JPH0253453B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ポリアルキレンイミン及びジイソシ
アナートから成る架橋樹脂、該架橋樹脂を使用す
るムコ多糖化合物の選択吸着方法及びその分離方
法に係わる。 ムコ多糖類、ポリアミノサツカライド類、アミ
ノ化多糖類とも定義され、混合物の形態で動物組
織より抽出される他のグリコサミノグリカン類
（GAG）からヘパリン（HEP）を分離する為に
は、通常、適当な濃度の無機塩類の存在下で第四
級アンモニウム塩類で処理しGAG複合体を分別
沈澱する方法がとられる（E.J.スコツト，
Methods Biochem.Anal.８，145（1960））。これ
に代る方法として、酢酸カリウムを使うとヘパリ
ンが特に好ましく沈澱し得る（英国特許No.
1221784）。 ヘパリンの単離法として他に、ヘパリンを適当
なゲル（例えば架橋デキストラン）上で濾過する
方法があるが、これはヘパリンが格子細孔に浸透
し引き続き吸着することを利用したものである。
ヘパリンを単離させる方法を更にすすめて陰イオ
ン交換樹脂を基にした方法もあるが、この陰イオ
ン交換樹脂は普通ポリスチレン又は第四級アンモ
ニウム官能基が導入されたセルロース誘導体若し
くは他の架橋した多糖誘導体である。この場合、
ヘパリンは前記樹脂によつてより好ましく結合す
る。 しかし乍ら、ヘパリンを定量的に回収するため
の処理法が通常何段階か必要とされるため、前記
方法のいずれも完全ではないことがわかつた。こ
れは主として、上記のような方法が一般に平衡反
応を利用するため、単離されるべき生成物以外に
それよりは少いがしかし相当量の不純物とみなさ
れる他の成分もまた得られるという事実に帰因す
る。 このように、例えば、ゲル濾過技術で利用され
ている分離機構は、ポリマーの格子細孔より小さ
い分子がその細孔の中へ浸透するのに対し、それ
より大きい分子は外に残されるという事実に基づ
いている。従つて、担体の大きさの重要性及び臨
界性、つまり担体の多孔度の特徴は明白であり、
又、このような方法に用いられる溶出技術が分配
係数に関連した困難を次々に伴うことも明らかで
ある。 ヘパリンの分離を困難にする別の要因は、類似
の化学構造をもつ他のポリアミノサツカライド類
の競争反応で、化学的、物理的見地からみて分離
反応を阻害する。 普通の陰イオン交換樹脂を用いたヘパリンの分
離機構は、ヘパリンには陰イオンサイト―SO₃ ^-
及び―COO^-が他のGAG類より多いので、樹脂
の陰イオンサイトに引きつけられる可能性が一層
大きいことを利用した特殊な吸着とみなすことが
出来る。 しかし乍ら、そのようなサイトの樹脂中におけ
る分布は一般に不規則であるため、このプロセス
では多糖中に存在する限られた数の陰イオン基し
かかかわりを持たない。 樹脂中の一連の塩基性基が、同じヘパリン鎖に
属して相補関係をなす一連の酸性基を受け入れる
場合、特に樹脂の塩基性基が、ポリアミノサツカ
ライドの酸性基と同じ具合に一定の間隔をおいて
並んでいる場合は、「吸着」効率が確実に向上す
る。高分子電解質複合体が著しく安定しているの
はこの相補性原理によるものだが、このような複
合体では、塩基性サイト及び酸性サイトが高分子
構造の一部をなしていない場合に比べて、ポリ酸
のポリ塩基による誘引効果が増大する。 本発明者等は、上記の考えに基づいて、（分子
の構造型の評価によると）ヘパリンの酸性基と殆
んど同じ具合に一定間隔をおいて規則正しく並べ
られた一連の塩基性基が存在するという特徴を持
つ新種の樹脂を得た。 本発明による樹脂は、ジイソシアナート類と架
橋結合したポリアルキレンアミン特に、ヘキサメ
チレンジイソシアナート（HMDC）と架橋結合
したポリエチレンアミン（ポリエチレンイミン、
PEIとも云う）から成り、その平均分子量は約
150から120000の範囲に及ぶ。PEI鎖の架橋がな
されるとポリマーが不溶性になり、架橋剤の横断
結合のために溶媒とヘパリン分子間の間隙が得ら
れ、又ヘパリンと結合可能な一連の塩基性サイト
が適当に制限される。 ポリエチレンアミン鎖はアルキレンジイソシア
ナートによつて架橋されカルバミド性の横断結合
を形成する。特に、PEIとヘキサメチレンジイソ
シアナートとの架橋反応により、より一般的な広
く枝分かれした形が得られるが、枝分かれした部
分は機構Ａ）により、枝分かれしていない部分は
機構Ｂ）により反応する。 これにより３次元構造が得られ、この構造は次
のようであると仮定できる。

【表】 架橋処理に用いられるアルキレンジイソシアナ
ートの量は、ポリアルキレンアミンを構成する単
量体単位と、単官能基性とみなしたジイソシアナ
ートとのモル比として与えられるが、（単量体単
位に基いて）100モルのポリマーに対し約10乃至
15モルである。従つて、例えば、12モルのヘキサ
メチレンジイソシアナート（単官能基性とみな
す）を120モルのポリエチレンアミン（単量体単
位に基づく）に加えれば、水及び有機溶媒に不溶
性の架橋した樹脂が得られる。HMDCとPEIは
一般に、約１：５に相当する容積比で、有機溶媒
（クロロホルムが望ましい）で５％の溶液にして
用いられる。 樹脂と架橋剤の比率は上記の比率が望ましい
が、この比率が異つても、同様に不溶性で、架橋
度が異なる樹脂が得られるが、その適切な収率は
最低架橋度に対してかなり低い。これに関連して
注意したいのは、比較的低い分子量（例えば約
600で、これは重合度約14に相当する）をもつ
PEIを出発物質として反応させると、末端基
NH₂ ^-がHMDCと優先して反応するらしいという
ことである。このような条件で、又OCN―基と
NH―＋NH₂―基とのモル比を約１：10とすれ
ば、ｎ＝８−14である（CH₂―CH₂―NH）_o単位
鎖が形成され、それが十分に延びてポリアニオン
（polyanion）との協同効果を持つようになると
思われる。 次に実施例をいくつかあげて本発明をより詳細
に説明するが、実施例は説明の目的で列挙されて
いるだけで、本発明を限定するものではない。 実施例 １ 架橋ポリエチレンイミンの製造 ５％（Ｗ／Ｖ）ヘキサメチレンジイソシアナー
トのクロロホルム溶液20mlに、平均分子量が1800
であるポリエチレンイミンの５％（Ｗ／Ｖ）のク
ロロホルム溶液100mlを室温で撹拌し乍らゆつく
り加えた、約15分後、架橋度0.1のポリエチレン
イミン樹脂の白い塊状の沈澱が生成した。続いて
これをデカンテーシヨンによつて分離し、各回10
mlのクロロホルムを用いて３回洗浄をほどこし
た。まだいくらかクロロホルムを含んでいる沈澱
を更に各回10mlの蒸留水で３回洗浄し水中に保存
した。 乾燥生成物の計算収率は75〜80％であつた。 実施例 ２ 実施例１に従つて実施したが、1000〜1500の平
均分子量をもつポリプロピレンイミンをポリエチ
レンイミンの代りに用いた。 その結果、架橋度が0.05，生成物収率が乾燥量
基準で90％のポリプロピレンイミン樹脂が得られ
た。 第１図は、実施例１および２に従つて得られた
樹脂の典型的な赤外スペクトルを示している。赤
外スペクトルを調べれば樹脂の同定の他に、架橋
剤とポリイミン鎖との間の比率の準定量的評価が
でき又HMDCが二官能基的に反応したことが確
認出来る。 ここで用いられる「架橋度」とは、架橋反応に
かかわつたNH―（及び／又はNH₂―）基をもつ
単量体単位の数で、単官能基性とみなされるジイ
ソシアナート及び単量体単位とみなされるポリア
ミンの間の分子比を基礎にしたものをさす。 架橋度は架橋処理の際ポリアルキレンアミノの
アミノ基が1/4以上反応しないように選定されて
いる。 ヘパリンと他のグリコサミノグリカン類の水溶
液を架橋樹脂で処理テストした結果、ヘパリンが
その樹脂に対して著しい親和力を持つことが示さ
れた。 ヘパリンと他のグルコサミノグリカン類を共に
含む水溶液中で本発明による架橋樹脂の働きによ
りヘパリンを定量的に分離することが出来るが、
そのような水溶液のヘパリンの濃度範囲は0.1か
ら１重量パーセントである。これは以下の実施例
によつて明らかにされよう。 樹脂に吸着したヘパリンは回収可能であり、樹
脂は適度な塩溶液、例えば約1.5〜2.5MのNaCl水
溶液でヘパリンを含有する樹脂を処理することに
より、再生されて次に再使用出来る。 実施例 ３ ヘパリンの選択分離 ヘパリン20％，ヘパラン硫酸30％，コンドロイ
チン硫酸及びデルマタン硫酸20％並びにヒアルロ
ン酸10％を含む豚の十二指腸から抽出されたグリ
コサミノグリカン混合物を0.2重量パーセント含
む水溶液20mlを、PH3.5（HClの存在下で）で30分
間前処理をほどこし10mlの水で２回洗浄した実施
例１の架橋度0.1のポリエチレン樹脂２ｇと接触
させた。 撹拌し乍ら２時間接触をつづけた結果、ヘパリ
ンは樹脂によつて定量的且つ選択的に吸着された
ことが判明した。これは電気泳動分析によつてあ
きらかにされるが、その結果を第２図に表わし
た。 第２図で、上の線が処理前のグルコサミノグリ
カン溶液を、下の線が架橋PEIで処理した後の同
じ溶液を表わすが、あきらかに、処理溶液からは
ヘパリンは全く現われないのに対し、ヒアルロン
酸（HA），ヘパラン硫酸（HS）及びコンドロイ
チン硫酸とデルマタン硫酸の合計（ChS＋DeS）
のピークは処理溶液中でも依然として残つてい
る。 実施例 ４ ヘパラン硫酸（85％）及びヘパリン（15％）か
らなるムコ多糖分を含む水溶液20mlを、PH3.5
（HCIを用いて）で30分間前処理をほどこし10ml
の水で２回洗浄した架橋度0.05のポリエチレンイ
ミン樹脂４ｇと２時間接触させた。撹拌し乍ら２
時間接触させた結果、溶液の電気泳動分析はヘパ
リンが完全に消失していることを示した。 依然として溶存するヘパラン硫酸は溶液を蒸発
させることによつて簡単に回収されその収率は95
％であつた。 実施例 ５ ヘパリン0.1％（ムコ多糖10mgに相当する）を
含む水溶液10mlを、本発明による架橋PEI800mg
で２時間処理した。処理後、ヘパリンは樹脂によ
つて定量的に吸着されていたが、これはトルイジ
ンブルーとカルバゾールをホウ酸塩存在下で残液
にほどこして行つた比色テストによりあきらかに
された。 実施例 ６ ヘパリン18％を含むグルコサミノグリカン混合
物の水溶液を実施例３で述べられた操作条件によ
つて架橋したPEIで処理した。定量的電気泳動分
析はヘパリンが定量的且つ選択的に吸着されてい
ることを示した。 実施例 ７ ヘパリンの架橋PEIからの回収 実施例３に従つて吸着されたヘパリン８mgを含
むポリエチレンイミン樹脂２ｇを、各回20mlの
2MNaClで、撹拌し乍ら、30分間処理することを
５回くり返して抽出した。回収された抽出物は
元々樹脂によつて吸着されていたヘパリンの95〜
96％を含んでいたがこれは2MNaClの校正曲線に
関してカルバゾールを用いた比色分析から明らか
になつた。 透析による脱塩処理又は第四級アンモニウム塩
による沈殿生成によつてヘパリンが抽出物溶液か
ら分離された。 実施例を基に、特に、ヘパリンを含む混合物か
らヘパリンを分離することに関連しながら本発明
を説明したが、そのような混合物の他のポリアミ
ノサツカライド成分に対する本発明による架橋し
たポリアミンの親和力は樹脂の架橋度及び接触溶
液のPHと濃度を適当に変えることにより、場合に
応じて変化し適合することが出来る。事実、本発
明による架橋したポリアミン類は、架橋結合の数
つまりジイソシアナートの割合に従つて造粒や細
孔の大きさが異なるものを得ることが出来る。従
つて、架橋結合を殆んど持たないポリアミン類が
水溶液中で乾燥生成物の容量に比べてその何倍も
に増量するのに対し、橋かけ度の高い、つまり架
橋結合を多く持つているポリアミン類はその容量
があまり変わらない。これら橋かけ度の高いポリ
アミン類では組織がずつと密であり、従つて比較
的低分子量の分子のみを浸透させるが、同時にイ
オン交換は樹脂から出てくる水和した対イオンの
動きに対する抵抗が増すためずつと緩慢になる。
細孔の大きさがより大きくなると、本発明による
ポリアミンは、より大きな分子に近づき易くな
り、従つてより小さい分子種から分離され得る。 上述した効果以外に、架橋度は、３次元格子を
浸透したポリアニオンとの相補的相互作用に有効
な一連のNH―（及びNH₂―）基の数を決定す
る。一方、このようなNH―（及びNH₂―）基の
数は同等であるが、PHとイオン強度を利用するこ
とにより、陽電荷を持つていてその為多糖の陰イ
オン性基とのイオン結合形成によつて吸着力を増
大することの出来る基と電荷を持たない基との間
の比率は改良されてくる。 本発明による架橋したポリアミンは、従つて、
所望のGAG，特にヘパリンの分離及び溶解GAG
類の混合物からの所望でない成分、例えば抗擬析
剤の特性を使わずに生成したい場合のヘパリンの
排除にも用いられる。 いくつかの好ましいと思われる実施例を挙げ、
特にヘパリンに焦点を合わせて本発明の説明をし
たが、当業者には明らかなように、本発明の保護
範囲内で変化あるいは変形が可能である。従つ
て、架橋剤として更にアリーレンジイソシアナー
ト類やジアルデヒド類の様な二官能基性反応物又
はトリクロロチアジンの様な複素環式化合物を使
つても良いし又、水を、特にジアルデヒド類の場
合は、溶媒として使うことも出来る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１および２に従つて得られた架
橋樹脂の典型的な赤外スペクトルを、第２図は実
施例３で触れたグルコサミノグリカン溶液の電気
泳動分析を示す。 HA＝ヒアルロン酸、HEP＝ヘパリン、HS＝
ヘパラン硫酸、ChS＋DeS＝コンドロイチン硫酸
及びデルマタン硫酸。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ポリアルキレンイミン及びジイソシアナート
   から成る架橋樹脂であつて、重合度が約８〜42の
   該ポリアルキレンイミンとジイソシアナートとの
   モル当量比１：0.10〜１：0.15での架橋によつて
   得られ、該架橋樹脂は下記の一般式 （式中、ｎ＝１又は２，Ｒ＝Ｈ又はCH₃，Ａは
   共有結合又は―NH―（CH₂）ａ―、ただしａは
   ２又は３，ｂは２〜６を示す。）で示される繰返
   し単位を有し、架橋度が0.05〜1.0である（ただ
   し、該ポリアルキレンイミンのアミノ基の1/4よ
   り多くは架橋に関与しない。）ことを特徴とする
   前記架橋樹脂。 ２ 前記ポリアルキレンイミンがポリエチレンイ
   ミン又はポリプロピレンイミンであり、前記ジイ
   ソシアナートがヘキサメチレンジイソシアナート
   であることを特徴とする、特許請求の範囲第１項
   記載の架橋樹脂。 ３ 水溶液中でグルコサミノグリカン類の混合物
   から一種のムコ多糖化合物を選択吸着する方法で
   あつて、前記溶液を攪拌しながら、ポリアルキレ
   ンイミン及びイソシアナートから成る架橋樹脂で
   あつて、重合度が約８〜42の該ポリアルキレンイ
   ミンとジイソシアナートとのモル当量比１：0.10
   〜１：0.15での架橋によつて得られ、該架橋樹脂
   は下記の一般式 （式中、ｎ＝１又は２，Ｒ＝Ｈ又はCH₃，Ａは
   共有結合又は―NH―（CH₂）ａ―、ただしａは
   ２又は３，ｂは２〜６を示す。）で示される繰返
   し単位を有し、架橋度が0.05〜1.0である（ただ
   し、該ポリアルキレンイミンのアミノ基の1/4よ
   り多くは架橋に関与しない。）ことを特徴とする
   前記架橋樹脂と接触させることを特徴とする前記
   選択吸着方法。 ４ 前記架橋樹脂の架橋点間の鎖の平均鎖長、構
   造及び極性が、吸着されるべき前記ムコ多糖化合
   物固有の極性部分の鎖の平均鎖長、構造及び極性
   と実質的に相補的であることを特徴とする特許請
   求の範囲第３項に記載の選択吸着方法。 ５ 前記ムコ多糖化合物がヘパリンであることを
   特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の選択吸
   着方法。 ６ 水溶液中でグリコサミノグリカン類の混合物
   から一種のムコ多糖化合物を選択吸着する方法で
   あつて、前記溶液を攪拌しながら、ポリアルキレ
   ンイミン及びジイソシアナートから成る架橋樹脂
   であつて、重合度が約８〜42の該ポリアルキレン
   イミンとジイソシアナートとのモル当量比１：
   0.10〜１：0.15での架橋によつて得られ、該架橋
   樹脂は下記の一般式 （式中、ｎ＝１又は２，Ｒ＝Ｈ又はCH₃，Ａは
   共有結合又は―NH―（CH₂）ａ―、ただしａは
   ２又は３，ｂは２〜６を示す。）で示される繰返
   し単位を有し、架橋度が0.05〜1.0である（ただ
   し、該ポリアルキレンイミンのアミノ基の1/4よ
   り多くは架橋に関与しない。）ことを特徴とする
   前記架橋樹脂と接触させることを特徴とする選択
   吸着方法により架橋樹脂に選択吸着された一種の
   ムコ多糖化合物を分離する方法であつて、前記一
   種のムコ多糖化合物を含む前記架橋樹脂が1.5〜
   2.5M NaCl溶液で繰り返し処理することにより
   元の形態で回収され、その後得られた溶液中に存
   在する前記一種のムコ多糖化合物が透折又は第四
   級アンモニウム塩を用いる沈澱により公知の方法
   で単離されることを特徴とする前記分離方法。