JPH0253061B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、血液、血漿、その他の体液より、抗
DNA抗体、抗ENA抗体、抗核抗体などの自己抗
体および免疫複合体を除去する吸着材と、それを
用いた吸着装置に関する。さらに詳しくは、全身
性紅斑性ループス（システミツク・ループス・エ
リトマトーデス；以下SLEと略記する）をはじめ
とする膠原病患者の体液中に存在するこれらの自
己抗体、免疫複合体を特異的に吸着除去すること
により、体液を浄化再生し、疾患の進行を防止す
ると共に、症状を軽減せしめ、さらに治瘉を早め
る簡便な吸着材および吸着装置を提供することを
目的とする。 SLEは若年者とくに若い女性に多く、全身臓器
なかでも血管系、結合織がおかされるという難病
性疾患であり、自己免疫病変群の代表的疾患であ
る。その病因については不明であつたが、近年、
SLE患者血液中の抗核抗体等の存在が、各種の症
状の発生に重要な関連性があると考えられ、ま
た、血管炎や腎病変の病因としては、抗原−抗体
免疫複合体が組織に沈着するというメカニズムが
重視されてきている。最近、患者血漿中の抗原、
抗体、免疫複合体といつた悪性物質を除去する上
から、患者血漿と他の新鮮凍結血漿ないしは、ア
ルブミン製剤と入れ換える血漿交換療法が施行さ
れ、かなりの進行防止、症状軽減あるいは治瘉効
果が確認されるようになつてきた。 しかしながら、この血漿交換療法には、(1)除去
した血漿を補充するための新鮮凍結血漿ないしは
血漿成分の大量かつ持続的な入手が困難なこと、
(2)他人の血漿を利用するため、肝炎ウイルス等の
感染の危険が高いといつた欠点があり、一般に普
及できるものではない。 また、患者血漿中の悪性物質の除去には、限外
過膜を用いる方法があり、血漿成分の補給を要
しないという長所を有しながらも、(1)分子量によ
り、きれいに分離することができないこと、(2)除
去に分子量以外の選択性がないため、血漿中の有
用な物質も除去してしまうこと、(3)膜の目づまり
による過速度の低下、カツトオフ分子量の変動
などの問題点を有している。 さらに、担体にDNA、合成核酸ポリマー等の
生体（類似）高分子を固定し、自己抗体を除去す
る方法も提案されている。しかし、この方法は、
(1)固定化物質が高価であること、(2)抗原である固
定化物質の遊離が起こり、患者体内への流入の恐
れがあることから、実用上、治瘉に用いるには難
点がある。 本発明者らは、これらの問題点を克服すべく、
簡便かつ安全で、患者血漿中から悪性物質のみを
特異的に除去するための吸着材を鋭意研究した。
その結果、従来、生体（類似）高分子において吸
着能を有するものが知られていたのに対し、驚く
べきことに、核酸塩基を構成する低分子物質にお
いても、高分子と同等以上の吸着能を有すること
を見い出し、本発明を完成するに至つた。これに
より、固定化物質の脱離流出の不安は解消され、
実際の臨床応用上の困難を打破することができ
た。 すなわち、本発明は、プリン塩基またはピリミ
ジン塩基を構成要素として含む低分子物質ないし
はその誘導体の少なくとも１種を、不溶性担体に
共有結合してなる抗DNA抗体、抗ENA抗体、抗
核抗体等の自己抗体および免疫複合体の吸着材、
およびこの吸着材の少なくとも１種を、流体の導
出入口を有する容器内に収容せしめてなることを
特徴とする該自己抗体と免疫複合体の吸着装置で
ある。 本発明の吸着材の除去対象とする疾患は、抗
DNA抗体、抗ENA抗体、抗核抗体およびその免
疫複合体の出現するものであれば、いずれにも適
用できる。具体的には、SLE、混合性結合織病
（MCTD）、進行性全身性硬化症、シエーグレン
症候群、皮膚筋炎（多発性筋炎）、ケイ肺症、慢
性関節リウマチ、橋本病、慢性肝炎、糖尿病、気
管支拡張症などがある。 抗原−抗体反応を利用し、抗原を抗体に固定化
して、抗体を除去しようとする試みが知られてお
り、抗DNA抗体等においても、DNAを担体に固
定して除去が可能である。しかし、すでに述べた
ように、実用には不適であつた。本発明により、
体内に万一はいつても安全な物質を用いて、
DNAと同等以上の吸着性能を有する吸着材が開
発され、これにより広範囲な臨床応用が可能にな
り、今後、自己免疫疾患の治療に大きな進歩をも
たらすものと思われる。 本発明に用いられるプリン塩基およびピリミジ
ン塩基を構成する低分子物質とは、アデニン、シ
トシン、グアニン、ウラシル、チミン、ヒポキサ
ンチン、キサンチンなどの塩基、アデノシン、シ
チジン、グアノシン、ウリジン、イノシン、キサ
ントシン、デオキシアデノシン、デオキシシチジ
ン、デオキシグアノシン、デオキシウリジン、チ
ミンジンなどのヌクレオシド、アデノシン5′−リ
ン酸、シチジン5′−リン酸、グアノシン5′−リン
酸、イノシン5′−リン酸、ウリジン5′−リン酸、
およびこれらのリボースがデオキシリボースにな
つたもの、および二リン酸、三リン酸、また、
2′位、3′位にリン酸がついたものなどのヌクレオ
チド、ヌクレオチドにグルコース、マンノース等
の糖が結合したもの、ヌクレオチド数10以下のオ
リゴヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（NAD）、フラビンアデニンジヌクレ
オチド（FAD）、コエンザイムＡ、コエンザイム
B₁₂などのヌクレオチド補酵素、およびこれらす
べての誘導体をさす。このうち特に、塩基、ヌク
レオシド、ヌクレオチドが好ましく、さらには塩
基が良く、その中でもプリン塩基のアデニン、グ
アニンがより好ましい。これら低分子物質の分子
量は一般に１万以下が好ましく、特に1000以下で
ある。これらを単に一つだけ固定するのではな
く、複数の種類を担体に固定してもよい。 本発明に用いる担体は、水に不溶性のものであ
れば、いずれも用いることができるが、非特異的
吸着を避ける点で、親水性担体を用いるのが望ま
しい。不溶性担体の形状は、粒子状、繊維状、中
空糸状、膜状等いずれのものも用いることができ
るが、実施上の取り扱い、リガンドの保持量、血
漿との接触有効面積等の点で、粒子状、繊維状の
ものが良い。 粒子状担体としては、平均粒径150μから2500μ
の範囲にあることが好ましい。平均粒径はJIS−
Ｚ−8801に規定されるフルイを用いて流水中で分
級した後、各級の上限粒径と下限粒径の中間値を
各級の粒径とし、その重量平均として平均粒径を
算出する。また、粒子形状は球形が好ましいが、
特に限定されるものではない。平均粒径が2500μ
を超えると、悪性物質の吸着量および吸着速度が
低下し、150μ未満では、体外循環に用いると圧
損が大きく目づまりが起こりやすく、また凝固系
の活性化、血球粘着をおこしやすい。使用できる
粒子状担体としては、アガロース系、架橋デキス
トラン系、セルロース系、架橋ポリアクリルアミ
ド系、多孔性シリカビーズ、活性炭等の担体を用
いることができるが、アガロース系、架橋デキス
トラン系、セルロース系等の多糖類ゲルが良い結
果を与える。また、通常、固定化酵素、アフイニ
テイクロマトグラフイに用いられる公知の担体
は、特別な限定なく使用できる。 また、本発明で用いられる粒子状担体として
は、多孔性合成重合体粒子を用いることができ
る。該粒子はその表面に、先に記した本発明に用
いる物質を固定できるものであり、平均孔径300
Åないし9000Å、より好ましくは1000Åないし
6000Åの範囲にあるものである。該粒子の重合体
組成は、ポリアミド系、ポリエステル系、ポリウ
レタン系、ビニル化合物の重合体を用いることが
できるが、特に親水性のビニル化合物系多孔性合
成体粒子が好ましい結果を与える。 該多孔性構造は平均孔径300Åないし9000Åの
範囲にあるものが好ましいが、平均粒径が小さす
ぎる場合には、吸着される自己抗体の量が少な
く、大きすぎる場合には、重台体粒子の強度が低
下し、かつ表面積が減少するため実用的ではな
い。 平均孔径の測定は、水銀圧入式ポロシメーター
によつて行うことができる。この方法は多孔性物
質に水銀を圧入してゆき、浸入した水銀量から気
孔量を、圧入に要する圧力から孔径を求める方法
であり、40Å以上の孔を測定することができる。
平均孔径は、孔径をｒ、ポロシメーターで測定し
た累積気孔量をｖとしたとき、dv／ｄogrの値
が最大となるときのｒの値とする。 繊維状担体を用いる場合には、その繊維径が
0.02デニールないし10デニール、より好ましくは
0.1デニールないし５デニールの範囲にあるもの
がよい。繊維径が大きすぎる場合には、自己抗体
の吸着量および吸着速度が低下し、小さすぎる場
合には、凝固系の活性化、血球粘着、目づまりを
おこしやすい。使用できる繊維状担体としては、
再生セルロース系繊維、ナイロン、アクリル、ポ
リエステル等公知の親水性繊維である。 結合リガンドを親水性担体に固定化する方法
は、共有結合、イオン結合、物理的吸着法、架橋
法、包理あるいは担体表面への沈澱不溶化等の方
法があるが、結合リガンドの溶出を防ぐ上で、共
有結合によるものが良いので、本発明において
は、共有結合させて吸着材とした。 共有結合の方法としては、通常、固定化酵素、
アフイニテイーカラムの製造に用いられる方法が
とられる。担体を活性化する方法として、ハロゲ
ン化シアン、過ヨウ素酸、架橋試薬、エポキシド
等を用いて行なえる。担体とリガンドとの間に、
任意の長さの分子（スペーサー）を挿入して使用
することができる。 本発明で担体に結合させるリガンドの量は、担
体１ｇ（乾燥重量）当り0.1μmolないしは
1000μmolの範囲であり、より好ましくは、
0.5μmolないしは100μmolの範囲である。保持量
が0.1μmol未満の場合は、悪性物質の吸着能の低
下が起こり、200μmolを超える場合は、血漿有用
成分の非特異吸着が起こり好ましくない。 担体と共有結合させる結合リガンドの位置は、
塩基以外の部分をもつ物質に関しては、塩基以外
の部分で結合させ、塩基の部分を外側に向け、悪
性物質との接触を容易にするのが好ましい。 該吸着材の作用機構は、抗原抗体反応に近いも
のと考えられるが、本来の抗原である生体高分子
または類似した合成高分子を用いずに、万一体内
にはいつても何ら支障がなく、体内で代謝される
低分子によつて、充分な吸着除去能力を呈するこ
とは驚くべきことといえる。また、免疫複合体の
吸着には、疎水的な結合が寄与していると考えら
れる。 本発明の自己抗体吸着装置は、上記説明の自己
抗体吸着材を、流体の導出入口を有する容器内に
充填し、体液が自己抗体吸着材と接触しつつ通過
するようにしたものである。これの具体例を第１
図と第２図に示す。第１図において、円筒１の両
端開口部に、内側にフイルター２を張つたパツキ
ング３を介して体液導出入口４を有するキヤツプ
５をネジ６で嵌合し、両端のフイルターの間隙に
吸着材７を充填保持させてなるものである。 吸着材としては、本発明の前記吸着材を単独で
充填してもよく、他の吸着材と混合もしくは積層
してもよい。吸着材層の容積は、体外循環に用い
る場合、50〜400ml程度が適当である。 本発明の装置を体外循環で用いる場合には、大
略次の二通りの方法がある。一つには、体内から
取り出した血液を遠心分離機もしくは膜型血漿分
離器を使用して、血漿成分と血球成分とに分離し
たのち、血漿成分を本発明の装置に通過させ、浄
化した後、血球成分と合わせて体内にもどす方法
であり、他の一つは体内から取り出した血液を直
接本発明の装置に通過させ、浄化する方法であ
る。 また、血液もしくは血漿の通過速度について
は、該吸着材の吸着能率が非常に高いため、吸着
材の粒度を粗くすることができ、また充填度を低
くできるので、吸着材層の形状の如何にかゝわら
ず、高い通過速度を与えることができる。そのた
め多量の体液処理をすることができる。 体液の通液方法としては、臨床上の必要に応
じ、あるいは設備の設置状況に応じて、連続的に
通液してもよいし、また断続的に通液使用しても
よい。 本発明の吸着材および吸着装置は、以上述べて
きたように、体液中の抗DNA抗体、抗ENA抗
体、抗核抗体等の自己抗体および免疫複合体を高
率かつ特異的に吸着除去し、非常にコンパクトで
あると共に簡便かつ安全である。また、滅菌操作
も容易かつ確実に実施できるという効果を併せも
つている。 また、本発明の吸着材は、装置に充填して治療
器として用いられるにとどまらず、抗DNA抗体、
抗ENA抗体、抗核抗体等の自己抗体および免疫
複合体の分離、精製用吸着材およびこれらの測定
用基材としても極めて有効に利用できる。 以下、実施例により、本発明の実施の態様をよ
り詳細に説明する。 実施例 １ CNBr活性化セフアローズ4B（スエーデン・フ
アルマシア社製、平均粒径260μ）に、通常の方
法によつてアデニン〔ヤマサ醤油（株）製〕を共
有結合せしめ、過剰の活性基をグリシンでブロツ
キングした。保持量は6N塩酸で室温24時間処理
した後、リガンドを遊離させ、260nmの吸収から
算出した。吸着材は生理食塩水で充分に洗浄した
後、脱水して実験に使用した。 吸着実験は、患者血漿３容と吸着材１容を混合
し、37℃、３時間インキユベーシヨンにより行つ
た。また、対照として、未活性化セフアローズ
4Bを用いた。 抗DNA抗体価は、ホルマリン固定鶏血球に
DNAを感作したものと、処理または未処理の患
者血漿の段階希釈液との混和によつて生じる凝集
反応（室温）の有無により、陽性か陰性かを判断
し、陽性を示す最高希釈倍数をもつて抗体価を求
めた。測定には「DNAテスト」〔富士臓器製薬
（株）製〕のキツトを用いた。 抗核抗体価は、細胞を塗抹したスライドガラス
に段階希釈した検体（一次抗体）を滴下し、抗原
−抗体反応を行い、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト
免疫グロブリン抗体（二次抗体）を適下し、酵素
の呈色反応を光学顕微鏡で観察した。測定には、
「エンザイムANAテスト」〔（株）医学生物学研
究所製〕のキツトを用いた。陽性を示す最高希釈
倍数をもつて抗体価を表示した。 免疫複合体量の測定には、ポリエチレングリコ
ール（PEG）により免疫複合体を沈降させ、補
体血反応と組合わせる方法を用いた。この方法の
操作方法、条件は次のようにして行つた。 (1) 検体0.3mlを分離管に注ぐ。次に、
0.2NEDTA50μを加えて撹拌し、さらにほう
酸緩衝液50μ加えて撹拌する。12.5％PEG（分
子量6000）を0.1ml加えて撹拌し、４℃、90分
静置する。 (2) ４℃、1700ｇで10分間遠心し、沈澱を2.5％
PEG1.0mlで洗う。1700ｇで15分間遠心し、上
清を捨てる。 (3) 37℃のGVB⁺⁺（２価陽イオンを含むゼラチン
ベロナール緩衝液）30μを加え、沈澱を溶解
する。補体源としてプール健康人血清10μを
加える。37℃、30分間、免疫複合体と補体とを
反応させる。 (4) 1.5×10⁸／mlEA（抗体感作赤血球）1.0mlを加
え、37℃、60分間、振とうさせて、残存補体に
よる溶血反応を促進させる。 (5) 反応後、４℃の生理食塩水6.5mlを加えて遠
心し、上清の吸光度（OD₄₁₄）を測定する。 (6) 健康人血清を対照とし、これに対する溶血の
阻止率を算出する。単位をPEG−CC％とする。 阻止率＝（対照）−（検体吸光度）／（対照吸光度）×
100 除去率＝（未処理）−（処理血漿阻止率）／（未処理血
漿阻止率）×100 EAは日本凍結乾燥研究所製の補体価測定用感
作赤血球（KW）を用いた。 アルブミン量はブロムクレゾールグリーン
（BCG）を用いるアルブミン測定法を利用し、試
薬は〔Ａ／Ｇ Ｂ−テスト ワコー、和光純薬工
業（株）製〕を用いた。吸着実験後のアルブミン
の減少量の患者血漿に対する割合を除去率とし
た。 結果を第１表に示した。 実施例 ２ 結合リガンドに５−アミノウラシルを用いたほ
かは、すべて実施例１と同一条件で実施した。結
果を第１表に示した。 実施例 ３ 結合リガンドにグアニンを用いたほかは、すべ
て実施例１と同一条件で実施した。結果を第１表
に示した。 実施例 ４ 結合リガンドにグアノシンを用いたほかは、す
べて実施例１と同一条件で実施した。結果を第１
表に示した。 実施例 ５ 結合リガンドにシチジン−5′−リン酸（CMP）
を用いたほかは、すべて実施例１と同一条件で実
施した。結果を第１表に示した。 実施例 ６ 結合リガンドにアデノシン−5′−リン酸
（ADP）を用いたほかは、すべて実施例１と同一
条件で実施した。結果を第１表に示した。 実施例 ７ 結合リガンドにニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（NAD）を用いたほかは、すべて実施
例１と同一条件で実施した。結果を第１表に示し
た。 実施例 ８ 0.5デニールのベンベルグ長繊維〔旭化成工業
（株）製〕を用いて、常法によりCNBrで活性化
し、アデニンを用いて固定した。該吸着材１ｇと
患者血漿10mlを37℃、３時間インキユベートし
た。対照として、未処理のベンベルグを用いた。
これ以外は、すべて実施例１と同一条件で実施し
た。結果を第１表に示した。 実施例 ９ ビニル化合物系多孔性合成重合体として、ヒド
ロキシエチルメタアクリレート−エチレングリコ
ールジメタアクリレート−グリシジルメタアクリ
レートよりなる三元共重合体で、平均粒径500μ、
平均孔径1500Å、エポキシ密度1mol％の重合体
をCNBrで活性化し、アデニンを固定した。未反
応エポキシドは、グリシンを用いてブロツクし
た。 これを吸着材として10ml用い、第２図に示す実
験系を用いて吸着実験を行なつた。 すなわち、容器８に同一患者血漿９を30ml入
れ、ポンプ１０により毎分１mlの流速で汲み出
し、悪性物質吸着装置１１に送り、ドリツプチヤ
ンバー１２およびサンプリング口１３を経て、容
器８に返送されるようにチユーブ１４を配設し
た。 上記装置により、血液を３時間循環させた後、
血液をサンプリングし、血漿中の自己抗体、免疫
免疫複合体量等は、実施例１と同様に測定した。
対照として、未処理のビニル化合物系多孔性合成
重合体を用いた。結果を第１表に示した。

【表】

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の悪性物質吸着装置の１例を示
す断面図、第２図は本発明の悪性物質吸着装置を
用いたモデル実験説明図である。 １……円筒、２……フイルター、３……パツキ
ング、４……体液導出入口、５……キヤツプ、６
……ネジ、７……吸着材。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 不溶性担体に、プリン塩基またはピリミジン
   塩基を構成要素として含む低分子量の物質ないし
   はその誘導体の少なくとも１種を共有結合させて
   なることを特徴とする自己抗体、免疫複合体の吸
   着材。 ２ アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルま
   たはチミンを含む低分子量の物質を単独または併
   用して用いる特許請求の範囲第１項記載の吸着
   材。 ３ リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレ
   オシドを含む低分子量の物質を単独または併用し
   て用いる特許請求の範囲第１項記載の吸着材。 ４ 不溶性担体に、プリン塩基またはピリミジン
   塩基を構成要素として含む低分子量の物質ないし
   はその誘導体の少なくとも１種を共有結合させて
   なる吸着材の単独または２種以上を、流体の導出
   入口を有する容器内に収容せしめてなることを特
   徴とする自己抗体、免疫複合体の吸着装置。