JPH0290053A - 微生物センサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物センサー　特に生物化学的酸素消費量（
以下ＢＯＤという）の迅速な測定に好適な微生物セ／丈
−九関する。

〔従来の技術及び課題〕

最近、センサーの応用範囲が広がり、種々のセンサーが
開発されている。センサーは、物理センサーと化学セン
サーの２つに大別することができる。物理センサーは、
温度、湿度、圧力等の計測に用いられ、化学センサーは
各種化学物質の計測に使用される。化学センサーの中で
も、分子認識素子に微生物を使用するものは微生物セン
サーと総称されている。

微生物センサーには、種々の種類があるが、好気性微生
物の呼吸性を利用するものであれば酸素の消費に関連す
る物質の濃度の計測に使用でき、例えばＢＯＤの測定に
好適なセンサーとしての使用が考えられる。

ＨＯＤは、水中の好気性微生物によって消費される溶存
酸素の量を言い、有機性物質による水質汚濁の基本的指
標とされるが、従来法によるこのＢＯＤの測定には５日
間という長いインキュベーション時間が必要で、しかも
測定操作も煩雑であシ、得られる値はオペレーターの技
術に依存するといわれている。

以前よシ、微生物センサーを利用し、ＢＯＤを短時間で
測定しようとする試みがなされている〔旧ｏＬ＊ｅｈｎ
ｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ＢＩｏａｎｇｌｎｅａｒｌｎ＋ｒ
。

ｖｏｌ、　ＸＩＸ　、　ｐａｔｒｏｌ　１５３５〜１５
４７（１９７７）　〕。

このセンサーは、ある特定の微生物を多孔性アセチルセ
ルロース膜中に封入し、これを隔膜式酸素電極面に密着
させた構造を有しているものであるが、このセンサーに
用いる微生物は特殊なものに限られる上、このセンサー
を用いて得られたＢＯＤ値は、標準的なりＯＤ測定法（
例えばＪＩＳＫＯ１０２）で求めた値とは一般に一致せ
ずこれらを一致させるためには、両者の関係を示す方程
式を求める必要があり、そのため実用面で難点を有する
ものとなっていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、酸素の消費に関連する物質の濃度の計測
、特にＢＯＤの計測を迅速かつ正確に行う微生物センサ
ーについて鋭意研究を重ねた結果、好気性微生物を付着
させた水不溶性高分子材料と、隔膜式酸素電極を具備し
た微生物センサーを開発し、先に特許出願した（特開昭
６２−２３８４５４号）。

本発明者らは更に、上記微生物センサーの感度を向上妊
せるべく検討を進めた結果、特定の水不溶性高分子材料
は好気性微生物の吸着能が高く、従って極めて感度の良
い微生物センサーが得られることを見出し、本発明を完
成した。

すなわち、本発明は好気性微生物を付着させた水不溶性
高分子材料と隔膜式酸素電極を具備する微生物センサー
において、水不溶性高分子材料がビニルピリジン系単量
体と架橋性単量体とを含有する単量体混合物を難水溶性
無機塩を分散安定剤として懸濁重合し、得られた？リフ
−ビーズ中のピリジル基を更に四級化することにより得
られる、分子中に次の繰返し単位Ｏ） −ＣＨ，−ＣＨ− λ （式中、Ｒは炭素ａ１〜１６のアルキル基、ベンシル基
、フェニルエチル基、フェニルプロピル基又はペンタフ
ルオロフェニルメチル基を示し、Ｘｅは塩素イオン又は
臭素イオンを示す） を有する架橋？リマーピーズであることを特徴とする微
生物センサーを提供するものである。

本発明において用いられる架橋ポリマービーズは、ビニ
ルビリシン系単量体に加えて、ゾピニルベンゼン、エチ
レングリコールゾ（メタ）アクリレート、テトラメチレ
ングリコールゾ（メタ）アクリレート、グリセリントリ
（メタ）アクリレート等の架橋性単量体を用い、水中油
型の懸濁重合によって重合して得た？リマービーズを、
相当する四級化剤を使用して四級化することにより得ら
れる。

一般に、懸濁重合には分散安定剤として、ゼラチン、Ｓ
粉、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセ
ルロース、？リビニルアルコール等の水溶性高分子や炭
酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム等の
難水溶性無機塩等が使用されるが、前者の水溶性高分子
を使用すると得られ之水不溶性高分子材料の表面にそれ
らが強固に残留し、その微生物吸着を妨げるので好まし
くない。

本発明において用いられるビニルビリシン系単量体とし
ては、例えば２−ビニルビリシン、３−ビニルピリジン
、４−ビニルビリシン、２−メチル−５−ビニルビリシ
ン、２−エチル−５−ビニルビリシン、３−メチル−５
−ビニルビリシン、２．３−ゾメｆ　ルー　５−ビニル
ビリゾン、２−メチル−３−エチル−５−ビニルビリシ
ンなどが挙げられる。これらは単独で又は２徨以上混合
して使用される。“また、これらのビニルビリシン類は
他のビニルモノマーと共に用いて共重合させることもで
きるが、これらのピニルモノマートシては、例えばスチ
レン、ビニルトルエン、ビニルナフタレン、クロルスチ
レンなどの芳香族モノビニル化合物；アクリル酸メチル
、メタクリル酸メチル、アクリロニトリル、アクリル酸
エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸エチル、Ｎ−
ｔ−グチルアクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルメタクリル
アミドなどの脂肪族モノビニル化合物を用いることがで
きる。

上記単量体群の中でも、微生物吸着能、センサー感度な
どの点から、４−ビニルビリシンを用いたものが特に好
適である。

懸濁重合を行って得たポリマービーズ中のピリジル基を
、更に四級化するには、公知の種々の四級化剤を利用し
得るが、本発明の目的のためには、特に式（１） ％式％（１） （式中、Ｒは炭素数１〜１６のアルキル基、ベンシル基
、フェニルエチル基、フェニルプロピル基又はペンタフ
ルオロフェニルメチル基を示し、Ｘは塩素原子又は臭素
原子全示す、）のものが好適である。

四級化反応は常法によりおこなわれ、その際の反応条件
も特別の制限はない。

このような処理を施して得られた架＠ｆＭｉマーピーズ
が本発明の微生物センサーに用いることができるが、そ
の粒径は０．０１〜１ｍｍ、特に０．４ｍｍ程度のもの
が好ましい。

本発明の微生物センサーは、上記の架橋？リマービーズ
を水不溶性高分子材料として用いる以外は、はぼ公知の
微生物センサーに準じて構成することができる。

第１図は、本発明の微生物センサーの一実施例を示す図
面であるが、この微生物センサーは好気性微生物を付着
する性質を有する水不溶性高分子材料３を隔膜式酸素電
極１の隔膜２の下方に設置することによって構成されて
いる。

本発明に用いられる隔膜式酸素電極としては、通常陰極
となる白金電極と、陽極となる塩化銀電極を１本のガラ
ス管にまとめ、電極表面を含む下端をテフロン等の隔膜
で被ったもの等が挙げられる。

また、水不溶性高分子材料の設置の具体的方法としては
その如何を問わないが、例えば隔膜式酸素電極１の下部
に、該電極１とほぼ同じ径の貫通孔を有するゴム栓４の
一部を被嵌し、ゴム栓４内側壁及び当該酸素電極１の最
下面とで囲繞空間を形成せしめ、この空間に水不溶性高
分子材料３分光項した後、当該ゴム栓４の下端開口部を
微孔を有するネット状物５にて張設閉止し、当該材料３
を保持固定する方法が簡便で有利である。なお、この場
合なるべく空隙を少なくすることが望ましいが、ことさ
ら力を加えて充填する必要はなく、当該空間に、当該材
料３を満たし、軽く指でおさえる程度でよい。

更に、本発明徴生物センサーの別の態様としては、水不
溶性高分子材料を隔膜式酸素電極と分離して、適宜カラ
ム等の中に充填したものも挙げられる。

次に、以上の如く構成きれる本発明徴生物センサーを用
いたＢＯＤの測定方法につき第１図を例に取り説明する
。

まず、水不溶性高分子材料３に好気性微生物を付着させ
る。その方法としては、まず第１Ｖｃ、第１図に示す如
き本発明の微生物センサーを好気性微生物が存在する液
中に浸漬させることが挙げられる。この浸漬時間は、水
不溶性高分子材料や微生物の種類により異なるが、通常
３時間程度で充分である。又、第１図に示す如き微生物
センサーを組み立てる前に水不溶性高分子材料に好気性
微生物を付着させておいても良い。このためには、好気
性微生物を含有する水中に水不溶性高分子材料を懸濁式
せ、おだやかに攪拌する方法や水不溶性高分子材料を充
填したカラムに好気性微生物を含有する水を循環させれ
ば良い。

次いで、このセンサーをイオン交換水中く出力電流が安
定になるまで浸漬し、安定になったところで測定試料を
添加し、出力電流の値を読み取り、別途予め作成してお
いた検量線によりＢＯＤ値が求められる。

なお、斯かる測定に当っては、例えば第２図に示す如く
、電極１に接続された記録計１１及びスター２−１２を
備えた反応容器１３並びに試料注入器１４より成る測定
キットを用いるのが好ましい。

また、本発明の方法を用いれば、水不溶性高分子材料に
吸着させる微生物の種類を選択することにより、ＢＯＤ
のみならず特定の有機物全定量するために使用する微生
物センサーを得ることができる。例えばシュードモナス
フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｇ　ｆｌｕｏ
ｖｅｓｅｎｇ　）の様にグルコースを選択的に資化する
微生物を吸着固定化すればグルコースセンサーが、父ニ
トロソモナス（Ｎｌ　ｔｒｏａｏｎ＋ｏｎｍｓ　）やニ
トロバクタ−（Ｎ１ｔｒｏｂａｃｔ＠ｒ　）等の硝化菌
を吸着固定化すればアンモニアセンサーが得られる。

〔発明の効果〕

特開昭６２−２３８４５４号に開示の微生物センサーで
は、用いられる水不溶性高分子材料は好気性微生物を付
着するものであれば特に制限はなかった。しかし、本発
明の微生物センサーにおいては、特に好気性微生物吸着
能の高い水不溶性高分子材料を用いるので、微生物セン
サーとしての感度、精度が著しく向上し之。また、微生
物吸着能が高い結果、水不溶性高分子材料に好気性微生
物を担持させるために要する時間が短縮きれ、分析時間
を短縮することが可能となる。

〔実施例〕

次に実施例及び合成例ｔあげて本発明の方法を詳細に説
明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでは
ない。

合成例１ 攪拌装置、コンデンサー　温度計及び窒素導入管を付し
た１ｔの七ノ９ラブルフラスコにリン酸カルシウム２５
Ｆとイオン交換水２００ｔからなるスラリーと、４−ビ
ニルビリシン４２ｔ１ノビニルベンゼン１０．５Ｆ、ク
ロルベンゼン３０？、１−ブタノール２０Ｆおよびアゾ
ビスイソブチロニトリル０．３２からなる溶液を加え、
３００　ｒｐｒｎの速度で攪拌しながら７５℃で５時間
加熱し、重合を行った。

冷却後、得られた？リマービーズをｒ別、次いでエタノ
ールで洗浄した。洗浄稜の？リマービーズをエタノール
１５０　ｆ　トＪ化べ／ゾル６０２とからなる溶液中に
加え、７０℃で５時間加熱した。生成物をｒ別、エタノ
ールで洗浄した後、減圧乾燥した。次いで、０．１Ｎ炭
酸水素ナトＩＪウム水溶液で生成物を洗浄、その後イオ
ン交換水で洗浄し、架橋？リマービーズ（１）を得た。

収量４５２゜生成物は平均粒径４００μｍの球状物であ
った。

合成例２ 合成例１と同様な装置に炭酸カルシウム２５りとイオン
交換水２００ｆとからなるスラリーと４−ビニルビリシ
ン３８．８　Ｆ、ジビニルベンゼン１０．５Ｆ、スチレ
ン５．２Ｆ１　りロルベンゼン３０ｆ、１−ブタノール
２０ｆおヨヒアゾビスイソグチロニトリル０．３１から
なる溶液を加え、合成例１と同様に重合を行った。その
後、合成例１と同様の方法で、臭化ペンシルとの反応お
よび後処理を行ない、架橋〆リマービーズ（２＋を得た
。収量４３Ｐ０生成物は平均粒径３５０μｍの球状物で
あった。

合成例３ 合成例１と同様な方法で合成し九４−ビニルビリシン／
ゾビニルベンゼン共重合体ピーズ４０２をエタノール１
５０Ｆと３−フェニル−・１−ブロモゾロ／９ン７０１
とからなる溶液に加え、７０℃で５時間加熱した。生成
物をｆ別、エタノールで洗浄した後、減圧乾燥した。次
いで、０．ＩＮ炭酸水素す）　ＩＩウム水溶液、イオン
交換水の順に生成物を洗浄し、架橋？リマービーズ（３
）を得た。収量５０ｆ０生底物は平均粒径４００μｍの
球状物であった。

合成例４ 合成例２と同様な方法で合成した４−ビニルピリシン／
スチレン／ジビニルベンゼン共重合体ビーズ４０ｆｆエ
タノール１５０Ｆと臭化メチル３０Ｆとからなる溶液に
加え、１０℃で２４時間反応させた。、反応混合物より
揮発性物質を減圧下除去し、次いで０．１Ｎ炭酸水素ナ
トリウム水溶液、イオン交換水の順に生成物を洗浄し、
架橋？リマービーズ（４）を得た。収量４３ｔ０生成物
は平均粒径４００μｍの球状物であった。

合成例５ リン酸カルシウムスラリーの代りに、？リビニルアルコ
ール（ケン化［８６，５％）ノ０．３％水溶液２００ｆ
を使用し、合成例１と同様の実験を行って、架橋？リマ
ービーズ（５）を得た。

実施例１ 架橋？リマービーズの微生物吸着能の測定＝１００１１
７の三角フラスコに微生物吸着用担体５ｆおよび活性汚
泥処理槽内の懸濁液５０ｄを加え、２５℃で２時間おだ
やかに振とうした。次いで、Ｐ別、生理食塩水による洗
浄、乾燥を行なった後秤量し、重量増加より好気性微生
物の吸着！−を求めた。合成例１〜５でｖ８製した架橋
？リマービーズ（１）〜（５）Ｋついて行った、実験の
結果を表１に示す。

表　　１ 架橋？リマービーズ　　好気性微生物吸着量（ｍｇ７ｙ
レシン）（２）　　　　　　　　　　　　ｊ　１５分散
安定剤として？リビニルアルコールを使用したもの以外
は架橋？リマーピーズ１２あたり１００＃を越える好気
性微生物が吸着した。

実施例２ 第１図に示す微生物センサーの隔膜式酸素電極の隔膜の
下部に水不溶性高分子材料としての架橋？リマービーズ
（１１２００々を充填し、これを活性汚泥処理槽内の懸
濁液に約３時間浸漬して好気性微生物を付着させた。次
いでこれを第２図に示す測定系に組み込んでイオン交換
水（１００ｇ！／）中に浸漬した。そして、液温は３０
℃±１℃に保ち、出力電流のベースラインが安定したと
ころで、注射器１４で試料としてのグルコース・グルタ
ミン酸混合標準液（ＪＩＳ　Ｋ口１０２．ＢＯＤ　２２
０　ｐｐｍに相当）ｉ５ｄ添加した。出力電流は徐々に
減少し、約２５分後に一定値を示した。この値を出力電
流減少量とする。以下これと同様にして標準液の添加量
を変えた場合の出力電流減少量を測定した。測定結果を
まとめて表２及び第３図に示す。

表２ ＢＯＤ（ｐｐｍ）　　　　　出力電流減少値（μＡ）１
　０．５　　　　　　　　　　　　　　０．０９２０　
　　　　　　　　　　　　　　０、ｉ　　５４００．３
３ 実施例３ 架橋？リマービーズ（２）　２００　Ｒｇを用いて実施
例２と同様の実験を行った。結果を表３及び第４図に示
す。ＢＯＤ値と出力電流減少値との間には良好な直線的
な相関関係が認められた。

し゛１下余白 表３ ＢＯＤ（ｐｐｍ）　　　　　　出力電流減少値（μＡ）
１　０．５　　　　　　　　　　　　　　　０．０　９
２０　　　　　　　　　　　　　　　　０．１　９４　
０　　　　　　　　　　　　　　　　０．３５６０　　
　　　　　　　　　　　　　　　０．５５実施例４ 加架？リマーピーズ（３）を２００■用いて実施例２と
同様の実験を行った。結果を表４及び第５図に示す。Ｂ
ＯＤ値と出力電流減少値との間には良好な直線的な相関
関係が認められた。

以下余白 表４ ＋　　０．５　　　　　　　　　　　　　０．０　９２
　０　　　　　　　　　　　　　　　０．１　９４　０
　　　　　　　　　　　　　　０．３　６実施例５ 架橋？リマーピーズ（４）　２００　ｍｆｌ用いて実施
例２と同様の実験を行った。結果を表５及び第６図に示
す。ＢＯＤ値と出力電流減少値との間には良好な直線的
な相関関係が認められた。

表５ ＢｏＤ（ｐｐｒＱ）　　　　　　出力電流減少値（μＡ
）１　０．５　　　　　　　　　　　　　　０．０８２
　０　　　　　　　　　　　　　　　　０、ｉ　　７４
　０　　　　　　　　　　　　　　　　０．３０６　０
　　　　　　　　　　　　　　　　　０．４　５実施例
６ Ｎ６に：示す組成で合成下水を調製した。このものを希
釈した液のＢＯＤ　ｉ実施例２〜５で作製した微生物セ
ンサーで測定した。又同じ濃度の合成下水を用いて、Ｊ
ＩＳＫＯ１０２の方法に従ってＢＯＤを求めた。この時
の温度は２０’Ｃ±１℃であった。その結果も、本発明
の微生物センサーを用いて求めた値と共に表７に示す。

この表から明らかなように、本発明の微生物センサーを
用いて求め九ＢＯＤ値とＪＩＳの方法で求められたＢＯ
Ｄ値とは、はぼ−致し、本発明の微生物センサーは、Ｂ
ＯＤの迅速測定方法全可能にすることがわかる。

表６ 合成下水の組成 以下余白 以下余白 実施例７ 架橋？リマーピーズ（１）の２００１ｎｆｌを隔膜式酸
素電極の隔膜の下部に充填し、これを酵母（ｍａｃｃｂ
ａｒｏｎｏｙｅｅｓ　ｅａｒマ１ｍ１ｍ５　）の懸濁液
に約３時間浸漬して酵母を付着させた。次いでこれを第
２図に示す測定系に組み込んでイオン交換水中に浸漬し
た。そして、液温Ｖｉ３０℃±１℃に保ち、出力電流の
ベースラインが安定したところで、注射器１４で試料と
してのグルコースを添加した。出力電流は徐々に減少し
、約２５分後に一定値を示した。以下、これと同様にし
て、グルコース濃度を変化させた場合の出力電流減少量
を測定した。出力電流値が一定するまでには、試料添加
後３０分くらいを要した。また、同一条件で３回実験を
行ったが、再現性もあることが確認された。測定結果は
表８及び第７図に示すが、グルコース濃度と出力電流減
少量との間には相関関係が認められた。このことは、本
発明のセンサーがグルコースセンサーとしても有用でる
ることを示している。

Ｏ＋１２ ８．２６ ０．３７ 比較例１ 架橋？リマービーズ（５）２００■を使用して、実施例
２と同様の実験を行った。結果を表９に示す。ＢＯＤ値
と出力電流減少値との闇には相関が認められるものの、
第８図に示す如く、検量線の傾きは小きく、ＢＯＤセン
サーとしての感度は低いといえる。これはぼりビニルア
ルコールを分散安定剤として使用して調製した架橋？リ
マービーズ（５）の好気性微生物吸着能が不足している
ためと考えられる。

表９ ＢＯＤ（ｐｐｍ）　　　　　出力電流減少値（μＡ）１
　０．５　　　　　　　　　　　　　　０，０１　５２
０　　　　　　　　　　　　　　　０．０５０４０　　
　　　　　　　　　　　　　０．０７５６　　Ｑ　　　
　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，１５比較例２ 比較例１で作製し次センサーを用いて、実施例６と同様
に合成下水のＢＯＤを測定し、ＪＩＳ　Ｋｏ　１０２法
による測定結果と比較した。

結果を表１０に示す。

表１０ＢＯＤ測定値（ｐｐｒｎ） １／２００　　　　　４０ １／４００　　　　　１　７ １／８００　　　　　８ 微生物センサーによる測定値とＪＩＳ　ＫＯ１０２によ
る測定値との間には、実施例６における結果と比べ、有
意な差が見られた。この差異は合成下水の濃度が高いほ
ど大きい。これは？リビニルアルコールを分散安定剤と
して使用して調製した架橋？リマービーズ（５）の好気
性微生物吸着能が不足しているためと考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例である微生物センサーの縦断
面図、第２図は本発明微生物センサ・−を含む装置の全
体図、第３図〜第８図は本発明の水不溶性高分子化合物
による検量線を示す図面である。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、好気性微生物を付着させた水不溶性高分子材料と隔
   膜式酸素電極を具備する微生物センサーにおいて、水不
   溶性高分子材料がビニルピリジン系単量体と架橋性単量
   体とを含有する単量体混合物を難水溶性無機塩を分散安
   定剤として懸濁重合し、得られたポリマービーズ中のピ
   リジル基を更に四級化することにより得られる、分子中
   に次の繰返し単位（１）▲数式、化学式、表等がありま
   す▼（１） （式中、Ｒは炭素数１〜１６のアルキル基、ベンジル基
   、フェニルエチル基、フエニルプロピル基又はペンタフ
   ルオロフェニルメチル基を示し、Ｘ＾■は塩素イオン又
   は臭素イオンを示す） を有する架橋ポリマービーズであることを特徴とする微
   生物センサー。 ２、好気性微生物を付着させた水不溶性高分子材料が、
   隔膜式酸素電極の当該隔膜の下方に設置されたことを特
   徴とする請求項第１項記載の微生物センサー。