JP7450871B2 - 細胞製造装置 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞製造装置に関する。
ある細胞の細胞核を別の細胞の細胞質内へ移植する細胞核移植は、細胞の性質を変える方法として、医療や産業に重要な役割を果たしている。
例えば、細胞核を除去した受精卵に、別個体の体細胞由来の核を移植した後、受精卵を子宮に戻すことでクローン個体を産出する方法や、子宮に戻さず体外で胚盤胞へ発生させて胚性幹細胞 (Embryonic Stem cells: ES細胞) を樹立する体細胞由来胚性幹細胞 (nuclear transfer Embryonic stem cells: NtES細胞) 樹立方法などがある。こうして得られたクローン個体やNtES細胞は、畜産や再生医療の基礎研究に寄与している。
細胞核移植以外に、細胞の性質を変える技術として、センダイウイルス法やプロトプラスト-ポリエチレングリコール法、電気的細胞融合法などの細胞融合技術が挙げられる。細胞融合は、２つ以上の細胞を融合させ、１つの細胞を形成する技術である。この方法では、細胞融合後の１つの細胞内に２つ以上の細胞に由来する細胞核が存在するため、融合細胞は医療利用に制限がある。
細胞融合技術の内、電界集中型細胞融合法は、２つの細胞を、細胞核の直径以下の幅や径のスリットや孔 (オリフィス) を介して接触させ、スリットやオリフィスでパルス的に電界を集中させることで、２つの細胞膜の接点で電気的に細胞膜が部分的に破壊され、復元する過程で細胞を融合する方法である（例えば、特許文献１、２参照）。この方法では、オリフィスや流路の最大径や最大幅が細胞核径より小さいことにより、細胞核の混合を防ぐことが可能である（例えば、特許文献１、２参照）。近年、Polydimethyl siloxane (PDMS)を使用して作製された流路を用いて様々な電界集中型細胞融合法が検討されている。例えば、PDMSで製造された２つの平行流路間をオリフィスのみで繋ぎ、各流路末端に細胞供給口と吸引口をそれぞれ設けた流路を用い、オリフィスで細胞対を形成後、細胞融合させる方法がある。例えば、細胞供給口にJurkat細胞または樹状細胞を導入し、吸引口方向へ流路上で細胞を移動させ、オリフィスでJurkat細胞と樹状細胞を融合させ、Jurkat細胞の細胞質を樹状細胞へ移動させた後、界面活性剤を添加し、Jurkat細胞側の流路に流れを生じさせて両細胞を切り離すことで、細胞質が移動できるようになった（例えば、非特許文献１参照）。
この電界集中型細胞融合法を基に細胞質交換法が開発された（例えば、特許文献３参照）。細胞質交換法では、標的体性細胞とｉＰＳ細胞を用いた場合、次の（Ａ）～（Ｄ）の手順を経て体性細胞の細胞質をｉＰＳ細胞の細胞質へ交換する（図１参照）。
（Ａ）標的体性細胞と１個目のｉＰＳ細胞を電界集中型細胞融合(１回目）する。
（Ｂ）ｉＰＳ細胞のみを切り離すことで、体性細胞の細胞質を除去する。
（Ｃ）新たな２個目のｉＰＳ細胞と、切り離し元の標的体性細胞の電界集中型細胞融合(２回目）する。
（Ｄ）体性細胞を切り離すことで、ｉＰＳ細胞の細胞質を体性細胞へ導入する。
この方法では、細胞質交換細胞は、ＰＤＭＳで作製された流路内の第一と第二の２つの細胞供給流路から供給された体性細胞とｉＰＳ細胞を使用して、細胞質交換部で２回の電界集中型細胞融合後に作製される。作製された細胞質交換細胞は、第３の細胞回収流路を経て流路外へ回収可能である（例えば、特許文献４参照）。
Cytoplasmic transfer without nuclei mixing between dendritic cells and tumor cells achieved by one to-one electrofusion via micro-orifices in a microfluidic device. 18th International Conference on Miniaturized. Systems for Chemistry and Life Sciences. October 26-30, 2014, San Antonio, Texas, USA
細胞質交換流路では、流路内で仕切られた３つの流路として、２つの細胞供給流路と１つの細胞回収流路を必要する。細胞質交換では、１つのポンプの吸引吐出により、２つの細胞供給流路を繋ぐ細胞融合部を通過する交差せん断流を利用して、細胞の分離方向を制御し、細胞供給流路を通過するせん断流を利用して細胞を切り離す。細胞核交換法で望ましい細胞の所定の位置の移動や、細胞分離方向の制御のためには、より安定したせん断流の供給が重要である。
本発明は、２つの細胞供給流路と１つの細胞回収流路で構成される流路内の流れを安定化し、容易に細胞を所定の位置に移動させ、安定に細胞核を交換するための細胞製造装置を提供することを目的とする。
本発明の一実施態様は、第１の細胞の細胞核を有し、前記第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造装置であって、第１の細胞供給部と、第２の細胞供給部と、前記第１の細胞供給部に接続する第１の流路と、前記第２の細胞供給部に接続する第２の流路と、前記第１の流路と前記第２の流路を隔てる壁に設けられ、前記第１の流路と前記第２の流路を繋ぐ孔と、前記第１の流路側の壁に前記孔を囲むように設けられた凹形状の第１の細胞設置部と、前記第１の流路内に設けられ、前記第１の流路に開口する開口部を有する第３の流路と、前記第３の流路に接続する細胞回収部と、前記第１の流路と前記第２の流路が、それぞれ前記第１の細胞供給部と前記第２の細胞供給部の逆側の端で合一して構成される共通流路と、前記共通流路が、前記第１の流路と前記第２の流路の逆側の端に接続するポンプと、前記孔に対して電圧を印加するための直流交流信号発生装置と、を有し、前記凹形状の第１の細胞設置部は第１の縁を有し、前記壁の中心面に対して、前記第１の液体の流れに対して第１の縁の最も近い点と最も遠い点からの垂線の長さをそれぞれｈ１およびｈ２とするとき、それらの長さの関係がｈ１＜ｈ２である、製造装置である。前記第１の縁の最も近い点から前記孔にいたる前記第１の斜面と前記第１の縁の最も遠い点から前記孔にいたる前記第２の斜面が、それぞれ第１の直線部分および第２の直線部分を有し、前記壁の中心面に対する前記第１の直線部分および第２の直線部分の傾きを、それぞれθ１及びθ２とするとき、θ１＜θ２であってもよい。前記第２の流路側の壁に前記孔を囲むように設けられた凹形状の第２の細胞設置部を有してもよい。前記凹形状の第２の細胞設置部は第２の縁を有し、前記壁の中心面に対して、前記第２の液体の流れに対して第１の縁の最も遠い点と最も近い点からの垂線の長さをそれぞれｈ３およびｈ４とするとき、それらの長さの関係がｈ３＜ｈ４であってもよい。前記第２の縁の最も遠い点から前記孔にいたる前記第３の斜面と前記第２の縁の最も近い点から前記孔にいたる前記第４の斜面が、それぞれ第３の直線部分および第４の直線部分を有し、前記壁の中心面に対する前記第３の直線部分および第４の直線部分の傾きを、それぞれθ３及びθ４とするとき、θ３＜θ４であってもよい。
本発明のその他の実施態様は、第１の細胞の細胞核を有し、前記第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造装置であって、第１の細胞供給部と、第２の細胞供給部と、前記第１の細胞供給部に接続する第１の流路と、前記第２の細胞供給部に接続する第２の流路と、前記第１の流路と前記第２の流路を隔てる平面上の壁に設けられ、前記第１の流路と前記第２の流路を繋ぐ孔と、前記第１の流路内に設けられ、前記第１の流路に開口する開口部を有する第３の流路と、前記第３の流路に接続する細胞回収部と、前記第１の流路と前記第２の流路が、それぞれ前記第１の細胞供給部と前記第２の細胞供給部の逆側の端で合一して構成される共通流路と、前記共通流路が、前記第１の流路と前記第２の流路の逆側の端に接続するポンプと、前記孔に対して電圧を印加するための直流交流信号発生装置と、を有し、第１の流路内において、前記孔と前記共通流路側の端との間で、前記第１の流路が前記壁と逆側において狭くなっている、および／または第２の流路内において、前記第２の細胞供給部側の端と前記孔との間で、前記第２の流路が前記壁と逆側において狭くなっている、製造装置である。前記第１の流路において、前記壁と逆側に第１の抵抗体が設置されることによって前記第１の流路が前記壁と逆側において狭くなっていてもよい。前記第２の流路において、前記壁と逆側に第２の抵抗体が設置されることによって前記第２の流路が前記壁と逆側において狭くなっていてもよい。
本発明のさらなる実施態様は、第１の細胞の細胞核を有し、前記第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造装置であって、第１の細胞供給部と、第２の細胞供給部と、前記第１の細胞供給部に接続する第１の流路と、前記第２の細胞供給部に接続する第２の流路と、前記第１の流路と前記第２の流路を隔てる壁に設けられ、前記第１の流路と前記第２の流路を繋ぐ孔と、前記第１の流路側の壁に前記孔を囲むように設けられた凹形状の第１の細胞設置部と、前記第１の流路内に設けられ、前記第１の流路に開口する開口部を有する第３の流路と、前記第３の流路に接続する細胞回収部と、前記第１の流路と前記第２の流路が、それぞれ前記第１の細胞供給部と前記第２の細胞供給部の逆側の端で合一して構成される共通流路と、前記共通流路が、前記第１の流路と前記第２の流路の逆側の端に接続するポンプと、前記孔に対して電圧を印加するための直流交流信号発生装置と、を有し、前記凹形状の第１の細胞設置部は第１の縁を有し、前記壁の中心面に対して、前記第１の液体の流れに対して第１の縁の最も近い点と最も遠い点からの垂線の長さをそれぞれｈ１およびｈ２とするとき、それらの長さの関係がｈ１＜ｈ２であり、第１の流路内において、前記孔と前記共通流路側の端との間で、前記第１の流路が前記壁と逆側において狭くなっているか、および／または第２の流路内において、前記第２の細胞供給部側の端と前記孔との間で、前記第２の流路が前記壁と逆側において狭くなっている、製造装置である。前記第１の縁の最も近い点から前記孔にいたる前記第１の斜面と前記第１の縁の最も遠い点から前記孔にいたる前記第２の斜面が、それぞれ第１の直線部分および第２の直線部分を有し、前記壁の中心面に対する前記第１の直線部分および第２の直線部分の傾きを、それぞれθ１及びθ２とするとき、θ１＜θ２であってもよい。前記第１の流路において、前記壁と逆側に第１の抵抗体が設置されることによって前記第１の流路が前記壁と逆側において狭くなっていてもよい。前記第２の流路において、前記壁と逆側に第２の抵抗体が設置されることによって前記第２の流路が前記壁と逆側において狭くなっていてもよい。
本発明によって、２つの細胞供給流路と１つの細胞回収流路で構成される流路内の流れを安定化し、容易に細胞を所定の位置に移動させ、安定に細胞核を交換するための細胞製造装置を提供することができるようになった。
以下、実施例を挙げながら、本発明の実施形態を詳細に述べる。
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＝＝細胞質を交換するための装置＝＝
（１）基本構成
以下、本発明の装置の一実施態様を、図２を用いて詳細に説明する。
（１）基本構成
以下、本発明の装置の一実施態様を、図２を用いて詳細に説明する。
本発明の一実施態様の装置は、第１の細胞供給部２０１と、第２の細胞供給部２０２と、第１の細胞供給部２０１に接続する第１の流路２０３と、第２の細胞供給部２０２に接続する第２の流路２０４と、第１の流路２０３と第２の流路２０４を隔てる壁２０５に設けられ、第１の流路２０３と第２の流路２０４を繋ぐ孔２０６と、第１の流路２０３と第２の流路２０４が、それぞれ第１の細胞供給部２０１と第２の細胞供給部２０２の逆側の端で合一して構成される共通流路２０９と、共通流路２０９が、第１の流路２０３と第２の流路２０４の逆側の端に接続するポンプ２１０と、孔２０６に対して電圧を印加するための直流交流信号発生装置２１２と、を有する。直流交流信号発生装置２１２は、電力増幅器２１３及び電極２１１を備えていてもよい。
ここで、孔２０６とは、第１の流路２０３及び第２の流路２０４を連通する通路のことを言う。孔２０６の最大幅または最大径を、第１の細胞供給部２０１から供給される第１の細胞の核および第２の細胞供給部２０２から供給される第２の細胞の核の径より小さくしておき、細胞核が孔を通過できないようにしておくことが好ましい。具体的には、孔の最大幅または最大径は、第１の細胞の種類および第２の細胞の種類によって適宜調整すればよいが、１０μｍ以下であることが好ましく、５μｍ以下であることがより好ましく、３μｍ以下であることがさらに好ましい。孔２０６の数は単数であっても複数であってもよいが、複数ある場合、同じ形状であることが好ましい。
壁２０５は垂直またはほぼ垂直であることが好ましい。
（２）第３の流路
この製造装置は、第１の流路２０３内に設けられ、第１の流路２０３に開口する開口部２１４を有する第３の流路２０７と、第３の流路２０７に接続する細胞回収部２０８と、を備えていてもよい。
この製造装置は、第１の流路２０３内に設けられ、第１の流路２０３に開口する開口部２１４を有する第３の流路２０７と、第３の流路２０７に接続する細胞回収部２０８と、を備えていてもよい。
第１の流路２０３に開口する第３の流路２０７の開口部２１４は、第１の細胞の細胞核を有し第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞（以下、細胞質交換細胞と称する）が通過できる大きさであればよく、その最小幅または最小径は、細胞質交換細胞の大きさによって適宜調整すればよい。例えば、６μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上であることがより好ましく、２０μｍ以上であることがさらに好ましい。開口部２１４の最小幅または最小径は、細胞質交換細胞が通過できるのであれば、細胞質交換細胞の直径よりも小さくてもよい。実際、接続口の最小幅または最小径を細胞質交換細胞の直径よりも若干小さくしておき、流路内の溶液の流速を早くすることによって、細胞を歪ませて第３の流路２０７内へ細胞を導入するようにすると、一旦第３の流路２０７に入った細胞質交換細胞は流路外に逆流しにくくなる。第３の流路２０７は、もう一端で細胞回収部２０８に接続されており、孔２０６を通じて作製された細胞質交換細胞を、第３の流路２０７に送り込んで、細胞回収部２０８で回収することにより、細胞質の交換処理をされていない細胞や処理途中の細胞から、細胞質交換細胞を分離して回収することが容易になる。
（３）第１の細胞設置部
この製造装置は、第１の流路２０３側の壁２０５に孔２０６を囲むように設けられた凹形状の第１の細胞設置部３０１を有する。凹形状の第１の細胞設置部３０１は、第１の流路２０３への開口部の周囲を縁取る第１の縁と、第１の細胞供給部２０１から共通流路２０９へ流れる第１の液体の流れに対して、第１の縁の最も近い点から孔にいたる第１の斜面３０４と第１の縁の最も遠い点から孔にいたる第２の斜面３０５とを有する。壁２０５の中心面３０３に対し、液体の流れに対し第１の縁の最も近い点と最も遠い点からの垂線の長さをそれぞれｈ１およびｈ２とするとき、それらの長さの関係がｈ１＜ｈ２であることが好ましい。ｈ１＜ｈ２とすることにより、孔２０６を通る安定した交差せん断流が生じ、例えば、第１の流路２０３を第１の細胞供給部２０１から共通流路２０９へ流れる細胞が、第１の細胞設置部３０１におさまりやすくなる。ここで、ｈ１は５μｍ以上が好ましく、１５μｍ以上が好ましく、２５μｍ以上が好ましい。ｈ２は１０μｍ以上が好ましく、また２０μｍ以上が好ましく、３０μｍ以上が好ましい。また、第１の流路２０３及び第２の流路２０４は、実質的に平行に走っていることが好ましい。なお、本明細書で、壁２０５の中心面３０３とは、孔２０６を通り、第１の流路２０３および／または第２の流路２０４を流れる液体の流れに平行な面のうち、垂直な面のことをいう。
この製造装置は、第１の流路２０３側の壁２０５に孔２０６を囲むように設けられた凹形状の第１の細胞設置部３０１を有する。凹形状の第１の細胞設置部３０１は、第１の流路２０３への開口部の周囲を縁取る第１の縁と、第１の細胞供給部２０１から共通流路２０９へ流れる第１の液体の流れに対して、第１の縁の最も近い点から孔にいたる第１の斜面３０４と第１の縁の最も遠い点から孔にいたる第２の斜面３０５とを有する。壁２０５の中心面３０３に対し、液体の流れに対し第１の縁の最も近い点と最も遠い点からの垂線の長さをそれぞれｈ１およびｈ２とするとき、それらの長さの関係がｈ１＜ｈ２であることが好ましい。ｈ１＜ｈ２とすることにより、孔２０６を通る安定した交差せん断流が生じ、例えば、第１の流路２０３を第１の細胞供給部２０１から共通流路２０９へ流れる細胞が、第１の細胞設置部３０１におさまりやすくなる。ここで、ｈ１は５μｍ以上が好ましく、１５μｍ以上が好ましく、２５μｍ以上が好ましい。ｈ２は１０μｍ以上が好ましく、また２０μｍ以上が好ましく、３０μｍ以上が好ましい。また、第１の流路２０３及び第２の流路２０４は、実質的に平行に走っていることが好ましい。なお、本明細書で、壁２０５の中心面３０３とは、孔２０６を通り、第１の流路２０３および／または第２の流路２０４を流れる液体の流れに平行な面のうち、垂直な面のことをいう。
また、この装置において、第１の縁の最も近い点と最も遠い点から孔２０６にいたる第１の斜面３０４及び第２の斜面３０５がそれぞれ第１の直線部分及び第２の直線部分を有し、壁２０５の中心面３０３に対する第１の直線部分及び第２の直線部分の傾きを、それぞれθ１及びθ２とするとき、θ１＜θ２であることが好ましい。θ１＜θ２とすることにより、孔２０６を通る安定した交差せん断流が生じ、例えば、第１の流路２０３を第１の細胞供給部２０１から共通流路２０９へ流れる細胞が、第１の細胞設置部３０１におさまりやすくなる。ここで、θ１は０°以上が好ましく、３５°以上が好ましく、４５°以上が好ましい。また、θ２は９０°以下が好ましく、７５°以下が好ましく、５０°以下が好ましい。なお、本明細書で、斜面が直線部分を有するとは、孔２０６を通り、壁２０５の中心面３０３に垂直な壁２０５の断面において、斜面の一部または全部が直線状であることを言う。直線状の部分は、斜面の長さのうち、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９９％以上であることがより好ましく、１００％であることがさらに好ましい。
本実施形態で、孔２０６とは、第１の流路２０３及び第２の流路２０４を連通する通路のことを言うが、斜面を有する第１の細胞設置部３０１は含まないものとする。孔２０６の数は単数であっても複数であってもよいが、複数である場合、それぞれの第１の細胞設置部３０１の形状は同じか、ほぼ同じであることが好ましい。孔２０６の数が複数である場合、壁２０５の中心面３０３は、すべての孔２０６を通るように構成されることが好ましい。
（４）第２の細胞設置部
この製造装置は、第２の流路２０４側の壁２０５に孔２０６を囲むように設けられた凹形状の第２の細胞設置部３０２を有してもよい。凹形状の第２の細胞設置部３０２は、第２の流路２０４への開口部の周囲を縁取る第２の縁と、第２の細胞供給部２０２から共通流路２０９へ流れる第２の液体の流れに対して、第２の縁の最も遠い点から孔２０６にいたる第３の斜面３０６と第２の縁の最も近い点から孔２０６にいたる第４の斜面３０７とを有する。壁２０５の中心面３０３に対して、液体の流れに対し第２の縁の最も遠い点と最も近い点からの垂線の長さをそれぞれｈ３およびｈ４とするとき、それらの長さの関係がｈ３＜ｈ４であることが好ましい。ｈ３＜ｈ４とすることにより、孔２０６を通る安定した交差せん断流が生じ、例えば、孔２０６から離れた細胞が、第２の流路２０４を共通流路２０９へ流れやすくなる。ここで、ｈ４は１０μｍ以上が好ましく、また２０μｍ以上が好ましく、３０μｍ以上が好ましい。ｈ３は５μｍ以上が好ましく、１５μｍ以上が好ましく、２５μｍ以上が好ましい。
この製造装置は、第２の流路２０４側の壁２０５に孔２０６を囲むように設けられた凹形状の第２の細胞設置部３０２を有してもよい。凹形状の第２の細胞設置部３０２は、第２の流路２０４への開口部の周囲を縁取る第２の縁と、第２の細胞供給部２０２から共通流路２０９へ流れる第２の液体の流れに対して、第２の縁の最も遠い点から孔２０６にいたる第３の斜面３０６と第２の縁の最も近い点から孔２０６にいたる第４の斜面３０７とを有する。壁２０５の中心面３０３に対して、液体の流れに対し第２の縁の最も遠い点と最も近い点からの垂線の長さをそれぞれｈ３およびｈ４とするとき、それらの長さの関係がｈ３＜ｈ４であることが好ましい。ｈ３＜ｈ４とすることにより、孔２０６を通る安定した交差せん断流が生じ、例えば、孔２０６から離れた細胞が、第２の流路２０４を共通流路２０９へ流れやすくなる。ここで、ｈ４は１０μｍ以上が好ましく、また２０μｍ以上が好ましく、３０μｍ以上が好ましい。ｈ３は５μｍ以上が好ましく、１５μｍ以上が好ましく、２５μｍ以上が好ましい。
また、この装置において、第２の縁の最も遠い点と最も近い点から孔２０６にいたる第３の斜面及び第４の斜面がそれぞれ第３の直線部分及び第４の直線部分を有し、孔２０６の中央面３０３に対する第３の直線部分及び第４の直線部分の傾きを、それぞれθ３及びθ４とするとき、θ３＜θ４であることが好ましい。θ３＜θ４とすることにより、孔２０６を通る安定した交差せん断流が生じ、例えば、孔２０６から離れた細胞が、第２の流路２０４を共通流路２０９へ流れやすくなる。ここで、θ３は０°以上が好ましく、３５°以上が好ましく、４５°以上が好ましい。θ４は９０°以下が好ましく、７５°以下が好ましく、５０°以下が好ましい。
本実施形態で、孔２０６には、斜面を有する第２の細胞設置部３０２は含まれないものとする。孔２０６の数は単数であっても複数であってもよいが、複数である場合、それぞれの第２の細胞設置部３０２の形状は同じか、ほぼ同じであることが好ましい。
（５）各流路内での抵抗増加のための構成
この製造装置は、第１の流路２０３内において、孔２０６と共通流路２０９側の端との間で、第１の流路２０３が壁２０５と逆側において狭くなっているか、または第２の流路２０４内において、第２の細胞供給部２０２側の端と孔２０６との間で、第２の流路２０４が壁２０５と逆側において狭くなっているか、またはこれら両方が狭くなっていてもよい。このような構成では、ポンプの吸引・吐出により、第１の流路２０３内の流れおよび／または第２の流路２０４内の流れは流路が狭くなっている部分で抑制され、相対的に孔２０６を通過する流れが増えるようになり、孔２０６を横切る安定な交差せん断流が生じる。 具体的な構造は特に限定されないが、例えば、図４に示すように、第１の流路２０３または第２の流路２０４において、それぞれ、孔２０６と共通流路２０９側の端との間または第２の細胞供給部２０２側の端と孔２０６との間において、壁２０５と逆側で流路を構成する構造そのものが狭くなっていてもよい。あるいは図５に示すように、第１の流路２０３内の孔２０６と共通流路２０９側の端との間に第１の抵抗体５０１を設けてもよく、または第２の流路２０４内に第２の細胞供給部２０２の端と孔２０６のと間に第２の抵抗体５０２を設けてもよく、または両方を同時に設けてもよい。
この製造装置は、第１の流路２０３内において、孔２０６と共通流路２０９側の端との間で、第１の流路２０３が壁２０５と逆側において狭くなっているか、または第２の流路２０４内において、第２の細胞供給部２０２側の端と孔２０６との間で、第２の流路２０４が壁２０５と逆側において狭くなっているか、またはこれら両方が狭くなっていてもよい。このような構成では、ポンプの吸引・吐出により、第１の流路２０３内の流れおよび／または第２の流路２０４内の流れは流路が狭くなっている部分で抑制され、相対的に孔２０６を通過する流れが増えるようになり、孔２０６を横切る安定な交差せん断流が生じる。 具体的な構造は特に限定されないが、例えば、図４に示すように、第１の流路２０３または第２の流路２０４において、それぞれ、孔２０６と共通流路２０９側の端との間または第２の細胞供給部２０２側の端と孔２０６との間において、壁２０５と逆側で流路を構成する構造そのものが狭くなっていてもよい。あるいは図５に示すように、第１の流路２０３内の孔２０６と共通流路２０９側の端との間に第１の抵抗体５０１を設けてもよく、または第２の流路２０４内に第２の細胞供給部２０２の端と孔２０６のと間に第２の抵抗体５０２を設けてもよく、または両方を同時に設けてもよい。
＝＝細胞質を交換する方法＝＝
本発明の一実施形態に係る第１の細胞の細胞質の交換方法は、第１の細胞の細胞質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入する第２の工程を含む、細胞質の交換方法であって、
（１）第１の工程の後で第２の工程が行われる、または
（２）第１の細胞の細胞質の４０％～６０％と、第２の細胞の細胞質の４０％～６０％とが交換される第１の細胞質交換工程によって、第１の工程と第２の工程が同時に行われる、方法である。
本発明の一実施形態に係る第１の細胞の細胞質の交換方法は、第１の細胞の細胞質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入する第２の工程を含む、細胞質の交換方法であって、
（１）第１の工程の後で第２の工程が行われる、または
（２）第１の細胞の細胞質の４０％～６０％と、第２の細胞の細胞質の４０％～６０％とが交換される第１の細胞質交換工程によって、第１の工程と第２の工程が同時に行われる、方法である。
（２）の場合、細胞質交換工程後の第１の細胞の細胞質の４０％～６０％と、新たな第２の細胞の細胞質の４０％～６０％とが交換される第２の細胞質交換工程がさらに行われてもよく、この第２の細胞質交換工程がさらに１回以上行われてもよい。この工程を繰り返すことによって、第１の細胞の細胞質が第２の細胞の細胞質に交換される割合が高くなる。
本発明の一実施形態に係る細胞質の交換方法を用いて、第１の細胞の細胞核を有し、第２の細胞の細胞核を有さず、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造することができる。
こうして製造された細胞において、第１の細胞の細胞膜の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
また、第２の細胞の細胞質の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
以下に、図６から図１２を用いて、本発明の一実施形態に係る細胞の製造方法を具体的に説明するが、本発明は本実施形態に限定されない。装置構成としては、以下の３通りが考えうるが、いずれも本方法に対し、同じ効果をもたらす。
［１］（１）から（４）までの構成を有する装置
［２］（１）（２）（５）の構成を有する装置
［３］（１）から（５）までの構成を有する装置
本実施形態では、第１の流路２０３と第２の流路２０４を備え、第１の流路２０３の壁２０５と第２の流路２０４の壁２０５は孔２０６で連通している流路を用い、第１の細胞の細胞核を有し、第２の細胞の細胞核を有さず、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造する。
［２］（１）（２）（５）の構成を有する装置
［３］（１）から（５）までの構成を有する装置
本実施形態では、第１の流路２０３と第２の流路２０４を備え、第１の流路２０３の壁２０５と第２の流路２０４の壁２０５は孔２０６で連通している流路を用い、第１の細胞の細胞核を有し、第２の細胞の細胞核を有さず、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造する。
第１の工程として、まず、第１の流路２０３にあって、残したい細胞核と、除去したい細胞質と、細胞膜と、を有する第１の細胞と、第２の流路にある中間体を、流路中の溶液の流れによって、両方の流路の壁を貫通して設けられた孔の入り口を構成する第１の細胞設置部３０１と第２の細胞設置部３０２近傍に誘導する（図７－１、図１０－１、図１１－１、図１２－１）。必要に応じて交流電界を発生させ、その中で細胞を誘導してもよい。流路の壁２０５は絶縁体で構成されるのが好ましい。溶液は、細胞を生きた状態で操作できるものであれば特に限定されず、例えば生理食塩水や細胞培養用培地などを例示できる。中間体は特に限定されず、対になった細胞と融合して細胞の細胞質を受け入れられるものであればよいが、具体的な例としては、細胞やリポソームが例示できる。細胞である場合、第１の細胞または第２の細胞と同じ種類であっても異なる種類であってもよい。孔２０６の形状は特に限定されず、スリット状、円状、長円状であってもよく、壁２０５の厚みと同じ深さを有するため、厚い壁２０５の場合は流路状であってもよい。
第２の工程として、誘電泳動力により、孔２０６を挟んで第１の細胞と中間体の第１の対を形成させる（図７－１、図１０－１、図１１－１、図１２－１）。誘電泳動力は、交流印加による電界集中により流路の壁で生じる。
第３の工程として、第１の対に電圧を印加することで、第１の細胞と中間体とを融合して第１の融合細胞を作製する (図７－１、図１０－１、図１１－１、図１２－１)。この時印加する電圧は、従来細胞融合に用いられることが知られている強さとすることができるが、０．１～５０Ｖであることが好ましく、０．５Ｖ～２０Ｖであることがより好ましく、１～１０Ｖであることがさらに好ましく、１～３Ｖであることがさらに好ましく、約２Ｖであることがさらに好ましい。また印加する時間は、特に限定されないが、１μｓｅｃ～１ｍｓｅｃであることが好ましく、１μｓｅｃ～５００μｓｅｃであることがより好ましく、１μｓｅｃ～１００μｓｅｃであることがさらに好ましいが、可能な限り短い時間であることがより好ましい。中間体が細胞である場合、本工程では、細胞融合後、第１の細胞と中間体の細胞質がお互いに混入する。
第４の工程として、第１の細胞の細胞質を中間体へ移動させる（図７－２、図１０－２、図１１－２、図１２－２）。この工程では、シリンジ２１０を引くことによって生じる吸引力によって、第１の流路２０３内と第２の流路２０４内において、第１の細胞供給部２０１と第２の細胞供給部２０２から共通流路２０９への流れが生じる。そして、第１の流路２０３内の流れの一部が、孔２０６を通って第２の流路２０４内へ流れる交差せん断流となる。この交差せん断流が、第１の細胞の細胞質が中間体の細胞質へ移る原動力となる。移動させる細胞質の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
第５の工程として、細胞質が導入された中間体の細胞は、第２の流路２０４内の流れにより、第１の細胞から切り離され、第２の流路２０４および共通経路２０９を通って、シリンジ２１０に回収される
このように、本実施形態では、第１の工程から第５の工程までの工程において、第２の細胞供給部２０４から供給される中間体を用いることにより、第１の細胞の細胞質を除去することができる。なお、第１の工程から第５の工程において、装置が（３）から（５）に記載の好ましい構成を少なくとも一つ備えること、すなわち、第１の細胞設置部３０１においてｈ１＜ｈ２および／またはθ１＜θ２であること、および／または第２の細胞設置部３０２においてｈ３＜ｈ４および／またはθ３＜θ４であること、および／または各流路内での抵抗増加のための構成が設けられていることにより、安定的な交差せん断流が生じ、不要な逆流の発生を抑制でき、安定的に、効率的に、細胞質除去を成立させることができる（図６－１；図８と図９の左図）。例えば、交差せん断流を安定させることによって、第１の細胞を、第１の細胞設置部３０１の第１の細胞供給部２０１側の斜面に沿って孔２０６に誘導し易くし、孔２０６上で安定して保持できるようにする。さらに、交差せん断流が孔２０６を通過するときには、細胞質の移入を容易にし、その後、第２の流路２０３内へ入ることによって、中間体の細胞を第２の細胞設置部３０２から容易に引き離すことができるようにする。
このように、本実施形態では、第１の工程から第５の工程までの工程において、第２の細胞供給部２０４から供給される中間体を用いることにより、第１の細胞の細胞質を除去することができる。なお、第１の工程から第５の工程において、装置が（３）から（５）に記載の好ましい構成を少なくとも一つ備えること、すなわち、第１の細胞設置部３０１においてｈ１＜ｈ２および／またはθ１＜θ２であること、および／または第２の細胞設置部３０２においてｈ３＜ｈ４および／またはθ３＜θ４であること、および／または各流路内での抵抗増加のための構成が設けられていることにより、安定的な交差せん断流が生じ、不要な逆流の発生を抑制でき、安定的に、効率的に、細胞質除去を成立させることができる（図６－１；図８と図９の左図）。例えば、交差せん断流を安定させることによって、第１の細胞を、第１の細胞設置部３０１の第１の細胞供給部２０１側の斜面に沿って孔２０６に誘導し易くし、孔２０６上で安定して保持できるようにする。さらに、交差せん断流が孔２０６を通過するときには、細胞質の移入を容易にし、その後、第２の流路２０３内へ入ることによって、中間体の細胞を第２の細胞設置部３０２から容易に引き離すことができるようにする。
第６の工程として、第１の細胞に移植したい細胞質と、必要のない細胞核を有する第２の細胞を、孔の入り口を構成する、第２の細胞設置部３０２近傍に誘導する (図７－３、図１０－３、図１１－３、図１２－３)。必要に応じて交流電界を発生させ、その中で細胞を誘導してもよい。そして、誘電泳動力により、孔を挟んで第１の細胞と第２の細胞の第２の対を形成させる (図７－３、図１０－３、図１１－３、図１２－３)。誘電泳動力は、交流印加による電界集中により流路の壁２０５で生じる。
第７の工程として、第２の対に電圧を印加することで第１の細胞と第２の細胞を融合して第２の融合細胞を作製する (図７－３、図１０－３、図１１－３、図１２－３)。この時印加する電圧は、従来細胞融合に用いられることが知られている強さであればよいが、１～１０Ｖであることが好ましく、２Ｖであることがさらに好ましい。また印加する時間は、１００μｓｅｃであることが好ましく、１００μｓｅｃ以下で可能な限り短い時間であることがさらに好ましい。
第８の工程として、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ移動させる (図７－４、図１０－４、図１１－４、図１２－４)。この工程では、シリンジ２１０を押すことによって生じる吐出力によって、第１の流路２０３内と第２の流路２０４内において、共通流路２０９から第１の細胞供給部２０１と第２の細胞供給部２０２への流れが生じる。そして、第２の流路２０４内の流れの一部が、孔を通って第１の流路２０３内へ流れる交差せん断流となる。この交差せん断流が、第２の細胞の細胞質が第１の細胞の細胞質へ移る原動力となる。移動させる細胞質の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
第９の工程として、第１の細胞を、第２の細胞から切り離す (図７－４、図１０－４、図１１－４、図１２－４)。
このように、本実施形態では、第６の工程から第９の工程までの工程によって、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入することができる。なお、第６の工程から第９の工程において、装置が（３）から（５）に記載の好ましい構成を備えること、すなわち、第１の細胞設置部３０１においてｈ１＜ｈ２および／またはθ１＜θ２であること、および／または第２の細胞設置部３０２においてｈ３＜ｈ４および／またはθ３＜θ４であること、および／または各流路内での抵抗増加のための構成が設けられていることにより、安定的な交差せん断流が生じ、不要な逆流の発生を抑制でき、安定的に、効率的に、細胞質導入を成立させることができる（図６－２；図８と図９の左図）。例えば、交差せん断流を安定させることによって、第２の細胞を、第２の細胞設置部３０２の第２の細胞供給部２０２側の斜面に沿って孔に誘導し易くし、孔２０６上で安定して保持できるようにする。さらに、交差せん断流が孔２０６を通過するときには、細胞質の移入を容易にし、その後、第１の流路２０３内へ入ることによって、第１の細胞を第１の細胞設置部３０１から容易に引き離すことができるようにする。
さらに、第１０の工程として、シリンジ２１０を押し続けることにより、第２の細胞の細胞質と第１の細胞の細胞核を持つ第１の細胞を第３の流路２０７へ導入し、細胞回収部２０８へ移動させることができる。
そして、第１１の工程として、第２の細胞の細胞質と第１の細胞の細胞核を持つ第１の細胞を細胞回収部２０８から回収する。このように、第１０の工程と第１１の工程で、第２の細胞の細胞質を有する第１の細胞を流路から回収することができる。
本方法において、第１の細胞と第２の細胞の細胞種は特に限定されないが、第１の細胞は体細胞であることが好ましく、線維芽細胞または血球細胞であることがさらに好ましい。また、第２の細胞は幹細胞であることが好ましく、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、骨格筋幹細胞からなる群から選択されるのがさらに好ましい。第１の細胞は体細胞とし、第２の細胞を幹細胞とすることにより、例えば、幹細胞の細胞核を体細胞の細胞核に交換したことと同様の効果が得られる。
本実施例では、図２および図３に示した構成を有する装置を用い、Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞質を、細胞質を除去した別のｉＰＳ細胞内へ移植した。具体的に用いた各機器と条件は、以下の通りである。
・ファンクションジェネレーター
交流印加条件：周波数１ＭＨｚ、電圧５Ｖ
パルス印加条件：時間１００μｓ、電圧１０Ｖ
・デジタルオシロスコープ
・バイポーラ電力増幅装置
・位相差・蛍光顕微鏡
また、蛍光染色試薬は、以下のものを用いた。なお、Calcein、Calcein Red-Orange、Hoechst 33342はそれぞれ、細胞質を緑色に、細胞質を赤色に、細胞核を青色に染色する。
交流印加条件：周波数１ＭＨｚ、電圧５Ｖ
パルス印加条件：時間１００μｓ、電圧１０Ｖ
・デジタルオシロスコープ
・バイポーラ電力増幅装置
・位相差・蛍光顕微鏡
また、蛍光染色試薬は、以下のものを用いた。なお、Calcein、Calcein Red-Orange、Hoechst 33342はそれぞれ、細胞質を緑色に、細胞質を赤色に、細胞核を青色に染色する。
・Calcein, AM - Special Packaging (Excitation/Emission (nm): 494/514 C3100MP、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ・米国)
・CellTraceTM Calcein Red-Orange, AM - Special Packaging (Excitation/Emission (nm): 577/590、C34851、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)
・CellstainR Hoechst 33342 solution (Excitation/Emission (nm): 350/461、346-07951、(株)同仁化学研究所、東京・日本)
Ｊｕｒｋａｔ細胞懸濁液（１ｘ１０６個／ｍＬ、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）とｉＰＳ細胞懸濁液（１ｘ１０６個／ｍＬ、ＳｔｅｍＦｉｔＡＮ０６）を１ｍＬずつ２本の１５ｍＬ遠心管に加え、一方の遠心管ＡにCalcein AM １μＬ、もう一方の遠心管ＢにはCalcein red-orange １μＬとHoechst33342 １μＬを加えて、３７℃で３分間インキュベーションして細胞質と細胞核を染色した。余分な染色試薬を除くため、遠心管をそれぞれ６００ｒｐｍと１０００ｒｐｍで２分間遠心した後、上清を除去した。
・CellTraceTM Calcein Red-Orange, AM - Special Packaging (Excitation/Emission (nm): 577/590、C34851、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)
・CellstainR Hoechst 33342 solution (Excitation/Emission (nm): 350/461、346-07951、(株)同仁化学研究所、東京・日本)
Ｊｕｒｋａｔ細胞懸濁液（１ｘ１０６個／ｍＬ、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）とｉＰＳ細胞懸濁液（１ｘ１０６個／ｍＬ、ＳｔｅｍＦｉｔＡＮ０６）を１ｍＬずつ２本の１５ｍＬ遠心管に加え、一方の遠心管ＡにCalcein AM １μＬ、もう一方の遠心管ＢにはCalcein red-orange １μＬとHoechst33342 １μＬを加えて、３７℃で３分間インキュベーションして細胞質と細胞核を染色した。余分な染色試薬を除くため、遠心管をそれぞれ６００ｒｐｍと１０００ｒｐｍで２分間遠心した後、上清を除去した。
沈殿した細胞に対して、細胞融合用緩衝液（２００ｍＭソルビトール、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン）１ｍＬを加えて細胞を懸濁した。再び遠心管を上記と同条件で遠心して、細胞を沈殿させ、上清を１ｍＬ除去した。この細胞洗浄工程をさらに２回繰り返した。最後に、細胞融合緩衝液を１５０μＬ加えて細胞を懸濁し、細胞融合用細胞懸濁液とした。以下、図１１の写真を参考にしながら、各工程を説明する。
＜細胞融合１回目＞
図２および図３に示した装置上の第１の細胞供給部２０１へ遠心管Ａの細胞懸濁液（細胞Ａ含有）を加え、第２の細胞供給部２０２へ遠心管Ｂの細胞懸濁液（細胞Ｂ含有）を加えた。ポンプとしてピペットマンを用い、細胞を細胞供給口から第１の流路２０３および第２の流路２０４へ移動させると、各細胞を、細胞設置部近傍へ容易に移動させることができた（図１３－１）。
図２および図３に示した装置上の第１の細胞供給部２０１へ遠心管Ａの細胞懸濁液（細胞Ａ含有）を加え、第２の細胞供給部２０２へ遠心管Ｂの細胞懸濁液（細胞Ｂ含有）を加えた。ポンプとしてピペットマンを用い、細胞を細胞供給口から第１の流路２０３および第２の流路２０４へ移動させると、各細胞を、細胞設置部近傍へ容易に移動させることができた（図１３－１）。
交流印加による誘電泳動力により細胞Ａを第１の細胞設置部３０１へ導き、また、細胞Ｂを第２の細胞設置部３０２へ導き、孔を挟んで細胞ＡとＢの対を形成させた。図１３－１に位相差、図１３－２と図１３－３に蛍光視野の画像を示す。そして、パルスを１回以上印加しながら、パルス印加過程を位相差と蛍光視野で観察して、細胞融合による蛍光色素の移動を確認した（図１３－４と図１３－５）。
＜細胞核の回収＞
交流印加を停止して、ピペットマン２１０によって吸引し、細胞Ａの細胞質を細胞Ｂへ移動させた（図１３－７）。引き続きピペットマン２１０によって吸引し、細胞Ａから細胞Ｂを分離した（図１３－８）。細胞Ａを第１の細胞設置部３０１でさらに安定的に保持するため再び交流を印加することで、細胞Ａの核を孔に維持した（図１３－８）。
交流印加を停止して、ピペットマン２１０によって吸引し、細胞Ａの細胞質を細胞Ｂへ移動させた（図１３－７）。引き続きピペットマン２１０によって吸引し、細胞Ａから細胞Ｂを分離した（図１３－８）。細胞Ａを第１の細胞設置部３０１でさらに安定的に保持するため再び交流を印加することで、細胞Ａの核を孔に維持した（図１３－８）。
＜細胞融合２回目＞
再びピペットマン２１０で細胞を吸引し、別の細胞Ｂを第２の細胞設置部３０２近傍へ導いた。交流印加による誘電泳動力により細胞Ｂを第２の細胞設置部３０２へ導いて、孔を挟んで細胞ＡとＢの対を形成させた。図１３－１に位相差、図１３－９と図１３－１０に蛍光視野の画像を示す。そして、パルスを１回以上印加しながら、パルス印加過程を位相差と蛍光視野で観察し、細胞融合による蛍光色素の移動を確認した（図１３－１１）。
再びピペットマン２１０で細胞を吸引し、別の細胞Ｂを第２の細胞設置部３０２近傍へ導いた。交流印加による誘電泳動力により細胞Ｂを第２の細胞設置部３０２へ導いて、孔を挟んで細胞ＡとＢの対を形成させた。図１３－１に位相差、図１３－９と図１３－１０に蛍光視野の画像を示す。そして、パルスを１回以上印加しながら、パルス印加過程を位相差と蛍光視野で観察し、細胞融合による蛍光色素の移動を確認した（図１３－１１）。
＜細胞質の移植＞
交流印加を停止して、ピペットマン２１０で押圧し、細胞Ａへ細胞Ｂの細胞質を移動させた（図１３－１３）。そしてピペットマン２１０で押圧し続け、細胞Ａを細胞Ｂから分離した（図１３－１４）。分離した細胞Ａは、第３の流路２０７を経て細胞回収部２０８へ移動し、細胞Ａは細胞回収部２０８から流路外へ回収可能となった。これにより、細胞Ａの細胞核は、細胞質との関係において、細胞Ｂの細胞質内へ移植したのと同様の効果が得られた。
交流印加を停止して、ピペットマン２１０で押圧し、細胞Ａへ細胞Ｂの細胞質を移動させた（図１３－１３）。そしてピペットマン２１０で押圧し続け、細胞Ａを細胞Ｂから分離した（図１３－１４）。分離した細胞Ａは、第３の流路２０７を経て細胞回収部２０８へ移動し、細胞Ａは細胞回収部２０８から流路外へ回収可能となった。これにより、細胞Ａの細胞核は、細胞質との関係において、細胞Ｂの細胞質内へ移植したのと同様の効果が得られた。
１０１ 孔
１０２ 壁
２０１ 第１の細胞供給部
２０２ 第２の細胞供給部
２０３ 第１の流路
２０４ 第２の流路
２０５ 壁
２０６ 孔
２０７ 第３の流路
２０８ 細胞回収部
２０９ 共通経路
２１０ ポンプ
２１１ 電極
２１２ 直流交流信号発生装置
２１３ 電力増幅器
２１４ 開口部
３０１ 第１の細胞設置部
３０２ 第２の細胞設置部
３０３ 中心面
３０４ 第１の斜面
３０５ 第２の斜面
３０６ 第３の斜面
３０７ 第４の斜面
５０１ 第１の流路の抵抗体
５０２ 第２の流路の抵抗体
１０２ 壁
２０１ 第１の細胞供給部
２０２ 第２の細胞供給部
２０３ 第１の流路
２０４ 第２の流路
２０５ 壁
２０６ 孔
２０７ 第３の流路
２０８ 細胞回収部
２０９ 共通経路
２１０ ポンプ
２１１ 電極
２１２ 直流交流信号発生装置
２１３ 電力増幅器
２１４ 開口部
３０１ 第１の細胞設置部
３０２ 第２の細胞設置部
３０３ 中心面
３０４ 第１の斜面
３０５ 第２の斜面
３０６ 第３の斜面
３０７ 第４の斜面
５０１ 第１の流路の抵抗体
５０２ 第２の流路の抵抗体
Claims (12)
- 第１の細胞の細胞核を有し、前記第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造装置であって、
第１の細胞供給部と、
第２の細胞供給部と、
前記第１の細胞供給部に接続する直線状の第１の流路と、
前記第２の細胞供給部に接続し、前記第１の流路に平行な直線状の第２の流路と、
前記第１の流路と前記第２の流路を隔てる壁に設けられ、前記第１の流路と前記第２の流路を繋ぐ孔と、
前記第１の流路側の壁に前記孔を囲むように設けられた凹形状の第１の細胞設置部と、
前記第１の流路内に設けられ、前記第１の流路に開口する開口部を有する第３の流路と、
前記第３の流路に接続する細胞回収部と、
前記第１の流路と前記第２の流路が、それぞれ前記第１の細胞供給部と前記第２の細胞供給部の逆側の端で合一して構成される共通流路と、
前記共通流路が、前記第１の流路と前記第２の流路の逆側の端に接続するポンプと、
前記孔に対して電圧を印加するための直流交流信号発生装置と、
を有し、
前記凹形状の第１の細胞設置部は第１の縁を有し、前記壁の中心面に対して、前記第１の流路を流れる液体の流れに対して第１の縁の最も近い点と最も遠い点からの垂線の長さをそれぞれｈ１およびｈ２とするとき、それらの長さの関係がｈ１＜ｈ２であり、
前記第１の流路を流れる前記液体の流れは、前記壁の前記中心面に平行な、前記第１の細胞供給部から前記共通流路への方向の直線状の流れである、製造装置。 - 前記第１の縁の最も近い点から前記孔にいたる前記第１の縁の最も近い点から前記孔にいたる第１の斜面と前記第１の縁の最も遠い点から前記孔にいたる第２の斜面が、それぞれ第１の直線部分および第２の直線部分を有し、前記中心面に対する前記第１の直線部分および第２の直線部分の傾きを、それぞれθ１及びθ２とするとき、θ１＜θ２である、請求項１に記載の製造装置。
- 前記第２の流路側の壁に前記孔を囲むように設けられた凹形状の第２の細胞設置部を有する、請求項１又は２に記載の製造装置。
- 前記凹形状の第２の細胞設置部は第２の縁を有し、前記壁の中心面に対して、前記第２の流路を流れる液体の流れに対して第１の縁の最も遠い点と最も近い点からの垂線の長さをそれぞれｈ３およびｈ４とするとき、それらの長さの関係がｈ３＜ｈ４であり、
前記第２の流路を流れる前記液体の流れは、前記壁の前記中心面に平行な、前記共通流路から前記第２の細胞供給部への方向の直線状の流れである請求項３に記載の製造装置。 - 前記第２の縁の最も遠い点から前記孔にいたる第３の斜面と前記第２の縁の最も近い点から前記孔にいたる第４の斜面が、それぞれ第３の直線部分および第４の直線部分を有し、前記中心面に対する前記第３の直線部分および第４の直線部分の傾きを、それぞれθ３及びθ４とするとき、θ３＜θ４である、請求項４に記載の製造装置。
- 第１の細胞の細胞核を有し、前記第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造装置であって、
第１の細胞供給部と、
第２の細胞供給部と、
前記第１の細胞供給部に接続する直線状の第１の流路と、
前記第２の細胞供給部に接続し、前記第１の流路に平行な直線状の第２の流路と、
前記第１の流路と前記第２の流路を隔てる平面上の壁に設けられ、前記第１の流路と前記第２の流路を繋ぐ孔と、
前記第１の流路内に設けられ、前記第１の流路に開口する開口部を有する第３の流路と、
前記第３の流路に接続する細胞回収部と、
前記第１の流路と前記第２の流路が、それぞれ前記第１の細胞供給部と前記第２の細胞供給部の逆側の端で合一して構成される共通流路と、
前記共通流路が、前記第１の流路と前記第２の流路の逆側の端に接続するポンプと、
前記孔に対して電圧を印加するための直流交流信号発生装置と、
を有し、
、および／または
前記第１の流路を流れる液体の流れは、前記壁の中心面に平行な、前記第１の細胞供給部から前記共通流路への方向の直線状の流れであって、前記第１の流路内において、前記孔と前記共通流路側の端との間で、前記第１の流路が前記壁と逆側において狭くなっている、および／または前記第２の流路を流れる液体の流れは、前記壁の前記中心面に平行な、前記共通流路から前記第２の細胞供給部への方向の直線状の流れであって、前記第２の流路内において、前記第２の細胞供給部側の端と前記孔との間で、前記第２の流路が前記壁と逆側において狭くなっている、製造装置。 - 前記第１の流路において、前記壁と逆側に第１の抵抗体が設置されることによって前記第１の流路が前記壁と逆側において狭くなっている、請求項６に記載の製造装置。
- 前記第２の流路において、前記壁と逆側に第２の抵抗体が設置されることによって前記第２の流路が前記壁と逆側において狭くなっている、請求項６に記載の製造装置。
- 第１の細胞の細胞核を有し、前記第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造装置であって、
第１の細胞供給部と、
第２の細胞供給部と、
前記第１の細胞供給部に接続する直線状の第１の流路と、
前記第２の細胞供給部に接続し、前記第１の流路に平行な直線状の第２の流路と、
前記第１の流路と前記第２の流路を隔てる壁に設けられ、前記第１の流路と前記第２の流路を繋ぐ孔と、
前記第１の流路側の壁に前記孔を囲むように設けられた凹形状の第１の細胞設置部と、
前記第１の流路内に設けられ、前記第１の流路に開口する開口部を有する第３の流路と、
前記第３の流路に接続する細胞回収部と、
前記第１の流路と前記第２の流路が、それぞれ前記第１の細胞供給部と前記第２の細胞供給部の逆側の端で合一して構成される共通流路と、
前記共通流路が、前記第１の流路と前記第２の流路の逆側の端に接続するポンプと、
前記孔に対して電圧を印加するための直流交流信号発生装置と、
を有し、
前記凹形状の第１の細胞設置部は第１の縁を有し、前記壁の中心面に対して、前記第１の流路を流れる液体の流れに対して第１の縁の最も近い点と最も遠い点からの垂線の長さをそれぞれｈ１およびｈ２とするとき、それらの長さの関係がｈ１＜ｈ２であり、
前記第１の流路を流れる前記液体の流れは、前記壁の前記中心面に平行な、前記第１の細胞供給部から前記共通流路への方向の直線状の流れであって、第１の流路内において、前記孔と前記共通流路側の端との間で、前記第１の流路が前記壁と逆側において狭くなっているか、および／または前記第２の流路を流れる液体の流れは、前記壁の前記中心面に平行な、前記共通流路から前記第２の細胞供給部への方向の直線状の流れであって、前記第２の流路内において、前記第２の細胞供給部側の端と前記孔との間で、前記第２の流路が前記壁と逆側において狭くなっている、製造装置。 - 前記第１の縁の最も近い点から前記孔にいたる第１の斜面と前記第１の縁の最も遠い点から前記孔にいたる第２の斜面が、それぞれ第１の直線部分および第２の直線部分を有し、前記中心面に対する前記第１の直線部分および第２の直線部分の傾きを、それぞれθ１及びθ２とするとき、θ１＜θ２である、請求項９に記載の製造装置。
- 前記第１の流路において、前記壁と逆側に第１の抵抗体が設置されることによって前記第１の流路が前記壁と逆側において狭くなっている、請求項９または１０に記載の製造装置。
- 前記第２の流路において、前記壁と逆側に第２の抵抗体が設置されることによって前記第２の流路が前記壁と逆側において狭くなっている、請求項９または１０に記載の製造装置。
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| JP2008194029A (ja) | 2007-01-19 | 2008-08-28 | Tosoh Corp | 細胞融合装置及びそれを用いた細胞融合方法 |
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- 2019-08-28 JP JP2019155371A patent/JP7450871B2/ja active Active
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