JPH029365A - 細胞融合装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は一般に細胞融合装置に関し、かつより特定的
には、たとえば雑種細胞を作り出すための、電気融合（
ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）による細胞融合のための
装置に関する。

発明の背景 電気融合は導電媒体に浮遊する細胞に高電圧電界を与え
ることによって細胞ハイブリダイゼーションを引き起こ
すための既知の技術である。細胞はポリエチレングリコ
ールの懸濁液への付加、または電気泳動もしくは電荷変
異方法のような手段によって、しばしば真珠鎖式として
知られる長い鎖の群を形成するために手で触れてもよい
。

細胞の電気融合に必要な電界強度は３００から４００Ｋ
Ｖ／ｍのオーダである。このような電界強度において、
融合室におけるバッチ処理で行なわれる既知の工程にお
ける主要な問題とされる要因は伝導加熱することであり
、それゆえ浸透ストレスもまた低い細胞生存度を生み出
すので、たとえば懸濁液媒体としてマンニトールまたは
スクロースを用いることによって達成される非イオン浸
透性補償とともに細胞に対する熱損傷を避けるために低
伝導性非生理学的支持媒体は、どうしても用いられなけ
ればならなかった。

この発明の主要な目的は、生理学的に正常な媒体、すな
わち、イオン的にかつ浸透性的に細胞に対して正常な媒
体が、結果として起こる細胞生存度の実質的な増大とと
もに用いられることを許容する、細胞の電気融合のため
の改良された装置を提供することである。

発明 この発明に従うと、細胞の電気融合のための装置は媒体
に浮遊する細胞の通過のための特定の流れ容量の流れ通
路と、流れ通路を取囲む冷却手段と、流れ通路の両端の
電極と、媒体が流れ通路をゆっくり流れるようにされる
間ＤＣ電圧パルスを電極に与えるための高電圧パルス発
生回路とを含む。

使用において、電圧パルスは、流れ通路の流れ容量と、
媒体の流れ速度と、冷却手段による熱抽出速度とに関連
して、細胞を含む媒体の温度上昇が媒体中の細胞に対す
る熱損傷を実質的に避けるように制限されるような大き
さおよび繰返し速度で与えられる。

このように、この発明は、電気融合が、細胞を含む媒体
の、好ましくは３７℃である、特定の最大値に制限され
たパルス化された温度上昇を引き起こすように規定され
るＤＣ電圧パルスで行なわれる冷却手段を有するフロー
スルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒＯｕｇｈ）システムにあり、
その媒体は、このように、その結果として起こる細胞生
存度の大幅な改良とともに組織培養流体のような生理学
的に正常な媒体によって構成される。この発明は、３か
ら４ＫＶ／ｃｍの電界強度を、細胞にとってイオン的お
よび浸透性的に正常な流体に与えることを可能にし、か
つ媒体の温度はせん断力によって細胞の集合を分離する
ために材料を十分に速く流すことなく制限される。この
装置の使用において細胞は、抗体材料のような物質、レ
クチン、ポリーＬ−リジンのような界面活性物質または
結合因子を媒体に付加することによって小さな集団に集
められてもよい。流れ通路に流れる流体は、好ましくは
、電圧パルスに関連して時間決めされたパルス化された
流れであるので、小さな集団の集合は比較的長い鎖の集
合と比較して貞利である。

この発明は特に、単一クローンの抗体を作り出す目的の
ために牌臓細胞および骨髄種細胞から雑種細胞を作り出
すのに役立つ。

この発明のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の
図面に例示されたようなこの発明の具体的な実施例の次
の詳細な説明からより明らかとなるであろう。

実施例の説明 第１図は、部材１２を配置することによって支えられる
シリコーンゴムシールを通じてガラス毛細管の形である
流れ通路１４を配置する役目を果たす上部および下部テ
フロン（商標）端部ブロック１０から形成されるフロー
スルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）セルを示す。ブロ
ック１０はまた、流れ通路１４を取囲む循環ガラスウォ
ータジャケット１６を適所にクランプする役割を果たし
、流れ通路１４はまわりを取囲むジャケットの中で循環
する水へ熱伝達することによって通路の中を流れる媒体
の効率的な冷却を確実にするために十分薄い壁を有する
。

電極１８は端部ブロックの室に含まれる電解質２０の、
中に配設され、かつ、半透膜２６によって、端部ブロッ
ク１０の入口／出口経路２２．２４から分離される。

１ｍ店の使い捨て注射器２８は、上端部ブロック１０の
入口／出口経路２２と接続しかつ、実際においてコンピ
ユータ化された制御手段によって構成されるタイマ３０
からｘ−＋ｔ　ｍされるステップモータ２９によって動
作されるように適合される。

低端部ブロック１０の入口／出口経路は、コンピユータ
化された制御手段３０の管理下で進められる、たとえば
９６のためマイクロダイタ皿を含む、断片収集器３４に
試料を運ぶことができる使い捨て出口先端部３２に接続
する。

高電圧パルス発生回路３６は、再びコンピユータ化され
た制御手段３０の管理化で、規定された大きさ、期間お
よび周波数のＤＣ電圧パルスを電極１８に与える。

使用について、冷却水はガラスジャケット１６を循環し
、かつ組織培養流体に浮遊する細胞はステップモータ２
９によって駆動される使い捨て注射器２８から毛細管１
４を通される。各々のステップは、パルスユニット３６
をトリガし、このユニット３６は、規定された長さの端
部ブロック室に含まれる電解質２０に浸されている電極
１８に与えられる高電圧（およそ８ＫＶ）パルスを与え
る。

−ｍのパルスの後、断片収集器３４はパルス化された試
料を回収するためにマイクロダイタ皿を動かす。流れの
速さはウォータジャケット内の水による熱の除去によっ
て規定され、かつパルスの大きさは与えられた電界の間
許容された温度上昇によって規定される。試料注射器２
８および出口先端３２の両方は殺菌した使い捨て器具で
あるる。

より詳細には、１ｍ店は細胞を含む媒体（組織培養流体
）の適切な容量である。これは、マイクロリットル毎に
５個の流体パルスを運ぶため、マイクロコンピュータお
よびインターフェイス（タイマ３０）によって制御され
る、１ｍ店の使い捨て注射器（注射器２８）を駆動する
注射器ポンプ（ステップモータ２９）によって運ばれる
。ソフトウェアから抽出される制御パルスは断片収集器
３４と同様、高電圧パルス発生ユニット３６を制御する
ために用いられる。

注射器２８および出口先端３２は、毛細管１４によって
結合され、この毛細管１４は２２ｍｍの長さのうち約１
８ｍｍがウォータジャケット１６に取囲まれ、好都合に
０．７ｍｍの直径を有する。

電解質サイドアームは、各々の端部ブロック１０に螺合
するねじ切りされた中空なテフロン（商標）のプラグに
よってクランプされる標準の分離膜“ビスキン（ｖｉｓ
ｋｉｎ）’細管によって構成されるセルロース膜（半透
膜２６）によ７て直径２ｍｍの端部ブロック経路２２．
２４の溶媒から分離される。電極］８は白金であり、か
つ０．　９％の塩化ナトリウム溶液に浸される。２０℃
またはそれ以下の冷却水はおよそ３ｍｕ／分で冷却ジャ
ケット１６を流れる。毛細管１４を流れる組織培養媒体
（およそ０．　９％の塩化ナトリウム）は、１６から３
４キロオームの抵抗率を有する。

使用モードをより詳細に参照すると、器具は注射器ポン
プにクリップされるきれいな使い捨て注射器を用いて手
で組織培養流体で満たされる。注射器はコンピュータ制
御下で空にされかつ使い捨て先端の下に置かれる容器か
らの細胞懸濁液（およそ１０’細胞）で再び満たされる
。流体（１ｍα）は２Ｈｚでパルスされかつ８μ（ｌｓ
ｅｃ−’で引込まれ、かつ、リターンバスに試料を再び
パルスしながら同じ速度でマイクロタイタ皿に再び運ば
れる。

装置に一般に適用可能な制限条件は以下のとおりである
。

ピーク電圧−８ＫＶ パルス長（７５％ポイント）−１１５μＳ流体抵抗率０
１６　Ｋ　オーム、２０℃において ピーク電流−〇、５アンペア 出力−４０００ワツト 許容された温度上昇−１７℃ 管容量−９μ鉦 １パルス５ｅＣ−’において Ｅ−０，５ジュール−Ｃ６１２カロリーΔＴ　　ｍａｘ
ｍｌパルスあたり１３℃熱伝達は計算され得るが、制限
条件は管１４の閉じられた端部であると仮定される。９
μ１ｓｅｃ−１の流れにおいて、この断片はおよそ０，
２秒で水に流されきれいにされる。食塩水における赤血
球による測定は５−１０Ｈｚで起こる細胞溶解を示し、
かつ最適速度は２Ｈｚパルスに定められ、かつ流れは８
μ７１　５ｅｃ−’　に定められた。

さらに、マウス骨髄種細胞Ｘ６３　　Ａｇ３−６５３お
よび牌臓細胞において実施される予ｍ測定において、雑
種が得られかつ５Ｈｚにおける生存度は７５から８０％
であり、かつ低パルス速度においては影響を受けなかっ
た。

高電圧発生回路の簡略化された回路図が第２図に与えら
れる。簡潔にいうと、変圧器出力を有するコンデンサ放
電サイリスタチョッパは、所与の流れ速度のために固定
したパルス速度を与えるため、マイクロコンピュータに
よって制御される８ＫＶ、１００μＳのパルスを発生す
るために用いられる。

主要な回路はＣ５゜を出力変圧器の１次に放電ししかし
ＴＨＹ２によって強制的に直流にされるサイリスタＴＨ
ＹＩを有する２つのサイリスタチョッパである。回路は
サイリスタの両方の陰極が０ボルトであり、ゲートトリ
ガ分離を必要としないように整列される。

整流回路４０を介して主電圧を与えると、Ｃ１゜は４５
０ボルトまで充電されかつらボルトが論理回路に与えら
れる。ＴＨＹｌの陽極はＣＩＯの負がＴ２の１次を介し
てＯボルトに接続されるので（ＤＣのために）、そのと
き＋４５０ボルトである。ＭＯＮＯＩが手動ボタンまた
は外部トリがパルスによってトリガされるとき、正のゲ
ート信号７５−１００μｓ長（Ｒ２Ｃ２によって決めら
れるように）はｖＴｌを介してＴＨＹＩゲートに与えら
れる。

ＴＨＹｌはそのとき導通し、かつ４５０ボルトの負のス
テップはＴ２の１次に与えられる。同様のステップが０
９の上に現われる。Ｃ５は導通し、かつＬを有するＣ９
は１．５サイクルの間共振しＴＨＹ２の陽極を約２００
−３００ボルト正に、Ｃ９は約８００ボルトに充電した
状態にしておく。

７５−１００μｓ期間のおわりにおいて、ＭＯＮＯ２は
ＭＯＮＯＬのＱ出力後縁によってトリガされかつＶＴ２
を介してＴＨ￥２を点弧する。負荷電流はＴＨＹＩがオ
フするのを許容する十分長い間ＴＨＹ２およびＣ９を通
じてそらされる。Ｃ９はそのとき出力パルスの後縁を形
成するＴＨＹ２およびＴ２に放電し続ける。

出力における立上がりおよび立下がり時間は、Ｔ２の漏
れインダクタンスによって０．５Ａから約３０−４０μ
ｓの公称最大負荷に制限されることが言及されなければ
ならない。しかしながら、これはちょうどサイリスタ定
格内において約８０アンペアのピーク１次電流だけを与
えるＴ２の２次上の短絡になる。Ｒ５−Ｃ５、Ｒ３−Ｃ
４は＋５供給からゲート電流を分離しかつ、Ｄ６がＴＨ
Ｙｌが電圧を逆にすることを妨げかっＤ７がＴ２上のオ
ーバシュートをクリップする間メインパルスに続く後の
いかなる５点弧をも防ぐ役割をする。

Ｒ７，は、Ｒ２が必要とされるパルス長のために選択さ
れるとき、初めＣＯＯ士にある＋４５０ボルトを得るた
めに選ばれる。

完全な装置はりレーダンブ（図示されず）および電源発
生回路（図示されず）を含む。

実際の実施例において、器具および制御装置は、完全自
動操作によく適するので、電気的にかみ合わされたキャ
ビネットの中に入れられるのが好ましいであろう。

上に延べられかつ例示された実施例の多様な修正は、添
付の請求の範囲によって規定される発明の範囲内におい
て可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実際の実施例の正面図である。 第２図は電圧パルス発生回路の簡略化した回路図である
。 図において、１４は流れ通路、１６はウォータージャケ
ット、３０はタイマ、３６は高電圧パルス発生回路であ
る。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）媒体に浮遊する細胞の通過のための特定の流れ容
   量の流れ通路と、流れ通路を取囲む冷却手段と、流れ通
   路の両端の電極と、媒体が流れ通路をゆっくり流れるよ
   うにされている間、電極にＤＣ電圧パルスを与えるため
   の高電圧パルス発生回路とを含む、細胞の電気融合のた
   めの装置。
2. （２）与えられた電圧パルスは、流れ通路の流れ容量と
   、媒体の流れ速度と、冷却手段による熱注出速度とに関
   連して、細胞を含む媒体の温度上昇が細胞を含む媒体に
   対する熱損傷を実質的に避けるように制限されるような
   大きさおよび繰返し速度である、請求項１に記載の装置
   。
3. （３）装置のための制御手段が細胞を含む媒体の温度を
   最大３７℃に制限する、請求項１または２に記載の装置
   。
4. （４）媒体は組織培養流体である請求項１、２、または
   ３に記載の装置。
5. （５）与えられた電圧パルスのピークの大きさはおよそ
   ８ＫＶであり、かつ前記与えられた電圧パルスはおよそ
   １０μｌ／ｓｅｃの、細胞を含む媒体の流れ速度で、１
   ０Ｈｚを越えない周波数においておよそ１００μｓの持
   続期間を有する、請求項１から４のいずれかに記載の装
   置。
6. （６）流れ経路は約２０ｍｍの長さが冷却手段によって
   取囲まれる、１ｍｍ以下の直径を有する、請求項１から
   ５のいずれかに記載の装置。
7. （７）冷却手段は循環ウォータジャケットである、請求
   項１から６のいずれかに記載の装置。
8. （８）流れ通路は前記流れ通路と連通する入口／出口経
   路を含む端部ブロックの間に取付けられ、前記各々の入
   口／出口経路は一方の端部ブロックが、媒体のパルス化
   された流れを作り出すためのステップモータによって駆
   動するように適合された注射器に接続し、かつ他方が試
   料を断片収集器に送り込むための出口先端に接続する、
   請求項１から７のいずれかに記載の装置。
9. （９）電極は各々の端部ブロックに形成される電解室に
   含まれる電解質に設けられ、電解質は半透膜によって端
   部ブロックにある入口／出口経路から分離される、請求
   項８に記載の装置。
10. （１０）高電圧パルス発生回路は出力変圧器の１次巻線
    に放電するコンデンサを制御すためのサイリスタチョッ
    パとサイリスタのためのトリガ可能な制御回路とを含む
    、請求項１から９のいずれかに記載の装置。
11. （１１）制御回路高電圧パルス発生回路をトリガするた
    めの第１制御パルスおよび、ステップモータのための制
    御回路をトリガするための第１制御パルスに対して時間
    決めされた関係の第２制御パルスを与えるためのコンピ
    ュータを含む、請求項８または請求項９に付随の請求項
    １０に従う装置。