＥＭ−３０を、ブラスミドｐＭＨＣ
Ｅ−３０由来のＣＥＭＨ鎖可変領域遺伝子を含有する約
有する ３ ｋｂ Ｃ ｌａ Ｉ ／Ｈ ｉｎｄＩｒｌ
フラグメントを単離し、このフラグメントをＣ ｌａ
Ｉ ／Ｈ ｉｎｄＩ［Ｉ消化したベクターｐＨＧＩＺに
連結することで構築した。ブラスミドｐＭＨＣＥ−３０
は１つ以上のＢａｍ８１部位を含有しているので、Ｃｌ
ａｌで完全消化した後にＢａｍＨＩで部分消化すれば、
プラスミ ドｐＭＨＣＥ−３０の有する３ｋｂ Ｃｌａ
ｌ／Ｈｉｎｄ［［制限フラグメントが最も容易に単離さ
れる。
Ｅ−３０由来のＣＥＭＨ鎖可変領域遺伝子を含有する約
有する ３ ｋｂ Ｃ ｌａ Ｉ ／Ｈ ｉｎｄＩｒｌ
フラグメントを単離し、このフラグメントをＣ ｌａ
Ｉ ／Ｈ ｉｎｄＩ［Ｉ消化したベクターｐＨＧＩＺに
連結することで構築した。ブラスミドｐＭＨＣＥ−３０
は１つ以上のＢａｍ８１部位を含有しているので、Ｃｌ
ａｌで完全消化した後にＢａｍＨＩで部分消化すれば、
プラスミ ドｐＭＨＣＥ−３０の有する３ｋｂ Ｃｌａ
ｌ／Ｈｉｎｄ［［制限フラグメントが最も容易に単離さ
れる。
ブラスミドｐＳ Ｖ ２ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３ ７ １
４ ９）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、Ｃ１ａＩリ
ンカー（配列：ｄＣＡＴＣＣＧＡＴＧ）をＥｃｏＲ１部
位内に連結してプラスミドｐ３ Ｖ ２ｎｅｏ−Ｃ ｌ
ａを作成した。次いで、プラスミドｐＳ Ｖ ２ｎｅｏ
−Ｃ ｌａを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＣｌａｌで完全
消化し、約４ ． ５ ｋｂベクターフラグメントを単
離した。プラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０を制限酵素Ｃｌ
ａｌで完全消化した後、制限酵素ＢａｍＨＩで部分消化
することで、ヒトＨ鎖定常領域をコードしている遺伝子
に連結したＣＥＭＨ鎖可変領域をコードしている遺伝子
を含有する約１２．７ｋｂ制限フラグメントを単離した
。
４ ９）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、Ｃ１ａＩリ
ンカー（配列：ｄＣＡＴＣＣＧＡＴＧ）をＥｃｏＲ１部
位内に連結してプラスミドｐ３ Ｖ ２ｎｅｏ−Ｃ ｌ
ａを作成した。次いで、プラスミドｐＳ Ｖ ２ｎｅｏ
−Ｃ ｌａを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＣｌａｌで完全
消化し、約４ ． ５ ｋｂベクターフラグメントを単
離した。プラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０を制限酵素Ｃｌ
ａｌで完全消化した後、制限酵素ＢａｍＨＩで部分消化
することで、ヒトＨ鎖定常領域をコードしている遺伝子
に連結したＣＥＭＨ鎖可変領域をコードしている遺伝子
を含有する約１２．７ｋｂ制限フラグメントを単離した
。
ブラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０の約１２．７ｋｂＣ１ａ
Ｉ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを、ブラスミドｐＳＶ
２ｎｅｏ−Ｃ Ｉａの約４．５ｋｂ Ｃｌａｌ／Ｂａ
ｍＨ Ｉベクターフラグメントに連結し、発現ベクター
ｐＮＣＥＭＧＩを作成した。プラスミドｐＨＧＣＥＭ−
３０およびｐＮｃＥＭＧｌの制限部位および機能地図を
それぞれ添付の第７図および第８図に示す。
Ｉ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを、ブラスミドｐＳＶ
２ｎｅｏ−Ｃ Ｉａの約４．５ｋｂ Ｃｌａｌ／Ｂａ
ｍＨ Ｉベクターフラグメントに連結し、発現ベクター
ｐＮＣＥＭＧＩを作成した。プラスミドｐＨＧＣＥＭ−
３０およびｐＮｃＥＭＧｌの制限部位および機能地図を
それぞれ添付の第７図および第８図に示す。
次ぎに、プラスミドｐＮｃＥＭＧｌを特定の部位を欠失
するように処理する。このブラスミドをまず、制限酵素
Ｎｏｔｌで消化し、次いでクレノー酵素で処理し、自己
連結させ、Ｎｏｔ１部位を欠失させ、これにより、ブラ
スミドｐＮｃＥＭＧｌΔＮを作戊する。次いで、このブ
ラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで部分消化し、クレノー
処理し、自己連結させて、３つＢａＩＩＩＨ１部位のう
ち２つを欠失させ、これにより、プラスミドｐＮｃＥＭ
ＧｌΔＢ２を作成する。欠失するＢａｎＨ１部位は、Ｏ
ＥＭ構造遺伝子の直ぐ５゜側の部位と、ヒトガンマｌ遺
伝子およびネオマイシン耐性付与遺伝子間にある部位で
ある。ＯＥＭ構造遺伝子の直ぐ３″側に見いだされるＢ
ａｍＨ１部位は維持させた。次いで、プラスミドｐＮｃ
ＥＭＧｌΔＮΔＢ２を制限酵素Ｓａ１１で哨化し、クレ
ノー処理した後、自己連結させ、ヒトガンマｌ遺伝子の
直ぐ５′側に見いだされる２つのＳａｌｌ部位を欠失さ
せて、ブラスミドｐＮｃＥＭＧｌΔＮΔＢ２ΔＳ２を作
成する。
するように処理する。このブラスミドをまず、制限酵素
Ｎｏｔｌで消化し、次いでクレノー酵素で処理し、自己
連結させ、Ｎｏｔ１部位を欠失させ、これにより、ブラ
スミドｐＮｃＥＭＧｌΔＮを作戊する。次いで、このブ
ラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで部分消化し、クレノー
処理し、自己連結させて、３つＢａＩＩＩＨ１部位のう
ち２つを欠失させ、これにより、プラスミドｐＮｃＥＭ
ＧｌΔＢ２を作成する。欠失するＢａｎＨ１部位は、Ｏ
ＥＭ構造遺伝子の直ぐ５゜側の部位と、ヒトガンマｌ遺
伝子およびネオマイシン耐性付与遺伝子間にある部位で
ある。ＯＥＭ構造遺伝子の直ぐ３″側に見いだされるＢ
ａｍＨ１部位は維持させた。次いで、プラスミドｐＮｃ
ＥＭＧｌΔＮΔＢ２を制限酵素Ｓａ１１で哨化し、クレ
ノー処理した後、自己連結させ、ヒトガンマｌ遺伝子の
直ぐ５′側に見いだされる２つのＳａｌｌ部位を欠失さ
せて、ブラスミドｐＮｃＥＭＧｌΔＮΔＢ２ΔＳ２を作
成する。
次いで、ブラスミドｐ０４Ｇ２１を制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＭａｅｎｌで消化し、９． ２． ２ ７ガンマ
可変領域をコードしている遺伝子を殆ど含有する約４２
１塩基対のＥ ｃｏＲ Ｉ ／Ｍａｅｍ制限フラグメン
トを単離する。次いで、Ｂｃｌ Ｉ ／ＥｃｏＲ Ｉリ
ンカーを合戊する。このリンカーは以下の配列を有して
いる； ５゜−ＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＣＧ −３゜３゜−
ＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＡＡ−５’Ｂｃ １ １
ＥｃｏＲ ｌ次いで、９．２．２７ガンマ可変
領域のＮＨ．末端における５個のアミノ酸のコード化配
列および真核生物スプライス部位を含有するＭａｅｎ［
−ＢａｍＨＩリンカーを合成する。このリンカーは以下
の配列を有している： ５゜−ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＡＡＧ
−３’３゜− ＧＣＡＧＡＧＧＡＧＴＣＣＡ
ＴＴＣＣＴＡＧ−５’ＭａｅＩＩ［
ＢａｍＨＩ次に、上記２つのリンカーをブラスミドｐＧ
４Ｃ；２１の約４ ２ １ｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ／Ｍａｅ
Ｉ［［制限フラグメントに連結する。制限酵素Ｂｅｌｌ
およびＢａｍＨＩで消化した後、得られた約４６２ｂｐ
フラグメントを単離して精製する。プラスミドｐＮＣＥ
ＭＧｌΔＮΔＢ２ΔＳ２を制限酵素ＢａｌｌおよびＢａ
ｍＨＩで消化し、抗−ＣＥＡ ガンマ鎖可変領域をコー
ドしている遺伝子を除去する。次いで、約４６２ｂｐ
Ｂｃｌ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉ制限フラグメントをプラスミ
ドｐＮｃＥＭＧｌΔＮΔＢ２ΔＳ２のＢｃｌｌ／Ｂａｍ
ＨＩ消化した、大きなベクターフラグメント内に連結し
、プラスミドｐＮ９．２．２７を作成する。このプラス
ミドは、ブラスミドｐＮｃＥＭＧｌのガンマプロモータ
ー、９．２．２７抗体のＨ鎖可変領域をコードしている
遺伝子、ヒトガンマ鎖定常領域をコードしている遺伝子
、およびネオマイシン耐性付与遺伝子を含有している。
およびＭａｅｎｌで消化し、９． ２． ２ ７ガンマ
可変領域をコードしている遺伝子を殆ど含有する約４２
１塩基対のＥ ｃｏＲ Ｉ ／Ｍａｅｍ制限フラグメン
トを単離する。次いで、Ｂｃｌ Ｉ ／ＥｃｏＲ Ｉリ
ンカーを合戊する。このリンカーは以下の配列を有して
いる； ５゜−ＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＣＧ −３゜３゜−
ＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＡＡ−５’Ｂｃ １ １
ＥｃｏＲ ｌ次いで、９．２．２７ガンマ可変
領域のＮＨ．末端における５個のアミノ酸のコード化配
列および真核生物スプライス部位を含有するＭａｅｎ［
−ＢａｍＨＩリンカーを合成する。このリンカーは以下
の配列を有している： ５゜−ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＡＡＧ
−３’３゜− ＧＣＡＧＡＧＧＡＧＴＣＣＡ
ＴＴＣＣＴＡＧ−５’ＭａｅＩＩ［
ＢａｍＨＩ次に、上記２つのリンカーをブラスミドｐＧ
４Ｃ；２１の約４ ２ １ｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ／Ｍａｅ
Ｉ［［制限フラグメントに連結する。制限酵素Ｂｅｌｌ
およびＢａｍＨＩで消化した後、得られた約４６２ｂｐ
フラグメントを単離して精製する。プラスミドｐＮＣＥ
ＭＧｌΔＮΔＢ２ΔＳ２を制限酵素ＢａｌｌおよびＢａ
ｍＨＩで消化し、抗−ＣＥＡ ガンマ鎖可変領域をコー
ドしている遺伝子を除去する。次いで、約４６２ｂｐ
Ｂｃｌ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉ制限フラグメントをプラスミ
ドｐＮｃＥＭＧｌΔＮΔＢ２ΔＳ２のＢｃｌｌ／Ｂａｍ
ＨＩ消化した、大きなベクターフラグメント内に連結し
、プラスミドｐＮ９．２．２７を作成する。このプラス
ミドは、ブラスミドｐＮｃＥＭＧｌのガンマプロモータ
ー、９．２．２７抗体のＨ鎖可変領域をコードしている
遺伝子、ヒトガンマ鎖定常領域をコードしている遺伝子
、およびネオマイシン耐性付与遺伝子を含有している。
プラスミドｐＮ９．２．２７Ｇ１の制限部位および機能
地図を添付の第１２図に示す。
地図を添付の第１２図に示す。
噛乳動物および他の真核生物細胞を形質転換し、かつそ
の中で各種の抗体鎖を発現させるのに適したベクターを
構築するには、組換え９． ２． ２ ７免疫グロブリ
ンおよびその誘導体をコードしている本発明のＤＮＡ化
合物は特に好ましい。多くの噛乳動物宿主細胞は、本発
明で例示される各種の抗［４のアミノ末端に存在するシ
グナルペブチドを認識し、そして適切にプロセッシング
するために必須の細胞機構（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｃ
ｈｉｎｅｒｙ）を有している。幾つかの浦乳動物宿主細
胞は、さらに、抗体分子内に認められる翻訳後修飾（例
えば、グリコシル化）を行うことができる。真核生物宿
主細胞を形質転換するためのベクターの変種は広範囲で
存在するので、以下で例示する特定のベクターは本発明
の範囲の限定を意図するものではない。
の中で各種の抗体鎖を発現させるのに適したベクターを
構築するには、組換え９． ２． ２ ７免疫グロブリ
ンおよびその誘導体をコードしている本発明のＤＮＡ化
合物は特に好ましい。多くの噛乳動物宿主細胞は、本発
明で例示される各種の抗［４のアミノ末端に存在するシ
グナルペブチドを認識し、そして適切にプロセッシング
するために必須の細胞機構（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｃ
ｈｉｎｅｒｙ）を有している。幾つかの浦乳動物宿主細
胞は、さらに、抗体分子内に認められる翻訳後修飾（例
えば、グリコシル化）を行うことができる。真核生物宿
主細胞を形質転換するためのベクターの変種は広範囲で
存在するので、以下で例示する特定のベクターは本発明
の範囲の限定を意図するものではない。
本発明の各種発現ベクターは、種々の真核生物、特に噛
乳動物の宿主細胞を形質転換することができ、その中で
発現することができる。さらに、本発明の発現ベクター
は、犬腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での複製を行わせる配列
を含有している。抗体の発現は、その抗体の構造遺伝子
と関連性を有する特定のプロモーターが機能する宿主細
胞内で起こる。
乳動物の宿主細胞を形質転換することができ、その中で
発現することができる。さらに、本発明の発現ベクター
は、犬腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での複製を行わせる配列
を含有している。抗体の発現は、その抗体の構造遺伝子
と関連性を有する特定のプロモーターが機能する宿主細
胞内で起こる。
当業者ならば、本発明に係る各種の抗体鎖を発現するの
に各種の真核性宿主細胞を使用することができることを
理解されよう。Ｓ Ｐ ２／Ｏ−Ａｇｌ ４セルライン
は、普通は抗体を分泌しない骨髄腫（ミエローマ）セル
ラインである。プラスミドｐＧ９２．２７ＫおよびｐＮ
９．２．２．２７ＧｌでセルラインＳＰ２／Ｏをトラン
スフェクトした後では、そのトランスフェクトされたセ
ルラインは、キメラ９．２．２７抗体を培養液中に分泌
する。サブクローン実験の後、得られた分泌性細胞を血
清不含の培地に転換することによって、キメラ抗体が１
５μｇ ／ｘＱ／ １ ０ ’細胞までのレベルで発現
され得ることが証明されている。ＳＰ２／Ｏ細胞は本発
明の発現ベクターにとって好ましい宿主細胞であるが、
当業者ならば、本発明の２機能性抗体またはその誘導体
を発現させるのに広範囲の各種細胞を利用できることは
認識されよう。
に各種の真核性宿主細胞を使用することができることを
理解されよう。Ｓ Ｐ ２／Ｏ−Ａｇｌ ４セルライン
は、普通は抗体を分泌しない骨髄腫（ミエローマ）セル
ラインである。プラスミドｐＧ９２．２７ＫおよびｐＮ
９．２．２．２７ＧｌでセルラインＳＰ２／Ｏをトラン
スフェクトした後では、そのトランスフェクトされたセ
ルラインは、キメラ９．２．２７抗体を培養液中に分泌
する。サブクローン実験の後、得られた分泌性細胞を血
清不含の培地に転換することによって、キメラ抗体が１
５μｇ ／ｘＱ／ １ ０ ’細胞までのレベルで発現
され得ることが証明されている。ＳＰ２／Ｏ細胞は本発
明の発現ベクターにとって好ましい宿主細胞であるが、
当業者ならば、本発明の２機能性抗体またはその誘導体
を発現させるのに広範囲の各種細胞を利用できることは
認識されよう。
本発明で使用される宿主細胞は、当業者周知の標準的な
トランスフェクション法に基づく様々な方広で形質転換
することができる。使用することのできるｍｌ的なトラ
ンスフェクション法としては、電気穿孔法、プロトブラ
スト融合法、およびリン酸カルシウム沈澱法が挙げられ
る。このような方広は、以下の文献に一般的に記載され
ている：トネグッゾ−（Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ， Ｆ．
）らの、Ｍｏ１、 ａｎｄ Ｃｅ１１． Ｂｉｏ１、
（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー），
６：７０３−７０６（１９８６） ；チａ （Ｃｈ
ｕ， Ｇ． ）らのＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ
． （ニュクレイック・アシソズ・リサーチ）， １５
：１３１１−１３２５（１９８７） ；ライスら（Ｒｉ
ｃｅ， Ｄ． ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｋ １． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃ ｉ． ＋ Ｕ． Ｓ． Ａ． （ブロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシイズＵＳＡ）、？９ ：７８６２−７８６５（
１９７９），およびオイら（Ｏｉ， Ｖ． ）、Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔ Ｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃ ｉ． ， Ｕ
Ｓ．Ａ．，８０：８２５−８２９（４９８３）。
トランスフェクション法に基づく様々な方広で形質転換
することができる。使用することのできるｍｌ的なトラ
ンスフェクション法としては、電気穿孔法、プロトブラ
スト融合法、およびリン酸カルシウム沈澱法が挙げられ
る。このような方広は、以下の文献に一般的に記載され
ている：トネグッゾ−（Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ， Ｆ．
）らの、Ｍｏ１、 ａｎｄ Ｃｅ１１． Ｂｉｏ１、
（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー），
６：７０３−７０６（１９８６） ；チａ （Ｃｈ
ｕ， Ｇ． ）らのＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ
． （ニュクレイック・アシソズ・リサーチ）， １５
：１３１１−１３２５（１９８７） ；ライスら（Ｒｉ
ｃｅ， Ｄ． ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｋ １． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃ ｉ． ＋ Ｕ． Ｓ． Ａ． （ブロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシイズＵＳＡ）、？９ ：７８６２−７８６５（
１９７９），およびオイら（Ｏｉ， Ｖ． ）、Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔ Ｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃ ｉ． ， Ｕ
Ｓ．Ａ．，８０：８２５−８２９（４９８３）。
本発明のキメラ構築物を含有する組換え発現ベクターで
、宿主細胞を連続的にトランスフェクトすることが好ま
しい。たとえば、宿主細胞をまず、カッパ鎖構築物を含
有する発現ベクターでトランスフェクトし、カッパ鎖を
発現する形質転換宿主細胞を当業界周知の方法によって
遺択する。その後、選択した宿主細胞を、Ｈ鎖遺伝子構
築物を含有する発現ベクターでトランスフェクトする。
、宿主細胞を連続的にトランスフェクトすることが好ま
しい。たとえば、宿主細胞をまず、カッパ鎖構築物を含
有する発現ベクターでトランスフェクトし、カッパ鎖を
発現する形質転換宿主細胞を当業界周知の方法によって
遺択する。その後、選択した宿主細胞を、Ｈ鎖遺伝子構
築物を含有する発現ベクターでトランスフェクトする。
しかしながら、Ｌ鎖およびＨ鎖構築物の両者を同時に宿
主細胞に導入してもよく、または逆の順序で導入しても
よいことは、理解されるであろう。あるいは、Ｌおよび
Ｈ鎖遺伝子構築物の両方を単一の発現ベクター上で結合
させてもよく、またはこの２つのＤＮＡ構築物を宿主細
胞の形質転換の前に線状化し、互いに連結させることも
できるであろう。トランスフェクションおよび選択の後
、標準的な検定を行ってＣＥＰに対する抗体を検出し、
本発明の９．２．２７キメラ抗体を発現する形質転換細
胞を同定する。このような検定方法は、ブーモル（Ｂｕ
ｍｏｌ）らのＰｒｏｃ． Ｎａｔ １、 Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ， Ｕ． Ｓ． Ａ． ， ７９：ｌ２４５
−１２４９（１９８２）およびブーモルらのＪ． Ｂｉ
ｏ１、 Ｃｈｅ醜． ， ２５９：１２７３３−１２７
４１（１９８４）ｉこＳ己載されている。
主細胞に導入してもよく、または逆の順序で導入しても
よいことは、理解されるであろう。あるいは、Ｌおよび
Ｈ鎖遺伝子構築物の両方を単一の発現ベクター上で結合
させてもよく、またはこの２つのＤＮＡ構築物を宿主細
胞の形質転換の前に線状化し、互いに連結させることも
できるであろう。トランスフェクションおよび選択の後
、標準的な検定を行ってＣＥＰに対する抗体を検出し、
本発明の９．２．２７キメラ抗体を発現する形質転換細
胞を同定する。このような検定方法は、ブーモル（Ｂｕ
ｍｏｌ）らのＰｒｏｃ． Ｎａｔ １、 Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ， Ｕ． Ｓ． Ａ． ， ７９：ｌ２４５
−１２４９（１９８２）およびブーモルらのＪ． Ｂｉ
ｏ１、 Ｃｈｅ醜． ， ２５９：１２７３３−１２７
４１（１９８４）ｉこＳ己載されている。
トランスフエクトした宿主内で遺伝子を発現させた後で
は、成熟キメラ９．２．２７抗体はその上清中に分泌さ
れる。組換え技法により生産される多くの抗体が不必要
な異質性（幾つかのガンマ鎖のＣ一末端に現れる異質の
アミノ酸またはアミノ酸群から惹起される）を現わすの
で、培養液は一般に、採取した後、濃縮し、カルボキシ
ペブチダーゼの溶液で処理する。次いで、得られたキメ
ラ９．２．２７抗体を当業界周知の方法によって精製す
ればよい。
は、成熟キメラ９．２．２７抗体はその上清中に分泌さ
れる。組換え技法により生産される多くの抗体が不必要
な異質性（幾つかのガンマ鎖のＣ一末端に現れる異質の
アミノ酸またはアミノ酸群から惹起される）を現わすの
で、培養液は一般に、採取した後、濃縮し、カルボキシ
ペブチダーゼの溶液で処理する。次いで、得られたキメ
ラ９．２．２７抗体を当業界周知の方法によって精製す
ればよい。
本明細書中で説明したＤＮＡ配列およびプラスミドには
多数の修飾および変異が可能である。たとえば、遺伝子
コードの縮重は、ポリペブチドのコード化領域のヌクレ
オチドの置換を可能とするものである。そのような配列
は本発明によって既知となった９． ２． ２ ７のア
ミノ酸配列またはＤＮＡ配列から推定することができ、
以下に記載の通常の合成法によって構築することができ
る。そのような合戊法は、実質的にイタクラら［Ｉｔａ
ｋｕｒａ ｅｔ ａ１、， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８二
１０５６（１９７７）］およびクレアら［Ｃｒｅａ ｅ
ｔ ａ１、 ｒ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ１、 Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５ ： ５７６５（１９７８）
］の方法にしたがって行えばよい。さらに、合成遺伝子
およびリンカーは、Ｓｙｓｔｅｃ １４５０ＡＤＮＡ合
成機［Ｓｙｓｔｅｃ Ｉｎｃ．， ３８１６ Ｃｈａｎ
ｄｌｅｒ Ｄｒｉｖｅ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ＋ Ｍ
ＮＩまたはＡＢＳ ３ｇＯＡ ＤＮＡ合成機［Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， ８５０
ＬｉｎｃｏＩｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒｉｖｅ， Ｆｏ
ｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ ９４４０４コのどちらか
を用いて合戊することができる。その他多数のＤＮＡ合
戊装置が当分野で知られており、これらを用いて合或Ｄ
ＮＡフラグメントを調製することができる。
多数の修飾および変異が可能である。たとえば、遺伝子
コードの縮重は、ポリペブチドのコード化領域のヌクレ
オチドの置換を可能とするものである。そのような配列
は本発明によって既知となった９． ２． ２ ７のア
ミノ酸配列またはＤＮＡ配列から推定することができ、
以下に記載の通常の合成法によって構築することができ
る。そのような合戊法は、実質的にイタクラら［Ｉｔａ
ｋｕｒａ ｅｔ ａ１、， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８二
１０５６（１９７７）］およびクレアら［Ｃｒｅａ ｅ
ｔ ａ１、 ｒ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ１、 Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５ ： ５７６５（１９７８）
］の方法にしたがって行えばよい。さらに、合成遺伝子
およびリンカーは、Ｓｙｓｔｅｃ １４５０ＡＤＮＡ合
成機［Ｓｙｓｔｅｃ Ｉｎｃ．， ３８１６ Ｃｈａｎ
ｄｌｅｒ Ｄｒｉｖｅ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ＋ Ｍ
ＮＩまたはＡＢＳ ３ｇＯＡ ＤＮＡ合成機［Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， ８５０
ＬｉｎｃｏＩｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒｉｖｅ， Ｆｏ
ｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ ９４４０４コのどちらか
を用いて合戊することができる。その他多数のＤＮＡ合
戊装置が当分野で知られており、これらを用いて合或Ｄ
ＮＡフラグメントを調製することができる。
したがって、本発明はいかなる意味においても具体的に
例示したＤＮＡ配列およびプラスミドに限定されるもの
ではない。
例示したＤＮＡ配列およびプラスミドに限定されるもの
ではない。
本発明の発現ベクターを用いて真核宿主細胞を形質転換
し、種々のＬ鎖およびＨ鎖構造を有するポリペブチドを
該宿主細胞から発現させるのは当業者の理解されるとこ
ろであろう。宿主細胞が、該宿主細胞中で機能して免疫
グロブリンの構造遺伝子を転写させるプロモーターを含
有するベクターで形質転換されるときには、そして宿主
細胞が、シグナルベプチドをブロセッシングするための
細胞機序を備えているときには、成熟した抗体または抗
体鎖が細胞から分泌される。他の発現条件のもとでは、
たとえば宿主細胞が免疫グロブリンのＬ鎖だけを発現す
るときには、Ｌ鎖を宿主細胞から単離しなければならな
い。
し、種々のＬ鎖およびＨ鎖構造を有するポリペブチドを
該宿主細胞から発現させるのは当業者の理解されるとこ
ろであろう。宿主細胞が、該宿主細胞中で機能して免疫
グロブリンの構造遺伝子を転写させるプロモーターを含
有するベクターで形質転換されるときには、そして宿主
細胞が、シグナルベプチドをブロセッシングするための
細胞機序を備えているときには、成熟した抗体または抗
体鎖が細胞から分泌される。他の発現条件のもとでは、
たとえば宿主細胞が免疫グロブリンのＬ鎖だけを発現す
るときには、Ｌ鎖を宿主細胞から単離しなければならな
い。
既述のように、本発明のベクター、方法、形質転換体お
よび抗体は、癌との戦いにおいて基本的な効果を有する
であろう。モノクローナル抗体９．２．２７は、ヒト黒
色腫の診断、予知および処置に効果的な薬物である。生
化学的および免疫学的研究により、本発明の組換えおよ
びキメラ９，２．２７分子がハイブリドーマ細胞から誘
導された９．２．２７分子と同一の抗原反応性を有して
いることが判明している。
よび抗体は、癌との戦いにおいて基本的な効果を有する
であろう。モノクローナル抗体９．２．２７は、ヒト黒
色腫の診断、予知および処置に効果的な薬物である。生
化学的および免疫学的研究により、本発明の組換えおよ
びキメラ９，２．２７分子がハイブリドーマ細胞から誘
導された９．２．２７分子と同一の抗原反応性を有して
いることが判明している。
しかし、ネズミ抗体を用いることによる問題は、ヒト対
象においてこの抗体が免疫学的応答を引き起こすことが
多いことである。この問題は、本発明のキメラ抗体を用
いることによって回避することができる。９．２．２７
の定常領域をヒト起源の定常領域と置き換えることによ
って、患者の免疫系はこのキメラ抗体を「自己」と認識
し、したがって抗−９。２．２７抗体を創製することは
少なくなる。さらに、ヒト定常領域の使用は、補体の活
性化およびその他の細胞応答を助けるであろう。
象においてこの抗体が免疫学的応答を引き起こすことが
多いことである。この問題は、本発明のキメラ抗体を用
いることによって回避することができる。９．２．２７
の定常領域をヒト起源の定常領域と置き換えることによ
って、患者の免疫系はこのキメラ抗体を「自己」と認識
し、したがって抗−９。２．２７抗体を創製することは
少なくなる。さらに、ヒト定常領域の使用は、補体の活
性化およびその他の細胞応答を助けるであろう。
また、これまで知られていなかった９． ２． ２ ７
のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を使用すれば、親和性
が高いか、または低い新規な誘導体を作或し得ることは
当業者の理解されるところであろう。
のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を使用すれば、親和性
が高いか、または低い新規な誘導体を作或し得ることは
当業者の理解されるところであろう。
抗体の様々な部分を欠失あるいは突然変異させて新規な
抗体を創製することもできるし、あるいはある鎖の一部
を別の鎖片で置き換えることもできる。Ｘ一線結晶学に
よる研究を行えば、９．２．２７が結合する抗原のエビ
トープに抗体のどのアミノ酸残基が近接しているかが分
かるであろう。タンパク質工学の方法を用いることによ
り、９．２，２７を修飾すれば、癌患者の細胞表面抗原
に対して改良された親和性を示す「タンパク工学的に加
工された」抗体を得ることができる。
抗体を創製することもできるし、あるいはある鎖の一部
を別の鎖片で置き換えることもできる。Ｘ一線結晶学に
よる研究を行えば、９．２．２７が結合する抗原のエビ
トープに抗体のどのアミノ酸残基が近接しているかが分
かるであろう。タンパク質工学の方法を用いることによ
り、９．２，２７を修飾すれば、癌患者の細胞表面抗原
に対して改良された親和性を示す「タンパク工学的に加
工された」抗体を得ることができる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
これらの実施例は各種構築の操作法を挙げ、その操作法
を適宜説明するものである。これらの実施例は、いかな
る意味においても発明の範囲を限定するものではない。
を適宜説明するものである。これらの実施例は、いかな
る意味においても発明の範囲を限定するものではない。
本明細書に記載したアミノ酸配列およびヌクレオチド配
列は、キメラ９．２．２７抗体の構築或分からなるが、
これらの配列に若干の改変を加えても、抗原の結合性が
実，質的に同等である可変領域が得られることは理解さ
れよう。本発明は、必要とされる抗原の特異性が保持さ
れる限りは、これらの改変も包含するものである。
列は、キメラ９．２．２７抗体の構築或分からなるが、
これらの配列に若干の改変を加えても、抗原の結合性が
実，質的に同等である可変領域が得られることは理解さ
れよう。本発明は、必要とされる抗原の特異性が保持さ
れる限りは、これらの改変も包含するものである。
実施例ｌ
ブラスミドｐＭＬＣＥ−１０の単離
大腸ｍ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ １２ ＨＢ ｔｏ １／ｐ
ＭＬＣＥ１０の凍結乾燥品は、受託番号ＡＴＣＣ ６７
６３９（寄託日： １９ｇ８年３月１日）のもと、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＭＤ ２
０８５２，ロックビレ，バークローン・ドライブ１２３
０１番）から入手される。この凍結乾燥品をＬＢ培地［
ＩＱ中にバクトートリプトン１０ｇ１バクトー酵母エキ
ス ５ｇおよびＮａＣＣ１０ｇを含有、ｐＨを７．５に
調節］１０岬の入った試験管内にデカントし、３７゜Ｃ
で２時間インキユベートする。この時点で培養物を５０
μｇ ／ｊ！１２アンピシリンに凋節し、次いで３７℃
で一晩インキユベートする。ブラスミドｐＭＬＣＥｉＯ
は、ヒト癌胎児性抗原を認識する、ＯＥＭ２３ １．６
．７モノクローナル抗体のＬ鎖司変領域をコードしてい
る遺伝子を含有している。
ＭＬＣＥ１０の凍結乾燥品は、受託番号ＡＴＣＣ ６７
６３９（寄託日： １９ｇ８年３月１日）のもと、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＭＤ ２
０８５２，ロックビレ，バークローン・ドライブ１２３
０１番）から入手される。この凍結乾燥品をＬＢ培地［
ＩＱ中にバクトートリプトン１０ｇ１バクトー酵母エキ
ス ５ｇおよびＮａＣＣ１０ｇを含有、ｐＨを７．５に
調節］１０岬の入った試験管内にデカントし、３７゜Ｃ
で２時間インキユベートする。この時点で培養物を５０
μｇ ／ｊ！１２アンピシリンに凋節し、次いで３７℃
で一晩インキユベートする。ブラスミドｐＭＬＣＥｉＯ
は、ヒト癌胎児性抗原を認識する、ＯＥＭ２３ １．６
．７モノクローナル抗体のＬ鎖司変領域をコードしてい
る遺伝子を含有している。
一晩培養物の少量をとり、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ １ ２
ＨＢ １ ０ １／ｐＭＬＣＥ−１ ０の単一のコロニ
ー単離体が得られるような方法で、それを５０μｇ ／
ｘ（１アンビシリンを含むＬＢ一寒天（１５ｇ／Ｑバク
ト寒天を含むＬＢ培地）平板上にプレートした。
ＨＢ １ ０ １／ｐＭＬＣＥ−１ ０の単一のコロニ
ー単離体が得られるような方法で、それを５０μｇ ／
ｘ（１アンビシリンを含むＬＢ一寒天（１５ｇ／Ｑバク
ト寒天を含むＬＢ培地）平板上にプレートした。
得られた単一のコロニーを５０μｇｈＱアンピンリンを
含むＬＢ培地１０ｊＩ１２に接種し、激しく振盪させな
がら３７°Ｃで一晩インキユベートした。
含むＬＢ培地１０ｊＩ１２に接種し、激しく振盪させな
がら３７°Ｃで一晩インキユベートした。
コ” Ｔｌ培養物１ ０ ｘ（ｌを５０μｇ／ｙｔ（
ｌアンビシリン含有のＬＢ培地５００ｙｔ（ｌに接種し
、激しく振盪させながら培養物が定常相に達するまで３
７゜Ｃにおいてインキユベートした。
ｌアンビシリン含有のＬＢ培地５００ｙｔ（ｌに接種し
、激しく振盪させながら培養物が定常相に達するまで３
７゜Ｃにおいてインキユベートした。
以下の操作は、マニアティスら［Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅ
ｔａｔ． ，モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］の方法を脚色
したものである。得られた細胞を、４゜Ｃ， ４０００
ｇで１０分間遠心することによって採取し、その上清を
捨てた。得られた細胞ベレットを水冷したＳＴＥ緩衝液
［０．１Ｍ ＮａＣＱ： １０ｍＭ トリスーＨＣｌ
２（ｐＨ７．８）；およびｌｍＭＥＤＴＡ］１００ｘＣ
で洗浄した。洗浄後、得られた細胞ペレットを５ｘｇ／
ｘｃ リゾチームを含有する溶液１［５ＱｍＭ グルコ
ース；２５ｍＭ トリスーＨＣＱ（ｐＨ８．０）；およ
び１ ０ａ＋Ｍ ＥＤＴＡ］１ ０１Ｉ（ｌに再懸濁し
、室温で１０分間放置した。次いで、このリゾチーム処
理した細胞に溶液２［０．２Ｎ ＮａＯＨおよび１％Ｓ
ＤＳ］２０ｆｆｆ２を加え、得られた溶液を反転させて
穏やかに混合した。この混合物を水上で１０分間インキ
ユベートした。
ｔａｔ． ，モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］の方法を脚色
したものである。得られた細胞を、４゜Ｃ， ４０００
ｇで１０分間遠心することによって採取し、その上清を
捨てた。得られた細胞ベレットを水冷したＳＴＥ緩衝液
［０．１Ｍ ＮａＣＱ： １０ｍＭ トリスーＨＣｌ
２（ｐＨ７．８）；およびｌｍＭＥＤＴＡ］１００ｘＣ
で洗浄した。洗浄後、得られた細胞ペレットを５ｘｇ／
ｘｃ リゾチームを含有する溶液１［５ＱｍＭ グルコ
ース；２５ｍＭ トリスーＨＣＱ（ｐＨ８．０）；およ
び１ ０ａ＋Ｍ ＥＤＴＡ］１ ０１Ｉ（ｌに再懸濁し
、室温で１０分間放置した。次いで、このリゾチーム処
理した細胞に溶液２［０．２Ｎ ＮａＯＨおよび１％Ｓ
ＤＳ］２０ｆｆｆ２を加え、得られた溶液を反転させて
穏やかに混合した。この混合物を水上で１０分間インキ
ユベートした。
この溶閑細胞混合物に水冷した５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ
４． ８）１ ５ｍ（！を加え、溶液を反転混合した
。この溶液を氷上でｌＯ分間インキユヘートシた。水２
８．５１ｆｆおよび５Ｍ酢酸カリウム６０１Ｑに水酢酸
１１．５ｆｆｆｆを加えることによって５Ｍ酢酸カリウ
ム溶液を調製した；得られた溶液はカリウムについては
３Ｍ，そしてアセテートについては５Ｍである。
４． ８）１ ５ｍ（！を加え、溶液を反転混合した
。この溶液を氷上でｌＯ分間インキユヘートシた。水２
８．５１ｆｆおよび５Ｍ酢酸カリウム６０１Ｑに水酢酸
１１．５ｆｆｆｆを加えることによって５Ｍ酢酸カリウ
ム溶液を調製した；得られた溶液はカリウムについては
３Ｍ，そしてアセテートについては５Ｍである。
この溶菌細胞混合物を、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）
ＳＷ２７（またはその同等の機器）を使用し、４゜Ｃ、
２０，ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心した。細胞ＤＮＡと
その残骸は管の底にペレソトを形成した。上清約３６村
を回収し、０．６容量のイソブロバ／一ルを加えて混合
し、得られた溶液を室温でＸ５分間放置した。室温にお
いて１２，ＯＯＯｙで３０分間遠心することによってブ
ラスミドＤＮＡを採取した。上清を捨て、得られたＤＮ
Ａベレソトを７０％エタノールによって室温で洗浄した
。このエタノール洗液をデカントし、得られたべレソト
を真空デシケーター中で乾燥した。次いで、このペレッ
トをＴＥ緩衝液［１０ｍＭトリスーＨ Ｃ Ｃ（ｐＨ
８０）およびｌｍＭ ＥＤＴＡ］８ｘ（！中に再懸濁し
た。
ＳＷ２７（またはその同等の機器）を使用し、４゜Ｃ、
２０，ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心した。細胞ＤＮＡと
その残骸は管の底にペレソトを形成した。上清約３６村
を回収し、０．６容量のイソブロバ／一ルを加えて混合
し、得られた溶液を室温でＸ５分間放置した。室温にお
いて１２，ＯＯＯｙで３０分間遠心することによってブ
ラスミドＤＮＡを採取した。上清を捨て、得られたＤＮ
Ａベレソトを７０％エタノールによって室温で洗浄した
。このエタノール洗液をデカントし、得られたべレソト
を真空デシケーター中で乾燥した。次いで、このペレッ
トをＴＥ緩衝液［１０ｍＭトリスーＨ Ｃ Ｃ（ｐＨ
８０）およびｌｍＭ ＥＤＴＡ］８ｘ（！中に再懸濁し
た。
このＤＮＡ溶｝夜にＣｓＣ（２８ｇを加えた。各｛Ｏｍ
ｌ２のＣｓＣＱ−ＤＮＡ溶液に１０ｉｇ／＋Ｃ臭化エチ
ジウム水溶岐約０．８ｍ（ｌを加えた。最終の溶液密度
は約１．５５ｇ／＋Ｃであり、臭化エチジウム濃度は約
６００μｇ ／ｙＱであった。この溶液をベックマン５
０型遠心管に移し、バラフィンオイルで上端まで満たし
、封をし、そして２０’Ｃにおいて４ ５， Ｏ Ｏ
Ｏｒｐｍで２４時間遠心した。遠心後、普通光のもとて
２つのＤＮＡバンドが観察された。
ｌ２のＣｓＣＱ−ＤＮＡ溶液に１０ｉｇ／＋Ｃ臭化エチ
ジウム水溶岐約０．８ｍ（ｌを加えた。最終の溶液密度
は約１．５５ｇ／＋Ｃであり、臭化エチジウム濃度は約
６００μｇ ／ｙＱであった。この溶液をベックマン５
０型遠心管に移し、バラフィンオイルで上端まで満たし
、封をし、そして２０’Ｃにおいて４ ５， Ｏ Ｏ
Ｏｒｐｍで２４時間遠心した。遠心後、普通光のもとて
２つのＤＮＡバンドが観察された。
管からキャップを取った後、注射器の＃２ｌ皮下注射針
を遠心管の側面から挿入し、下方のＤＮＡバンドを採取
した。
を遠心管の側面から挿入し、下方のＤＮＡバンドを採取
した。
水飽和のｌ−ブタノールで数回抽出して臭化エチジウム
を除去した。ＴＥ緩衝液に対して透析することによって
ＣｓＣＱを除去した。緩衝フェノール、次いでクロロホ
ルムで抽出した後、ＤＮＡを７０％エタノールで沈澱さ
せ、洗浄し、そして乾燥した。約ｌａｇのプラスミドｐ
ＭＬＣＥ−１０が得られ、これをＴＥ綬衝液中、約１μ
ｇ／μＱの濃度で、４°Ｃにおいて保存した。ブラスミ
ドｐＭＬＣＥ−１０の制限部位および機能地図を添付の
第１図に示す。
を除去した。ＴＥ緩衝液に対して透析することによって
ＣｓＣＱを除去した。緩衝フェノール、次いでクロロホ
ルムで抽出した後、ＤＮＡを７０％エタノールで沈澱さ
せ、洗浄し、そして乾燥した。約ｌａｇのプラスミドｐ
ＭＬＣＥ−１０が得られ、これをＴＥ綬衝液中、約１μ
ｇ／μＱの濃度で、４°Ｃにおいて保存した。ブラスミ
ドｐＭＬＣＥ−１０の制限部位および機能地図を添付の
第１図に示す。
実施例２
ブラスミドｐＨＫＣＥ−１０の構築
実施例１で調製したプラスミドｐＭＬ，ＣＥ−ＩＱ
ＤＮＡ（約１０μ０を、１ ０ Ｘ Ｈ ｉｎｄｌｌｌ
制限緩衝液［５００ｍＭ ＮａＣＱ； ５００ｍＭｌ−
リスーＨＣＱ（ｐＨ ８． ０） ： １ ０ ０ａ＋
Ｍ ＭｇＣＱ２；および１０ｍＭＤＴＴ］（２０μＱ）
、ｌ Ｒ９７ＲＱ Ｂ Ｓ Ａ（２ ０μ１２）、制限
酵素Ｈ ｉｎｄｌｌｌ［５ ｕｌ２： 〜５ ０単位（
Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ（Ｂ Ｒ Ｌ）の定義；本発明に用いた制限
酵素の全てはここから入手した）］、および水（１４５
μＱ）と混合し、得られた反応液を３７゜Ｃで２時間イ
ンキユベートした。本明細書に記載の制限酵素反応は、
常法通りフェノールおよびそれに続くクロロホルム抽出
によって停止させ、その後にＤＮＡの沈澱、エタノール
洗浄、およびＴＥ緩衝液へのＤＮＡの再懸濁を行った。
ＤＮＡ（約１０μ０を、１ ０ Ｘ Ｈ ｉｎｄｌｌｌ
制限緩衝液［５００ｍＭ ＮａＣＱ； ５００ｍＭｌ−
リスーＨＣＱ（ｐＨ ８． ０） ： １ ０ ０ａ＋
Ｍ ＭｇＣＱ２；および１０ｍＭＤＴＴ］（２０μＱ）
、ｌ Ｒ９７ＲＱ Ｂ Ｓ Ａ（２ ０μ１２）、制限
酵素Ｈ ｉｎｄｌｌｌ［５ ｕｌ２： 〜５ ０単位（
Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ（Ｂ Ｒ Ｌ）の定義；本発明に用いた制限
酵素の全てはここから入手した）］、および水（１４５
μＱ）と混合し、得られた反応液を３７゜Ｃで２時間イ
ンキユベートした。本明細書に記載の制限酵素反応は、
常法通りフェノールおよびそれに続くクロロホルム抽出
によって停止させ、その後にＤＮＡの沈澱、エタノール
洗浄、およびＴＥ緩衝液へのＤＮＡの再懸濁を行った。
上記のようにＨｉｎｄｌｌｌ消化を停止させた後、Ｈｉ
ｎｄｌｌｌ消化したプラスミドｐＭＬＣＥ−ｔｏ ＤＮ
Ａを沈澱させ、次いでＴＥ緩衝液（５μＱ）に再懸濁し
た。
ｎｄｌｌｌ消化したプラスミドｐＭＬＣＥ−ｔｏ ＤＮ
Ａを沈澱させ、次いでＴＥ緩衝液（５μＱ）に再懸濁し
た。
０．５μ９／村の臭化エチジウムを含有する０．７５％
ＴＢＥアガロースゲルにおいて、３０ｖで一晩、Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ消化のブラスミドｐＭＬＣＥ−１０ ＤＮＡ
を電気泳動することによって、完全なＯＥＭ２３ １．
６．７可変κ領域を含有するブラスミドｐＭＬＣＥ−ｌ
Ｑの約３．８ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントを
単離した。Ｕｖ透明光箱で可視化した後、約３．８ｋｂ
のＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントをＤ Ｅ Ａ Ｅ
８ １ ［Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅ
ｌ１、 Ｋｅｅｎｅ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅコ紙
に電気泳動させ、次いでＩＭＮａＣＱ中で溶出させ、エ
タノール沈澱させた。この溶出フラグメントをＴＥ緩衝
液（５μＱ〉に再懸濁した。
ＴＢＥアガロースゲルにおいて、３０ｖで一晩、Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ消化のブラスミドｐＭＬＣＥ−１０ ＤＮＡ
を電気泳動することによって、完全なＯＥＭ２３ １．
６．７可変κ領域を含有するブラスミドｐＭＬＣＥ−ｌ
Ｑの約３．８ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントを
単離した。Ｕｖ透明光箱で可視化した後、約３．８ｋｂ
のＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントをＤ Ｅ Ａ Ｅ
８ １ ［Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅ
ｌ１、 Ｋｅｅｎｅ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅコ紙
に電気泳動させ、次いでＩＭＮａＣＱ中で溶出させ、エ
タノール沈澱させた。この溶出フラグメントをＴＥ緩衝
液（５μＱ〉に再懸濁した。
大腸菌Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＨＫＦ−１の凍結乾燥品
をＡＴＣＣから受託番号ＡＴＣＣ６７６３７ （１９８
８年３月１日寄託）のもとで入手した。ヒトκ定常領域
をコードしている遺伝子を含有するブラスミドｐＨＫＦ
−１を、実質的に実施例ｌの教示に従って大腸菌Ｋ１２
ＨＢＩＯＩ／ｐＨＫＦ−１の培養物から単離した。プ
ラスミドｐＨＫＦ−１の制限部位および機能地図を添付
の第２図に示す。
をＡＴＣＣから受託番号ＡＴＣＣ６７６３７ （１９８
８年３月１日寄託）のもとで入手した。ヒトκ定常領域
をコードしている遺伝子を含有するブラスミドｐＨＫＦ
−１を、実質的に実施例ｌの教示に従って大腸菌Ｋ１２
ＨＢＩＯＩ／ｐＨＫＦ−１の培養物から単離した。プ
ラスミドｐＨＫＦ−１の制限部位および機能地図を添付
の第２図に示す。
ブラスミドｐＨＫＦ−１（１μ９）を制限酵素Ｈｉｎｄ
ｌｌｌで消化し、直線形のプラスミドを単離し、上に教
示したようにしてアガロースゲルから精製した。
ｌｌｌで消化し、直線形のプラスミドを単離し、上に教
示したようにしてアガロースゲルから精製した。
プラスミドｐＭＬＣＥ−ＩＱの約３．８ｋｂのＨｉｎｄ
ｌｌ１制限フラグメント（約ｌμ９；２μｇ）を、ＩＯ
Ｘリガーゼ緩衝液［３００ｍＭトリスーＨＣ＋２（ｐＨ
７．６）； １ ００ｍＭ ＭｇＣＣ−および５０ａ＋
Ｍ ＤＴＴ］（２．５ｕ（！）、ｌ１９／ＩＱ Ｂ Ｓ
Ａ（２． ５μｌ２）、５ｎ＋ＭＡＴＰ（７μＱ）、
’［’４ ＤＮＡリガーゼ（２．５μ１２；Ｐ−ＬＢ
ｉｏｃｈｅａ＋ｉｃａｌｓの定義で約２．５単位）、お
よび水（ｌ８μＱ）中、Ｈｉｎｄｌｌｌ消化のブラスミ
ドｐＨＫＦ−１（約６００ｒ＋９；０．５μｇ）に連結
した。得られた連結混合物を１２℃で一晩インキユベー
トした。この連結したＤＮＡは所望のプラスミドｐＨＫ
ＣＥ−１０を構戊していた。
ｌｌ１制限フラグメント（約ｌμ９；２μｇ）を、ＩＯ
Ｘリガーゼ緩衝液［３００ｍＭトリスーＨＣ＋２（ｐＨ
７．６）； １ ００ｍＭ ＭｇＣＣ−および５０ａ＋
Ｍ ＤＴＴ］（２．５ｕ（！）、ｌ１９／ＩＱ Ｂ Ｓ
Ａ（２． ５μｌ２）、５ｎ＋ＭＡＴＰ（７μＱ）、
’［’４ ＤＮＡリガーゼ（２．５μ１２；Ｐ−ＬＢ
ｉｏｃｈｅａ＋ｉｃａｌｓの定義で約２．５単位）、お
よび水（ｌ８μＱ）中、Ｈｉｎｄｌｌｌ消化のブラスミ
ドｐＨＫＦ−１（約６００ｒ＋９；０．５μｇ）に連結
した。得られた連結混合物を１２℃で一晩インキユベー
トした。この連結したＤＮＡは所望のプラスミドｐＨＫ
ＣＥ−１０を構戊していた。
実施例３
大腸菌Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＨＫＣＥ−１０の堡底
大腸菌Ｋ１２ ＨＢＩＯＩはＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉ
ｃｉｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ（Ｐｅｏｒｉａ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から受託番号
Ｎ Ｒ Ｒ Ｌ Ｂ − １ ５ ６ ２ ６ （１
９８３年９月２８日寄託）のもと、凍結乾燥形態で入手
することができる。この凍結乾燥品を復元し、ＨＢＩＯ
Ｉの単一コロニーを単離し、培養培地にアンビシリンを
使用しないことを除いて実質的に実施例１の方法に従い
、ＨＢＩＯＩ細胞の１０ｘＱの一晩培養物を調製した。
ｃｉｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ（Ｐｅｏｒｉａ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から受託番号
Ｎ Ｒ Ｒ Ｌ Ｂ − １ ５ ６ ２ ６ （１
９８３年９月２８日寄託）のもと、凍結乾燥形態で入手
することができる。この凍結乾燥品を復元し、ＨＢＩＯ
Ｉの単一コロニーを単離し、培養培地にアンビシリンを
使用しないことを除いて実質的に実施例１の方法に従い
、ＨＢＩＯＩ細胞の１０ｘＱの一晩培養物を調製した。
この一晩培養物（５０μｌ２）を、１ ０ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ４および１ ０ ｍＭ ＭｇＣ １２．をも含有して
いるＬＢ培地（５ ｘＱ＞に接種した。この培養物を激
しく振盪しながら３７°Ｃで一晩インキユベートした。
Ｏ４および１ ０ ｍＭ ＭｇＣ １２．をも含有して
いるＬＢ培地（５ ｘＱ＞に接種した。この培養物を激
しく振盪しながら３７°Ｃで一晩インキユベートした。
翌朝、この培養物を、１ ０ｍＭ ＭｇＳＯ．およびｌ
ｏｍＭＭ ｇ Ｃ Ｑ ｔ含有のＬＢ培地で２００ｘｌ
２に希釈した。
ｏｍＭＭ ｇ Ｃ Ｑ ｔ含有のＬＢ培地で２００ｘｌ
２に希釈した。
この希釈培養物を、５５０ｎｘでの吸収（Ａ，，。）が
約０．５（約１ｘｌＯ８細胞／Ｍ（ｌの細胞密度を表す
）になるまで、激しく振盪しながら３７°Ｃでインキユ
ベートした。この培養物を氷一水浴で１０分間冷却し、
次いで４゜Ｃで１０分間、４０００ｇで遠心することに
よって細胞を集めた。この細胞ペレットを冷１ ０ｍＭ
ＭｇＳＯ４（１ ００Ｒ（！）に再懸濁し、直ちに遠
心して再ペレソト化した。この細胞ベレソトを３０ｍＭ
ＣａＣＬ（１００ｘ（！）に再悲濁し、水上で２０分
間インキユベートした。
約０．５（約１ｘｌＯ８細胞／Ｍ（ｌの細胞密度を表す
）になるまで、激しく振盪しながら３７°Ｃでインキユ
ベートした。この培養物を氷一水浴で１０分間冷却し、
次いで４゜Ｃで１０分間、４０００ｇで遠心することに
よって細胞を集めた。この細胞ペレットを冷１ ０ｍＭ
ＭｇＳＯ４（１ ００Ｒ（！）に再懸濁し、直ちに遠
心して再ペレソト化した。この細胞ベレソトを３０ｍＭ
ＣａＣＬ（１００ｘ（！）に再悲濁し、水上で２０分
間インキユベートした。
この細胞をもう一度遠心することによって集め、３ ０
ｍＭ ＣａＣｌ２ｔ（ １ ０ｉｆｆ）に再懸濁した。
ｍＭ ＣａＣｌ２ｔ（ １ ０ｉｆｆ）に再懸濁した。
この細胞（０．５ｘＣ）を実施例２で調製した連結ＤＮ
Ａに加えた（ＤＮＡは３０ｍＭ ＣａＣＬにしておいた
）。
Ａに加えた（ＤＮＡは３０ｍＭ ＣａＣＬにしておいた
）。
この細胞一ＤＮＡ混合物を水上で１時間インキユヘート
し、４２゜Ｃで９０秒間、熱ショックを与え、次いで氷
上で約２分間冷却した。この細胞−ＤＮＡ混合物をｌ２
５１ｌＱフラスコ中のＬＢ培地（１ ０ｘＱ）で希釈し
、３７゜Ｃで１時間インキユベートした。
し、４２゜Ｃで９０秒間、熱ショックを与え、次いで氷
上で約２分間冷却した。この細胞−ＤＮＡ混合物をｌ２
５１ｌＱフラスコ中のＬＢ培地（１ ０ｘＱ）で希釈し
、３７゜Ｃで１時間インキユベートした。
１００μＱづつをアンピシリン含有のＬＢ一寒天プレー
トに蒔き、コロニーが現れるまで３７゜Ｃでインキユヘ
ートシた。別の方広によれば、このＤＮＡを、Ｂ Ｒ
Ｌ （Ｐ． Ｏ． Ｂｏｘ ６００９， Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ ２０８７７）からの市販品から
入手可能な凍結のコンビテントな大腸菌Ｋｌ２ ＨＢＩ
ＯＩ細胞に導入することができる。
トに蒔き、コロニーが現れるまで３７゜Ｃでインキユヘ
ートシた。別の方広によれば、このＤＮＡを、Ｂ Ｒ
Ｌ （Ｐ． Ｏ． Ｂｏｘ ６００９， Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ ２０８７７）からの市販品から
入手可能な凍結のコンビテントな大腸菌Ｋｌ２ ＨＢＩ
ＯＩ細胞に導入することができる。
コロニーを個々に培養し、それぞれのコロニーのブラス
ミドＤＮＡを制限酵素分析とゲル電気泳動によって調べ
た。ブラスミドＤＮＡの単離は、実施例１の方法に従い
比較的小さなスケールで行ったが、所望の大腸菌Ｋ １
２ ＨＢ １０ １／ｐＨＫＣＥ−ｔｏ形質転換体が
同定されるまでＣｓＣＣ勾配工程は削除した。ブラスミ
ドｐＨＫｃＥｌｏの制限部位および機能地図を添付の第
３図に示す。
ミドＤＮＡを制限酵素分析とゲル電気泳動によって調べ
た。ブラスミドＤＮＡの単離は、実施例１の方法に従い
比較的小さなスケールで行ったが、所望の大腸菌Ｋ １
２ ＨＢ １０ １／ｐＨＫＣＥ−ｔｏ形質転換体が
同定されるまでＣｓＣＣ勾配工程は削除した。ブラスミ
ドｐＨＫｃＥｌｏの制限部位および機能地図を添付の第
３図に示す。
実施例４
ブラスミドｐＧＣＥＭＫの構築
ヒトκ定常領域遺伝子に融合させたネズミκ可変領域遺
伝子を含有する真核性発現ベクターを、受託番号ＡＴＣ
Ｃ３７１４５のもとてＡＴＣＣからだれでも入手できる
ベクターｐＳ Ｖ ２ｇｐｔを用いて構築した。ｌＱＸ
ＥｃｏＲＩ緩衝１［５００ｍＭＮａＣＱ； ＩＭトリス
−ＨＣ（２（ｐＨ７．５）；および５０ ｍＭ Ｍ ｇ
Ｃ ｌ２ｔコおよび制限酵素ＥｃｏＲＩを用いたこと
以外は実質的に実施例２の教示に従って、ブラスミドｐ
Ｓ Ｖ ２ ｇｐｔ（約１μ９）を制限酵素ＥｃｏＲＩ
で消化した。エタノール沈澱と精製の後、Ｍｏｌｅｃｕ
ｆａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（上記）の記載のようにして、
それぞれ５ｍＭの４種のデオキシリポヌクレオチドｄＴ
ＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰ（ｌＯμＱ）
、クレノウ酵素（２単位）およびＩＯＸクレノウ緩衝液
［５００ｍＭトリスーＨＣｆｆ（ｐＨ７．５）； １０
０ｍＭ ＭｇＣ Ｑｓ ；および１ ０ｍＭ ＤＴＴ］
（５μＣ）を加えて全ｆｆ！５０μＱ中でＥｃｏＲＩ末
端を平滑にした。
伝子を含有する真核性発現ベクターを、受託番号ＡＴＣ
Ｃ３７１４５のもとてＡＴＣＣからだれでも入手できる
ベクターｐＳ Ｖ ２ｇｐｔを用いて構築した。ｌＱＸ
ＥｃｏＲＩ緩衝１［５００ｍＭＮａＣＱ； ＩＭトリス
−ＨＣ（２（ｐＨ７．５）；および５０ ｍＭ Ｍ ｇ
Ｃ ｌ２ｔコおよび制限酵素ＥｃｏＲＩを用いたこと
以外は実質的に実施例２の教示に従って、ブラスミドｐ
Ｓ Ｖ ２ ｇｐｔ（約１μ９）を制限酵素ＥｃｏＲＩ
で消化した。エタノール沈澱と精製の後、Ｍｏｌｅｃｕ
ｆａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（上記）の記載のようにして、
それぞれ５ｍＭの４種のデオキシリポヌクレオチドｄＴ
ＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰ（ｌＯμＱ）
、クレノウ酵素（２単位）およびＩＯＸクレノウ緩衝液
［５００ｍＭトリスーＨＣｆｆ（ｐＨ７．５）； １０
０ｍＭ ＭｇＣ Ｑｓ ；および１ ０ｍＭ ＤＴＴ］
（５μＣ）を加えて全ｆｆ！５０μＱ中でＥｃｏＲＩ末
端を平滑にした。
この反応を室温で３０分間進行させ、次いで全混合物を
フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール比澱させ
、水（５μｇ）に再懸濁した。
フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール比澱させ
、水（５μｇ）に再懸濁した。
次に、リン力一をこの平滑にしたベクターに付加した。
Ｃｌａｌリンカーは配列ｄ（ｐＣＡＴＣＣＧＡＴＧ）を
含有しており、これをＮ Ｅ Ｂ （Ｂｅｖｅｒｌｙ＋
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入した。別法で
は、市販の装置、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ（８５０ ＬｉｎｃｏＩｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄ
ｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ．ＣＡ ９４４０４
）から市販の３８０ＡＤＮＡ合戊機（ホスホルアミダイ
トの化学を利用している）を用いてリンカーを合或する
ことができる。また、ＤＮＡを合成するための他の方法
も当分野で知られている。ｌ本鎖ＤＮＡ合戊のための通
常の改良ホスホトリエステル広は、イタクラ等［Ｉｔａ
ｋｕｒａ ｅｔ ａ１、 ， １９７７， Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ １９８ ： １０５６］およびクレア等［Ｃｒｅ
ａ ｅｔ ａ１、 ， １９７ｇ， Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔ１、 Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５ ： ５７
６５］が記載している。さらに、ＤＮＡ合成の特に好ま
しい方法を、シン等［Ｈｓｉｕｎｇｅｔ ａ１、 ，
１９８３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ １１ ： ３２２７］およびナラン等［Ｎａｒａ
ｎｇ ｅｔ ａ１、＋ １９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８ ： ９０コが開示して
いる。
含有しており、これをＮ Ｅ Ｂ （Ｂｅｖｅｒｌｙ＋
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入した。別法で
は、市販の装置、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ（８５０ ＬｉｎｃｏＩｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄ
ｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ．ＣＡ ９４４０４
）から市販の３８０ＡＤＮＡ合戊機（ホスホルアミダイ
トの化学を利用している）を用いてリンカーを合或する
ことができる。また、ＤＮＡを合成するための他の方法
も当分野で知られている。ｌ本鎖ＤＮＡ合戊のための通
常の改良ホスホトリエステル広は、イタクラ等［Ｉｔａ
ｋｕｒａ ｅｔ ａ１、 ， １９７７， Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ １９８ ： １０５６］およびクレア等［Ｃｒｅ
ａ ｅｔ ａ１、 ， １９７ｇ， Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔ１、 Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５ ： ５７
６５］が記載している。さらに、ＤＮＡ合成の特に好ま
しい方法を、シン等［Ｈｓｉｕｎｇｅｔ ａ１、 ，
１９８３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ １１ ： ３２２７］およびナラン等［Ｎａｒａ
ｎｇ ｅｔ ａ１、＋ １９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８ ： ９０コが開示して
いる。
５ｘキナーゼ緩衝液［３００ｍＭトリスーＨＣｅ（ｐＨ
７． ８） ； ５ ０ｍＭ ＭｇＣ（！− ；およ
び２５ｍＭＤＴＴ］（１０μＱ）、５ｍＭＡＴＰ（５μ
１２）、Ｈ，Ｏ（２４μＱ）、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（０．５μＱ； Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓの定義で約２．５単位）、１ ｍｙ／ ｍＱ Ｂ
Ｓ Ａ （５ ｕｆｆ）、およびｌｏｍＭスペルミジン
（５μＱ）を含有する混合物中、混合物を３７゜Ｃで３
０分間インキユベートすることによってＣｌａＩリンカ
ー（約２μ９）をキナーゼ処理した。このキナーゼ処理
したＣｌａｌリンカー（約１２、５μｌ２）を、Ｅｃｏ
Ｒ１切断して平滑にしたｐＳＶ２ｇｐｔベクター（約５
０ Ｏ ｎ９）に添加し、実質的に実施例２の教示に
従って連結反応を行った。次いで、実質的に実施例３の
教示に従って、試料を電気泳動にかけ、ベクターを単離
し、ＤＥＡＥ８ １紙から精製し、次に自己連結させ、
大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞に導入した。アンピシリン耐性コ
ロニーから単離したプラスミドを分析し、適切なＣｌａ
ｌ制限部位を含有しているブラスミドをｐＳ Ｖ ２
ｇｐｔ−Ｃ ｌａ Ｉと命名した。
７． ８） ； ５ ０ｍＭ ＭｇＣ（！− ；およ
び２５ｍＭＤＴＴ］（１０μＱ）、５ｍＭＡＴＰ（５μ
１２）、Ｈ，Ｏ（２４μＱ）、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（０．５μＱ； Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓの定義で約２．５単位）、１ ｍｙ／ ｍＱ Ｂ
Ｓ Ａ （５ ｕｆｆ）、およびｌｏｍＭスペルミジン
（５μＱ）を含有する混合物中、混合物を３７゜Ｃで３
０分間インキユベートすることによってＣｌａＩリンカ
ー（約２μ９）をキナーゼ処理した。このキナーゼ処理
したＣｌａｌリンカー（約１２、５μｌ２）を、Ｅｃｏ
Ｒ１切断して平滑にしたｐＳＶ２ｇｐｔベクター（約５
０ Ｏ ｎ９）に添加し、実質的に実施例２の教示に
従って連結反応を行った。次いで、実質的に実施例３の
教示に従って、試料を電気泳動にかけ、ベクターを単離
し、ＤＥＡＥ８ １紙から精製し、次に自己連結させ、
大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞に導入した。アンピシリン耐性コ
ロニーから単離したプラスミドを分析し、適切なＣｌａ
ｌ制限部位を含有しているブラスミドをｐＳ Ｖ ２
ｇｐｔ−Ｃ ｌａ Ｉと命名した。
制限酵素ＣｌａｌおよびＢａｍＨＩを用いたことを除き
実質的に実施例２の教示に従って、プラスミドｐｓ Ｖ
２ ｇｐｔ−Ｃ Ｉａ Ｉ （約１μ９）を消化し、
約４，５ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｃｌａｌ制限フラグメント
をアガロースゲルから単離し、ＤＥＡＥ８ １紙から精
製した。同様に、プラスミドｐＨＫＣＥ−１０を２種類
の同じ制限酵素で消化し、約９ｋｂのＢａｍＨＩＣｌａ
ｌ制限フラグメントを単離し、精製した。ヒトκ定常領
域をコードしている遺伝子に連結した抗体ｃ ＥＭ２
３ １． ６． ７のネズミκ可変領域をコードしてい
る遺伝子を含有するこの約９ｋｂの制限フラグメントを
、ベクターｐｓ Ｖ ２ ｇｐｔ＝ Ｃ ｌａ Ｉの約
４．５ｋｂ Ｃｌａｌ −ＢａｍＨ Ｉフラグメントに
連結した。この連結混合物を大腸菌ＨＢＩＯＩに導入し
、アンピシリン耐性コロニーからの組換えプラスミドを
適切な制限部位について試験した。適切な地図を有する
プラスミドをプラスミドｐＧＣＥＭＫと命名した。ブラ
スミドｐＧＣＥＭＫの制限部位および機能地図を添付の
第４図に示す。
実質的に実施例２の教示に従って、プラスミドｐｓ Ｖ
２ ｇｐｔ−Ｃ Ｉａ Ｉ （約１μ９）を消化し、
約４，５ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｃｌａｌ制限フラグメント
をアガロースゲルから単離し、ＤＥＡＥ８ １紙から精
製した。同様に、プラスミドｐＨＫＣＥ−１０を２種類
の同じ制限酵素で消化し、約９ｋｂのＢａｍＨＩＣｌａ
ｌ制限フラグメントを単離し、精製した。ヒトκ定常領
域をコードしている遺伝子に連結した抗体ｃ ＥＭ２
３ １． ６． ７のネズミκ可変領域をコードしてい
る遺伝子を含有するこの約９ｋｂの制限フラグメントを
、ベクターｐｓ Ｖ ２ ｇｐｔ＝ Ｃ ｌａ Ｉの約
４．５ｋｂ Ｃｌａｌ −ＢａｍＨ Ｉフラグメントに
連結した。この連結混合物を大腸菌ＨＢＩＯＩに導入し
、アンピシリン耐性コロニーからの組換えプラスミドを
適切な制限部位について試験した。適切な地図を有する
プラスミドをプラスミドｐＧＣＥＭＫと命名した。ブラ
スミドｐＧＣＥＭＫの制限部位および機能地図を添付の
第４図に示す。
実施例５
ブラスミドＩ）ＨＧＣＥＭ−３０の構築プラスミドｐＭ
ＨＣＥ−３Ｑは抗体Ｃ ＥＭ２ ３１．６．７のネズミ
γ可変領域をコードしている遺伝子を含有しており、こ
れを、ＡＴＣＣに１９８８年３月１日に寄託されて受託
番号ＡＴＣＣ６７６４０のもとで入手可能な菌株である
大腸閑Ｋ１２ＨＢ １０ １／ｐＭＨＣＥ−３０から単
離することができる。ブラスミドｐＨＧＩＺはヒトγ定
常領域をコードしている遺伝子を含有しており、これも
、ＡＴＣＣに１９８８年３月１日に寄託されて受託番号
ＡＴＣＣ６７６３８のもとで入半可能な菌株である大腸
菌Ｋ １２ ＨＢ １０ １／ｐＨＧ ＩＺから単離す
ることかできる。プラスミドｐＭＨＣＥ−３０およびｐ
ＨＧＩＺの制限部位および機能地図をそれぞれ添付の第
５図および第６図に示す。
ＨＣＥ−３Ｑは抗体Ｃ ＥＭ２ ３１．６．７のネズミ
γ可変領域をコードしている遺伝子を含有しており、こ
れを、ＡＴＣＣに１９８８年３月１日に寄託されて受託
番号ＡＴＣＣ６７６４０のもとで入手可能な菌株である
大腸閑Ｋ１２ＨＢ １０ １／ｐＭＨＣＥ−３０から単
離することができる。ブラスミドｐＨＧＩＺはヒトγ定
常領域をコードしている遺伝子を含有しており、これも
、ＡＴＣＣに１９８８年３月１日に寄託されて受託番号
ＡＴＣＣ６７６３８のもとで入半可能な菌株である大腸
菌Ｋ １２ ＨＢ １０ １／ｐＨＧ ＩＺから単離す
ることかできる。プラスミドｐＭＨＣＥ−３０およびｐ
ＨＧＩＺの制限部位および機能地図をそれぞれ添付の第
５図および第６図に示す。
ネズミの可変重鎖遺伝子を次のようにしてヒトγ−１遺
伝子に融合させた。ブラスミドｐＭＨＣＥ−３０（約ｌ
Ｏμ９）を制限酵素Ｃｌａｌ（１単位／μｇ）で消化し
、次いで制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌで部分消化して、主イ
ントロンに重鎖可変遺伝子を含有する約有する３ｋｂの
Ｃ ｌａ Ｉ − Ｈ ｉｎｄｌｌｌ制限フラグメント
を得た。部分消化は、０．１単位／μ９のＤＮＡだけを
用い、３７゜Ｃで１時間の消化を用いて行った。
伝子に融合させた。ブラスミドｐＭＨＣＥ−３０（約ｌ
Ｏμ９）を制限酵素Ｃｌａｌ（１単位／μｇ）で消化し
、次いで制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌで部分消化して、主イ
ントロンに重鎖可変遺伝子を含有する約有する３ｋｂの
Ｃ ｌａ Ｉ − Ｈ ｉｎｄｌｌｌ制限フラグメント
を得た。部分消化は、０．１単位／μ９のＤＮＡだけを
用い、３７゜Ｃで１時間の消化を用いて行った。
また、ヒトγ−１遺伝子を含有するプラスミドｐＨｃ１
ｚ（約１μｇ）も制限酵素ＣｌａｒおよびＨｉｎｄｌｌ
ｌで消化した。実質的に実施例２の教示に従って、ブラ
スミドｐＭＨＣＥ−３０由来の約有する３ｋｂの制限フ
ラグメントをゲルおよびＤＥＡＥ８ １から単離した。
ｚ（約１μｇ）も制限酵素ＣｌａｒおよびＨｉｎｄｌｌ
ｌで消化した。実質的に実施例２の教示に従って、ブラ
スミドｐＭＨＣＥ−３０由来の約有する３ｋｂの制限フ
ラグメントをゲルおよびＤＥＡＥ８ １から単離した。
このフラグメントを、実質的に実施例２の教示に従い、
挿入体（５ ０ ０ ｎ９）および消化ベクターＤＮＡ
（２０Ｏｎ９）を全量ＬＯｕＱの連結混合物中で用いて
、プラスミドｐＨＧＩＺのＣＩ＆ｌ −Ｈｉｎｄ Ｉ
Ｉ １部位に連結した。大腸閑Ｋ１２ＨＢＩＯ１の形質
転換によって得られた組換えブラスミドを制限消化マノ
ピングによって分析し、ヒトγ−１定常領域遺伝子に融
合したネズミ重鎖可変領域遺伝子を含有しているプラス
ミドを同定し、これをプラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０と
命名した。プラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０の制限部位お
よび機能地図を添付の第７図に示す。
挿入体（５ ０ ０ ｎ９）および消化ベクターＤＮＡ
（２０Ｏｎ９）を全量ＬＯｕＱの連結混合物中で用いて
、プラスミドｐＨＧＩＺのＣＩ＆ｌ −Ｈｉｎｄ Ｉ
Ｉ １部位に連結した。大腸閑Ｋ１２ＨＢＩＯ１の形質
転換によって得られた組換えブラスミドを制限消化マノ
ピングによって分析し、ヒトγ−１定常領域遺伝子に融
合したネズミ重鎖可変領域遺伝子を含有しているプラス
ミドを同定し、これをプラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０と
命名した。プラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０の制限部位お
よび機能地図を添付の第７図に示す。
実施例６
ブラスミドｐＮｃＥＭＧｌの構築
キメラＩｇ遺伝子を、実質的に実施例４で説明したよう
にして真核性発現ベクターに挿入した。
にして真核性発現ベクターに挿入した。
使用したベクターは、ＡＴＣＣから受託番号ＡＴＣＣ３
７１４９のもとでだれでも人手することができるｐＳＶ
２ｎｅｏである。実質的に実施例４の教示に従ってこの
ベクターにＣｌａ１部位を付加し、ブラスミドｐＳ Ｖ
２ｎｅｏ−Ｃｌａｌを得た。ブラスミドｐｓＶ２ｎｅ
ｏ−Ｃｌａｌ（約１μｇ）を制限酵素ＣｌａＩおよびＢ
ａｍＨＩ（１単位／μ９ＤＮＡ）で消化した。
７１４９のもとでだれでも人手することができるｐＳＶ
２ｎｅｏである。実質的に実施例４の教示に従ってこの
ベクターにＣｌａ１部位を付加し、ブラスミドｐＳ Ｖ
２ｎｅｏ−Ｃｌａｌを得た。ブラスミドｐｓＶ２ｎｅ
ｏ−Ｃｌａｌ（約１μｇ）を制限酵素ＣｌａＩおよびＢ
ａｍＨＩ（１単位／μ９ＤＮＡ）で消化した。
プラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０（約ｌμｇ）を制限酵素
Ｃｌａｌで完全に消化し、次いで制限酵素Ｂａｍｌ−Ｔ
Ｉ（０．１単位／μ９）で部分消化して、キメラ可変お
よびγ−１領域遺伝子を含有する約１２．７ｋｂのＣｌ
ａｌ −ＢａｍＨ Ｉ制限フラグメントを得た。このフ
ラグメントをＤＥＡＥ８ １紙で単１１１ｍし、ＴＥ緩
衝液（１０μＱ）中に溶出させた。実質的に実施例２の
教示に従い、ベクターＤＮＡ（５０ｎ９）、約１２．７
ｋｂ挿入ＤＮＡ（４００ｎ９）、１０Ｘ連結緩衝液、ｌ
ＱｍＭＡＴＰおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてｌ
２゜Ｃで一晩、連結を行った。大腸菌Ｋ１２ＨＢ１０１
細胞を形質転換し、制限マソピングを用いて組換えブラ
スミトを同定し、これをｐＮｃＥＭＧｌと命名した。ブ
ラスミドｐＮＣＥＭＧ１の制限部位および機能地図を添
付の第８図に示す。
Ｃｌａｌで完全に消化し、次いで制限酵素Ｂａｍｌ−Ｔ
Ｉ（０．１単位／μ９）で部分消化して、キメラ可変お
よびγ−１領域遺伝子を含有する約１２．７ｋｂのＣｌ
ａｌ −ＢａｍＨ Ｉ制限フラグメントを得た。このフ
ラグメントをＤＥＡＥ８ １紙で単１１１ｍし、ＴＥ緩
衝液（１０μＱ）中に溶出させた。実質的に実施例２の
教示に従い、ベクターＤＮＡ（５０ｎ９）、約１２．７
ｋｂ挿入ＤＮＡ（４００ｎ９）、１０Ｘ連結緩衝液、ｌ
ＱｍＭＡＴＰおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてｌ
２゜Ｃで一晩、連結を行った。大腸菌Ｋ１２ＨＢ１０１
細胞を形質転換し、制限マソピングを用いて組換えブラ
スミトを同定し、これをｐＮｃＥＭＧｌと命名した。ブ
ラスミドｐＮＣＥＭＧ１の制限部位および機能地図を添
付の第８図に示す。
実施例７
プラスミドｐＧ９．２．２７Ｋの構築
ブラスミドｐＴＺＫ９１０は、ブラスミドｐＴＺ１８０
中に挿入された完全な９． ２． ２ ７κ可変領域遺
伝子をコードしている遺伝子を含有している。
中に挿入された完全な９． ２． ２ ７κ可変領域遺
伝子をコードしている遺伝子を含有している。
プラスミドｐＴＺＫ９１０は、１９８９年４月７日にＮ
ＲＲＬに寄託されて受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８４７
８のもとでだれでも入手することができる閑株である大
腸閑Ｋｌ２ ＪＭ１０９／ｐＴＺＫ９１０から単離す
ることができる。ブラスミドｐＴＺＫ９１０の制限部位
および機能地図を添付の第９図に示す。実質的に実施例
１の教示に従ってこの菌株からプラスミドｐＴＺＫ９１
０を単離し、次いで９． ２． ２ ７κ可変領域をコ
ードしている遺伝子を単離し、リンカーを付加し、そし
てこの遺伝子を発現ベクターｐＧＣＥＭＫに挿入した。
ＲＲＬに寄託されて受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８４７
８のもとでだれでも入手することができる閑株である大
腸閑Ｋｌ２ ＪＭ１０９／ｐＴＺＫ９１０から単離す
ることができる。ブラスミドｐＴＺＫ９１０の制限部位
および機能地図を添付の第９図に示す。実質的に実施例
１の教示に従ってこの菌株からプラスミドｐＴＺＫ９１
０を単離し、次いで９． ２． ２ ７κ可変領域をコ
ードしている遺伝子を単離し、リンカーを付加し、そし
てこの遺伝子を発現ベクターｐＧＣＥＭＫに挿入した。
制限酵素ＤｄｅｌおよびｌＱＸＤｄｅｌ緩衝液［ｌ５Ｍ
ＮａＣＱ； ６０ｍＭ トリスーＨＣ（（ｐＨ７．５
）；および６ ０ ｍＭ ＭｇＣ （！ｔｌを用いたこ
と以外は実質的に実施例２の教示に従って、ブラスミド
ｐＴＺＫ９１０（約２μのを消化した。次に、Ｄｄｅｌ
消化したブラスミドを精製し、制限酵素ＢａｍＨＩおよ
びｌＱＸＢａｍＨＩ緩衝液［１．５Ｍ ＮａＣｆｆ；
６０Ｉ＠ＭトリスーＨＣＣ（ｐＨ７．９）；および（３
ＱｍＭＭｇＣ Ｉ２．］を用いて消化した。次いで、こ
のプラスミドをゲル電気泳動にかけ、ＤＥＡＥ８ １紙
を用いて単離を行い、９． ２． ２ ７κ可変領域を
コードしている遺伝子の大部分を含有する約３５７ｂｐ
のＤｄｅｌ −ＢａｍＨ Ｉ制限フラグメントを精製し
た。
ＮａＣＱ； ６０ｍＭ トリスーＨＣ（（ｐＨ７．５
）；および６ ０ ｍＭ ＭｇＣ （！ｔｌを用いたこ
と以外は実質的に実施例２の教示に従って、ブラスミド
ｐＴＺＫ９１０（約２μのを消化した。次に、Ｄｄｅｌ
消化したブラスミドを精製し、制限酵素ＢａｍＨＩおよ
びｌＱＸＢａｍＨＩ緩衝液［１．５Ｍ ＮａＣｆｆ；
６０Ｉ＠ＭトリスーＨＣＣ（ｐＨ７．９）；および（３
ＱｍＭＭｇＣ Ｉ２．］を用いて消化した。次いで、こ
のプラスミドをゲル電気泳動にかけ、ＤＥＡＥ８ １紙
を用いて単離を行い、９． ２． ２ ７κ可変領域を
コードしている遺伝子の大部分を含有する約３５７ｂｐ
のＤｄｅｌ −ＢａｍＨ Ｉ制限フラグメントを精製し
た。
次いで、一群のリンカーを調製して、発現ベクターへの
プラスミドｐＴＺＫ９１０のＤｄｅｌ −ＢａｍＨＩフ
ラグメントの連結を容易にした。当分野で周知の、そし
て実施例４に記載した方注によってオリゴヌクレオチド
リンカーを調製した。始めに、一方の末端にＢｇｌｌ＋
認識部位を有し、池方の末端にＤｄｅ１部位を有するリ
ンカーを、次の配列で作成した ２つの鎖を別々に含威し、次いでそれぞれ約１００ｐモ
ルをＴＥ緩衝液（５μｉ２）中で一緒に混合し、７０’
Ｃまで加熱し、次に一晩ｌ２゜Ｃまで冷却してこれらの
鎖を自己アニーリングさせた。
プラスミドｐＴＺＫ９１０のＤｄｅｌ −ＢａｍＨＩフ
ラグメントの連結を容易にした。当分野で周知の、そし
て実施例４に記載した方注によってオリゴヌクレオチド
リンカーを調製した。始めに、一方の末端にＢｇｌｌ＋
認識部位を有し、池方の末端にＤｄｅ１部位を有するリ
ンカーを、次の配列で作成した ２つの鎖を別々に含威し、次いでそれぞれ約１００ｐモ
ルをＴＥ緩衝液（５μｉ２）中で一緒に混合し、７０’
Ｃまで加熱し、次に一晩ｌ２゜Ｃまで冷却してこれらの
鎖を自己アニーリングさせた。
同様の方法で、５゜末端にＢａｍＨＩ部泣を有し、３゜
末端にＳｓｔｌ１部位を有するリンカーを合成した。こ
のリンカーは、真核性スプライス部位に加えて９． ２
． ２ ７κ可変領域のＮＨ．末端に１５アミノ酸の暗
号配列を含有している。このリンカーは次の配列を有し
ている： ２つの鎖のそれぞれ約１００ｐモルを一緒にアニーリン
グさせ、次いでこのＢ ａＩＩＩＨ Ｉ − Ｓ ｓｔ
ｌｌリンカー、アニーリングさせたＢｇｌｌｌ−Ｄｄｅ
ｌリンカーおよびブラスミドｐＴＺＫ９１０のＤｄｅｌ
−ＢａｍＨＩフラグメント（約０．５μｇ）を、実質
的に実施例４の教示に従って連結した。連結の後に、こ
の混合物を制限酵素Ｂｇｌｌ１およびＳ ｓｔｌｌで処
理し、次いで実質的に実施例２の教示に従って、９．２
．２７κ可変領域の完全な暗号配列を含有している約４
２０塩基対のＢ ｇｌｌｌ − Ｓ ｓｔｌｌ制限フラ
グメントをゲルから精製した。
末端にＳｓｔｌ１部位を有するリンカーを合成した。こ
のリンカーは、真核性スプライス部位に加えて９． ２
． ２ ７κ可変領域のＮＨ．末端に１５アミノ酸の暗
号配列を含有している。このリンカーは次の配列を有し
ている： ２つの鎖のそれぞれ約１００ｐモルを一緒にアニーリン
グさせ、次いでこのＢ ａＩＩＩＨ Ｉ − Ｓ ｓｔ
ｌｌリンカー、アニーリングさせたＢｇｌｌｌ−Ｄｄｅ
ｌリンカーおよびブラスミドｐＴＺＫ９１０のＤｄｅｌ
−ＢａｍＨＩフラグメント（約０．５μｇ）を、実質
的に実施例４の教示に従って連結した。連結の後に、こ
の混合物を制限酵素Ｂｇｌｌ１およびＳ ｓｔｌｌで処
理し、次いで実質的に実施例２の教示に従って、９．２
．２７κ可変領域の完全な暗号配列を含有している約４
２０塩基対のＢ ｇｌｌｌ − Ｓ ｓｔｌｌ制限フラ
グメントをゲルから精製した。
プラスミドｐＧＣＥＭＫ（約ｌμｇ）を制限酵素ＢｇＩ
Ｉ１およびＳｓｔｌｌで消化し、大きいベクターフラグ
メントをゲル精製した。このベクターはｇｐｔ耐性遺伝
子およびヒトκ定常領域遺伝子を含有しているが、ＣＥ
Ｍκ可変領域遺伝子は含有していない。９．２．２７κ
可変領域遺伝子を含有している約４２０ｂｐのＢｇｌｌ
ｌ−Ｓｓｔｌｌ制限フラグメントを、Ｂｇｌｌｌ／Ｓｓ
ｔｌｌ消化したブラスミドｐＧＣＥＭＫに連結した。形
質転換と再単離の後に、適切な制限部位を示すブラスミ
ドをブラスミドｐＧ９．２．２７Ｋと命名した。ブラス
ミドｐＧ９．２．２７Ｋの制限部位および機能地図を添
付の第１０図に示す。
Ｉ１およびＳｓｔｌｌで消化し、大きいベクターフラグ
メントをゲル精製した。このベクターはｇｐｔ耐性遺伝
子およびヒトκ定常領域遺伝子を含有しているが、ＣＥ
Ｍκ可変領域遺伝子は含有していない。９．２．２７κ
可変領域遺伝子を含有している約４２０ｂｐのＢｇｌｌ
ｌ−Ｓｓｔｌｌ制限フラグメントを、Ｂｇｌｌｌ／Ｓｓ
ｔｌｌ消化したブラスミドｐＧＣＥＭＫに連結した。形
質転換と再単離の後に、適切な制限部位を示すブラスミ
ドをブラスミドｐＧ９．２．２７Ｋと命名した。ブラス
ミドｐＧ９．２．２７Ｋの制限部位および機能地図を添
付の第１０図に示す。
実施例８
築
９． ２． ２ ７キメラガンマｌ遺伝子を真核生物に
発現させるベクターを作成するために、先ず、ブラスミ
ドｐＮｃＥＭＧｌから、１個のＮｏｔ１部位、２個のＢ
ａａ８１部位および２個のＳ ａ（２ Ｉ部位を欠失さ
せる。ブラスミドｐＮｃＥＭＧｌ約１μｇを、制限酵素
ＮｏｔｌおよびｌＯＸＮｏｔｌ緩衝液（１．５Ｍ Ｎａ
ＣＱ ： １ ００ｍＭ ｝リスーＨＣｌ７ ，ｐ
Ｈ７．９；および１ ０ ０ ｍＭ ＭｇＣ １２ｔ
）を使用して消化する。エタノール沈殿後、５０μｅの
反応全量中、各々５ｍＭの４種類のデオキシリボヌクレ
オチドｄｔｔＰ，ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰおよびｄｃＴＰｌ
ｏμｇ１゛クレノウ酵素２単位およびＩＯＸ緩衝液（０
．５ＭトリスーＨＣＱ．ｐＨ７．５ ； Ｏ．ＩＭ Ｍ
ｇＣムおよび１ ０＋Ｍ ＤＴＴ）５μＱを加えること
によって、Ｎｏｔｌ末端を平滑にする。３７℃、３０分
後、フェノール／クロロホルム抽出によって反応を停止
させ、ＤＮＡを自己ライゲートさせて、Ｅ．コリＨＢｌ
ｏｔ細胞に導入する。構造遺伝子の５゜でＮＯｔ１部位
の欠失を示すこれらのプラスミドをプラスミドｐＮｃＥ
ＭＧｌΔＮと命名する。
発現させるベクターを作成するために、先ず、ブラスミ
ドｐＮｃＥＭＧｌから、１個のＮｏｔ１部位、２個のＢ
ａａ８１部位および２個のＳ ａ（２ Ｉ部位を欠失さ
せる。ブラスミドｐＮｃＥＭＧｌ約１μｇを、制限酵素
ＮｏｔｌおよびｌＯＸＮｏｔｌ緩衝液（１．５Ｍ Ｎａ
ＣＱ ： １ ００ｍＭ ｝リスーＨＣｌ７ ，ｐ
Ｈ７．９；および１ ０ ０ ｍＭ ＭｇＣ １２ｔ
）を使用して消化する。エタノール沈殿後、５０μｅの
反応全量中、各々５ｍＭの４種類のデオキシリボヌクレ
オチドｄｔｔＰ，ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰおよびｄｃＴＰｌ
ｏμｇ１゛クレノウ酵素２単位およびＩＯＸ緩衝液（０
．５ＭトリスーＨＣＱ．ｐＨ７．５ ； Ｏ．ＩＭ Ｍ
ｇＣムおよび１ ０＋Ｍ ＤＴＴ）５μＱを加えること
によって、Ｎｏｔｌ末端を平滑にする。３７℃、３０分
後、フェノール／クロロホルム抽出によって反応を停止
させ、ＤＮＡを自己ライゲートさせて、Ｅ．コリＨＢｌ
ｏｔ細胞に導入する。構造遺伝子の５゜でＮＯｔ１部位
の欠失を示すこれらのプラスミドをプラスミドｐＮｃＥ
ＭＧｌΔＮと命名する。
同様にして、ブラスミドｐＮｃＥＭＧｌΔＮを制限酵素
ＢａｍＨＩで部分消化し、次いで、クレノウで処理して
、プラスミドに認められる３個のＢａｒａＨＩ部位の２
個を欠失させる。形質転換およびランダムなプラスミド
の単離後、ＣＥＭ構造遺伝子に対する５゜のＢａｍ８１
部位の欠失およびヒトガ冫７１遺伝子とネオマイシン耐
性付与遺伝子の間ノＢａｍＨ｛部位の欠失を示すブラス
ミドを、ブラスミドｐＮｃＥＭＧ１ΔＮΔＢ２と命名す
る。プラスミドｐＮｃＥＭＧ１△ＮΔＢ２はまだ、ＣＥ
Ｍ可変領域遺伝子のすぐ３゜に認められるＢａｍＨ１部
位を保持していることに注意すべきである。
ＢａｍＨＩで部分消化し、次いで、クレノウで処理して
、プラスミドに認められる３個のＢａｒａＨＩ部位の２
個を欠失させる。形質転換およびランダムなプラスミド
の単離後、ＣＥＭ構造遺伝子に対する５゜のＢａｍ８１
部位の欠失およびヒトガ冫７１遺伝子とネオマイシン耐
性付与遺伝子の間ノＢａｍＨ｛部位の欠失を示すブラス
ミドを、ブラスミドｐＮｃＥＭＧ１ΔＮΔＢ２と命名す
る。プラスミドｐＮｃＥＭＧ１△ＮΔＢ２はまだ、ＣＥ
Ｍ可変領域遺伝子のすぐ３゜に認められるＢａｍＨ１部
位を保持していることに注意すべきである。
最後に、ブラスミドｐＮｃＥＭＧ１ΔＮΔＢ２のヒトガ
ンマｌ遺伝子のすぐ５′に認められる２個のＳ ａＱ
１部位を欠失させる。プラスミドｐＮＣＥＭＧ１ΔＮΔ
Ｂ２約１マイクログラムを制限酵素ＳａＱｌで消化し、
次に、クレノウで処理してＳａ（２１部位を欠失させる
。形質転換およびプラスミドの単離後、ヒトガンマｌ遺
伝子に対する５′の２個のＳａｌ２１部位の欠失を示す
プラスミドを、プラスミドｐＮｃＥＭＧｌΔＮΔＢ２Δ
Ｓ２と命名する。
ンマｌ遺伝子のすぐ５′に認められる２個のＳ ａＱ
１部位を欠失させる。プラスミドｐＮＣＥＭＧ１ΔＮΔ
Ｂ２約１マイクログラムを制限酵素ＳａＱｌで消化し、
次に、クレノウで処理してＳａ（２１部位を欠失させる
。形質転換およびプラスミドの単離後、ヒトガンマｌ遺
伝子に対する５′の２個のＳａｌ２１部位の欠失を示す
プラスミドを、プラスミドｐＮｃＥＭＧｌΔＮΔＢ２Δ
Ｓ２と命名する。
旦．ブラスミドｐＮ９．２．２７Ｇｌの構築プラスミド
ｐＧ４Ｇ２１は、ブラスミドｐＧＥＭ４に挿入された９
． ２． ２ ７ガンマ可変領域全体をコードしている
遺伝子を含有している。ブラスミドｐ０４Ｇ２１は、１
９８９年４月７日にＮＲＲＬに寄託され、ＮＲＲＬ
Ｂ−１８４７９として誰でも入手し得る株、Ｅ．コリＫ
１２ＤＨ５／ｐＧ４Ｇ２ １から単離することができる
。ブラスミドｐ０４Ｇ２１の制限部位および機能地図を
添付の第１１図に示す。プラスミドｐ０４Ｇ２１を、実
質上実施例１の教示に従って株から単離し、次いで、９
．２．２７ガンマ可変領域をコードしている遺伝子を単
離し、リンカーを付加し、この遺伝子を発現ベクターｐ
ＮｃＥＭＧ１ΔＮΔＢ２ΔＳ２に挿入する。
ｐＧ４Ｇ２１は、ブラスミドｐＧＥＭ４に挿入された９
． ２． ２ ７ガンマ可変領域全体をコードしている
遺伝子を含有している。ブラスミドｐ０４Ｇ２１は、１
９８９年４月７日にＮＲＲＬに寄託され、ＮＲＲＬ
Ｂ−１８４７９として誰でも入手し得る株、Ｅ．コリＫ
１２ＤＨ５／ｐＧ４Ｇ２ １から単離することができる
。ブラスミドｐ０４Ｇ２１の制限部位および機能地図を
添付の第１１図に示す。プラスミドｐ０４Ｇ２１を、実
質上実施例１の教示に従って株から単離し、次いで、９
．２．２７ガンマ可変領域をコードしている遺伝子を単
離し、リンカーを付加し、この遺伝子を発現ベクターｐ
ＮｃＥＭＧ１ΔＮΔＢ２ΔＳ２に挿入する。
ブラスミドｐ０４Ｇ２１約２μｇを、制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびｌＱＸＥｃｏＲＩ緩衝液を使用する以外、実
質上実施例２の教示に従って消化する。次いで、このＥ
ｃｏＲＩ一消化ブラスミドを精製し、制限酵素Ｍａｅｎ
Ｉおよび１０ＸＭａｅＩ［［緩衝液を使用して消化する
。次に、このブラスミドをゲル電気泳動し、ＤＥＡＥ８
１紙を使用して単離し、９．２．２７ガンマ可変領域
をコードしている遺伝子の大部分を含有しているこの約
４ ２ １ ｂｐ ＥｃｏＲ１−ＭａｅＩＩ［制限フラ
グメントを精製する。
ＩおよびｌＱＸＥｃｏＲＩ緩衝液を使用する以外、実
質上実施例２の教示に従って消化する。次いで、このＥ
ｃｏＲＩ一消化ブラスミドを精製し、制限酵素Ｍａｅｎ
Ｉおよび１０ＸＭａｅＩ［［緩衝液を使用して消化する
。次に、このブラスミドをゲル電気泳動し、ＤＥＡＥ８
１紙を使用して単離し、９．２．２７ガンマ可変領域
をコードしている遺伝子の大部分を含有しているこの約
４ ２ １ ｂｐ ＥｃｏＲ１−ＭａｅＩＩ［制限フラ
グメントを精製する。
次いで、■組のリンカーを製造し、プラスミドｐ０４Ｇ
２１のＥ ｃｏＲ Ｉ ／ ＭａｅｌＩ［フラグメント
の発現ベクターへのライゲートを促進する。実質上実施
例７の教示に従い、一端にＢｃ（！Ｉ部位を有し、他端
にＥｃｏＲ１部位を有するリンカーを合或し、ＥｃｏＲ
ｒ／Ｍａｅｌｌ！制限フラグメントにアニーリングお
よびライゲートさせる。このリンカーは、なる配列を有
している。同様にして、５゛末端にＭａｅｌＩ１部位を
有し、３′末端にＢａｍＨ１部位を有するリンカーを合
戊する。このリンカーは９，２．２７ガンマ可変領域の
ＮＨ，末端の５個のアミノ酸プラス真核生物性スブライ
シング部位をコードしている配列を含有している。リン
カーは、なる配列を有している。このリンカーをアニー
リングし、次いで、このＭａｅｌｎ − Ｂ ａｍＨ
［リンカーアニーリングされたＢｃｌ２１ ＥｃｏＲ
Ｉリンカーおよびプラスミドｐ０４Ｇ２１のＥｃｏＲ
Ｉ −Ｍａｅ■制限フラグメント約０．５μｇを実質上
実施例４の教示に従ってライゲートする。ライゲーショ
ン後、混合物を制限酵素Ｂｃｌ２１およびＢａｍＨＩで
処理し、次に、この約４６２塩基対Ｂｅ（２ Ｔ −
ＢａｍＨＩ制限フラグメントを実質上実施例２の教示に
従ってゲルから精製する。この制限フラグメントは、９
．２．２７ガンマ可変領域の全コード配列を含有してい
る。
２１のＥ ｃｏＲ Ｉ ／ ＭａｅｌＩ［フラグメント
の発現ベクターへのライゲートを促進する。実質上実施
例７の教示に従い、一端にＢｃ（！Ｉ部位を有し、他端
にＥｃｏＲ１部位を有するリンカーを合或し、ＥｃｏＲ
ｒ／Ｍａｅｌｌ！制限フラグメントにアニーリングお
よびライゲートさせる。このリンカーは、なる配列を有
している。同様にして、５゛末端にＭａｅｌＩ１部位を
有し、３′末端にＢａｍＨ１部位を有するリンカーを合
戊する。このリンカーは９，２．２７ガンマ可変領域の
ＮＨ，末端の５個のアミノ酸プラス真核生物性スブライ
シング部位をコードしている配列を含有している。リン
カーは、なる配列を有している。このリンカーをアニー
リングし、次いで、このＭａｅｌｎ − Ｂ ａｍＨ
［リンカーアニーリングされたＢｃｌ２１ ＥｃｏＲ
Ｉリンカーおよびプラスミドｐ０４Ｇ２１のＥｃｏＲ
Ｉ −Ｍａｅ■制限フラグメント約０．５μｇを実質上
実施例４の教示に従ってライゲートする。ライゲーショ
ン後、混合物を制限酵素Ｂｃｌ２１およびＢａｍＨＩで
処理し、次に、この約４６２塩基対Ｂｅ（２ Ｔ −
ＢａｍＨＩ制限フラグメントを実質上実施例２の教示に
従ってゲルから精製する。この制限フラグメントは、９
．２．２７ガンマ可変領域の全コード配列を含有してい
る。
ブラスミドｐＮｃＥＭＧｌΔＮΔＢ２ΔＳ２約１μｇを
制限酵素Ｂｃｆ２ＩおよびＢａｍＨＩで消化し、大きい
ベクターフラグメントをゲルにより精製する。
制限酵素Ｂｃｆ２ＩおよびＢａｍＨＩで消化し、大きい
ベクターフラグメントをゲルにより精製する。
このベクターは、不オマイシン耐性付与遺伝子およびヒ
トガンマ１定常領域を含有しているが、ＣＥＭガンマ可
変領域遺伝子を含有していない。９．２．２７ガンマ可
変領域遺伝子を含有している約４６２塩基対ＢｃＣ Ｉ
− ＢａｍＨ Ｉ制限フラグメントを、Ｂｃｌ２１／
ＢａｍＨｒ一消化したブラスミドｐＮＣＥＭＣＩΔＮΔ
Ｂ２△Ｓ２にライゲートする。形質転換および再単離後
、適当な制限部位を示すこれらのブラスミドをブラスミ
ドｐＮ９．２．２．２７Ｇｌと命名する。ブラスミドｐ
Ｎ９．２．２．２７Ｇｌの制限部位および機能地図を添
付の図面の第１２図に示す。
トガンマ１定常領域を含有しているが、ＣＥＭガンマ可
変領域遺伝子を含有していない。９．２．２７ガンマ可
変領域遺伝子を含有している約４６２塩基対ＢｃＣ Ｉ
− ＢａｍＨ Ｉ制限フラグメントを、Ｂｃｌ２１／
ＢａｍＨｒ一消化したブラスミドｐＮＣＥＭＣＩΔＮΔ
Ｂ２△Ｓ２にライゲートする。形質転換および再単離後
、適当な制限部位を示すこれらのブラスミドをブラスミ
ドｐＮ９．２．２．２７Ｇｌと命名する。ブラスミドｐ
Ｎ９．２．２．２７Ｇｌの制限部位および機能地図を添
付の図面の第１２図に示す。
実施例９
真核生物細胞におけるキメラ９． ２． ２ ７抗体の
発現 Ａ．キメラ構築物ｐＧ９．２．２７Ｋを使用するキメラ
軽鎖遺伝子のトランスフェクショントランスフエクショ
ンのために使用した軽鎖免疫グロブリンプラスミドは、
上の実施例７の記載と同様にｐＧ９．２．２７である。
発現 Ａ．キメラ構築物ｐＧ９．２．２７Ｋを使用するキメラ
軽鎖遺伝子のトランスフェクショントランスフエクショ
ンのために使用した軽鎖免疫グロブリンプラスミドは、
上の実施例７の記載と同様にｐＧ９．２．２７である。
ヒトカッパ遺伝子に融合されたキメラ可変軽鎖（Ｖκ）
９．２．２７遺伝子を含有しているｐＧ９．２．２７プ
ラスミドをまず、Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ ｅｔ ａ１、，
（１９８６） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：７０３およびＣｈｕ ｅ
ｔ ａ１、，（１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：ｌ３１１による記載と実
質上同じ電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔ ｉｏ
ｎ）によってＳ Ｐ ２／Ｏハイブリドーマ細胞にトラ
ンスフェクトする。宿主であるＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４ハ
イブリドーマ細胞は、キメラ遺伝子の受容体である。Ｓ
Ｐ２／Ｏ−Ａｇ １ ４ハイブリドーマ細胞は、ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ １５８１の受託番号でＡＴＣＣから誰で
も入手可能である。ＳＰ２／Ｏ−Ａｇｌ４細胞を、５％
ＦＣＳを含有している培地中で増殖させ、電気穿孔前の
３日間、対数期の増殖相に維持する。制限酵素ＰｖｕＩ
（ｌｕ／μｇ）およびＰｖｕＩ反応緩衝液（Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ， Ｇａｉ
ｔｈｅｒｇｂｕｒｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ））を使用し
、プラスミドベクターｐＧ９．２．２７（２０μｇ）を
直線化する。トランスフェクション時、ＩＥＣ臨床用遠
心機にて８ ０ ０ ｒｐａ＋、室温でｌＯ゜遠心する
ことによって、ＳＰ２／Ｏ細胞を集める。次に、細胞を
、６＋＋＋Ｍデキストロースを加えたハンクス緩衝化食
塩溶液（■ａｎｋｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧｉｂｃｏＬａｆｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ）中で３回洗浄し、３．ＯＸＩＯ’細胞／，１１２
の終濃度で再懸濁する。細胞０．３ｓｌずつをｌ Ｘ
Ｉ Ｏ７／． ３ｉ１２の密度でキュベット（セル）に
入れ、直線化したＤＮＡを加える。混合物を氷上で１０
分間維持する。
９．２．２７遺伝子を含有しているｐＧ９．２．２７プ
ラスミドをまず、Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ ｅｔ ａ１、，
（１９８６） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：７０３およびＣｈｕ ｅ
ｔ ａ１、，（１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：ｌ３１１による記載と実
質上同じ電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔ ｉｏ
ｎ）によってＳ Ｐ ２／Ｏハイブリドーマ細胞にトラ
ンスフェクトする。宿主であるＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４ハ
イブリドーマ細胞は、キメラ遺伝子の受容体である。Ｓ
Ｐ２／Ｏ−Ａｇ １ ４ハイブリドーマ細胞は、ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ １５８１の受託番号でＡＴＣＣから誰で
も入手可能である。ＳＰ２／Ｏ−Ａｇｌ４細胞を、５％
ＦＣＳを含有している培地中で増殖させ、電気穿孔前の
３日間、対数期の増殖相に維持する。制限酵素ＰｖｕＩ
（ｌｕ／μｇ）およびＰｖｕＩ反応緩衝液（Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ， Ｇａｉ
ｔｈｅｒｇｂｕｒｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ））を使用し
、プラスミドベクターｐＧ９．２．２７（２０μｇ）を
直線化する。トランスフェクション時、ＩＥＣ臨床用遠
心機にて８ ０ ０ ｒｐａ＋、室温でｌＯ゜遠心する
ことによって、ＳＰ２／Ｏ細胞を集める。次に、細胞を
、６＋＋＋Ｍデキストロースを加えたハンクス緩衝化食
塩溶液（■ａｎｋｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧｉｂｃｏＬａｆｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ）中で３回洗浄し、３．ＯＸＩＯ’細胞／，１１２
の終濃度で再懸濁する。細胞０．３ｓｌずつをｌ Ｘ
Ｉ Ｏ７／． ３ｉ１２の密度でキュベット（セル）に
入れ、直線化したＤＮＡを加える。混合物を氷上で１０
分間維持する。
．８ｎ＋ｍ間隙の電極（Ｐ／Ｎ ４７２）およびＢＴＸ
ＩＯＯトランスフェクター（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒ
（ＢＴＸ， Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．）
）を使用して、電気穿孔を行う。
ＩＯＯトランスフェクター（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒ
（ＢＴＸ， Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．）
）を使用して、電気穿孔を行う。
条件は、それぞれ３００ボルトでｌＯＯμ秒、３パルス
である。次に、電気穿孔した細胞を、２×１ ０ ’／
ｘＱの密度で培地（Ｔ７５フラスコ中）に、７２時間再
懸濁する。（３７°Ｃ、５％ＣＯ，）。次いで、細胞を
、２４ウェルのプレート中、５ＸｌＯ’／＊（ｌの密度
で適当な抗生物質に蒔き：ｐＧ９．２．２７を含有して
いるＳ Ｐ ２／Ｏ細胞をＨＭＡＸ１、Ｏ培地（５ ０
ｎｇ／ ｘＱヒポキサンチン、２５０ｎｇ／ｘＱミコ
フェノール酸および５０μｇ／ｘ（ｌキサンチン； Ｓ
ｉｇｍａ． ＳＬ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ
から入手可能）に１μ９／ ｚ（ｌで蒔く。ＨＭＡＸ耐
性コロニーを含有している各ウェルから上清２００μＱ
を集める。次ぎに、この上清を、ｐＧ９．２．２７のキ
メラ免疫グロプリン遺伝子の発現を示すヒトカッパ定常
領域遺伝子の存在について検定する。
である。次に、電気穿孔した細胞を、２×１ ０ ’／
ｘＱの密度で培地（Ｔ７５フラスコ中）に、７２時間再
懸濁する。（３７°Ｃ、５％ＣＯ，）。次いで、細胞を
、２４ウェルのプレート中、５ＸｌＯ’／＊（ｌの密度
で適当な抗生物質に蒔き：ｐＧ９．２．２７を含有して
いるＳ Ｐ ２／Ｏ細胞をＨＭＡＸ１、Ｏ培地（５ ０
ｎｇ／ ｘＱヒポキサンチン、２５０ｎｇ／ｘＱミコ
フェノール酸および５０μｇ／ｘ（ｌキサンチン； Ｓ
ｉｇｍａ． ＳＬ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ
から入手可能）に１μ９／ ｚ（ｌで蒔く。ＨＭＡＸ耐
性コロニーを含有している各ウェルから上清２００μＱ
を集める。次ぎに、この上清を、ｐＧ９．２．２７のキ
メラ免疫グロプリン遺伝子の発現を示すヒトカッパ定常
領域遺伝子の存在について検定する。
Ｂ．キメラ９．２．２７を分泌しているＳＰ２／０細胞
の同定 キメラＣＥＭ−ヒトカッパ遺伝子を発現している形質転
換されたＳＰ２／Ｏ細胞を、ヒトカッパについて、エン
グバルおよびパールマン（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ． ａｎ
ｄ Ｐｅｒｌｍａｎｎ＋Ｐ．）のＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ， ８：８７１−８７４ （１９７１）の記
載に従い、通常の酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）
によって同定する。
の同定 キメラＣＥＭ−ヒトカッパ遺伝子を発現している形質転
換されたＳＰ２／Ｏ細胞を、ヒトカッパについて、エン
グバルおよびパールマン（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ． ａｎ
ｄ Ｐｅｒｌｍａｎｎ＋Ｐ．）のＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ， ８：８７１−８７４ （１９７１）の記
載に従い、通常の酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）
によって同定する。
この検定の目的は、ネズミノ１イブリドーマ９．２．２
７から単離され、ヒトカッパ１遺伝子に融合されたネズ
ミ可変領域から構築されているｐｃ９．２．２７プラス
ミドベクターによってコードされているキメラカッパ鎖
ポリペプチドを分泌している細胞を同定することである
。ヤギ抗−ヒトカッパ鎖（Ｔａｇｏ ＃４１０６）の１
０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７−８中５μｇ／皮Ｑ溶
液を調製する。９６ウエルプレートの各ウェルをこの溶
液５０μＱで被覆する。次ぎに、プレートを３７°Ｃで
一夜インキユベートする。次いで、プレートをＨ，Ｏお
よびＰＢＳ＋０．１％ツィーン（ｗ／ｖ）中で十分洗浄
する。
７から単離され、ヒトカッパ１遺伝子に融合されたネズ
ミ可変領域から構築されているｐｃ９．２．２７プラス
ミドベクターによってコードされているキメラカッパ鎖
ポリペプチドを分泌している細胞を同定することである
。ヤギ抗−ヒトカッパ鎖（Ｔａｇｏ ＃４１０６）の１
０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７−８中５μｇ／皮Ｑ溶
液を調製する。９６ウエルプレートの各ウェルをこの溶
液５０μＱで被覆する。次ぎに、プレートを３７°Ｃで
一夜インキユベートする。次いで、プレートをＨ，Ｏお
よびＰＢＳ＋０．１％ツィーン（ｗ／ｖ）中で十分洗浄
する。
上清画分５０μＱを各ウエルに加え、室温で２時間イン
キユベートする。プレートを再び上記の様にして洗浄す
る。ヤギ抗ヒトカッパ鎖アルカリホスファターゼコンジ
一ゲート（Ｔａｇｏ ＃２４９６）を上清物質と同一媒
質中でｌ ： １０００に希釈する。ｌウェル当たり１
００μＱを加え、室温で１時間インキユベートする。プ
レートを上記と同様にして洗浄スる。アルカリホスファ
ターゼの基質をパッケージの指示にしたがって、蒸留し
たＨ，０３３１１２当たりｌ錠で調製し、この基質１５
０μＱを各ウェルに加え、３７℃で３０分間インキコベ
ートする。
キユベートする。プレートを再び上記の様にして洗浄す
る。ヤギ抗ヒトカッパ鎖アルカリホスファターゼコンジ
一ゲート（Ｔａｇｏ ＃２４９６）を上清物質と同一媒
質中でｌ ： １０００に希釈する。ｌウェル当たり１
００μＱを加え、室温で１時間インキユベートする。プ
レートを上記と同様にして洗浄スる。アルカリホスファ
ターゼの基質をパッケージの指示にしたがって、蒸留し
たＨ，０３３１１２当たりｌ錠で調製し、この基質１５
０μＱを各ウェルに加え、３７℃で３０分間インキコベ
ートする。
３００ＩＩＭ ＥＤＴＡ５ＱμＱで反応を停止させ、４
０５ｎＭで吸収を読み取る。最も高いレベルのカッパの
発現を示す上清を同定し、対応するウェルからの細胞を
プールし、キメラ構築物ｐＮ９．２．２．２７Ｇｌの導
入のために伸長させる。
０５ｎＭで吸収を読み取る。最も高いレベルのカッパの
発現を示す上清を同定し、対応するウェルからの細胞を
プールし、キメラ構築物ｐＮ９．２．２．２７Ｇｌの導
入のために伸長させる。
Ｃ．重鎖キメラ構築物ｐＮ９．２．２７を使用するキメ
ラカッパ産生細胞の形質転換 Ｓ Ｐ ２／Ｏ細胞にトランスフェクトするために使用
した重鎖免疫グロブリンブラスミドは、実施例８に記載
の構築物由来のｐＮ９．２、２７であった。次ぎに、プ
ールされたキメラ９，２．２７−ヒトカッパ遺伝子を発
現している細胞群を、キメラ９． ２． ２ ７重鎖遺
伝子を含有しているブラスミド構築物で電気穿孔する。
ラカッパ産生細胞の形質転換 Ｓ Ｐ ２／Ｏ細胞にトランスフェクトするために使用
した重鎖免疫グロブリンブラスミドは、実施例８に記載
の構築物由来のｐＮ９．２、２７であった。次ぎに、プ
ールされたキメラ９，２．２７−ヒトカッパ遺伝子を発
現している細胞群を、キメラ９． ２． ２ ７重鎖遺
伝子を含有しているブラスミド構築物で電気穿孔する。
カッパ遺伝子の電気穿孔の場合と同様に、Ｓ Ｐ ２／
Ｏキメラカッパ産生細胞（Ｓ Ｐ ２／Ｏ−κ）を、電
気穿孔前に３日間、対数期増殖相に維持する。ブラスミ
ドＤＮＡｐＮ９．２．２７Ｇｌ（２０マイクログラム）
を、Ｐｖｕｌ反応緩衝液中、酵素ＰｖｕＴで直線化する
。細胞を集め、洗浄し、実施例９Ａで詳細に説明する様
に３×１０７細胞／ｔｔｔ（ｌの密度で再懸濁する。Ｄ
ＮＡを加え、電気穿孔前に１０分間、混合物を氷上で維
持する。使用した条件は、２５０ボルトで５ｍ秒間、■
パルスである。細胞をＩ｛Ｈ２（またはＤＭＥＭまたは
ＲＰＭＩの様なその他の培地）の様な噛乳動物組織培養
培地プラス５％ＦＣＳブラスＨＭＡＸ１．Ｏ中、２．５
Ｘ１０’／ｘｌ２で３７゜Ｃ、５％ＣＯ８にて７２時間
プレートする。次ぎに、これらの細胞を２４ウエルプレ
ート中、５００μｇ／村の活性濃度でＨＭＡＸ１．Ｏお
よびＧ４１８抗生物質（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ， Ｇｉｂ
ｃｏ−ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ＊Ｍａｒｙ
ｌａｎｄ）を含有している培地に５ｘｌＯ’／ｘＱでプ
レートする。選別をｌ４日間維持し、その時点でＨＭＡ
Ｘ／Ｇ４１８耐性コロニーを有するウェルを更に検定す
るために同定する。
Ｏキメラカッパ産生細胞（Ｓ Ｐ ２／Ｏ−κ）を、電
気穿孔前に３日間、対数期増殖相に維持する。ブラスミ
ドＤＮＡｐＮ９．２．２７Ｇｌ（２０マイクログラム）
を、Ｐｖｕｌ反応緩衝液中、酵素ＰｖｕＴで直線化する
。細胞を集め、洗浄し、実施例９Ａで詳細に説明する様
に３×１０７細胞／ｔｔｔ（ｌの密度で再懸濁する。Ｄ
ＮＡを加え、電気穿孔前に１０分間、混合物を氷上で維
持する。使用した条件は、２５０ボルトで５ｍ秒間、■
パルスである。細胞をＩ｛Ｈ２（またはＤＭＥＭまたは
ＲＰＭＩの様なその他の培地）の様な噛乳動物組織培養
培地プラス５％ＦＣＳブラスＨＭＡＸ１．Ｏ中、２．５
Ｘ１０’／ｘｌ２で３７゜Ｃ、５％ＣＯ８にて７２時間
プレートする。次ぎに、これらの細胞を２４ウエルプレ
ート中、５００μｇ／村の活性濃度でＨＭＡＸ１．Ｏお
よびＧ４１８抗生物質（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ， Ｇｉｂ
ｃｏ−ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ＊Ｍａｒｙ
ｌａｎｄ）を含有している培地に５ｘｌＯ’／ｘＱでプ
レートする。選別をｌ４日間維持し、その時点でＨＭＡ
Ｘ／Ｇ４１８耐性コロニーを有するウェルを更に検定す
るために同定する。
当業者には、本発明の精神および範囲を逸脱しない限り
、本発明の改良法および変法が可能であることが理解さ
れよう。特許請求の範囲はこの様な改良法および変法を
全て包含することを説明せんと意図するものである。
、本発明の改良法および変法が可能であることが理解さ
れよう。特許請求の範囲はこの様な改良法および変法を
全て包含することを説明せんと意図するものである。
第１図はブラスミドｐＭＬＣＥ−１．０の制限部位およ
び機能地図、第２図はブラスミドｐＨＫＦ−１の制限部
位および機能地図、第３図はブラスミドｐＨＫＣＥ−１
０の制限部位および機能地図、第４図はブラスミドｐＧ
ＣＥＭＫの制限部位および機能地図、第５図はプラスミ
ドｐＭＨＣＥ−３０の制限部位および機能地図、第６図
はプラスミドｐＨＧＩＺの制限部位および機能地図、第
７図はプラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０の制限部位および
機能地図、第８図はブラスミドｐＮｃＥＭＧ１の制限部
位および機能地図、第９図はプラスミドｐＴＺ Ｋ９１
０の制限部位および機能地図、第１０図はブラスミドｐ
Ｇ９．２．２７Ｋの制限部位および機能地図、第１１図
はブラスミドｐＧ４Ｇ２１の制限部位および機能地図、
ならびに第１２図はブラスミドｐＮ９．２．２．２７Ｇ
ｌの制限部位および機能地図を、それぞれ示す模式図で
ある。 区普のでキ書ｒ内容に変更なし） ＦＩＧ，１
び機能地図、第２図はブラスミドｐＨＫＦ−１の制限部
位および機能地図、第３図はブラスミドｐＨＫＣＥ−１
０の制限部位および機能地図、第４図はブラスミドｐＧ
ＣＥＭＫの制限部位および機能地図、第５図はプラスミ
ドｐＭＨＣＥ−３０の制限部位および機能地図、第６図
はプラスミドｐＨＧＩＺの制限部位および機能地図、第
７図はプラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０の制限部位および
機能地図、第８図はブラスミドｐＮｃＥＭＧ１の制限部
位および機能地図、第９図はプラスミドｐＴＺ Ｋ９１
０の制限部位および機能地図、第１０図はブラスミドｐ
Ｇ９．２．２７Ｋの制限部位および機能地図、第１１図
はブラスミドｐＧ４Ｇ２１の制限部位および機能地図、
ならびに第１２図はブラスミドｐＮ９．２．２．２７Ｇ
ｌの制限部位および機能地図を、それぞれ示す模式図で
ある。 区普のでキ書ｒ内容に変更なし） ＦＩＧ，１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、キメラモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコード
している第１のＤＮＡ配列を含有する組換ＤＮＡ化合物
であって、第１のＤＮＡ配列が【遺伝子配列があります
】 からなるアミノ酸配列をコードしている組換ＤＮＡ化合
物。 ２、コード鎖が 【遺伝子配列があります】 からなる請求項１に記載の組換ＤＮＡ化合物。 ３、第１のＤＮＡ配列が更に、真核生物のシグナルペプ
チドをコードしているＤＮＡ配列を含有する請求項１に
記載の組換ＤＮＡ化合物。 ４、リーダーペプチドをコードしているＤＮＡ配列が 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列を有するリーダーペプチドをコー
ドしている請求項３に記載の組換ＤＮＡ化合物。 ５、リーダーペプチドをコードしているＤＮＡ【遺伝子
配列があります】 からなる請求項４に記載の組換ＤＮＡ化合物。 ６、プラスミドｐＴＺＫ９１０（ＮＲＲＬＢ−１８４７
８）である請求項５に記載の組換ＤＮＡベクター。 ７、キメラモノクローナル抗体の軽鎖定常領域をコード
している第２のＤＮＡ配列を更に含有する請求項１に記
載の組換ＤＮＡ化合物。 ８、請求項７に記載のＤＮＡ化合物を含有している組換
ＤＮＡベクター。 ９、第１０図に示されたプラスミドｐＧ９．２．２７Ｋ
である請求項８に記載の組換ＤＮＡベクター。 １０、キメラモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコー
ドしている第１のＤＮＡ配列を含有する組換ＤＮＡ化合
物であって、第１のＤＮＡ配列が【遺伝子配列がありま
す】 からなるアミノ酸配列をコードしている組換ＤＮＡ化合
物。 １１、コード鎖が 【遺伝子配列があります】 からなる請求項１０に記載の組換ＤＮＡ化合物。 １２、第１のＤＮＡ配列が更に、真核生物のシグナルペ
プチドをコードしているＤＮＡ配列を含有する請求項１
０に記載の組換ＤＮＡ化合物。 １３、リーダーペプチドをコードしているＤＮＡ配列が 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列を有するリーダーペプチドをコー
ドしている請求項１２に記載の組換ＤＮＡ化合物。 １４、リーダーペプチドをコードしているＤＮＡが 【遺伝子配列があります】 からなる請求項１３に記載の組換ＤＮＡ化合物。 １５、プラスミドｐＧ４Ｇ２１（ＮＲＲＬＢ−１８４７
９）である請求項１４に記載の組換ＤＮＡベクター。 １６、キメラモノクローナル抗体の重鎖定常領域をコー
ドしている第２のＤＮＡ配列を更に含有する請求項１５
に記載の組換ＤＮＡ化合物。 １７、請求項１６に記載のＤＮＡ化合物を含有している
組換ＤＮＡベクター。 １８、第１２図に示されたプラスミドｐＮ９．２．２７
Ｇｌである請求項１７に記載の組換ＤＮＡベクター。 １９、キメラ抗体の軽鎖をコードしているＤＮＡ配列、
および軽鎖の発現を誘導するように軽鎖コードＤＮＡに
関連して位置している転写および翻訳ＤＮＡ配列を含有
している、少なくとも１個のＤＮＡベクターを含有する
、キメラモノクローナル抗体を発現し得る真核生物宿主
細胞であって、軽鎖可変領域をコードしているＤＮＡ鎖
配列が【遺伝子配列があります】 からなる真核生物宿主細胞。 ２０、第２のＤＮＡベクター、または第１のＤＮＡ構築
物が更に、キメラ抗体の重鎖をコードしているＤＮＡ鎖
配列、および重鎖の発現を誘導するように重鎖コードＤ
ＮＡ鎖配列に関連して位置している転写および翻訳ＤＮ
Ａ配列を含有している、請求項１９に記載の真核生物宿
主細胞であって、重鎖可変領域をコードしているＤＮＡ
鎖配列が 【遺伝子配列があります】 からなる真核生物宿主細胞。 ２１、第１のＤＮＡベクタ−がキメラモノクローナル抗
体の軽鎖をコードし、第２のＤＮＡベクターがキメラモ
ノクローナル抗体の重鎖をコードしている請求項２０に
記載の真核生物宿主細胞。 ２２、ＳＰ２／０／ｐＧ９．２．２７Ｋ／ｐＮ９．２．
２７Ｇｌである請求項２１に記載の真核生物宿主細胞。 ２３、 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含有して
いるキメラモノクローナル抗体。 ２４、抗体がキメラ９．２．２７である請求項２３に記
載のキメラモノクローナル抗体。 ２５、 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含有して
いるキメラモノクローナル抗体。 ２６、抗体がキメラ９．２．２７である請求項２５に記
載のキメラモノクローナル抗体。 ２７、 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含有して
いるキメラモノクローナル抗体。 ２８、抗体がＸＣＥＭ４４９である請求項２７に記載の
キメラモノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US387665 | 1989-07-31 | ||
| US07/387,665 US5580774A (en) | 1989-07-31 | 1989-07-31 | Chimeric antibodies directed against a human glycoprotein antigen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03103179A true JPH03103179A (ja) | 1991-04-30 |
Family
ID=23530868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2205917A Pending JPH03103179A (ja) | 1989-07-31 | 1990-07-31 | ヒト糖タンパク質抗原に対するキメラ抗体 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5580774A (ja) |
| EP (1) | EP0411893A3 (ja) |
| JP (1) | JPH03103179A (ja) |
| KR (1) | KR910003106A (ja) |
| AU (1) | AU633336B2 (ja) |
| CA (1) | CA2022273A1 (ja) |
| HU (1) | HUT54408A (ja) |
| IE (1) | IE902754A1 (ja) |
| IL (1) | IL95236A0 (ja) |
| ZA (1) | ZA905979B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006501818A (ja) * | 2002-07-23 | 2006-01-19 | デルタ バイオテクノロジー リミテッド | 遺伝子およびポリペプチド配列 |
| JP2013505732A (ja) * | 2009-09-29 | 2013-02-21 | ロシュ グリクアート アーゲー | 二重特異性デス受容体アゴニスト抗体 |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3909799A1 (de) | 1989-03-24 | 1990-09-27 | Behringwerke Ag | Monoklonale antikoerper (mak) gegen tumorassoziierte antigene, ihre herstellung und verwendung |
| US5811447A (en) | 1993-01-28 | 1998-09-22 | Neorx Corporation | Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells |
| US6515009B1 (en) | 1991-09-27 | 2003-02-04 | Neorx Corporation | Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells |
| US6306421B1 (en) | 1992-09-25 | 2001-10-23 | Neorx Corporation | Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells |
| US6491938B2 (en) | 1993-05-13 | 2002-12-10 | Neorx Corporation | Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells |
| US6663881B2 (en) | 1993-01-28 | 2003-12-16 | Neorx Corporation | Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells |
| EP2298310A3 (en) | 1993-01-28 | 2011-04-06 | Boston Scientific Limited | Therapeutic inhibitors of vascular smooth muscle cells |
| US5981568A (en) | 1993-01-28 | 1999-11-09 | Neorx Corporation | Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells |
| CA2257357C (en) | 1996-06-07 | 2010-04-13 | Neorx Corporation | Humanized antibodies with modified glycosylation |
| WO1998043618A2 (en) | 1997-03-31 | 1998-10-08 | Neorx Corporation | Use of cytoskeletal inhibitors for the prevention of restenosis |
| DE19739685A1 (de) | 1997-09-10 | 1999-03-11 | Eichel Streiber Christoph Von | Monoklonale Antikörper zur Therapie und Prophylaxe von Erkrankungen durch Clostridium difficile |
| CA2363067C (en) | 1999-01-12 | 2012-03-20 | David J. Grainger | Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response |
| US7009040B2 (en) * | 2003-01-21 | 2006-03-07 | Arius Research, Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
| US7255874B1 (en) | 2001-12-21 | 2007-08-14 | Closure Medical Corporation | Biocompatible polymers and adhesives: compositions, methods of making and uses related thereto |
| WO2003093446A2 (en) * | 2002-05-04 | 2003-11-13 | Acorda Therapeutics, Inc. | Antibodies for enhancing neurite outgrowth |
| US7468254B2 (en) * | 2003-01-21 | 2008-12-23 | Arius Research Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP |
| US7393531B2 (en) * | 2003-01-21 | 2008-07-01 | Arius Research Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP |
| CN101687009A (zh) | 2007-05-11 | 2010-03-31 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 治疗皮肤溃疡的方法 |
| EA200971050A1 (ru) | 2007-05-11 | 2010-06-30 | Томас Джефферсон Юниверсити | Способы лечения и предупреждения нейродегенеративных заболеваний и нарушений |
| US9260519B2 (en) | 2011-06-17 | 2016-02-16 | President And Fellows Of Harvard College | Frizzled 2 as a target for therapeutic antibodies in the treatment of cancer |
| WO2013003697A1 (en) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Trustees Of Boston University | Method for controlling tumor growth, angiogenesis and metastasis using immunoglobulin containing and proline rich receptor-1 (igpr-1) |
| WO2014160871A2 (en) | 2013-03-27 | 2014-10-02 | The General Hospital Corporation | Methods and agents for treating alzheimer's disease |
| UA118028C2 (uk) | 2013-04-03 | 2018-11-12 | Рош Глікарт Аг | Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування |
| JP6841753B2 (ja) | 2014-09-15 | 2021-03-10 | ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | ヒストンｈ３−リジントリメチル化を除去することによって体細胞核移入（ｓｃｎｔ）効率を増加させるための方法および組成物 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8308235D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US4533496A (en) * | 1984-05-08 | 1985-08-06 | Monsanto Company | Method of isolating monoclonal antibodies from hybridoma cultures |
| IL84285A (en) * | 1986-10-27 | 1993-03-15 | Int Genetic Engineering | Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen |
| AU625613B2 (en) * | 1988-01-05 | 1992-07-16 | Novartis Ag | Novel chimeric antibodies |
| WO1990002569A1 (en) * | 1988-09-06 | 1990-03-22 | International Genetic Engineering, Inc. | Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens |
| IL94872A (en) * | 1989-06-30 | 1995-03-30 | Oncogen | Monoclonal or chimeric antibodies that react with human carcinoma, recombinant proteins that contain their anti-binding site, pharmaceutical preparations and kits that contain the |
| US5081235A (en) * | 1989-07-26 | 1992-01-14 | City Of Hope | Chimeric anti-cea antibody |
| EP0438310A1 (en) * | 1990-01-19 | 1991-07-24 | Merck & Co. Inc. | Method for producing recombinant immunoglobuline |
-
1989
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