JPH025875A - ヒトサイトメガロウィルスの構造燐タンパク質（ｐｐ２８）、その製造および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、２８に口のＨＣＭＶ　（ヒトサイトメガロウ
ィルス）構造燐タンパク質（ｐＩ）　２８　）およびこ
のタンパク質の免疫原性の部分、遺伝子操作によるこれ
らの製造、ならびに診断補助物（ａｉｄ）としてのおよ
び抗体およびワクチン製造のための使用、に関する。

今日までのところ、分子量約２８ｋＤのＨＣＭ　Ｖポリ
ペプチドについては、いくつかの研究に記述されてきた
。ＲｏｂｙおよびＧｉｂｓｏｎ　（Ｒｏｂｙ、　Ｃ，お
よびＧｉｂｓｏｎ、　Ｗ：　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、釦、？
＋４−７２７．１９８６）およびＮｏｗａｋら（Ｎｏｗ
ａｋ、　Ｂ−ら：　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　庄、３２５−３
３８、１９８４）は、約２４ｋＯおよび２９ｋＤの燐タ
ンパク質についてそれぞれ記載している。両記載には、
このタンパク質がマトリックス中に位置していることが
示唆されている。Ｐｅｒｅｉｒａら（Ｐｅｒｅｉｒａ、
　Ｌ。

ら：　Ｖ＋ｒｏｌｏｇｙ　Ｌ目、７３−８６．１９８４
）は、糖タンパク質１〕複合体に属する２５ｋＤの糖タ
ンパク質を感染細胞抽出物から沈澱させるモノクローナ
ル抗体について記述している。ｌｒｍｉｅｒｅおよびＧ
　ｉ　ｂｓｏｎ（Ｉｒｍ１ｅｒｅ、　Ａ＋およびＧｉｂ
ｓｏｎ、　Ｗ、：　、１．　Ｖｉｒｏｌ。

註、２７？−２８３，１９８５）は、種々のＨＣＭ　Ｖ
株のＡおよびＢキャプシドの双方に見出された２８ｋＤ
のタンハク質を同定した。Ｒｅら（Ｒｅ、　Ｍ、　Ｃ，
ら：Ｊ。

（”ｓｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　％、２５０？−２５１１
，１９８５）は、モノクローナル抗体Ｐ２Ｇｌ　１　（
ＭＡｂ　　Ｐ２Ｏ３１）を用いて２８ｋＤの構造タンパ
ク質を調べた。これがＰｅｒｅｉｒａら（前出）によっ
て記述されたタンパク質であるかまたはＮｏｗａｋら（
前出ンによって記述されたものであるかは不明のままで
ある。

２８ｋＤの構造タンパク質がほとんど全ての強拍。

性のヒト血清に認められることから、：Ｅた、２８ｋＤ
のタンパク質がｆＩ　ＣＭ　Ｖの主たる免疫原の一つを
含んでいるにちがいないことから、これをコードするＨ
ＣＭＶ遺伝子を同定して単離することが望ましいと思わ
れる。他の目的は、次いて、これをより正確に特徴づけ
するためにこの遺伝子を適当な宿主系で発現させること
、また、可能であれは、これをＨＣＭＶの他の主要な免
疫原として確立させることである。

ＭＡＦ）Ｐ　２Ｇ　ｌ　１　（Ｒｅら、前出）を用イテ
、２８ｋＤの燐タンパク質（ｐ９２８）をコードするＨ
ＣＭＶｃＤＮＡ遺伝子バンククローンを同定して単離す
ることが可能であることが見出された。

今日までのところ、２８ｋＤの大きさの燐燐タンパク質
は開示されていなかった。

遺伝子バンクを作出するために、ヒト包皮線維芽細胞を
）［ＣＭＶ、Ａ６１６９株、で感染させて、感染後９６
〜１２０時間経過してから、ポリ（Ａ）　十−ＲＮＡを
単離して、これをｄｓ４）ＮＡに変換し、これをサイズ
分別することなく市販のファージ発現ベクター人ｇｔｌ
ｌに挿入した。このために、ベクターをＥｃ　ｏＲＩで
切断して、分子内の再連結を抑制するためにアルカリホ
スファターゼ（仔ウシ腸管由来）で処理した。ｃＤＮＡ
を、ＥｃｏＲＩリンカ−の結合によってファージアーム
（ａｒｍｓ）間に挿入して、インビトロでパッケージン
グ（ｐａｃｋａｇｉ　ｎｇ）を行った。このようにして
、１１００ｎのｄｓ−ｃＤＮＡから、約５ｘｌＯ５個の
独立した絹換え体および１８％野生型ファージを含む遺
伝子バンクを得た。

遺伝子バンクのスクリーニングをＹｏｕｎｇおよびＤａ
ｖｉｓ　（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ、およびＤａｖｉｓ、
　Ｒ，Ｗ：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ　ａｌｌ、　１１９４−１１９８゜１９８
３）の方法にて行った。ただし、ホースラデイツシュペ
ルオキシダーゼをプロティンＡに結合させ、検出システ
ムとしては４−クロロ−１−ナフトールを用い、上記の
モノクローナル抗体Ｐ２Ｇ１１を用いる改変を行った。

この免疫スクリーニングにおいて、ニトロセルロース膜
上にあるコロニーを丁寧にインキュベートして、結合し
なかった反応物を除去した後に陽性プラークを上記の改
変検出系を用いて検出する。

ＭＡＩ）Ｐ２Ｇ１’　１による遺伝子バンクのスクリー
ニングにおいて、１５万個の組喚え体λｇｔ１１フアー
ジから、２個の陽性シグナルが得られた。約２７０塩基
対（ｂｐ）が挿入されたクローン１個を更なる特徴づけ
のために選択して精製した。

これはＢ　’Ｕ　ＩＶＩ　Ｌ　−１と称された。

大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｙ　１０８９株を組換えフ
ァージで感染させ、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク
質の合成をイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰ’ＴＧ
）の添加によって誘導した。その結果、β−ガラクトシ
ダーゼ（ｔｔ８ｋＤ）よりも明らかに大きく、λｇＬｌ
ｌに感染した大腸菌細胞には見出せない約１３０ｋＤの
融合タンパク質が形成された。このタンパク質はＢＵＭ
Ｌ−１に感染しているが誘導されない細胞にも存在しな
い。ウェスタンプロット分析では、１３０ｋＤポリペプ
チドのみがＭＡｂＰ２Ｃ；１１と反応した。このように
、■換えクローンＢＵＭＬ−１はＨＣＭＶタンパク質部
分を含む融合タンパク質を合成することが明らかである
。

約２７０　ｂｐのｃＤＮＡ挿入物をここで用いて、ＨＣ
ＭＶタンパク質の遺伝子のウィルスゲノム中ての位置決
めを行った。この目的のために、上記のｃＤＮＡ挿入物
をＨＣＭＶの全ゲノムを含む８個のコスミドクローンと
ハイブリダイズさせた（　Ｂ、　Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅ
ｉｎら：　Ｇｅｎｅ　Ｌｆｌ、３９−４６、＋９８２）
。

Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩフラグメントＰ、ＲおよびＳを含
むコスミトＩ）　ＣＭ　１０５　ＢがｃＤＮＡとハイブ
リダイズした。この領域のより詳細なサザンブロット分
析によって、［（ＣＭＶＤＮＡフラグメントはト１　ｉ
　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　Ｒフラグメント中の左側端の５００
ｂｐのＩ（１）　ｎ　Ｉ　／　Ｓ　ｍ　ａ　１フラグメ
ントに位置することが示されたく第１図）。Ｓｓ　ｔｌ
Ｉ切断部位を用いて、ｃＤＮＡを、第１図に示すゲノム
の位置方向において右側のＫｐｎＩ／Ｓｍａｌフラグメ
ン！・に定めることが可能であった。

ノーザンプロット分析によって、ＢＵＭＬ−１のｃＤＮ
Ａフラグメントは、１．３ｋｂの大きさの後期ｍＲＮＡ
と最も強くハイブリダイズして、ＨｌｎｄＩＩＩＲフラ
グメントの方向から完全に転写されることが認められた
。

１４個のＨＣＭＶ−陽性の血清のうちの無作意に選択し
た１０個は、精製したウィルスに由来するｐ２８と反応
した。同じ血清は、操作された遺伝子によって合成され
た融合タンパク質（ｐ２７１、例１を参照されたい）と
も同様に反応した。

ＨＣＭ　Ｖ粒子をインビトロで燐酸化（Ｃ，Ｒｏｌｅｙ
およびＷ、Ｇｉｂｓｏｎ、前出、と同様の燐酸化）する
と、燐酸化１）２日をＭＡｂＰ２Ｇ１１および融合燐タ
ンパク質１３２７１（例１を参照されたい）に対する抗
体とともに沈澱させることが可能であった。このことは
、クローニングされたタンパク質が燐酸化されているこ
とを示す。従って、これを１）　ｐ　２８と称するもの
とする。

多大な技術的努力によってのみ、診断補助物およびワク
チンの用途に充分な量のｐｐ２８を単離することが可能
であるので、本発明の遺伝子操作による製造法は特に有
用である。真核細胞により発現された産生物のみならず
、細菌の発現産生物も抗原活性を有することが明らかに
なった。細菌は外来性遺伝子から燐タンパク質を生産し
ないので、ｍ菌内で産生されるｒ　ＨＣＭ　Ｖ　Ｉ）　
ｐ　２８　Ｊ、またはその部分、もまた強力な免疫原性
活性を有するとは期待できないとされていた。しかしな
がら、そのようなタンパク質でも真性のＩ）　ｐ　２８
と同様に適当な血清によって明瞭に確認されることがわ
かった。

したがって、本発明は以下のことに関する。

ａ）第１図に示されるＨ、　ＣＭ　ＶのＨｉ　ｎ　ｄ　
ｍ　Ｒフラグメントの左側端のＫｐｎｌ／Ｓｍａｌフラ
クメントの精製単ｆｉＤＮＡ配列、およびその転写産物
、 ｂ）　　この配列の全部または部分を含むＩ）ＮＡ構造
物およびベクター Ｃ）そのようなりＮＡで形質転換された原核細胞または
真核細胞、 ｄ）形質転換のためにこれら細胞によって発現されるポ
リペプチド、またはそれらの部分ｅ）それらのアミノ酸
配列、および診断補助物としてのそれらの使用、 ｆ）　　（ｄ）のポリペプチドに対する抗体、ならびに
受動免疫、診断および該ポリペプチドのｌｌｔ製のため
のそれらの使用、 ｇ）　　（ｅ）の単独または組合せからのペプチドおよ
びアミノ酸配列物を含む、ＨＣＭＶに対するワクチ・ン
、および １１）　　（ｄ）に記載のポリペプチド、またはそれら
の部分、の遺伝子操作による製造法 さらに本発明の態様は、以下の諸例および特許請求の範
囲に定義される通りである。

例１ニブラスミドｐ２７１の構築および発現まず、プラ
スミドｐＨＭ７を、約５００　ｂｐのＫ　Ｉ）　ｎ　［
−５ｍａ　ＩフラグメントをＭ１３ｍｐＨに挿入するこ
とによ′って作出した。プラスミド２７１を、９０Ｍ７
の約５００ｂｐのＥｃｏＲＩ−５ｍａｌフラグメントを
ｐ　Ｅ　Ｘ−２（Ｓｔａｎｌｅｙ。

に、およびＰ、　Ｌｕｚｉｏ：　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ
ｌ　３．１４２９−１４３４、１９８４）に挿入するこ
とによって得る。

１）ＥＸ−１およびｐＥＸ−３への挿入によっては、融
合タンパク質は作出されなかった。このように、プラス
ミドｐ２７１は、Ｃｒｏ／β−ガラクトシダーゼバイブ
リドタンパク質（約１１５ｋ［））と融合したＩ）　ｐ
　２８部分（約１８に口）からなる約１３３ｋＤの融合
タンパク質をコードする。適当な大腸菌株での発現を温
度感受性リプレッサーの熱不活化によって誘導する。大
腸菌ｐｏｐ２１３Ｂ（Ｓｔａｎｌｅｙ、　Ｋ、およびＰ
−Ｌｕｚｉｏ、前出）を３０℃にて菌液濃度０．２〜０
．３（Ａａ。ｎＪになるまで培養して、温度を急激に４
２℃に変えることによって融合タンパク質の合成を誘導
した。４２℃で９０分間保持した後に、細胞を集めて、
既知の方法にてＩ）　Ｉ）　２８タンパク質をＭ製した
。融合タンパク質は、全タンパク質重の約５％であった
。

例２：ｐＩ）２８発現の最適化（ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉ
ｏｎ）以下に述べろ再クローニングによって、（１）融
合タンパク質としてのＩ）　ｐ　２８の発現を全体とし
て向上させること、および（２）融合タンパク質の外来
性部分を減少させること、が可能であった。選択された
出発プラスミドは、Ｉ）　Ｂ　Ｄ　２　Ｉ　Ｃ２０Ｈ（
欧州特許出願ＥＰ第０．２３６，９７８号明細書）であ
った。このように、このプラスミドは、Ｉ）ＥＸ−２と
におけるよりもかなり（６０％以上）短いβ−ガラクト
シダーゼ部分をコードし、誘導はＬａｃプロモーター系
を介してイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＣ）に
よって起きた。

ｐ２７１からのｐ　Ｉ）　２８　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメン
トのクローニングのために、二つの方法を選択した。

１）ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩによってｌ）　２７１を
切断して、ＥｃｏＲＩ突出部をフレノウ（にＩｅｎｏ％
−）フラグメントを用いて埋填した。得られた約５００
　＋ＩＪのフラグメントをｐＢＤ２ＩＣ２０Ｔ（のＳｍ
ａＩ部位に挿入した。得られたプラスミド１）ＣＢＩＯ
のリンカ−領域は、以ｒのようなりＮＡ配列を有してい
る（二本鎖の間接的配列決定によって確認した）。

（Ｓ）　Ｅ　（埋填）　　　　　　　５（ｍ）Ｃｍ （ｊｌ）　　Ｏａ （１）Ｒ工 ＧＡＴＧＳＧＧＡＴＣＣＣ’ニーＡＡττＣＣ：ＡＧＣ
ＴＣＺＣＣＣＧＡＣＣ，、、ＣＣＣＧＧＧ−−−−一−
−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−ａｘ
、５ＯＯｂｐ−−−ＣＴ’、ＡＣ（：ｌ：：Ｔ’ＡＧＳ
ＧＧＴＴＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧ；ＧＣ，ＡＴＧＧ：：
：ＧＧＧＣＣＣｆｒｏｍ　　ｐＢＤ２ＩＣ２０！＞＜　
　ｆｒｏｍ　ｐ　　２７：Ｌ　　　　＞＜　　ｐｐ２８
、、、　　’　　＞Ａ　Ｓ　ｐＧ　１ｙＡ　Ｓ　ｐ　Ｐ
ｒ　ＯＧＹ！′１？ｈ　ｅＧｈ　ｕＬｅ懸Ｌ　■ｒｑＴ
ｈｒ　−４，９ｒ　０Ｇ１ｙ２）　　ｐＢＤ２１ｃ２０
ＨのｌＪンカー領域の解読枠をＢ　ａ　ｍ　ＨＩ部位に
おける埋填によってシフトさせたく−〉プラスミドｐＧ
Ｂ１１）。次いで、ｐ２７１からのＥｃｏＲＩ／５ｔｎ
ａ［フラグメントを、予めＥｃｏＲ１部位を埋填するこ
となく直接にＥｃｏＲＩおよびＮｒｕＩにょ）て切断し
ておいた１）ＧＢＩＩに挿入することが可能になった。

得られたプラスミドＩ）ＧＢ１２のリンカ−領域は、以
下のＤＮＡ配列を有する。

Ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　（５ＮＩＣ（ｍ
　ｒ） ０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ａ　ｕ）
Ｒ（Ｉ　Ｉ） ＣＡＴ（：ＱＣＣＡＴＣＣＡ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　、、、Ｃ（
”：こＧＡ−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋
−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−
−−ｃａ−５００ｂｐ−−−−大腸菌の全抽出物の分画
の後、関連タンパク質の色強度の定番によって、ｐ２７
１によってコードされたタンパク質は、誘導後に全タン
パク質の約５％を占めでおり、一方、ｐＧＢｌｏおよび
ｐＧＢ　１２に対応する値は、−貫して約２０％であっ
たことが明らかになった。ｐＧＢ　１０およびｐＧＢＩ
２でコードされた融合タンパク質中の外来性タンパク質
量がｐ２７１でコードされたものよりも少ないことを考
慮すると、ｐｐ２８発現がｐＧＢｌｏまたはｐａＢｌ　
２（７）使用で約１０倍に増強されることが明らかであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｎＩおよび
ＥｃｏＲＩのＨＣＭＶの物理的ゲノム地図を、Ｈｉｎｄ
ｍＲフラグメントの制限酵素地図と共に示す説明図であ
る。斜線部分は、クローンＢＵＭＬ−１のｃＤＮＡの領
域を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）Ａｄ１６９
   株ゲノムのＨｉｎｄIIIＲフラグメント領域に位置する
   遺伝子またはこの遺伝子の免疫原性部分の発現によって
   得ることができる、 ＨＣＭＶからの分子量約２８ｋＤを有する構造燐タンパ
   ク質（ｐｐ２８）、およびその免疫原性部分。 ２、ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）Ａｄ１６９
   株ゲノムからのＨｌｎｄIIIＲフラグメント内の１．０
   ｋｂＳｍａ I フラグメント上に位置する遺伝子または
   この遺伝子の部分またはそれらに相当する、他のＨＣＭ
   Ｖ株からのフラグメントの発現によって得られるｐｐ２
   ８およびその免疫原性部分。 ３、請求項１または２に記載の、ｐｐ２８をコードする
   遺伝子またはこの遺伝子の部分を含む、ＤＮＡ構造物お
   よびベクター。 ４、請求項３に記載のＤＮＡ構造物またはベクターによ
   って形質転換された原核細胞または真核細胞。 ５、請求項１に記載のｐｐ２８をコードする遺伝子の全
   部または部分を発現させることからなる、ｐｐ２８また
   はその免疫原性部分の調製法。 ６、Ｈｉｎｄ I Ｒフラグメントからの１．０ｋｂＳｍ
   ａ I フラグメントを用いることを特徴とする、請求項
   ５に記載の調製法。 ７、請求項１または２に記載のタンパク質またはそれら
   の部分を含んでなる、診断補助物。 ８、請求項１または２に記載のタンパク質に対するポリ
   クローナルまたはモノクローナル抗体を含んでなる、診
   断補助物。 ９、請求項３に記載のＤＮＡ配列物またはそれらの部分
   またはそれらとハイブリダイズする配列物を含んでなる
   、診断補助物。 １０、請求項１または２に記載のタンパク質またはそれ
   らの部分を含んでなる、ワクチン。 １１、請求項１または２に記載のタンパク質に対する抗
   体を含んでなる、ワクチン。