JPS63267272A - ワクチンとしてのハイブリッドサイトメガロウィルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔従来の技術〕 ベクターとしてサイトメガロウィルス及び該ベクター中
に挿入された対象のエピトープをコードする配列を使用
してのワクチンに関する。このワクチンは主に、ヒトに
関して使用される。

〔発明の背景〕 多くの疾病に関して、その原因は、病原菌の侵入及び増
殖を止めるための免疫系の機能障害である。免疫系は前
の感染に関して記憶力を有するので、この免疫系の応答
は、宿主を弱毒形の病原菌、又はある場合、病原菌の１
又はそれよりも多くの成分又はそのような成分のフラグ
メントに暴露することによって増強され得る。免疫系を
活性化し、そして記憶を刺激することによって、これら
のワクチンは、宿主が感染に対してより急速に応答し、
そして該感染を制限し、従って疾病を妨ぐことを可能に
する。

はとんどの場合、病原菌のタンパク質成分により宿主を
接種することは、強力な長期続く免疫応答を誘発しない
。これは、注入され得る少量のタンパク質の短い半減期
及びそのタンパク質が病原菌に対して示される態様と比
べて、宿主へのそのタンパク質の不自然な提示に起因す
ると思われる。

従って、ワクチンとして弱毒形の病原菌を使用すること
によって免疫応答を増強する方法を見出すことが目標で
ある。しかしながら、抗原が、病原菌からの天然の抗原
の環境に類似する環境に向けられ得ることによる他の手
段も利用可能になって来た。従って、感染性疾病を妨ぐ
ために強力な長期続く免疫応答を提供するであろうワク
チン（ここで抗原が与えられ得る）を調製するための安
全な方法を見出すことに実質的な興味が存在する。

〔関連する文献の説明〕

５ｐａｅｔｅ及びＭｏｃａｒｓｋｉ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ
、（１９８５）５６：１３５；Ｇｅｂａｌｌｅ、血起（
１９８６）５７：８６４　；及びＧｅｂａｌｌｅ　ｆｌ
Ｈ，＋Ｃｅ１ｌ（１９８６）４６：８６５は、サイトメ
ガロウィルスの構造及び発現の性質を記載する。−ａ　
ｔｈｅｎ及び５ｔｉｎｓｋｉ。

Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　（１９８２）４１：４６２　；　Ｍ
ｃＤｏｎｏｕｇｈ及び５ｐｅｃｔｏｒ＋■μ状吐ハ１９
８３）　１２５　：　３１　；　ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ　
１１　旦、　、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ　、　＋（１９８５
）５３ニア１１　；及びＨｕ　ｔｃｈ　１ｎｓｏｎ　ｆ
ｌ　旦、　＋　ｎ皿圏■（１９８６）１５５：Ｉ６０は
、サイドメガロウ４　）Ｌ／　ス（ＣＭＶ）の末端の反
復領域を記載する。Ｐｅｎｎｏｃｋ屋Ｈ＋ｊＭｏｌ　、
Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　（１９８４）　４　：３９９　
；　Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉｆｌ　Ｈ、。

１■１９８５）　５　：３４０３は、バキュロウィルス
及びワタシュアウィルス中への１ａｃＺ遺伝子の挿入を
報告する。ＣＭＶ　（Ｔｏｗｎｅ）は、ワクチンとして
ヒトに試験されて来た（Ｇｌａｚｅｒｒｊ上、、　Ａｎ
ｎ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ。

（１９７８）　９１　：６７６　；　Ｑｕ　１ｎａｎ　
ｆｌ　Ｈ、、前記（１９８４）　１０１　：４７８　；
及びＰｌｏｔｋｉｎ　２＋Ｃ＆、、Ｌａｎｃｅｔ　ｉ　
（１９８４）５２８）　、このウィルスは、感染を潜伏
性にすることができるとは思われない（Ｐｌｏｔｋｔｎ
　＆　Ｈｕａｎｇ＋　　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ。

（１９８５）月滲：３９２）。またアメリカ特許第３，
９５９，４６６号及び第４，０５８，５９８号も参照の
こと。

〔発明の要約〕

新規のサイトメガロウィルスベクター、キメラ構造体及
びワクチン（外来性の読み取り枠が発現のために適切な
調節配列の制御下でＣＭＶの主要β−遺伝子中に挿入さ
れる）が提供される。次に、そのキメラ性ウィルスが、
弱毒ウィルス及び外来性タンパク質の発現による哺乳類
宿主の感染のために使用され、その外来性タンパク質に
対する安全な免疫応答を誘導する。広範囲の種類の病原
菌からのタンパク質が、体液及び細胞保護のための免疫
系の活性化を安全に提供するためにＣＭＶ中に挿入され
得る。

以下余白 〔特定の態様の記載〕 キメラ性サイトメガロウィルスが使用されているワクチ
ンとして特に適用される新規のベクターが提供される。

そのサイトメガロウィルスは、哺乳類宿主中で増殖する
ことができ、工之　　ビトロでの細胞又は組織中におい
て培養することができ、毒性を欠き、そしてウィルスの
増殖を妨げず、そしてウィルスによって感染される場合
、細胞宿主によって発現される、読み取り枠を含んで成
るＤＮＡ配列の挿入によって変性され得る弱毒菌株であ
る。

ヒトに対して感染する弱毒ＣＭνウィルスは、ベクター
として、特にＴｏｗｎｅ及びＡＤ１６９　（Ｅｌｅｋ及
び５ｔｅｒｎ、Ｌａｎｃｅｔ（１９７４）±：　１　；
　ＮｅｆｆｆｌＨ，＋Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ。

旦■し旦１ｏ１−小世よ（１９７９）　１６０：３２）
を使用するために用いられ得、そしてこれらの両者の菌
株は、初期遺伝子（β遺伝子）中への、特にウィルスゲ
ノムのｂ又はｂ’（またＴＲＬ及びＩＲＬとしても言及
される）領域への、より特定には、ウィルスがこの遺伝
子の少なくとも２個のコピーを有する場合、読み取り枠
が挿入される１つの中への読み取り枠の挿入を可能にす
る。その挿入体は、弱毒ＣＭＶに対して内因性の調節領
域により転写及び翻訳調節の制御を提供するために挿入
され得、調節領域がＣＭＶに対して内因性又は外因性で
ある（外因性によっては、ＣＭＶよりも他のものからの
調節領域を意味する）、ウィルス宿主中において機能的
であるそれ自体の調節領域を挿入され得、又は個々に発
現し、又はＣＭＶの内因性タンパク質を有する融合タン
パク質として発現されるために導入され得る。その内因
性タンパク質は、少なくとも１個のアミノ酸、通常少な
くとも３個のアミノ酸及びＣＭＶ内因性タンパク質の完
全なアミノ酸配列まで（及びそれを含む場合もある）を
付与する、Ｎ−末端又はＣ−末端のいづれかを提供する
ことができる。

挿入体は１又はそれよりも多くの遺伝子（ＯＲＦ）を含
み、そしてそれらの遺伝子は同じ源又は異なった源から
のものであり得る。それらの遺伝子はゲノム、ｃＤＮＡ
、合成又はその組合せであることができる。遺伝子は他
の遺伝子に融合され得、又は独立して存在することがで
きる。それらの遺伝子はイントロンを含んでも良く又は
含まなくても良く、ここで該イントロンは、スライシン
グにおける変化を可能にすることができ又はできないか
も知れない。通常、読み取り枠挿入体は、単一のタンパ
ク質をコードするそれぞれの配列のために、少なくとも
８個のアミノ酸（２４個のヌクレオチド；ｎｔ）、より
普通には少なくとも１２個のアミノ酸（３６ｎｔ）　、
普通約１５００個よりも多くないアミノ酸をコードする
であろう。コードされ得るタンパク質の合計数は、普通
１００個を越えず、より普通には約５０個を越えず、一
般的には約１〜１０個の範囲であろう。ＣＭＶベクター
は、約５，０００個のヌクレオチド挿入体に調節するこ
とができる。

多量のＤＮＡが挿入される場合、欠失変異株が他のヘル
ペスウィルスに類似して、使用され得る。約２０ｋｂｐ
まで、通常約１５ｋｂｐまでがウィルスから欠失され得
、そしておよそそれと同等の長さの配列が適切な部位で
導入され得る。

挿入されたＤＮＡによってコードされる生成物は、原核
生物、真核生物、たとえばウィルス、細菌、菌類及びを
椎動物（たとえば霊長類、特にヒト）からのいづれかの
源からであり得る。ウィルスに関しては、免疫応答、た
とえば中和性抗体又は細胞毒性免疫細胞を誘発するであ
ろう、コアタンパク質、エベロープタンパク質、メクレ
オキャブシドタンパク質又は他のタンパク質もしくはそ
のフラグメントを含むことができる病原菌のタンパク質
が特に興味の対象であり；細胞性病原菌のためには、表
面膜タンパク質、特に外部メンバーのタンパク質及び保
護免疫性に関係され得る他のタンパク質が興味の対象で
ある。哺乳類細胞のためには興味のタンパク質は、免疫
の攻撃に対して敏感である、腫瘍状態又は他の疾病状態
に関係されるタンパク質であろう。読み取り枠の源であ
り得る病原菌は、アメリカ特許第４、ｂ７４，３８４号
（第７頁の左欄の始めから第８頁の右欄まで）に記載さ
れ、そしてこれを参照によって明細書に組み込む。

参照によって組み込まれた病原菌の他に、他の対象の病
原菌として、種々のヒトＴ−リンパ栄養性ウィルス、た
とえばｒ、ｎ、ｍ〔ヒト免疫不全！ウィルス（Ｈｍ　）
及び■、パルボウィルス、Ｂ−１９、ヘルヘスウィルス
、ＨＢＬＶ、非Ａ／非Ｂ肝炎ウィルスの因子、又は他の
新規に発見された病原菌を挙げることができる。

病原菌に関連するペプチドをコードし又はそのようなコ
ード領域に無関係な読み取り枠を有する付随物は、特定
の宿主の健康及び機能に関係する広範囲の種類のペプチ
ドをコードする読み取り枠であることができる。これら
の遺伝子は、リンフ才力イン、インターフェロン、コロ
ニー刺激因子、増殖因子、増殖インヒビター又は他の生
理学的なレギュレーターを含むことができる。

読み取り枠挿入体は、いづれか便利な手段によって対象
の領域中に導入され得る。１つの便利な手段は、対象の
領域と実質的に相同の領域を端に有する対象の挿入体を
ＣＭＶ中に有することによる組換えを使用することであ
る。相同性を提供するフランキングセグメントは、それ
ぞれの側に少なくとも約５０ｂｐ、より普通には少なく
とも１００ｂｐ、及び好ましくは約１　、０００ｂｐ　
（通常約５　ｋｂｐ以上でない）の挿入遺伝子を含むで
あろう。Ｌ−成分の−ｂ−配列のもの又は他のものに挿
入を優先的に向けるために、１つの又は両者のフランキ
ング配列を、隣接するＵＬ配列に向かって上配列以上に
延長することができる。それらのフランキング配列は、
ＣＭＶ源において隣接しているか又は隣接していないか
であるが、しかし特定の方向に挿入するために、対象の
領域に存在し、そして所望により適切な方向で存在する
であろう。

便利には、調節シグナルは、ＣＭＶのいづれかの遺伝子
に由来する。好ましくは、選択される調節領域は、高い
効率の転写、特に多くのｍＲＮＡを供給する転写を提供
すべきである。特定の対象の遺伝子は、ＣＭＶ増殖の間
に製造されるポリアデニル化された転写産物として最っ
とも豊富な定常状態で存在する２、　７　ｋｂのｍＲＮ
Ａをコードする初期遺伝子であることによって特徴づけ
られ得る遺伝子である。

１つの又は両者の調節領域は、同じか又は異なったＣＭ
Ｖ遺伝子から得られ、すなわち５′−プロモーター−レ
ギュレーター転写開始領域及び３′−転写終結領域が同
じか又は異なった遺伝子から得られる。所望により、１
つの又は両者の調節領域は、ＣＭＶに対して外因性であ
り、そして該領域が細胞宿主中で機能的であるいづれか
の源に由来する。従って、その開始領域は、他のウィル
ス、たとえば５１ｍ１ａｎウイルス、アデノウィルス又
は乳頭腫ウィルスの遺伝子の開始領域、又は哺乳類細胞
、たとえばアクチン、インターロイキン２又はインター
フェロン遺伝子に関係する調節領域に由来する。

転写開始領域は、ＲＮＡポリマラーゼの結合のための及
び５′−末端のプロセシングのための部位のみならず、
また読み取り枠の発現をも誘導し、そして転写速度を早
める（ここでエンハンサ−はＲＮＡポリマラーゼ結合部
位に近く又は離れて存在することができる）ための、又
はｍＲＮＡのプロセシング、安定性、輸送又は翻訳のた
めの領域も含むことができる。誘導は、温度感受性、代
謝物の存在、又は領域の発現の抑制又は活性化に影響を
もたらすことができる他の化学物質の結果であり得る。

挿入のための構成体は、ＣＭＶ由来のフランキング領域
、細胞宿主中において機能的な転写開始及び終結の調節
領域、及び転写及び翻訳調節領域の制御下での対象の読
み取り枠を含んで成り、ここで前記読み取り枠及び調節
領域は単一の遺伝子又は多くの遺伝子から成り、同じも
のか又は異なったもののいづれかであり、普通異なった
ものである。多くの場合、この構成体は、次の式：％式
％ によって表わされ、ここで配向は、指摘される特定の方
向によって意図されない（但し、ここで配向は実施可能
性のためには必要である）。

ＦＲはフランキング領域を意味し、ここで右下の数字は
構成体の５′又は３′領域を意味し、そしてフランキン
グ領域の５′及び３′領域は異なっていて、フランキン
グ領域のそれぞれは、挿入のために対象の領域からの約
５０ｂｐを含み、所望によりそのフランキング領域の少
なくとも１つは挿入のために対象の特定の領域外の少な
くとも約５ｏｂｐを含み、ここで対象の領域ばくり返え
されるが、しかしＣＭＶに存在する異なったコピーを違
ったふうに端に有し； Ｔｉは、ＲＮＡポリマラーゼ結合部位、いづれかの追加
のプロセシング部位、たとえばキャブピング及びスライ
シング部位を含む転写開始領域を意味し、そして転写又
は転写後の出来事及びエンハンサ−領域の誘導性調節を
提供する追加の領域を含むことができ： ＯＲＦは、対象のポリペプチドをコードする読み取り枠
を意味し、そして翻訳開始及び終結シグナルを含み； Ｔｔは、転写の終結並びにスプライシング、ポリアデニ
ル化及びプロセシングシグナルを提供する天然の遺伝子
のコード領域のすべて又は一部を含むことができる。そ
のＴｉ領域は、いづれかのコード領域を含み、その結果
ＯＲＦはそのようなコード領域と読み枠を整合し、そし
てカルボキシ末端としてＯＲＦを有する融タンパク質を
もたらす。Ｔ　ｔ　Ｎ域は、この領域と通常関連するコ
ード領域のすべて又は一部を含むことができ、その結果
ＯＲＦは、そのようなコード領域と読み枠を合わして整
合し、そしてアミノ末端としてＯＲＦを有する融合タン
パク質を提供する。ある場合、ＯＲＦは、その得られた
タンパク質内のＯＲＦによって、コードされたポリペプ
チドを有する融合生成物を提供するために、同じか又は
異なった遺伝子の一部である２種の異なったコード領域
の間に読み枠を合わして挿入され得る。フランキング領
域は、互配列、特にβ−遺伝子、より特定にはβ−遺伝
子の３′フランキング配列のいづれか一部に由来するこ
とができる。

その挿入はいづれかの配向で、好ましくはβ−遺伝子転
写物の転写の方向で行なわれ得る。

対象の読み取り枠は、ＤＮＡ配列の組合せを用いて、ト
ランスフェクションによって対象の領域中に挿入され、
ここで１つの配列は、損われていないＣＭシベクターＤ
ＮＡを含有し、そして他の配列はフランキング領域によ
って境界とされた発現力セントの少なくとも一部を含む
、好ましくは線状のＤＮＡ構成体を含有する。同時トラ
ンスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法及びグリ
セロールショック法を用いて又はエレクトロポレーショ
ンによって達成され得る。２種のＤＮＡ分子が従来の技
法に従って、挿入体ＯＲＰを端に有する相同領域とＣＭ
Ｖベクターの上配列の領域との間の相同組換えを可能に
する適切な宿主細胞中に導入される。

所望により、ＯＲＦはまた、挿入体く該挿入体は宿主細
胞中において決定した染色体外維持を保つことができて
もよいし又はできなくともよい）を含み、そして発現す
る感染された宿主細胞の選択を可能にする遺伝子も含む
ことができる。従って、選択のための方法を提供するこ
とによって、挿入体を含むＣ？ＩＶにより感染されたこ
れらの宿主細胞が選択されるであろう。選択は、検出可
能なシグナル、たとえば着色された生成物を産生ずる酵
素、抗体又は他のタンパク質によって検出され得る表面
膜タンパク質、又は同様のものを提供する遺伝子の結果
として存在する。他方、精製及び継代の後、ＣＭＶは制
限消化され、そしてサザン分析、電気泳動又は同様のも
のにゆだねられ、そのウィルス中にＯＲＦ挿入体の存在
を検出され得る。

次に、変性されたウィルスは、新鮮な宿主細胞、たとえ
ばヒト二倍体肺又は包皮繊維芽細胞上で連続的に継代さ
れ、ウィルスストックが提供される。

対象のＯＩ？Ｆを含むＣＭＶは、ヒト又は組織培養細胞
に使用され得る。それらは、種々の生成物、たとえば種
々の病原菌からの抗原、又は上記に指摘されたような他
の生成物の産生のために、培養中の細胞を感染するため
に使用され得る。ワクチンとして使用のためには、ワク
チンは、７０％ソルビトール及び蒸留水の溶液中におい
て一７０℃で貯蔵され得る（ソルビトール溶液１休積に
対する細胞培養物から最大のウィルス力価で得られたウ
ィルス１体積）。その力価は、プラークアッセイによっ
て又はＣＭＶに対する抗体（これらは容易に入手できる
）によって得られる（アメリカ特許第３、９５９．４６
６号を参照のこと）、ワクチンは、０、ｂ〜０．２−中
、約ｌＸｌ０”〜５Ｘ１０’個のプラーク形成単位を用
いることによって、皮下投与され得る。

１又はそれよりも多くの予防接種が、少なくとも約２週
の間隔で与えられ得る。予防接種された宿主からの血液
は、単離され、そしてＣＭＶ及び対象の抗原（これはＣ
ＭＶ中に導入された１又はそれよりも多くのＯＲＦによ
って発現された）に対する中和性抗体の存在についてス
クリーンされる。

ＯＲＦを含むＣＭＶは、免疫原としてウィルス感染の細
胞を使用し、そしてそれらを適切な宿主、たとえばマウ
ス中に注入することによって（ここで、次にＯＲＦによ
って発現されたポリペプチドに対して特異的な中和性抗
体が得られる）、抗体を産生ずるために使用され得る。

ＯＲＦは、マウスＣＭＶ、ネズミＣＭＶ　、テンジクネ
ズミＣＭＶ　５５１ｍ１ａｎ　ＣＭＶ、ウシＣＭＶ　、
ウマＣＭＶ又はいづれか他のＣＭＶ中に挿入され得、そ
して抗体を産生ずるためにその類似する宿主を感染せし
めるために使用され得る。ヒト宿主が対象の主要な宿主
である場合、本発明は、そのようなＣＭＶに対して敏感
な宿主のためのワクチンとしていづれかの弱毒ＣＭＶ株
を使用することができる。

ユニ」狭 次の例は、例示的であって、限定するものではない。

第１図においては、Ｌ及びＳ成分を原型の配向で示すＣ
ＭＶ　（Ｔｏｗｎｅ）ゲノムの配列が示される。それぞ
れの成分は、ルー垣立り及び（且ニー９（濃い線）の逆
方向反復体によって包まれているユニーク配列（薄い線
）から成る。土は、ＬＳ連結部で逆方向コピー（ａ′）
を有する末端方向反復体である。

拡張された領域は、旧ｎｄｎ［Ｋ及び０フラグメント及
びｐＯＮ２５６を構成するために使用される配列を示す
。ｐＯＮ２４１　（Ｓｐａｅｔｅ及びＭｏｃａｒｓｋｉ
、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

（１９８５）並：　１３５）からの５．９ｋｂｐの一部
ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＯＮ２２７によって担持
される主要β−遺伝子の３′フランキング領域の５′端
でのユニ一りＥｃｏＲ１部位中に挿入することによって
、ｐＯＮ２５６を製造した。その一部ＥｃｏＲＩフラグ
メントは、１ａｃＺ／ＳＶ４０配列に融合されたβ遺伝
子プロモーター／Ｕ＠節配列を含んだ。ｐＯＮ２２７は
、ｐＯＮ３０１　（Ｓｐａｅｔｅ及びＭｏｃａｒｓｋｉ
、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　（１９８５）５４：８１７〕のＢ
ａｍＨＩ　〜Ｋｐｎ　Ｉフラグメントとして得られた。

Ｔ４　Ｐｏ１ｌ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）
による消化及びフィルインＢａｍＨ１部位への連結の過
程においては、Ｋｐｎ１部位が１３ａｍＨ１部位に転換
された。

ｐＯＮ２２７は、第１図に示されるように１．６ｋｂｐ
のＣＭＶβ−遺伝子配列を含む。この１．６ｋｂｐのβ
−遺伝子配列は、ｌ赳Ｚ発現構成体のために３′フラン
キング配列を提供する。

ＤＮＡプローブは、第１図のＲＣ２５６に示されるよう
なその得られた構成体に関するサチン法分析に使用され
た。ｐＯＮｌに担持される１ａｃＺ特異的プローブは、
矢印及び斜線のストライブのブロックによって示される
。１配列プローブ、すなわちｐＯＮ２０８は、旧ｎｄＩ
［［Ｋフラグメントの端で空白のボックスによって示さ
れる。　　２．７ｋｂのＣＭＶβ転写物の方向は、点線
の矢印によって示される。５．０ｋｂの１ａｃＺ転写物
の方向は矢印によって示され、そして挿入体に隣接する
欠失はΔ及び破線によって示される。

ｐＯＮ２５６　（ＢｓｔＥ　ＩＩにより線状化された）
２．５ｑ及びＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ）ＤＮＡ　２０ｔｔｇ
を混合し、そしてリン酸カルシウム沈殿法及びグリセロ
ールショック法を使用してヒト繊維芽細胞（ＨＦ）上で
前記混合物を同時トランスフェクトした後、Ｉ？Ｃ２５
６を単離した（Ｓｐａｅｔｅ及びＭｏｃａｒｓｋｉ、　
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　（１９８５）５４：８１７）。

同時トランスフェクトの子孫を連続的に希釈し、そして
新しい細胞上で継代し、そしてそのプラークをグルベッ
コの変性された最少必須培地中、１５０Ｉ１ｇ／ｒｎｌ
のＸ　−ｇａｆｆｉ　（Ｓｉｇｍａ）　、０．５％アガ
ロース、１０％Ｎｕ血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）によりおおった。組換え体が、被
覆の後、６〜２４時間で、青色のプラークの出現によっ
て同定された。青色のプラークを取り、音波処理し、連
続的に希釈し、そして合計３回、新しい細胞上に継代し
た。高い力価のウィルスストック及びウィルスＤＮＡを
、５ｐａｅｔｅ及びＭｏｃａｒｓｋｉ、（１９８５）　
、前足に記載されているようにして、分析のために調製
した。

０、ｂ％ＳＯＳの存在下でブロテイナーゼＫ　（１００
躍／ｍ！　）　（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ）により消化し、そ
して続いてフェノール及びエーテルにより抽出すること
によって、ＲＣ２５６ＤＮＡを細胞外ピリオンから調製
した。制限消化を、製造規格（Ｎ、Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ
）に従って行ない、その消化物を０．５％アガロースゲ
ル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースに移し、
そして３Ｚｐ−ラベルのＤＮＡによりプローブした。多
（の異なった消化物が使用された。元の末端及び接続フ
ラグメントに比べて、末端及び接続フラグメントにおけ
る変化が、挿入体の存在を支持した。欠失が、第１図で
Δとして示されている挿入体の５′側で観察された。

ＤＮＡを調製し、そしてそのゲノム構造をサザンハイブ
リダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ。

（１９７５）怒：５０３）によって分析した。組換えＲ
Ｃ２５６ＤＮＡの旧ｎｄｌＩＩ及びＣｏａｌ消化物を、
１ａｃＺ特異的配列（ｐＯＮｌ　（Ｓｐａｅｔｅ及びＭ
ｏｃａｒｓｋｉ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

（１９８５）５６：１３５）　）により及び挿入部位で
の挿入又は欠失をフランキングするＣＭＶ特異的配列に
よりプローブした。

分析は、ＡａｃＺが期待通り、β遺伝子内のＣＭＶゲノ
ム中に挿入されたが、しかしこの遺伝子のたった１つの
コピーが分裂され、そして約６　ｋｂｐの欠失が挿入部
位の近くで起ったことを示した（第１図）。ＲＣ２５６
ゲノムのＬ及びＳ成分の逆位のために、３種の新しい旧
ｎｄＩ［［フラグメント〔１つはＬ末端（Ｔ１）フラグ
メント及び２つはＬ−３接続（Ｊ”）フラグメント〕が
１ａｃＺプローブへのハイブリダイゼーションによって
同定された。

ＣＭＶ　（Ｔｏｗｎｅ）　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩＫフラグメ
ントの１つのコピーを、挿入によって分裂し、そして１
つはそのまま残した。

ＣＭＶ　（Ｔｏｗｎｅ）　ＤＮＡの尖Ｉ消化が、４種の
別個の末端フラグメント（７，６ｋｂｐ、Ｔ＋　；　１
３ｋｂｐ、Ｔｚ　；　１５ｋｂｐ。

Ｔ、及び２６ｋｂｐ、Ｔ４）及び４種の別個の接続フラ
グメント（２０，６ｋｂｐ、　、Ｌ　；　２２．６ｋｂ
ｐ、Ｊｚ　；　３６ｋｂｐ、Ｊ：＋及び４１Ｋｂｐ、　
Ｊ４）をもたらした。Ｃｊ２ａ　Ｉは、Ｌ及びＳ成分の
逆方向反復体の外側を切断するので、この酵素はＲＣ２
５６の構造を確立するために使用された。

ＨｉｎｄＩ［［による消化に関しては、１種のＴ”及び
２種のＪ”（Ｊａｌフラグメントが、ｐＯＮ１プローブ
を用いてのハイブリダイゼーションにより同定された。

ＣＭＶ　（Ｔｏｗｎｅ）及びＲＣ２５６のＣ１ａ■消化
物を、ｐＯＮ２０８　（これは、すべてのＬ−３接続及
び末端フラグメントにハイブリダイズする主配列特異的
プローブである）にハイブリダイズした。このプローブ
は、ＣＭＶ　（Ｔｏｗｎｅ）　ＤＮＡ消化物中おける、
４種の接続（Ｊ、　〜Ｊ、、）及び４種の末端（Ｔ＋　
”Ｔ４）Ｃ１ａ　１フラグメントにハイブリダイズした
。しかしながら、ＲＣ２５６においては、消化物Ｊａ、
Ｊｚ及びＴ３が欠失し、そして新しい接続及び末端フラ
グメントにより置換された。これは、プローブとしてｐ
ＯＮ２２７〔これは、Ｔｚ　、　　Ｔ”　、　、Ｌ　、
　、ｈ及び２種のＪ”ＣＪａｌフラグメントにハイブリ
ダイズされる３′フランキング配列に対して特異的であ
る）を用いて確認された。

ｐＯＮ２５６の構成の間に欠失されたβ遺伝子の内部の
配列を表わす３１５ｂｐのＭｆｆｉｕ　Ｉ　／　Ｅｃｏ
ＲＩフラグメントに由来したプローブを用いて、ＲＣ２
５６のゲノムからのＴＲＩ　、　Ｊｔ及びＪ４フラグメ
ントの欠失を確認した。

エチジウムプロミドにより染色されたゲルのＤＮＡ制限
パターンは、旧ｎｄＩ［ｌＫ１０部位を補足するＤＮＡ
の欠失により旧ｎｄＩＩ［ｏフラグメントの不在及び６
．７ｋｂｐの新しい旧ｎｄＩＩ［フラグメント（第１図
においてΔによって示されている）の存在を示す。

さらに、ゲノム消化物に存在すると思われるＸｂａＩＯ
，ＢａｍＨＩＧ及びＥｃｏＲＩ　Ｏフラグメントは不在
であった。

Ｃ１ａＩ制限消化物を、プローブの５′フランキング配
列としてｐＯＮ２５８　（第１図）とハイブリダイズせ
しめた［ｐＯ８２５８は、ｐＯＮ２４１からの５′リー
ダーを示す１８０ｂｐの旧ｎｄＩＩＩ〜Ａｊ！ｕ　Ｉフ
ラグメントをｐＧＥＭｌ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）の旧ｎｄ
　ｍ　／　Ｈｉｎｃ　ＩＩポリリンカー中に挿入するこ
とによって構成された〕。β遺伝子の上流の６　ｋｂｐ
の配列の欠失に起因する新しい融合フラグメントを表わ
す４．８ｋｂｐのフラグメントが検出された（第１図）
。

欠失のサイズ及び位置は、　ｐＸｂａ　Ｏ（Ｔｈｏｍｓ
ｅｎ及び５ｔｉｎｓｋｉ、Ｇｅｎｅ（１９８１）１６：
２０７）及びｐＯＮ２５８プローブの単独での又は組合
しての使用による、Ｅ　Ｃｏ　ＲＩ　＋ＸｂａＩ　、　
Ｈｉｎｄｌｌｌ　、　ＢａｍＨＩ　、　Ｂｇｌ　ＩＩ　
、　ＢｓｔＥ］Ｉ。

ＤｄｅＩ　、　Ｋｐｎｌ　、　ＰｖｅＵ　、　Ｓａｌ　
Ｉ及びＸｈｏｌ消化物のサザン分析によって確証された
。これらの分析は、その欠失が転写開始部位の１７５５
ｂｐ上流よりもさらに上流で起ったことを示めし、そし
てβｇａｌの調節された発現を引き出すために十分な５
′近位配列が損われていなかったことを示唆した。

これらの分析はまた、このストック中のウィルスゲノム
の割合（５％）がこれらの欠失された配列を修復したこ
とを示し、そして他のヘルペスウィルス反復体中に前に
観察された遺伝子転換の方法を示唆した。

ＲＣ２５６感染の細胞において１ａｃＺ特異的配列の転
写を例示するために、次の研究が行なわれた。

ＲＣ２５６の転写活性を、ノザン分析を用いて試験した
。ＲＮＡ１．５ｔｔｇを、感染後２４時間（ｈｐｉ）で
、ＲＣ２５６により感染された細胞から用意し、そして
１１ａｃＺ配列に対する相同関係により５．０ｋｂ転写
物の存在を示すためにプローブした（Ｇｅｂａ　ｌ　ｌ
ｅ　ｆｔ　炙、　。

ＪＪｉｒｏｌ、（１９８６）４６：８６５）　、この転
写物は、ＨＦ細胞中への関連した構成体（ｐＯＮ２４１
）の過渡導入の後、観察された転写物にサイズで同一で
あった。その転写物のサイズは、転写が、６ａｃＺの３
′フランクで存在するＳＶ４０ポリＡ追加シグナルを越
えて“後ろの方の”ＳＶ４０配列（ここで適切なプロセ
シングシグナルが使用され得る）中に継続したことを示
唆した。β遺伝子の第２の連続したコピーが、上記の３
１５ｂｐのＭ　Ａｕ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩプローブを用
いて検出された野性型の２．７ｋｂ転写物を発現した。

組換え体からの遺伝子発現のレベルを試験するために、
野性型又は組換え体株により感染された細胞を、７２ｈ
ｐｉで２００　ｐ　Ｃｉ　／　ｍｌの（”Ｓ）メチオニ
ンにより２時間、放射性ラベルした。タンパク質を、β
−メルカプトエタノール及びＳＤＳの存在下で細胞溶解
により調製し、そしてＳＤＳ／ポリアクリルアミド（７
，５％ゲル）電気泳動（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）によって分
離し、ニトロセルロースフィルターに移し、そしてオー
トラジオグラフ処理した（Ｈｕｔ−ｃｈ　ｉ　ｎ５ｏｎ
　ｉｉ　Ｈ、、亘匹旦ｕ（１９８６）　１５５　：１６
０　；　ＭｃＤｏ−ｎｏｕｇｈ　ｆＬ　Ｅ　、　、　Ｊ
、Ｖｉｒｏｌ、　（１９８５）５３ニア１１　；　Ｗａ
ｔｈｅｎ及び５ｔｉｎｓｋｉ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１９
Ｂ２）４１：４６２）　、β−ｇａｌｌは、ＲＣ２５６
感染の細胞中に目立った遺伝子生成物として発現された
。

βｇａｌモノマーとして命名された種は、その相対的な
移動度及び高い力価のウサギ抗−βｇａβ抗体（Ｃｏｏ
ｐｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてのウェスタ
ーン分析に基づかれている。感染における後期で、この
組換え体からのβｇａｌｌの発現のレベルは、合計の感
染された細胞タンパク質の０．２〜１％に近づいた。こ
の値は、Ｒｏｔｍａｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｌａｃｔｏｓｅ
　０ｐｅｒｏｒ＋＋Ｊ、　Ｂｅｃｋｗｉ　ｔｈ及びり、
Ｚｉｐｓｅｒ、ｅｄ、、（Ｃ５ＨＮＹ　１９７２，２７
９〜２８９ページ）によって定義された条件下で１分間
当りに切断される′基質（ＯＮＰＧ）のモル数を測定す
ることによって得られ、ここでβ−ガラクトシダーゼの
１単位は、２．６Ｘ１０９個の分子の四量体酵素に相当
する。

ＲＣ２５６からのβｇａ１発現の運動学を、２，６゜１
０　、２４及び４３ｈｐｉで、（３５３）メチオニンに
より２時間、細胞を放射性ラベルし、そしてＳＤＳ／Ｐ
ＡＧＥによってタンパク質を分離することによって、研
究した。オートラジオグラフ処理及びウェスターンプロ
ットの両者のデータは、βｇａｊ２合成が６及び８　ｈ
ｐｉで始まり、そして１０〜１２ｈｐｉで最大の速度に
達したことを示した。さらに、βｇａｊ２の発現は、シ
クロへキシミド処理によって阻害された。

これらの観察は、この遺伝子の運動クラスの名称で前に
出版さた過渡アッセイに一致する。

ＣＭＶは、天然の宿主によって調製されような天然のタ
ンパク質を本質的にまねるために、活性形での外因性タ
ンパク質の発現のためにヒト宿主細胞中への外因性タン
パク質の導入のために使用され得ることが上記結果から
明らかである。この場合、ＣＭＶに対してのみならず、
また広範囲の種類の他の病原菌による感染に関して心配
しないで、そのような病原菌に対しても保護するために
、個人の予防接種に関して使用され得るワクチンが提供
される。従って、完全且つ効果的な手段が、免疫原応答
を誘導するために抗原の産生を提供する。

さらに、ウィルスは、細胞培養又は不／旦爽中で広範囲
の種類の生成物を産生ずるために使用され得、ここで特
定の表現型を欠く細胞は、ＣＭＶによる感染によってそ
の表現型を提供され得る。

ＣＭＶはまた、宿主によって製造されるセンス転写物の
翻訳を妨げるであろうアンチセンス転写物を付与するこ
とによって、特定の遺伝子の活性を調節するためにも使
用され得る。従って、ＣＭＶは、広範囲の種類の遺伝的
能力を損われていない哺乳類、特にヒト、宿主又は哺乳
類細胞培養物中に導入することによって、広い範囲の活
性を提供する。

前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行なうことができる。

３、発明の詳細な説明 第１図は次のことを示す： Ｉ　、　２４０ｋｂｐのＣＭＶ　（Ｔｏｗｎｅ）ゲノム
の配列−４種の可能な配向の１つ（原型）でＬ及びＳ成
分を示す。

■、その延長された領域は、旧ｎｄ　ｍ　Ｋ　９．７ｋ
ｂｐ及び旧ｎｄ　ｍ　０　？、８Ｋｂｐフラグメントを
示す。

１、　ｐＯＮ２５６のフラグメントは、１．６ｋｂｐの
β−遺伝子３′フランキング配列を含む、ｐＯＮ２２７
のユニークＥｃｏＲ１部位中に、１ａｃＺタンパク質コ
一ド配列及びＳＶ４０ポリアデニル化配列に融合された
β−遺伝子プロモーター／澗節配列及び５′リ一ダー配
列を含む、ｐＯＮ２４１からのＥｃｏＲＩにより一部消
化された５、９ｋｂｐフラグメントを挿入することによ
って構成された。

■、斜線のブロックとして１ａｃＺ／ＳＶ４０挿入体を
示すＲＣ２５６の図による表示。

Ｖ、　ＲＣ２５６のＤＮＡ内での挿入された配列及び欠
失された配列の制限地図を示す延長された領域。

Ｉにおいては、完全なＨｉｎｄＩ［Ｉ地図（ＬａＦｅｍ
ｉｎａ及びｌｌａｙｗａｒｄ、ｉｎ　Ｐｅｒｓｉｓｔｅ
ｎｔ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　Ｒ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ星炙、
、Ｅｄｓ、Ａｃａｄｅｎｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｈｅｗ　
Ｙｏｒｋ（１９８０）、３９ページ；Ｉｈａｒａ　ｔｌ
Ｅ、、　Ａｒｃｈ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ　　（１９８６
）工：１〕及びＣ１ａＩ末端フラグメントが示されてい
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）感染の宿主細胞中
   に発現することができる外来性遺伝子を含んで成る細胞
   感染することができる弱毒サイトメガロウィルス。 ２、前記外来性遺伝子が病原性タンパク質又はそのフラ
   グメントをコードする特許請求の範囲第１項記載の弱毒
   サイトメガロウィルス。 ３、前記病原性タンパク質がウィルスタンパク質である
   特許請求の範囲第２項記載の弱毒サイトメガロウィルス
   。 ４、前記ウィルスタンパク質がエンベロープ糖タンパク
   質である特許請求の範囲第３項記載の弱毒サイトメガロ
   ウィルス。 ５、￥ｂ￥配列中に挿入される発現カセット及び少なく
   とも１つの機能的なβ−遺伝子を含んで成る細胞感染す
   ることができる弱毒サイトメガロウィルスであって、前
   記発現カセットが転写及び翻訳調節の開始及び終結領域
   及び該領域の調節下での外来性遺伝子を含んで成り、前
   記調節領域がサイトメガロウィルス感染のヒト宿主細胞
   中において機能的である弱毒サイトメガロウィルス。 ６、サイトメガロウィルスのキャプシド及びエンベロー
   プの少なくとも１つに外来性タンパク質を含んで成る弱
   毒サイトメガロウィルス。 ７、前記外来性タンパク質がエンベロープタンパク質又
   はそのフラグメントである特許請求の範囲第６項記載の
   弱毒サイトメガロウィルス。 ８、前記外来性タンパク質が病原菌の表面膜タンパク質
   又はそのフラグメントである特許請求の範囲第６項記載
   の弱毒サイトメガロウィルス。 ９、特許請求の範囲第６項記載の弱毒サイトメガロウィ
   ルスの有効量及び生理学的に許容される担体を含んで成
   るワクチン。 １０、転写の方向に、ＣＭＶの￥ｂ￥配列からの配列、
   転写及び翻訳調節開始領域、該開始領域の転写制御下で
   のサイトメガロウィルス以外のものからの読み取り枠、
   転写及び翻訳調節終結領域、ＣＭＶの￥ｂ￥配列からの
   配列を含んで成るＤＮＡ構成体。 １１、前記ＯＲＦ（読み取り枠）がウィルスタンパク質
   をコードする特許請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ構成
   体。 １２、前記ウィルスタンパク質がキャプシド又はエンベ
   ロープタンパク質である特許請求の範囲第１１項記載の
   ＤＮＡ構成体。